Procedimento padronizado de operação do sistema
cromatográfico LaChrom®
(sctc / pcs / jlsc / mjf - May2001)
Sumário
(A) Inicializar o sistema LaChrom®
(B) Mudar ou criar aplicação
(1) na operação de rotina, ou seja, quando a aplicação tiver sido criada, para mudar a aplicação
(2) para criar uma nova aplicação
(3) Cadastrar a coluna de separação
(C) Habilitar o método
(1) quando existir o método operacional
(2) caso o método operacional não tenha sido criado
(D) Procedimento simplificado no desenvolvimento do método, ou seja, alterar um métodobase existente
(E) Procedimento 'passo a passo' no desenvolvimento do método (ou desenvolvimento do
método inicial)
(F) Editar o método de operação
(1) na primeira linha de ícones - definição dos parâmetros operacionais dos módulos
(2) na segunda linha de ícones - definição dos parâmetros relativos à análise
(G) Editar a tabela de amostra(s) (sample table) de trabalho
(H) Aquisição de dados
(I) Reprocessando a análise
(J) Desligar o sistema LaChrom®
(A)Inicializar o sistema LaChrom®
(1) ligar, sem seqüência específica, os módulos do sistema cromatográfico hplc
• solvent degasser L-7612,
• interface D-7000,
• column oven L-7300 / L-7351 / L-7360
• pump L-7100,
• autosampler L-7200 / L7250,
• detector UV/VIS L-7400, L-7420 ou DAD L-7455
• differential refractometer RI-71 ou L-7490, ou
• conductivity detector L-7470, ou
• amperometric detector L-3500A
(2) ligar o computador (cpu e monitor e impressora)
(3) verificar a indicação das seguintes inscrições ou eventos nos respectivos módulos:
• módulos L-7100, L-7200, L-7400
- ‘D-line system is not ready’
• forno L-7300
- ‘E5’
• forno L-7351 / L-7360
- ‘OFF’
• diode array detector L-7455 - led (verde) de operação da lâmpada de deutério
(4) verificar se a aplicação de trabalho já existe e se a coluna de separação já está cadastrada
seguindo o passo B)
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(5) Abrir o programa Multi-HSM Manager, escolher sistema 1 ou 2, clicar no ícone do 'System
Status' (i) e na opção INICIALIZE para inicializar os periféricos, assim liberando o painel de controle;
após a habilitação (idle) dos módulos do hardware, clicar 'OK'
(6) fazer o ambiente no sistema, por período mínimo que permita alcançar o equilíbrio, na
configuração e
componentes selecionados: eluente, coluna e parâmetros operacionais
(6a) Definir os canais a serem utilizados na bomba (A = FM, B = ACN C = MeOH e D = H2O) e
solução do “wash” do autosampler = FM s/ tampão
(6b) certificar-se de que o reservatório de descarte (geral e autosampler) está vazio
(6c) instalar a coluna situada no forno L-7300, lado direito do instrumento
(6d) purgar todos os canais da bomba c/ no mínimo 3 minutos para o canal da FM. Para efetuar a
purga, abrir a válvula de purga (sentido anti-horário), pressione MANUAL SET e entre até o fim da
linha com as respectivas concentraçãos (100% p/ o canal desejado e 0% p/ o restante), fluxo de
trabalho, pressão máxima e mínima e depois pressione PUMP ON/OFF e PURGE. Neste momento o
fluxo irá para 9.99ml/min., mude os canais a serem purgados pressionando diretamente as letras
respectivas no painel A, B C ou D. Após o término deste processo, desligue a purga pressionando
novamente PURGE e PUMP ON/OFF. Feche a válvula de purga (sentido horário) e ligue a bomba
PUMP ON/OFF para condicionar a coluna e o sistema com o fluxo e solvente de trabalho.
observação: a rinsagem da coluna emprega usualmente 10-20 vezes o volume 'void' da coluna (0,78
mL na coluna 125 x 4 mm e 1,57 mL na coluna 250 x 4 mm)
(6e) purgar o autosampler L-7200 pressionando a tecla WASH 3x
(6f) entre com a temperatura de trabalho no forno L-7300 pressionando SET MONIT e depois com as
setas ajuste o valor de no mínimo 5ºC acima do ambiente.
