Estudo da viabilidade da cultura de condrócitos humanos
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ARTIGO ORIGINAL
Estudo da viabilidade da cultura de condrócitos humanos visando
aplicação clínica para o transplante autólogo*
Study on human chondrocyte culture viability for autologous transplantation in clinical
application
Christiane Lombello 1 , Geraldo Marins dos Reis Jr 2 , Moisés Cohen 3
ABSTRACT
Objective: The limited regenerative capacity of the cartilage tissue
makes the treatment of chondral lesions difficult. The techniques
currently available to treat cartilage lesions may relieve symptoms,
but do not regenerate the injured tissue. Autologous chondrocyte
transplantation uses cell biology and cell culture techniques to
regenerate the hyaline cartilage. Methods: In this study, we analyze
chondrocyte biopsy collection and culture for autologous
transplantation. Ultrastructural analyses of hyaline cartilage biopsies
were performed 0, 6, 24 and 48 hours after collection. The tissue even
after 48 hours. Eleven cell culture assays were performed to evaluate
isolation, viability, morphology, proliferation and absence of
contaminants. Results: The cell culture techniques used allowed
chondrocyte proliferation. Rates on cell viability were maintained above
the acceptable patterns (above 90). Control of cell culture laboratory
conditions showed absence of contaminants, assuring safety of the
process. The chondrocytes obtained presented the morphology typical
of cultured cell monolayers. Conclusion: The results indicate viability
of chondrocyte culture technique for clinical application in autologous
transplantation.
Keywords: Cell culture; Chondrocytes/transplantation; Transplantation,
autologous/methods; Cartilage
RESUMO
Objetivo: A baixa capacidade regenerativa do tecido cartilaginoso
dificulta o tratamento das lesões condrais. As técnicas disponíveis
atualmente para o tratamento de lesões de cartilagem articular
podem resultar em alívio dos sintomas, mas não na regeneração
do tecido lesado. O transplante autólogo de condrócitos utiliza
técnicas de biologia celular e cultura de células para a regeneração
da cartilagem hialina. Neste trabalho procuramos analisar a cultura
de condrócitos visando o transplante autólogo. Métodos: Foram
realizados 11 experimentos de cultura celular para avaliar os dados
de isolamento, viabilidade, morfologia, proliferação e ausência de
contaminantes. As condições de cultura celular utilizadas
permitiram a proliferação dos condrócitos. As taxas de viabilidade
celular se mantiveram acima de 90%. Resultados: O controle das
condições do laboratório de cultura celular demonstrou a ausência
de contaminantes, garantindo a segurança do processamento. As
células obtidas apresentaram morfologia típica de condrócitos
cultivados em monocamada. Conclusão: Os resultados obtidos
indicam a viabilidade da técnica de cultura de condrócitos para a
aplicação clínica na técnica de transplante autólogo.
Descritores: Cultura de células; Condrócitos; Transplante autólogo/
métodos; Cartilagem
INTRODUÇÃO
A nutrição do tecido cartilaginoso das superfícies
articulares é realizada por meio da difusão de
substâncias encontradas no líquido sinovial. Os
condrócitos presentes no tecido são altamente
especializados e sua principal função é conferir as
propriedades biomecânicas, pela síntese dos componentes da matriz extracelular. Na cartilagem articular
estão presentes proteoglicanos, principalmente o
agregan, e colágeno tipo II preferencialmente. O
estado diferenciado dos condrócitos e mesmo a
ausência de vascularização do tecido dificultam o
reparo de lesões condrais.
O reparo tecidual das lesões condrais se baseia em
técnicas cirúrgicas cujo princípio é o preenchimento
da lesão com células mesenquimais provenientes da
medula óssea subcondral, como abrasão, perfurações
e microfraturas. No entanto, as lesões são preenchidas
por tecido fibroso, ou fibrocartilagem, com carac-
*Trabalho realizado no Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo/SP, em parceria com o Laboratório Biológica, Campinas /SP, e Departamento de Ortopedia e Traumatologia da Unifesp/EPM (SP).
1
Doutora em Biologia Celular e Estrutural pela Universidade Estadual de Campinas (SP).
2
Mestre em Engenharia Biomédica pela Universidade Estadual de Campinas (SP).
3
Professor Livre-docente, Chefe do Centro de Traumatologia do Esporte da Disciplina de Traumatologia do Departamento de Ortopedia e Traumatologia da Universidade Federal de São Paulo - Unifesp/EPM (SP).
