Marina Mori Pires de Camargo
Biomarcadores funcionais de curimbas,
Prochilodus lineatus, submetidos a testes in
situ no alto ribeirão Cambé, Londrina, PR.
Londrina
2002
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Biomarcadores funcionais de curimbas, Prochilodus lineatus, submetidos a testes
in situ no alto ribeirão Cambé, Londrina, PR. (Monografia de Bacharelado em
Ciências Biológicas) de autoria de CAMARGO, M. M. P. e MARTINEZ, C. B. R.
Universidade Estadual de Londrina, PR.
RESUMO
O Ribeirão Cambé é um dos principais cursos d’água da cidade de Londrina, Paraná. Ele
atravessa grande parte da área urbana, recebendo descarga de esgotos domésticos e
efluentes industriais, fato esse que tem contribuído para a alteração da qualidade de suas
águas. Testes in situ com peixes têm-se mostrado muito eficientes na avaliação da
qualidade da água de locais impactados e o uso do curimba (Prochilodus lineatus) é
bastante indicado por se tratar de uma espécie detritívora, neotropical e bastante sensível
a contaminantes. O objetivo desse trabalho foi verificar parâmetros funcionais de
curimbas submetidos a testes in situ em diferentes pontos ao longo do alto ribeirão
Cambé e comparar com os mesmos parâmetros de peixes submetidos a testes in situ em
um ribeirão menos impactado. Para isso, curimbas jovens foram mantidos em gaiolas de
PVC revestidas com tela, em quatro pontos no alto Ribeirão Cambé (Pontos A, B, C e D)
e em um local de referência, no Ribeirão dos Apertados, localizado no Parque Estadual
da Mata dos Godoy. Os testes foram realizados durante o inverno de 2002 (entre os
meses de agosto e setembro). Após uma semana (168 h) de confinamento os peixes
foram cuidadosamente retirados da gaiola e anestesiados com benzocaína para a coleta
de sangue, a partir da veia caudal, e do fígado. Foram feitas análises do conteúdo de
hemoglobina, concentração de glicose, proteínas, lipídeos totais e íons plasmáticos
(sódio, potássio e cloreto) além da atividade hepática das enzimas glutationa transferase
e catalase. Os resultados foram comparados entre os pontos e com o local de referência.
Os valores de hemoglobina e lipídeos totais dos animais testados não variaram entre os
pontos. A concentração de glicose apresentou os maiores valores no Ponto A e a
concentração de proteína no plasma foi significativamente menor nos pontos do ribeirão
Cambé em relação ao local de referência. Os valores de sódio foram significativamente
maiores na referência e no Ponto D, sendo que os maiores valores de potássio foram
encontrados nos animais confinados nos Pontos A e D. O íon cloreto não apresentou
diferenças significativas entre os pontos. O ponto D apresentou o maior valor de atividade
da glutationa transferase e o menor de catalase em relação aos demais pontos. Os
parâmetros avaliados mostraram-se eficientes como biomarcadores, já que indicaram que
os animais submetidos aos testes apresentaram alterações funcionais, o que pode ser
decorrente do comprometimento da água nesses pontos do Ribeirão Cambé.
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1 INTRODUÇÃO
A humanidade viveu por muito tempo com a idéia equivocada de que a
água era um recurso praticamente inesgotável e que a natureza por si só era capaz de
regenerá-lo. Esta visão acarretou diversos problemas à sociedade atual, como o
crescimento desordenado de nossas cidades, sem que qualquer cuidado tenha sido
tomado em relação aos rios, que consequentemente ficaram comprometidos com a
poluição. Sendo mantida esta atitude inconseqüente em relação aos rios, uma demanda
de água superior à disponibilidade acabará acontecendo, ou seja, haverá um consumo
maior de água na indústria, irrigação e abastecimento público do que os rios podem
fornecer.
Para evitar conflitos futuros, é necessária uma nova postura em relação
aos recursos hídricos, e isso inclui educação ambiental e monitoramento da qualidade das
águas por entidades competentes.
A qualidade da água é resultante das condições naturais da bacia
hidrográfica e das atividades humanas desenvolvidas nessa região. As condições
naturais, como estrutura do solo e cobertura vegetal, são importantes na retenção da
água da chuva e de partículas que possam escoar para o manancial, diminuindo assim,
os efeitos poluentes.