(7) configurar a impressora, clicando 'print setup' no file, selecionar o 'tamanho de papel': A4 (210 x
297 mmm),
selecionar no ícone propriedades a qualidade requerida para a impressão (p.ex. 'econofast') e clicar
'OK'
(B)Mudar (no 'change aplication') ou criar aplicação (no 'HSM
administrator')
(1) na operação de rotina, ou seja, quando a aplicação estiver criada, para mudar a aplicação:
(1a) selecionar sistema 1 ou 2 e clicar no ícone - 'change aplication' (ícone das gavetas)
(1b) escolher a aplicação pretendida e clicar ‘SELECT’
(2) para criar uma nova aplicação:
(2a) fechar a tela do Multi-HSM Manager
(2b) clicar no ícone HSM Administration para abrir o aplicativo
(2c) selecionar sistema 1 ou 2 e clicar no ícone - 'aplication setup' (ícone das gavetas)
(2d) no campo 'application name' criar nova aplicação, nominando a aplicação pretendida
(2e) no campo 'new subdirectory' criar subdiretório específico, mantendo se possível (por
racionalidade),
o mesmo nome para a análise ou série pretendida
(2f) clicar o ícone 'CREATE'
(2g) clicar o ícone 'CLOSE'
(3) Adicione a coluna de separação no banco de colunas
(3a) selecionar sistema 1 ou 2, clicar no ícone ‘Single Instrument Setup’ e no botão ‘ADD’
(3b) digite o nome da coluna e o número de série nos respectivos campos ‘Model Name’ e ‘Serial
Number’
(3c) clicar em ‘OK’, ‘OK’ e feche o aplicativo HSM Administration
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(C)Para habilitar o método, clicar no ícone ‘method setup’ (ícone da
seqüência de folhas)
(1) verificar se o método existe (se método e aplicação pretendidas aparecem marcados nos
campos
'method name' e 'application', clicar 'cancel'
(2) caso não existir método operacional criado
• selecionar no campo ‘application’ a aplicação desejada, nisto se apresentarão duas
possibilidades:
(2a) os métodos desenvolvidos estão dispostos no campo 'method name'
(2b) caso não existir método desenvolvido na aplicação pretendida o campo 'method name'
estará vazio
(3) assim, a criação de método pode seguir dois procedimentos:
(3a) procedimento simplificado, seguir para o ítem (D)
(3b) procedimento 'passo a passo' (ou desenvolvimento do método inicial),
nesta hipótese seguir diretamente para o ítem (E)
(D)Procedimento simplificado, ou seja, alterar um método-base
existente
(que apresente características próximas ao método pretendido)
? (1) na tela 'open file' selecionar o método pretendido e clicar 'OK'
? (1) no ícone 'file' na tela 'open file' selecionar no campo 'application' a aplicação pretendida e os
métodos desenvolvidos nesta aplicação se apresentarão no campo 'method name'
(2) selecionar o método pretendido, clicar 'OK' e se abrirá a tela do método selecionado, a ser
modificado
(3) clicar na opção 'File' e selecionar salvar como 'Save Method As', nisto se apresentará a subtela
'save as',
na qual se farão:
(3a) no campo 'name': nominar o novo método em desenvolvimento
(3b) no campo 'application': selecionar a aplicação pretendida
(3c) caso necessário, preencher o campo 'comment'
(3d) clicar 'OK', nesta operação a tela do método selecionado mostra sua nova denominação
(E) Procedimento 'passo a passo' (ou desenvolvimento do método
inicial)
(1) no ícone 'FILE' clicar 'NEW', nisto se apresentará a tela 'novo' e nela selecionar 'METHOD' e
clicar 'OK'
(2) assim, se apresentará a tela do método referencial do sistema
(F) Editar o método de operação
(1) na primeira linha de ícones - definição dos parâmetros operacionais dos módulos
(1a) no ícone ‘method configuration’ (ícone computador conectado aos módulos),
definir a configuração a ser aplicada na análise:
• interface D-7000
• detector ch1 L-7400 ou L-7455
• forno L-7300
• autosampler L-7200
• bomba A L-7100
• gradiente mode low para quando for utilizar mais de um canal
• selecionar a coluna
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e clicar no ‘update method’ (ícone da torre)
(1b) no ícone ‘method information’ (ícone com i)
• no campo 'description' descrever características do método em desenvolvimento
• preencher o campo 'developed by'
• nos campos 'solvent names' denominar os eluentes A, B, C, D