Endereço de correspondência: Christiane Lombello - R. Perez Y Marin, 81 - Guanabara - CEP 13020-250 - Campinas (SP) - e-mail- [email protected]
Recebido em 1 de julho de 2003 – Aceito em 22 de outubro de 2003
einstein 2003; 1:84-8
einstein 2003; 1:84-8
Estudo da viabilidade da cultura de condrócitos humanos
terísticas distintas da cartilagem hialina originalmente
presente. Nesse tecido de reparação, há a predominância na matriz extracelular de colágeno tipo I. O
transplante autólogo de condrócitos tem sido utilizado
como alternativa biotecnológica para o tratamento de
lesões condrais resultantes de trauma agudo ou
repetitivo e que não responderam a tratamentos
anteriores, cirúrgicos ou não (1-4).
O transplante autólogo de condrócitos é uma técnica
que visa a regeneração da cartilagem hialina,
restaurando a função da superfície articular. Esta
técnica vem sendo estudada desde o final da década
de 1980 (5-6). Em 1994, um grupo da Universidade de
Gotemburgo e do Hospital Universitário apresentou
um estudo piloto com 23 pacientes submetidos a esta
técnica para o tratamento de lesões cartilaginosas (7) .
Destes, 16 pacientes apresentavam lesões no côndilo
femoral e sete lesões patelares. Acompanharam-se os
casos por até dois anos, tendo sido constatada
recuperação boa ou excelente em 14 dos 16 com lesão
no côndilo femoral. Realizaram-se biópsias em 15
pacientes, tendo-se constatado a presença de
cartilagem hialina semelhante ao tecido original em
11 destes casos.
Outros relatos científicos foram publicados a partir
de então (8-11). O aprimoramento da técnica envolve a
suplementação das culturas celulares com fatores de
crescimento (12), o uso de biomateriais(13-14) e a aplicação
de sistemas de biorreatores para a produção de tecido
cartilaginoso in vitro (15) .
A técnica de transplante autólogo de condrócitos para
regeneração de cartilagem articular (Figura 1) consta
da retirada de uma amostra de cartilagem normal em
uma região de pouca carga da articulação. Esta biópsia
é devidamente acondicionada e enviada para o
laboratório de cultura celular, onde será realizada a
digestão enzimática do tecido para o isolamento e
cultivo celulares(16-17). Após um período de 30 a 40 dias
é preparada uma suspensão dos condrócitos cultivados.
A injeção da suspensão celular envolve o desbridamento da lesão condral, a cobertura da lesão com
uma camada de periósteo, normalmente retirado da
tíbia, e a injeção da suspensão celular entre a cobertura
de periósteo e o osso subcondral(8).
Os condrócitos transplantados têm a capacidade de se
reorganizar para a produção de matriz hialina,
regenerando o tecido com as mesmas características
da cartilagem hialina original. Observa-se uma
completa integração do tecido recém-formado,
preenchendo todo o sítio da lesão alinhado às áreas
adjacentes (7) . Nas primeiras oito semanas após o
transplante este já está preenchido, em média, em
71%, sendo a natureza do tecido basicamente hialina,
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com a formação de grupamentos celulares e predominância de colágeno tipo II (8).
No presente trabalho, procuramos o aprimoramento
da técnica de cultura celular visando o transplante
autólogo de condrócitos, avaliando os aspectos de
preservação, proliferação e morfologia celulares.
MÉTODOS
Coleta das Biópsias
Obtiveram-se amostras de cartilagem articular de nove
pacientes, seis homens e três mulheres, com idades entre
23 e 66 anos (média de 48 anos). Duas amostras foram
submetidas à digestão enzimática em dias diferentes,
contabilizando um total de 11 culturas celulares. Os
pacientes foram submetidos a artroscopia por diversas
causas. As amostras de cartilagem foram coletadas, com
prévia autorização dos pacientes, em meio de cultura
segundo o protocolo descrito anteriormente(7). Para o
transporte das amostras de cartilagem foram utilizados
recipientes térmicos permitindo a manutenção da
temperatura entre 4ºC e 8ºC.
Isolamento dos Condrócitos
Onze amostras de cartilagem articular foram
transportadas até o laboratório de cultura, onde foram
submetidas ao processo de digestão enzimática para o
isolamento das células, segundo o protocolo de Archer
e colaboradores (16).
Cultura dos Condrócitos
As células provenientes das digestões enzimáticas
foram então cultivadas em frascos de cultura na
presença de meio HAMF12 contendo 1% de penicilina/
estreptomicina e 10% de soro fetal bovino, por
períodos de até 40 dias, com duas ou três trocas
semanais de meio. O repique das células foi realizado
sempre que necessário.
