com a pele. Prova limitada de um efeito cancerígeno. Pode causar alterações genéticas
hereditárias. Em caso de contacto com os olhos, lavar imediata e abundantemente com
água e consultar um médico. Usar vestuário de protecção, luvas e equipamento de
protecção para os olhos/face adequados. Em caso de acidente ou de indisposição,
consultar imediatamente um médico (mostrar-lhe o rótulo se possível). Utilizar apenas em
áreas bem ventiladas.
O etanol é INFLAMÁVEL e IRRITANTE. Muito inflamável. Irritante para os olhos, vias
respiratórias e pele. Manter o recipiente adequadamente fechado. Conservar longe de
qualquer fonte de ignição – não fumar. Em caso de contacto com os olhos, lavar imediata e
abundantemente com água e consultar um médico. Usar vestuário de protecção adequado.
O peróxido de hidrogénio, 30%, é OXIDANTE e CORROSIVO. O contacto com
material combustível pode provocar um incêndio. Provoca queimaduras. Conservar longe
de material combustível. Em caso de contacto com os olhos, lavar imediata e
abundantemente com água e consultar um médico. Usar vestuário de protecção, luvas e
equipamento de protecção para os olhos/face adequados. Em caso de acidente ou de
indisposição, consultar imediatamente um médico (mostrar-lhe o rótulo se possível).
PEROXIDASE DE
LEUCÓCITOS
(MIELOPEROXIDASE)
(Procedimento N.º 390)
UTILIZAÇÃO PREVISTA
A Peroxidase de Leucócitos (Mieloperoxidase) da Sigma-Aldrich destina-se a ser
utilizada para demonstração histoquímica na peroxidase de leucócitos. Os reagentes para
a peroxidase de leucócitos destinam-se à “utilização em diagnóstico in vitro”.
Os métodos clássicos de localização citoquímica da mieloperoxidase (MP) envolvem
a utilização de benzidina1 ou diaminobenzidina.2 Em 1977, Hanker et al.3 descreveram a
utilização de p-fenilenediamina e catecol para a detecção da peroxidase de rábano
injectada. Esse sistema indicador é a base para o procedimento da Sigma-Aldrich, quando
a mieloperoxidase é detectada por meio da seguinte reacção:
MP
Declarações de riscos e segurança da UE
O reagente indicador de peroxidase é TÓXICO e perigoso para o ambiente. Tóxico por
inalação, em contacto com a pele e em caso de ingestão. Irritante para os olhos e pele.
Pode provocar sensibilização em contacto com a pele. Muito tóxico para organismos
aquáticos, pode causar efeitos negativos a longo prazo no ambiente aquático. Em caso de
contacto com os olhos, lavar imediata e abundantemente com água e consultar um médico.
Usar vestuário de protecção e luvas adequadas. Em caso de acidente ou de indisposição,
consultar imediatamente um médico (mostrar-lhe o rótulo se possível). Este material e o
seu recipiente têm que ser eliminados junto com os resíduos perigosos. Evitar libertação
no ambiente. Consultar instruções/fichas de dados de segurança especiais.
A hematoxilina ácida é NOCIVA. Nociva em caso de ingestão.
O formaldeído é TÓXICO. Tóxico por inalação, em contacto com a pele e em caso de
ingestão. Provoca queimaduras. Prova limitada de um efeito cancerígeno. Pode provocar
sensibilização em contacto com a pele. Em caso de contacto com os olhos, lavar imediata
e abundantemente com água e consultar um médico. Usar vestuário de protecção, luvas e
equipamento de protecção para os olhos/face adequados. Em caso de acidente ou de
indisposição, consultar imediatamente um médico (mostrar-lhe o rótulo se possível).
Utilizar apenas em áreas bem ventiladas.
O etanol é ALTAMENTE INFLAMÁVEL. Muito inflamável. Manter o recipiente
adequadamente fechado. Conservar longe de qualquer fonte de ignição – não fumar.
O peróxido de hidrogénio é CORROSIVO. Provoca queimaduras. Após o contacto com
a pele, lavar imediatamente com água abundante. Usar vestuário de protecção e
equipamento de protecção para os olhos/face adequados. Em caso de acidente ou de
indisposição, consultar imediatamente um médico (mostrar-lhe o rótulo se possível).
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p-Fenilenediamina +
Catecol + H2O2
Produto de reacção insolúvel castanho-preto
REAGENTES
CONCENTRADO DE TAMPÃO TRIZMAL™ 6,3, N.º de Catálogo 90-3C
TRIZMA® maleato, 200 mmol/L. Clorofórmio adicionado como conservante.
REAGENTE INDICADOR DA PEROXIDASE, N.º de Catálogo 390-1
P-fenilenediamina diHCl (1 parte) e catecol (2 partes).
