COPPER
Cobre
Color 3,5-DiBr-PAESA
5.
Determinação quantitativa de cobre
IVD
Agitar e ler a absorvância (A1) da amostra frente ao Branco de
reagente.Acrescentar:
Conservar a 2-8ºC
PRINCIPIO DO METODO
Ensaio colorimétrico directo sem desproteinização da amostra. Aumento de
absorvância do end point. Em meio ácido pH 4,7, o cobre é libertado da
ceruloplasmina reduzindo-se a cobre cuproso por meio do ácido ascórbico.O
ião cuproso reage com o corante 3-5 Di Br-PAESA formando-se um
composto com coloração estável.
A intensidade da coloração é proporcional ao cobre total presente na
amostra
SIGNIFICADO CLINICO
Existe uma grande variedade de doenças específicas com deficiencias de
cobre que inclui doenças cardíacas,doenças dos ossos, artrite e osteoporose
e síndrome de Menkes, doença de Wilson e outras. Níveis elevados de
cobre podem ser tóxicos1,2.
O diagnóstico clínico deve realizar-se tendo em consideração todos os
dados clínicos e laboratoriais.
REAGENTES
R1
Tampão
R2
Côr
R3
Ácido redutor
COBRE CAL
Acetato. pH 4,7
> 1 mol/L
0,4 mmol/L
3,5-DiBr-PAESA
Ácido Ascórbico (Pó)
Padrão primario de Cobre 100 g/dL
PRECAUÇÕES
R2: Corrosivo (C). R35: Provoca queimaduras graves.
CALIBRAÇÃO
O valor de COPPER CAL é detectavel pelo material de referência do NITS
(National Institute of Standards and Technology).
PREPARAÇÃO E ESTABILIDADE
- Reagente de trabalho (RT): Adicionar (  ) uma dose de R3 (medir
usando a colher que se inclui) a um frasco de R1. , até sua dissolução
completa. Estabilidade: 15 dias a 2-8ºC, desde que se mantenham os
frascos bem fechados e se evite a sua contaminação.Não utilizar caso
apresente turvação
- R2: Pronto para utilização . Uma vez aberto,é estavel por 90 dias
desde que se mantenham os frascos bem fechados a 2-8ºC e se evite a sua
contaminação.
- COBRE CAL: Pronto para utilização
CONSERVAÇÃO E ESTABILIDADE
Todos os componentes do kit são estáveis, até ao prazo de validade indicado
no rótulo, mantendo-se os frascos bem fechados a 2-8ºC, protegidos da luz
e evitando-se a contaminação. Não utilizar reagentes fora de prazo.
Indicadores de deterioração dos reagentes :
- Presença de partículas e turvação.
MATERIAL ADICIONAL
- Espectrofotómetro ou analisador para leituras a 582 nm.
- Cuvetes de 1,0 cm de passo de luz.
- Equipamento habitual de laboratório(Nota 2) .
AMOSTRAS
- Soro ou plasma1: Sem hemolizar. Usar sómente a heparina como
anticoagulante. Estabilidade 24 horas a 2-8ºC ou 15 dias –20ºC.
PROCEDIMENTO
1.
Os reagentes deverão estar á temperatura ambiente, antes da sua
utilização.Uma alteração proporcional nos volumes indicados não faz
variar o resultado.
2.
Condicões do ensaio:
Comprimento de onda: . . . . . . . . . . . . . . . . 582 nm (570-590)
Cuvete: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 cm passo de luz
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37ºC
3.
Ajustar o espectrofotómetro a zero frente a agua destilada.
4.
Pipetar para uma cuvete:
RT (mL)
Agua destilada (L)
Padrão(Nota 1,3) (L)
Amostra (L)
BSIS39-P
20/02/15
Branco
1,0
50
---
Padrão
1,0
50
--
Branco
50
R2 (L)
6.
7.
Padrão
50
Amostra
50
Agitar e incubar 4-5 minutos a 37ºC
Lêr a absorvância (A2) do Padrão e da amostra frente ao Branco de
reagente.A coloração é estável por pelo menos 1 hora.
CALCULOS
( A2  A1 ) Amostra  ( A2  A1 )Branco x 100 (Padrão conc) = mg/dL cobre na mostra
( A2  A1 ) Padrão ( A2  A1 )Branco
Factor de conversão: g/dL x 0,1573 = mol/L.
CONTROLO DE QUALIDADE
É conveniente analisar juntamente com as amostras os soros controlo
valorizados: SPINTROL H Normal e Patológico (Ref. 1002120 e 1002210).
Se os valores encontrados se encontrarem fora do intervalo de tolerência,
devem ser revistos o instrumento, os reagentes e o calibrador.
Cada laboratorio debe dispôr do seu próprio controlo de qualidade e estabelecer
correcções quando os controlos não cumprem com o estabelecido pelo
intervalo de tolerancia.