A ocupação da área da bacia hidrográfica e o uso que a população faz
dela (atividades poluidoras, uso de defensivos agrícolas e criação de animais) são
determinantes para o comprometimento ou não do local (CONDINI, 1998).
A cidade de Londrina possui uma rede hidrográfica bastante considerável,
sendo composta por 73 córregos e 8 ribeirões que se distribuem por 5 micro-bacias
hidrográficas (FOLHA DE LONDRINA, 1999). Destas, a bacia do Ribeirão Cambé é tida
como a mais importante, já que atravessa praticamente toda a área urbana da cidade,
sendo muito utilizada para o lazer e suprimento de água da população.
Exatamente por isso, a bacia do Ribeirão Cambé tem sido muito
degradada pela ação do homem, recebendo despejos domésticos e industriais, efluentes
agrícolas e lixo de toda espécie, além de ter tido praticamente toda sua mata ciliar retirada
para dar lugar a construções e ruas. Tudo isso somado ao crescimento desordenado da
cidade e à falta de cuidado da população, gerou uma situação bastante estressante
principalmente aos peixes e outros organismos aquáticos que habitam essas águas.
Estresse pode ser definido de várias formas, mas em termos fisiológicos
inclui todas as respostas que o animal apresenta em decorrência de mudanças em seu
4
ambiente natural (ADAMS, 1990). Estas respostas podem ter como objetivo a
manutenção ou o restabelecimento de sua homeostase face às mudanças físicas e/ou
químicas que estejam comprometendo sua sobrevivência em determinado local.
Alterações severas no ambiente podem causar a morte quase que
instantânea dos organismos do local. Da mesma forma, exposições prolongadas a
poluentes podem acarretar problemas que, mesmo não causando a morte do animal,
prejudicam o bom funcionamento de seu organismo. Já exposições aos xenobióticos1 em
doses subletais ou por períodos mais curtos, tendem a afetar, em longo prazo, o
crescimento, a reprodução e a resistência à doenças do animal, ocasionando sérias
conseqüências para a sobrevivência da população (JOBLING, 1995).
Os peixes, por serem animais essencialmente aquáticos, são bons
indicadores da qualidade da água. Um rio só é considerado em condições satisfatórias se
nele viverem e proliferarem peixes, sendo importante lembrar que a simples presença de
indivíduos adultos não contaminados não implica que o ambiente em questão esteja livre
de poluição. É necessário que a água do local permita a reprodução, alimentação e
crescimento de larvas e juvenis (BRANCO, 1983).
Como normalmente a poluição dos rios ocorre com concentrações
crônicas e subletais de poluentes, identifica-se mais comumente alterações estruturais e
funcionais nos peixes do que mortandade em massa dos organismos. Portanto, o uso de
parâmetros bioquímicos e fisiológicos tem apresentado bons resultados na avaliação do
efeito dos poluentes em peixes (WINKALER; MARTINEZ, 1999). Esses parâmetros são
chamados de biomarcadores e podem ser utilizados com sucesso como complemento
para as análises químicas em programas de monitoramento ambiental (SANCHEZHERNANDEZ et al.,1998).
Para o monitoramento efetivo da qualidade da água, testes in situ têm
sido utilizados com freqüência desde a década de 90 em países da Europa e nos Estados
Unidos (STIEN et al., 1998). Tais testes constituem-se basicamente da manutenção dos
organismos, no caso os peixes, em uma gaiola perfurada colocada no ambiente a ser
testado, com livre circulação de água e acesso ao alimento. Por determinado período de
tempo acompanha-se a sobrevivência dos animais e/ou realizam-se análises de
parâmetros biológicos dos animais expostos ao teste.
Testes in situ apresentam vantagens em relação aos testes laboratoriais
ou técnicas de coleta dos animais no campo, já que permitem uma total cobertura dos
1
Xenobiótico: “estranho biológico”; substância que seja estranha ao organismo (GRIZI, 2000).
5
contaminantes presentes na água e sedimento de uma área específica que se deseja
estudar, abrangendo todas as variações físico-químicas que possam vir a ocorrer no local
durante o experimento (MARTINEZ et al, 2002). Coletas dos animais no campo não
permitem padronização de idade e sexo, por exemplo, dos organismos a serem
estudados, e os testes laboratoriais não representam fielmente a realidade a qual os
peixes estão expostos no campo.