SOLUÇÃO DE HEMATOXILINA ÁCIDA, N.º de Catálogo 285-2
Hematoxilina, certificada, a 1 g/L, pH 3,3 a 25°C.
ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE:
O concentrado de tampão Trizmal™ 6,3 e a solução de hematoxilina ácida devem ser
armazenados à temperatura ambiente (18–26°C).
O reagente indicador de peroxidase deve ser armazenado refrigerado (2–8°C).
Não deve voltar a colocar a solução de hematoxilina ácida no recipiente original após
utilização na jarra de Coplin.
O peróxido de hidrogénio, 3% em solução salina de tampão fosfato, deve ser
armazenado no frigorífico (2–8°C). Eliminar se se verificarem indícios de turvação.
Os reagentes permanecem estáveis até ao final do prazo de validade.
DETERIORAÇÃO:
Eliminar o concentrado de tampão Trizmal™ 6,3 se se desenvolver turvação.
Eliminar a solução de hematoxilina ácida quando o período necessário para uma
coloração adequada ultrapassar em mais de 5 minutos o período recomendado
no procedimento.
PROCEDIMENTO
COLHEITA DE AMOSTRAS:
Recomenda-se que a colheita de amostras seja realizada de acordo com o
documento M29-A2 da NCCLS. Nenhum método de teste conhecido poderá garantir
totalmente que as amostras sanguíneas ou de tecido não irão transmitir infecções. Por
essa razão, todos os derivados sanguíneos ou amostras de tecido deverão ser
considerados potencialmente infecciosos.
Para o ensaio, poderão utilizar-se esfregaços de sangue total ou de medula óssea
preparados em estado fresco. O sangue pode ser colhido em heparina ou EDTA. A
exposição à luz deve ser minimizada uma vez que a peroxidase de leucócitos é fotolábil.
Sabe-se que os esfregaços não fixados são estáveis durante 3 semanas quando mantidos
no escuro.1 Deixar os esfregaços secar ao ar durante 10 minutos, protegidos da luz, antes
da fixação.
PREPARAÇÃO:
O tampão Trizmal™ 6,3 diluído é preparado misturando 1 volume de concentrado de
tampão TRIZMAL™ 6,3, N.º de Catálogo 90-3C, com 9 volumes de água desionizada.
Utilizar uma vez e eliminar.
O etanol, solução de fixador a 95% (v/v), é preparado misturando 5 mL de 37% de
formaldeído com 45 mL de etanol a 95%. Preparar diariamente uma solução fresca.
Armazenar devidamente tapado.
O peróxido de hidrogénio, 3%, em solução salina de tampão fosfato, é preparado
adicionando-se 1 parte de peróxido de hidrogénio, 30%, a 9 partes de solução salina de
tampão fosfato com pH 7,4. Deve ser preparado fresco.
PRECAUÇÕES:
Deverão ser aplicadas as precauções normais relativamente ao manuseamento de
reagentes laboratoriais. Eliminar os resíduos de acordo com todos os regulamentos locais,
estaduais, regionais ou nacionais. Consultar a ficha de dados de segurança dos materiais
para obter informações mais actualizadas sobre os riscos, perigos ou segurança.
MATERIAIS ESPECIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS:
Formaldeído, 37%, Solução
Etanol, 95% (v/v)
Solução salina de tampão fosfato, pH 7,4, N.º de Catálogo P 3813
Peróxido de hidrogénio, 30%
Declarações de riscos e segurança dos EUA
O reagente indicador de peroxidase é TÓXICO. Tóxico por inalação, em contacto com
a pele e em caso de ingestão. Irritante para os olhos, vias respiratórias e pele. Prova
limitada de um efeito cancerígeno. Pode provocar sensibilização por inalação e em
contacto com a pele. Muito tóxico para organismos aquáticos, pode causar efeitos
negativos a longo prazo no ambiente aquático. Em caso de contacto com os olhos, lavar
imediata e abundantemente com água e consultar um médico. Usar vestuário de protecção
e luvas adequadas. Em caso de acidente ou de indisposição, consultar imediatamente um
médico (mostrar-lhe o rótulo se possível). Este material e o seu recipiente têm que ser
eliminados junto com os resíduos perigosos. Evitar libertação no ambiente. Consultar
instruções/fichas de dados de segurança especiais.
O concentrado de tampão TRIZMAL™ é NOCIVO e perigoso para o ambiente. Nocivo
em caso de ingestão. Prova limitada de um efeito cancerígeno. Nocivo: perigo de provocar
danos graves na saúde por exposição prolongada através de inalação e em caso de
ingestão. Usar vestuário de protecção adequado.
A hematoxilina ácida é TÓXICA. Tóxica em caso de ingestão. Irritante para os olhos,
vias respiratórias e pele. Em caso de contacto com os olhos, lavar imediata e
abundantemente com água e consultar um médico. Usar vestuário de protecção e luvas
adequadas. Em caso de acidente ou de indisposição, consultar imediatamente um médico
(mostrar-lhe o rótulo se possível). Órgãos alvo: Nervos e fígado.
