UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
INSTITUTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
DISCIPLINA: INORGÂNICA AVANÇADA II
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
MALDI-TOF
Prof. Fabio da Silva Miranda
e-mail: [email protected]
Sala GQI 308, Ramal 2170
MALDI-MS
MALDI – matrix-assisted laser desorption ionization. Nesta técnica a
amostra é co-cristalizada com um composto orgânico (ex: ácido benzóico)
para formar uma matriz. Um laser no UV que é absorvido fortemente por
compostos orgânicos é focalizado sobre a matriz. Dessa forma íons
gerados tanto pela matriz tanto provenientes da matriz quanto da amostra e
são acelerados para o analisador de massas.
A técnica pode ser usada para produzir íons de grandes proteínas com
massa molecular relativa acima de 100.000,00.
Características do MALDI-TOF MS
•Ionização suave – analisa sem destruir biomoléculas e polímeros sintéticos;
•Faixa de massa grande;
•Misturas simples são facilmente analisadas;
•Relativamente tolerante a tampões e sais;
•Aquisição de dados rápida;
•Fácil de usar e manter, não é necessário o uso de água ou gases;
•Alta sensibilidade e boa resolução.
Esquema de funcionamento do MALDI
Representação esquemática dos processos desorção e ionização no MALDI
National High Magnetic Field Laboratory, FL, USA.
MALDI: Matrix Assisted Laser Desorption Ionization
Laser
Prato da amostra
1. Amostra (A) é misturada com o
excesso da matriz (M) e seco
sobre o prato de MALDI.
hn
2. Laser ionizar a matriz molecular.
3.
AH+
Moléculas da amostra são
ionizadas por transferência de
prótons da matriz:
MH+ + A → M + AH+.
Variable Ground
+20 kV
Grid
Grid
Prato praparação de amostras para MALDI
Analisador de massas por tempo de voo
Time-of-flight mass analyzer
Drift region (flight tube)
+
+
+
+
detector
Fonte
V
•Íons são formados em pulsos
•Os íons pequenos chegam primeiro ao detector
•Mede-se o tempo que o íon chega ao detector
Calibração da escala de massas
A razão massa/carga é proporcional ao quadrado do tempo de
deslocamento (drift time)
2
m 2t K
 2
z
L
t
=
Drift time
L
=
Drift length
m
=
Mass
K
=
Kinetic energy of ion
z
=
Number of charges on ion
Voyager-DE STR MALDI TOF
Sample
plate Extraction
grids
Attenuator
Prism
Laser
Reflector
Timed ion detector
selector
Reflector
Collision
cell
Camera
Pumping
Pumping
Linear
detector
MALDI TOF Hardware
Laser, Attenuator and Prism
Nitrogen laser at 337 nm, 3 ns wide pulses, 20 Hz.
Laser attenuator varies the intensity of the laser hitting the sample.
Prism deflects the laser beam into the ion source.
Sample Plate and Sample Stage
An accelerating voltage is applied to the sample plate in the range 15-25 kV.
Variable Voltage Grid
A grid 1-2 mm above the sample plate with an additional voltage to fine- tune
ion acceleration
Ground Grid
Grounded surface defines end of acceleration region
Grounded Aperture
Entrance to flight tube
MALDI TOF Hardware
Vacuum System
High vacuum is required to avoid ion collisions
Flight tube
A field free region where ions drift at a velocity inversely proportional to
the square root of their mass/charge.
Linear Detector
Measures the ion abundance in linear mode (no reflector used) and sends a
signal to the digitizer.
Microchannel Plate (MCP)
Exemplos de aplicação de MALDI-TOF
Analysis of the effect of OCT on MALDI signals from rat liver. (A) Procedure where OCT is
used to adhere the tissue to the sample stage but does not come into contact with the sliced
tissue. The resulting spectrum shows many intense signals between m/z 4500 and 10 500. (B)
The tissue was embedded in OCT and attached to the sample stage. The resulting spectrum
contains only about half of the signals as that in part A. Reprinted with permission from ref
95. Copyright 2003 Wiley Interscience.
Schwartz, S. A.; Reyzer, M. L.; Caprioli, R. M. J. Mass Spectrom. 2003, 38, 699.
Exemplos de aplicação de MALDI-TOF
Analysis of matrix crystallization
from solutions of different matrix
concentration.
Solutions
of
sinapinic
acid
in
50:50
acetonitrile/0.1% TFA in water at
concentrations of (A) 10 mg/mL,
(B) 20 mg/mL, and (C) saturated
(>30 mg/mL). The spectra
obtained from solutions spotted
on mouse liver tissue sections
showed that the greater the
concentration of matrix, the
greater the crystal coverage, and
the better the resulting mass
spectrum.
Reprinted
with
permission from ref 95. Copyright
2003 Wiley Interscience.
Exemplos de aplicação de MALDI-TOF
Analysis of matrix crystallization on
tissue. Comparison of three different
matrices, (A) SA, (B) DHB, and (C)
HCCA, at the concentration 20
mg/mL (in 50:50 acetonitrile/0.1%
TFA in water). SA and HCCA form
dense crystals on the tissue, while
DHB crystallizes on the rim of the
spot. Reprinted with permission from
ref 95. Copyright 2003 Wiley
Interscience.