Marcadores bioquímicos e fisiológicos têm a vantagem de apresentarem
respostas rápidas e específicas a determinados poluentes (TEH et al.,1997), além de que
as primeiras alterações causadas por exposições subletais costumam ocorrer nos níveis
moleculares e bioquímicos do animal, como por exemplo, na ação das enzimas (ADAMS,
1990).
O fígado nos peixes é um órgão que desempenha diversas funções
metabólicas, entre elas, o metabolismo de xenobióticos, além de ser bastante sensível à
presença de contaminantes no ambiente. Nesse órgão estão presentes algumas enzimas
que são responsáveis pela oxidação, redução ou conjugação de substâncias químicas
(JIMENEZ; STEGEMAN, 1990).
Enzimas detoxificantes, como a glutationa-S-transferase, têm sua
atividade aumentada na presença de hidrocarbonetos policíclicos e policlorados e
diminuída na presença de compostos organofosforados e carbamatos (STIEN, 1998). Já a
enzima catalase atua na remoção da H2O2 (peróxido de hidrogênio) do organismo e
também parece estar envolvida no controle do estresse oxidativo (HUGGETT, 1992).
Alguns contaminates ambientais causam aumento na oxidação de ácidos graxos, o que
pode velar a um estresse oxidativo. Nestes casos, a atividade hepática da catalase pode
aumentar em resposta a esse estresse. Portanto, o estudo de enzimas como a glutationaS-transferase e a catalase pode ser usado como indicador biológico de contaminação.
Como a exposição a contaminantes costuma fazer com que o peixe
aumente sua demanda energética, a análise de parâmetros metabólicos, como teor de
lipídeos e proteínas totais, pode servir como bom indicador de estresse. Além disso, o
estudo hematológico dos animais expostos aos testes in situ também é relevante
considerando-se que exposições prolongadas dos animais a metais, como chumbo por
exemplo, podem acarretar prejuízos para a hematopoiese. O peixe também pode
apresentar algumas estratégias adaptativas a esses estressores, variando sua
concentração de hemoglobina ou o tamanho e/ou o número de seus eritrócitos (SILVA,
1987).
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A água doce, ao contrário da água do mar, apresenta um conteúdo de
solutos muito baixo e variável (SCHMIDT-NIELSEN, 1996). Os teleósteos dulcícolas são
hiperreguladores e conseqüentemente precisam enfrentar o influxo osmótico de água e a
perda de íons, absorvendo íons ativamente pelas brânquias, e eliminando o excesso de
água através de uma urina diluída e abundante. A poluição aquática pode interferir nestes
processos de osmorregulação, fazendo com que íons como sódio, potássio e cloreto
sofram variações em suas concentrações. Alguns poluentes podem interferir na atividade
da bomba de sódio (Na+-K+-ATPase) ou ainda aumentar a produção de urina, o que pode
prejudicar a captação de íons pelas brânquias ou então aumentar a concentração iônica
do animal (HEATH, 1987).
Como os íons sódio e cloreto são os mais abundantes no plasma da
maioria dos animais, medidas de suas concentrações podem indicar as condições
osmóticas do plasma dos peixes.
Apesar de possuir concentrações iônicas diferentes, a osmolaridade dos
compartimentos intra e extracelular deve ser mantida semelhante, evitando que a célula
sofra grandes variações em seu volume, ganhando ou perdendo água. O controle do
volume celular é feito basicamente pela saída ou entrada de potássio na célula. Se por
algum motivo o animal ficar mais diluído de modo que a célula também fique mais diluída,
ocorre uma saída de potássio da célula, para diminuir a osmoticidade do meio intracelular.
O contrário também ocorre; se o animal perde água para o meio, devido por exemplo a
um aumento em sua diurese em resposta a um estressor, ocorre uma captação de íons
potássio a partir do plasma, mantendo assim, o volume celular constante (LANG, 1998).
Portanto, medidas da concentração de potássio no plasma podem indicar a capacidade
dos eritrócitos de regularem seu volume em resposta a determinadas situações
estressantes.