O formaldeído é TÓXICO. Tóxico por inalação, em contacto com a pele e em caso de
ingestão. Provoca queimaduras. Pode provocar sensibilização por inalação e em contacto
NOTAS:
Recomenda-se que sejam processados esfregaços sanguíneos preparados a partir
de dadores saudáveis, em conjunto com as amostras dos doentes, como forma de
verificação do desempenho do sistema.
Apesar de a mieloperoxidase ser, geralmente, considerada como marcador para
células da estirpe mielocítica, é imperativo reconhecer que as células monocitóides podem,
igualmente, apresentar uma actividade de peroxidase fraca.
Os dados obtidos com este procedimento servem apenas para auxiliar o diagnóstico e
deverão ser analisados em conjunto com outros testes de diagnóstico ou informações clínicas.
PROCEDIMENTO:
1. Fixar as películas à temperatura ambiente durante 30 segundos em solução de
fixador.
2. Lavar suavemente as lâminas em água corrente durante 2 minutos e deixar secar ao
ar e no escuro durante 10 minutos.
3. Pré-aquecer 50 mL de Tampão diluído TRIZMAL™ 6,3 num banho-maria de 37°C.
4. Imediatamente antes de utilizar, adicionar ao tampão diluído Trizmal™ 6,3 préaquecido 1 frasco de reagente indicador de peroxidase, N.º de Catálogo 390-1, e
200 µl (0,2 mL) de peróxido de hidrogénio a 3%. Misturar completamente. Eliminar
após a utilização.
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8.
Colocar as lâminas lavadas, fixas (Passo 2) na solução de reagente indicador de
peroxidase (Passo 4) durante 30 minutos, no escuro e num banho-maria a 37°C.
Após a incubação, lavar suavemente as lâminas em água corrente durante
15–30 segundos e deixar secar ao ar.
Proceder à contracoloração com solução de hematoxilina ácida, N.º de Catálogo 285-2,
durante 10 minutos.
Passar as lâminas por água desionizada corrente durante 15-30 segundos. Deixar
secar ao ar e examinar as lâminas microscopicamente.
CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO
Os esfregaços sanguíneos preparados a partir de dadores normais foram submetidos
a coloração para mieloperoxidase de acordo com este procedimento e através do método
de benzidina.1 Os neutrófilos demonstraram uma granulação castanha-preta com este
procedimento e uma granulação azul com o procedimento de benzidina. Em ambos os
casos, a coloração dos monócitos foi menos intensa e os linfócitos não apresentaram
qualquer actividade de mieloperoxidase.
Se os resultados observados forem diferentes dos esperados, contactar a Assistência
Técnica da Sigma-Aldrich para mais informações.
BIBLIOGRAFIA
1.
2.
3.
4.
5.
Kaplow SL: Simplified myeloperoxidase stain using benzidine dihydrochloride. Blood
26:215, 1965.
Graham RC, Karnovsky MJ: The early stage of absorption of injected horseradish
peroxidase in the proximal tubule of mouse kidney; Ultrastructural cytochemistry by a
new technique. J Histochem Cytochem 14:291, 1966.
Hanker JS, Yates PE, Metz CB, Rustioni A: A new specific sensitive and noncarcinogenic reagent for the demonstration of horseradish peroxidase. Histochem
9:789, 1977.
Bennett JM, Catovsky D, Daniel M, Randrin G, Galton DAG, Gralnick HR, Sultan C:
Proposals for the classification of the acute leukemias. French-American-British (FAB)
Co-operative Group. Brit J Haematol 33:451, 1976.
Marmont AM, Damasio E, Zucker-Franklin D: Neutrophils. In Atlas of Blood CellsFunction and Pathology, Vol. 1. Edited by D Zucker-Franklin, MF Greaves, CE Grossi,
AM Marmont, Lea and Febriger, Philadelphia, 1981, pp 149-424.
A Sigma-Aldrich, Inc. garante que os seus produtos estão em conformidade com as
informações contidas nesta e em outras publicações da Sigma-Aldrich. O comprador
deverá determinar a adequação do(s) produto(s) ao fim particular a que se destinam.
Poderão aplicar-se termos e condições adicionais. Consultar o verso da factura ou carta
de porte para mais informações sobre os termos e condições de venda adicionais.
Procedimento N.º 390
Revisão Anterior: 2003-03
Revisto: 2003-09
AR-MED Ltd., Runnymede Malthouse
Egham, TW20 9BD Reino Unido
SIGMA-ALDRICH, INC.
3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 USA +1 314 771 5765
Assistência Técnica: chamada paga no destino +1 314 771 3122
ou endereço de correio electrónico: [email protected]
Para encomendar: chamada paga no destino +1 314 771 5750
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