clicar no ‘update method’ (ícone da torre)
(1c) no ícone ‘pump setup’ (ícone da bomba)
• no campo 'pressure limit', definir os valores ‘min’ e ‘max’ da pressão operacional prevista
• editar o modo operacional em regime isocrático ou gradiente, com os respectivos solventes e
vazões
clicar no ‘update method’ (ícone da torre)
observação: em função da notação das unidades adotadas, os valores introduzidos no delineamento
do método, para o tempo (10,0 min) e vazão (0,8 mL / min), são expressos em valores decimais,
separados por vírgula (ou ponto)
(1d) no icone “autosampler” não é necessário alterar nehuma opção
(1e) no ícone ‘column oven setut’ (ícone com termômetro - forno)
• definir os limites de temperatura de operação com valores ‘max’ e 'nominal' (em °C)
clicar no ‘update method’ (ícone da torre)
(1f) no ícone ‘channel 1 detector setup’ (ícone do olho)
• definir os parâmetros do primeiro detector para os campos: ‘stop time’ ‘spectra’, ‘wavelength’,
‘absorbance’, ‘time’, ‘autozero’ e Response Time = 0,5s
clicar no ‘update method’ (ícone da torre)
(1g) no ícone ‘event signal setup’
• definir eventuais necessidades
clicar no ‘update method’ (ícone da torre)
(1h) no ícone ‘time summary’
• verificar o perfil evolutivo do regime de operação desenhado para o sistema de bombeamento
(2) na segunda linha de ícones - definição dos parâmetros relativos à análise
(2a) nos ícones dos canais (1 e 2)
• se apresentará definido o canal em uso
(2b) no ícone ‘calculation method’ (ícone da calculadora)
• definir os parâmetros nos campos: ‘quantitation’, ‘identification’ (time absolute), ‘data options’
e 'calibration'
clicar no ‘update method’ (ícone da torre)
(2c) no ícone ‘component table’ (ícone da frasco)
• definir os parâmetros nos campos: ‘retention time (RT)’, ‘window’ , 'name' e ‘func1’
clicar no ‘update method’ (ícone da torre)
(2d) no ícone ‘concentration table’ (ícone do frasco)
• escolher a unidade de concentração , entrar c/ os respectivos valores Std1 a Std20 para
todoso os componentes a serem quantificados
clicar no ‘update method’ (ícone da torre)
(2e) no ícone ‘integration table’ (ícone do solstício)
• definir inicialmente os valores referenciais: noise:
10
smoothing: OFF
sensitivity: 20
N-Method: 0
após definir as quatro primeiras funções indicadas, rever outros atributos mascarados, clicando na
quinta linha e definir os parâmetros necessários, com seus respectivos início e término ('on' e 'off'),
em função da integração pretendida
clicar no ‘update method’ (ícone da torre)
(2f) no ícone ‘DAD data processing’
• definir as opções ofertadas: como ‘peak purity check’, ‘peak-top spectrum integration’ e
• no campo chromatograms to create, definir o sistema apropriado de detecção
clicar no ‘update method’ (ícone da torre)
(2g) no ícone ‘Chromatogram display format’
• definir as escalas dos eixos de coordenadas: ‘vertical axis scale’ e ‘horizontal axis scale’
• definir sempre as opções: ‘auto zero’ e ‘full scale’ e ‘peak labels’
clicar no ‘update method’ (ícone da torre)
(2h) no ícone ‘DAD display format’
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• compatibilizar com os dados do ‘detector setup’ com os indicados no campo ‘display format’
• no campo 'display format' selecionar valor apropriado na 'absorbance scale'
clicar no ‘update method’ (ícone da torre)
(2i) no icone ‘Confidence Report’
• abilitar o System Suitability Test e escolher as funções e tolerâncias desejadas
• abilitar o ‘Module Performance Test’ e as opções ‘Print Pressure/Temperature profile’ e
programar os critérios de alarme ‘Criteria for Warning’
(2j) no ícone ‘Channel 1 report format’
• remover a opção print primary, escolher a opção ‘identified only’, escolher a unidade
concentração ‘CONC1’ ou ‘other’ para ter acesso aos campos de ‘nome’, ‘scale factor’ e ‘divide by
sample amount’. Em ‘column header’ defina a seguinte sequência: PK NUM, RT, AREA, CONC1 e
NAME. Escolha em ‘Export Repor’ CBM31REC.EXE p/ reprocess.
Escolha o formato do relatório em ‘repot layout’ – ‘edit primary’ – OK – FILE – LOAD – ROTINA – SIM
– OK – CLOSE.