Contagem e Viabilidade Celulares
Realizaram-se contagens para o número total de células
e a porcentagem de células viáveis, logo após o
isolamento das células e ao término das culturas,
utilizando o corante vital Azul de Tripan, em câmara
hemocitométrica.
Análises Morfológicas
Análises morfológicas das células foram realizadas
rotineiramente utilizando microscopia de fase em
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Lombello C, Reis Jr GM, Cohen M
microscópio invertido (Olympus IX-50). As culturas
foram fotografadas periodicamente para os registros
de morfologia celular.
Análises Microbiológicas
Algumas das culturas celulares foram amostradas para
os testes de contaminação microbiológica. Testes para
a presença de bactérias, fungos e micoplasmas foram
realizados segundo as normas ISO 11737-1, 5TH Ed.
1995 e USP XXIII/NF XVIII, 1995.
RESULTADOS
Isolamento dos Condrócitos
Obtiveram-se condrócitos isolados das amostras de
cartilagem articular pesando entre 102 mg e 417 mg
(média de 255 mg), resultando em uma média de
140.560 condrócitos em 100 mg de tecido (Tabela 1).
Tabela 1. Acompanhamento das culturas celulares a partir da biópsia do
tecido cartilaginoso. São demonstrados os valores de peso das biópsias,
contagens celulares e viabilidades inicial e final, bem como o tempo
transcorrido até a fase final da cultura.
Peso da
Número Inicial Viabilidade Dias de
Biópsia (mg) de Células
Inicial (%) Cultura
Número Final
de Células
Viabilidade
Final (%)
154
100,000
100
28
6,000,000
—
294
11,000
50
33
1,000,000
—
514
53,000
—
31
11,000,000
—
310
84,000
—
13
18,000,000
95
292
93,000
100
27
3,000,000
94
184
41,000
90
56
9,500,000
93
224
245,000
96
25
10,000,000
—
417
135,000
96
24
3,300,000
—
102
153,000
93
36
1,200,000
94
400
85,000
96
42
18,800,000
96
300
73,000
98
—
—
—
Os condrócitos recém-isolados apresentavam morfologia arredondada, característica destas células.
Realizaram-se contagens para viabilidade celular nas
11 amostras, apresentando valores sempre superiores
a 90% (Tabela 1).
Cultura dos Condrócitos
Os condrócitos foram mantidos em cultura por
períodos entre 13 e 56 dias para a obtenção de pelo
menos um milhão de células, resultando em uma média
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de 31,5 dias de cultura. Para o encerramento das
culturas procedeu-se à contagem do número total de
células e sua viabilidade. Os valores obtidos para a
viabilidade celular foram superiores a 90%. Os valores
obtidos para o número final de células, variando entre
1.200.000 e 18.800.000 células, resultando em uma
média de 8.500.000 células, ou seja, um aumento de
23,7 vezes o número celular inicial (Tabela 1).
Análises Morfológicas
Os processos de adesão e espalhamento celulares sobre
a superfície de polipropileno durante a cultura celular
resultaram na alteração da forma arredondada
característica dos condrócitos. Decorridos três a cinco
dias em cultura foi possível observar condrócitos
achatados e espalhados, com morfologia típica de
fibroblastos (Figura 2). A presença de figuras de divisão
celular nas culturas foi observada com freqüência
(Figura 2D). Apesar da morfologia alongada não
foram observados sinais evidentes de degeneração ou
apoptose celulares, dados comprovados pela contagem
final da viabilidade celular.
Análises Microbiológicas
Toda as análises microbiológicas realizadas nas culturas
celulares apresentaram resultados negativos, traduzindo a ausência de bactérias, fungos ou micoplasmas
nestas culturas.
DISCUSSÃO
Técnicas cirúrgicas que procuram obter o reparo
tecidual se baseiam no princípio de preencher a lesão
com células mesenquimais provenientes da medula
óssea, como as técnicas de abrasão, perfurações e
microfraturas. Todavia, as células que preenchem a
lesão condral sintetizam tecido fibroso, ou fibrocartilagem, com constituição e propriedades distintas
do tecido hialino originalmente presente. Nesse caso,
há o predomínio de colágeno tipo I na matriz
extracelular. Para o paciente, a presença de tecido
fibroso pode resultar em dores e limitação de movimento a longo prazo. Para a formação de cartilagem
articular hialina semelhante à original, o transplante
autólogo de condrócitos constitui uma alternativa para
o tratamento de lesões condrais resultantes de trauma
agudo ou repetitivo e que não responderam a
tratamentos anteriores, cirúrgicos ou não(5-11).