VALORES DE REFERENCIA1
Homens
 11,0 – 22,0 mol/L
70 - 140 g/dL
Mulheres
80 - 155 g/dL  12,6 – 24,4 mol/L
Estes valores são orientativos. Recomenda-se que cada laboratorio estabeleça
os seus próprios valores de referência.
CARACTERISTICAS DO METODO
Intervalo de medida: Desde o limite de detecção de 3 g/dL até ao limite de
linealidade de 500 g/dL.
Se a concentração é superior ao limite de linearidade,, diluir a amostra 1/10
com NACL 9 g/L e multiplicar o resultado final por 10.
Precisão:
Media (g/dL)
SD
CV (%)
Intraserie (n= 20)
71,8 120 170
2,19 2,64 2,68
3,05 2,19 1,57
Interserie (n= 20)
72,6
121
170
2,41
2,98
1,97
3,32
2,46
1,16
Exactidão: Os reagentes
SPINREACT (y) não apresentam diferenças
sistemáticas significativas quando se comparam com outros reagentes
comerciais (x).
Os resultados obtidos com 60 amostras foram os seguintes :
Coeficiente de correlação (r): 0,96.
Equação da recta de regressão : y= 0,9774x + 2,5776
As características do método podem variar segundo o equipamento utilizado
INTERFERENCIAS
Não se observaram interferencias com bilirrubina até 15 mg/dL, hemoglobina
até 0,5 g/dL e triglicéridos até 1000 mg/dL.
Encontram-se descritas varias drogas e outras substancias que interferem com
a determinação do cobre3,4.
NOTAS
1. COPPER CAL: Devido á natureza do produto, é aconselhável manejá-lo
com muito cuidado pois pode contaminar-se com muita facilidade.
2. Recomenda-se a utilização de material de plástico de uma só utilização.Em
caso de utilização de material de vidro deverá lavar-se abundantemente
com ácido clorídrico 1N, enchaguar varias vezes com agua destilada e
secar antes da sua utilização.
3. Usar pontas de pipetas descartáveis limpas para a sua dispensação.
4. SPINREACT dispõe de instruccões detalhadas para a aplicação
destreagente em diferentes analisadores.
BIBLIOGRAFIA
1.
2.
3.
4.
Burtis A et al. Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3rd ed AACC 1999.
Kaplan A et al. Clin Chem The C.V. Mosby Co.1984.
Young DS. Effects of drugs on Clinical Lab. Tests, 4th ed AACC Press, 1995.
Young DS. Effects of disease on Clinical Lab. Tests, 4th ed AACC 2001.
APRESENTAÇÃO
Ref.: 1001080
Cont.
.
R1: 5 x 10 mL, R2: 1 x 3 mL,
R3: 1  5 x 10 mL, CAL: 1 x 10 mL
Amostra
1,0
-50
SPINREACT,S.A./S.A.U. Ctra.Santa Coloma, 7 E-17176 SANT ESTEVE DE BAS (GI) SPAIN
Tel. +34 972 69 08 00 Fax +34 972 69 00 99. e-mail: [email protected]
COPPER
Copper
Color 3,5-DiBr-PAESA
5.
Quantitative determination of copper
IVD
PRINCIPLE OF THE METHOD
Direct colorimetric test without deproteinization of the sample. End point
increase. At pH 4.70, in a buffered media, copper is released from
ceruloplasmine complex and forms with the specific complexant 3-5 Di BrPAESA a stable coloured complex.
The color intensity is proportional to the amount of cooper present in the
sample.
CLINICAL SIGNIFICANCE
A variety of human copper deficiency conditions are recognized. Specific
diseases associated with copper include head disease, bone and joint
osteoarthritis and osteoporosis and Menkes’ syndrome, Wilson’s disease
and others. Elevated levels of copper can also be toxic.
Clinical diagnosis should not be made on a single test result; it should
integrate clinical and other laboratory data.
Acetate. pH 4,7
3,5-DiBr-PAESA
> 1 mol/L
0,4 mmol/L
Ascorbic acid (powder)
Copper primary standard 100 g/dL
PRECAUTIONS
R2: Corrosive (C): R35: Causes severe burns.
CALIBRATION
The COPPER CAL value is verified using NIST (National Institute of
Standards and Technology) traceable reference Standard.
PREPARATION AND STABILITY
- Working reagent (WR): Add (  ) one dose (dispense using the
enclosed spoon) of R 3 to one vial of R1. Cap and mix gently to
dissolve contents. (WR) is stable after reconstitution 15 days at 28ºC when stored tightly closed and contaminations prevented during
their use. Do not use if appears turbid.
- R2: Ready to use. After opening, is stable 90 days 2-8ºC, if
contamination avoided and vial recapped immediately after use.
- COPPER CAL: Ready to use.