(2k) fechar o método desenvolvido, clicando no (x) e aparecerá a subtela HSM: com a questão:
'salvar
alterações ? '
(2l) confirmar as alterações, e aparecerá a nova subtela 'save', onde poderão ser introduzidos
comentários no
campo 'comment', clicar 'OK'
(2m) ao concluir estas operações, o método desenvolvido estará habilitado no sistema
(G) Editar a tabela de amostra(s) (sample table) de trabalho
(1) no ícone ‘Sampler Setup’ (icone da bandeja verde)
(1a) no campo 'sample table name' dentre as tabelas desenvolvidas, selecionar a tabela pretendida e
clicar 'OK',
nisto aparecerá a janela contendo a tabela selecionada
(1b) alterar os campos: 'vial', 'volume', 'inj per vial', 'type', 'sample name' e se necessário o 'method
name' . Utilizar os comandos ‘clear to table’ e ‘append to table’ para refazer a sequência.
(1c) clicar em campos das linhas inferiores da tabela (em campos distintos do definido) para salvar os
elementos digitados
(1d) fechar a tabela e salvar
(2) caso não existir a tabela de amostra(s)
(2a) File – New - Sampler Table - OK
(2b) defina as característica da bandeja em rack parameters – STD ou L-7250 - OK
(2c) defina todos os campos pertinentes a esta sequência e pressione ‘append to table’
(2d) alterne para a tela ‘edit table’ e redefina os parâmetros necessários tais como sample name,
sample amount, vial, method, etc.
(2e) fechar a tabela e salvar
OBS.: Para facilitar o preparo da bandeja, após a rpogramação da sequência de injeção, o usuário
poderá imprimi-la: No sample table na tela ‘Edit Table’, clicar em ‘File’ e ‘Print’
(H) Aquisição de dados
(1)abrir o ícone ‘Acquire Data’, e aparecerão as tabelas desenvolvidas
(1a) selecionar o ‘sample table’ onde serão armazenados os dados da análise e clicar ‘OK’
antes de iniciar a operação via ‘start run’ ou ‘start series’,
• ligar o módulo L-7100 pump, pressionando o botão 'pump on / off' (se necessário)
• aguardar o condicionamento do sistema nas condições especificadas no método
desenvolvido;
p.ex. ambiente na coluna,
• clicar ‘start run / series’, para iniciar a análise cromatográfica, nisto se apresentará a
tela ‘baseline test’. Durante um minuto o sistema avaliará o valor do noise, e se este estiver abaixo do
valor especificado no sample table, a sequência prosseguirá 'para o status ‘waiting for injetion'.
Ao término da(s) análise(s), relacionada(s) na 'sample table', aparecerá a tela 'Idle' e a opção
‘Monitor’
• clicar o úlitmo ícone (x) do 'data acquisition monitor - para fechar a tela,
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• clicar o último ícone (x) do sample table name para fechar e salvar a tabela da aquisição de
dados.
OBS.: Após o inicio de uma sequência, a opção ‘Sleep / Wakup’ estará disponível para ser habilitada
! Está opção permite ao usuário que programe o sistema para se Auto-desligar e Auto-ligar.
(I) Reprocessando a análise
(1)abrir o ícone ‘Reprocess Data’, e aparecerão os números das corridas efetuadas
Selecione uma delas, visualize através do ‘display’, defina os parâmentros necessários e pressione
‘recalculate’ p/ recalcular.
Utilize o ‘modify report’ para visualizar o resultado.
Caso seje necessário alterar alguma informação na tabela de injeção, pressione ‘edit’, efetue as
alterações e depois pressione ‘save’ e ‘recalculate’.
(J) Desligar o sistema LaChrom®
(1)Feche o Multi-HSM Manager ou efetue a desconexão através do botão (i) e depois ‘Disconnect’.
Desligar, sem seqüência específica, os módulos do sistema cromatográfico hplc
• solvent degasser L-7612,
• interface D-7000,
• column oven L-7300, e
• pump L-7100,
• diode array detector L-7455, ou
• differential refractometer RI-71 ou L-7490, ou
• conductivity detector L-7470, ou
• amperometric detector L-3500A
(2) clicar o último ícone (x) da tela do Multi-HSM Manager
(3) desligar o computador via 'shut down'
(4) aguardar a indicação de desligar o computador e desligar o monitor
OBS.: Ao religar a máquina, o usuário deve sempre purgar a linha ‘A’ com H2O antes de iniciar um
novo trabalho !
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