Testamos em nosso laboratório as condições de
processamento das biópsias cartilaginosas e as fases
da cultura dos condrócitos, visando a proliferação
celular. Obtivemos fragmentos de cartilagem do
côndilo femoral de diferentes proporções e regiões,
Estudo da viabilidade da cultura de condrócitos humanos
A. Retirada de biópsia
de cartilagem articular.
C. Desbridamenteo
da lesão condral.
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B. Fase laboratorial para o isolamento, cultura e
proliferação dos condrócitos.
D. Retirada de
periósteo para
cobertura da
lesão condral.
E. Injeção da
suspensão celular
sob a cobertura de
periósteo.
Figura 1. Transplante autólogo de condrócitos para a regeneração da cartilagem articular. Primeiramente é retirada
uma biópsia de cartilagem de uma região não submetida a carga da articulação (A), em seguida a biópsia é
transportada para o laboratório de cultura celular, onde é realizado o isolamento e cultivo dos condrócitos (B). A
suspensão celular resultante deste processo é enviada para o transplante. A área da lesão deve ser desbridada (C),
e recoberta com periósteo (D) para a injeção da suspensão celular (E).
A
B
C
D
Figura 2. Microscopia de fase. (A). Podem ser observados condrócitos recém-isolados apresentando morfologia
arredondada característica. (B) Cultura em monocamada semiconfluente, 8 dias de cultivo. (C) Cultura em
monocamada confluente, 33 dias de cultivo. (D). Divisão celular com 35 dias de cultivo. Barra: 100υ m.
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Lombello C, Reis Jr GM, Cohen M
sendo que nossas observações expressam a realidade
clínica, não sendo possível padronizar a coleta de
material. Mesmo assim limitamos nossas coletas ao
côndilo femoral, preservando sempre o osso subcondral.
O processo de isolamento das células mostrou-se
eficiente, permitindo a obtenção de um grande
número de células por 100 mg de tecido. É importante
a obtenção de um número mínimo de células para o
início das culturas, uma vez que, visando o transplante
autólogo, contamos com uma grande proporção de
aumento celular em poucas passagens de cultura,
visando preservar as características celulares e evitando
apoptose. Sabemos que após algumas passagens sem
cultura as células podem entrar no processo de morte
celular e todo o processo de cultivo foi realizado
respeitando este limite. As condições de cultivo celular,
como a suplementação com soro fetal bovino,
garantiram alta taxa de proliferação celular, permitindo
a obtenção do número mínimo de 1.000.000 de células,
sempre com viabilidade celular superior ao limite de
85%, descrito na literatura(7).
A morfologia dos condrócitos em cultura traduz o
estado diferenciado das células, condizente com a
função proliferativa das culturas (18-20) . Condrócitos
cultivados em monocamadas por algumas passagens
adquirem morfologia achatada e apresentam alta taxa
proliferativa. A morfologia celular está diretamente
ligada à síntese protéica. Neste estado diferenciado as
células passam a produzir colágeno tipo I preferencialmente, substituindo a síntese de colágeno tipo
II, característico da cartilagem hialina. Após algumas
passagens é possível restabelecer o fenótipo normal
dos condrócitos desde que haja condições ideais para
que ocorra a rediferenciação celular (21-23). No caso do
transplante autólogo de condrócitos, o fato das células
serem implantadas em substrato hialino, com a
presença de matriz extracelular característica, atua
como sinal de diferenciação celular. Uma vez
implantados, os condrócitos têm a capacidade de
expressar seu fenótipo normal, sintetizando matriz
extracelular. Não observamos intensa síntese de matriz
extracelular em nossas culturas, pois a finalidade era
obter alta taxa proliferativa das células.
A ausência de contaminantes em todas as culturas
testadas (de acordo com as exigências do controle de
qualidade dos órgãos competentes) permitiu comprovar a segurança das condições de trabalho.
Os resultados obtidos neste estudo permitiram
avaliar as condições de processamento das biópsias para
a obtenção dos condrócitos e as condições de cultura
visando a proliferação celular. Pudemos concluir que o
cultivo de condrócitos para o transplante autólogo em
nosso meio é uma técnica possível, viável e segura para
aplicação clínica, como técnica cirúrgica de regeneração
da cartilagem articular.
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