STORAGE AND STABILITY
All the components of the kit are stable until the expiration date on the label
when stored tightly closed at 2-8ºC, protected from light and contaminations
prevented during their use.
Do not use reagents over the expiration date.
Signs of reagent deterioration:
- Presence of particles and turbidity.
ADDITIONAL EQUIPMENT
- Spectrophotometer or colorimeter measuring at 582 nm.
- Matched cuvettes 1,0 cm light path.
- General laboratory equipment(Note 2).
SAMPLES
- Serum or plasma1: Not hemolyzed. Use only heparin salts as
anticoagulants. Stability: 24 hours at 2-8ºC or 15 day at –20ºC.
PROCEDURE
1. Allow reagents to reach working temperature before using. A
proportional variation of the reaction volumes indicated does not
change the result.
2. Assay conditions:
Wavelength: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 582 nm (570-590)
Cuvette: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 cm light path
Temperature: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37ºC
3. Adjust the instrument to zero with distilled water.
4. Pipette into a cuvette:
Blank
Standard
Sample
WR (mL)
1,0
1,0
1,0
Distilled water
50
-50
-Standard(Note 1,3) (L)
--50
Sample (L)
BSIS39-I
20/02/15
Blank
50
R2 (L)
Store at 2-8ºC
REAGENTS
R1
Buffer
R2
Color
R3
Reducing acid
COPPER CAL
Mix and read the absorbance (A1) of the sample against the Blank. Add:
6.
7.
Standard
50
Sample
50
Mix and incubate for 4-5 min at 37ºC.
Read the absorbance (A2) of sample and standard against Blank. The
colour is stable for at least 1 hour.
CALCULATIONS
( A2  A1 ) Sample ( A2  A1 )Blank x 100 (Std. conc.)= mg/dL copper in the sample
( A2  A1 ) S tan dard  ( A2  A1 )Blank
Conversion factor: g/dL x 0,1573 = mol/L.
QUALITY CONTROL
Control sera are recommended to monitor the performance of assay
procedures: SPINTROL H Normal and Pathologic (Ref. 1002120 and
1002210).
If control values are found outside the defined range, check the instrument,
reagents and calibrator for problems.
Each laboratory should establish its own Quality Control scheme and
corrective actions if controls do not meet the acceptable tolerances.
REFERENCE VALUES1
Male
70 - 140 g/dL
 11,0 – 22,0 mol/L
Female
80 - 155 g/dL
 12,6 – 24,4 mol/L
These values are for orientation purpose; each laboratory should establish its
own reference range.
PERFORMANCE CHARACTERISTICS
Measuring range: From detection limit of 3 g/dL to linearity limit of 500 g/dL.
If the results obtained were greater than linearity limit, dilute the sample 1/10
with NaCl 9 g/L and multiply the result by 10.
Precision:
Mean (g/dL)
SD
CV (%)
Intra-assay (n=20)
71,8 120 170
2,19 2,64 2,68
3,05 2,19 1,57
Inter-assay (n=20)
72,6 121 170
2,41 2,98 1,97
3,32 2,46 1,16
Accuracy: Results obtained using SPINREACT reagents (y) did not show
systematic differences when compared with other commercial reagents (x).
The results obtained using 60 samples were the following:
Correlation coefficient (r): 0,96.
Regression equation: y= 0,9774x + 2,5776.
The results of the performance characteristics depend on the analyzer used.
INTERFERENCES
No interferences were observed to bilirubin up to 15 mg/dL, hemoglobin up
to 0.5 g/dL and triglycerides up to 1000 mg/dL.
A list of drugs and other interfering substances with copper determination has
been reported by Young et. al3,4.
NOTES
1. COPPER CAL: Proceed carefully with this product because due its
nature it can get contamined easily.
2. It is recommended to use disposable material. If glassware is used the
material should be scrupulously cleaned with hydrochloric acid 1 N and
then thoroughly rinsed it with distilled water.
3. Use clean disposable pipette tips for its dispensation.
4. SPINREACT has instruction sheets for several automatic
analyzers. Instructions for many of them are available on request.
BIBLIOGRAPHY
1.
2.
3.
4.
Burtis A et al. Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3rd ed AACC 1999.
Kaplan A et al. Clin Chem The C.V. Mosby Co.1984.
Young DS. Effects of drugs on Clinical Lab. Tests, 4th ed AACC Press, 1995.
Young DS. Effects of disease on Clinical Lab. Tests, 4th ed AACC 2001.
PACKAGING
Ref.: 1001080
Cont.
.
R1: 5 x 10 mL, R2: 1 x 3 mL,
1  5 x 10 mL, CAL: 1 x 10 mL
R3:
SPINREACT,S.A./S.A.U. Ctra.Santa Coloma, 7 E-17176 SANT ESTEVE DE BAS (GI) SPAIN
Tel. +34 972 69 08 00 Fax +34 972 69 00 99. e-mail: [email protected]