Espécies nativas de peixes ainda são pouco utilizadas na realização de
testes in situ no Brasil. Entretanto, trata-se de uma boa técnica para o monitoramento
ambiental e o estudo do impacto da poluição nessas populações, normalmente mais
sensíveis que as espécies introduzidas.
O curimba (Prochilodus lineatus) é uma espécie neotropical de grande
importância econômica e ecológica, além de ser bem estudado quanto a sua biologia,
fisiologia e reprodução.
Nesse trabalho foram desenvolvidos testes in situ com curimbas
(Prochilodus lineatus) em pontos com diferentes níveis de ação antrópica no Ribeirão
Cambé (Londrina – PR) e, como referência, foi utilizado o Ribeirão dos Apertados,
7
localizado dentro do Parque Estadual da Mata dos Godoy, local com mata ciliar bem
preservada e relativamente livre da entrada direta de contaminantes. Nesses testes foram
avaliados parâmetros hematológicos, iônicos, metabólicos e bioquímicos dos peixes como
forma de avaliação da poluição no Ribeirão Cambé, na cidade de Londrina, PR.
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1 OBJETIVOS
•
Realizar testes in situ com peixes da espécie Prochilodus lineatus
(curimba), confinados em gaiolas durante um período de 168 horas (1
semana);
•
Determinar
parâmetros
iônicos
(sódio,
potássio
e
cloreto),
hematológicos (hemoglobina), metabólicos (glicemia, proteínas totais e
lipídeos) e bioquímicos (atividade hepática das enzimas glutationa transferase
e catalase) de Prochilodus lineatus expostos a testes in situ;
•
Comparar os resultados obtidos com os testes em cinco localidades
no município de Londrina (PR), com diferentes características quanto à ação
antrópica;
•
Avaliar as integrações das respostas obtidas nos testes, relacionando-
as com o nível de impacto de cada local de amostragem.
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2 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 O animal
Prochilodus lineatus (Valenciennes, 1847)
Superordem Ostariophysi
Ordem Characiformes
Família Prochilodontidae
Gênero Prochilodus
Nos testes in situ foram utilizados peixes da espécie Prochilodus lineatus,
conhecidos na região pelo nome de curimba (Fig.1). Essa espécie possui tamanho
variando de médio a grande porte (de 30 a 45 cm e até 6000 g), corpo coberto por
escamas grandes e são detritívoros, não possuindo dentes mandibulares (GODOY, 1975;
SANTOS, 1962)
FIGURA 1. Fotografia mostrando um exemplar adulto de curimba (Prochilodus
lineatus) .
São peixes reofílicos, ou seja, que necessitam realizar grandes migrações
para realizar seu ciclo reprodutivo, sendo que costumam utilizar-se de ambientes lóticos
para reprodução e lênticos (lagoas) e semi-lênticos (canais e represas), para alimentação
e crescimento dos jovens (TAKASUSUKI, 2000).
Por possuir esse hábito migratório, o curimba entra em contato com água
de diferentes qualidades, em vários trechos do rio, o que aumenta a probabilidade do
peixe encontrar uma maior quantidade de poluentes.
Essa espécie foi utilizada nos testes por ser representativa da Bacia do
Rio Tibagi e ser encontrada principalmente em locais com menos poluição como os
municípios de Ipiranga e Sapopema (BENNEMANN et al., 1995). Como ela é menos
10
freqüente em localidades onde a poluição ou atividade industrial está presente, pode ser
entendida como uma espécie sensível a contaminantes. Ainda, por tratar-se de uma
espécie de hábitos detritívoros, ou seja, que se alimenta do sedimento do fundo dos rios,
esse animal é bastante indicado para monitoramento ambiental, por incorporar poluentes
do sedimento e da água.
3.2 Locais de amostragem
Os testes in situ foram realizados em quatro pontos distintos no alto
Ribeirão Cambé (pontos A, B, C e D) e em um ponto no Ribeirão dos Apertados, tido
como o ponto de referência (Fig. 2).
FIGURA 2. Mapa mostrando a região do Alto Ribeirão Cambé e o Ribeirão dos
Apertados, onde os testes foram realizados.
Os pontos de amostragem no ribeirão Cambé (Fig. 3) possuem
características diferentes quanto à ação antrópica, já que o Ribeirão Cambé atravessa
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regiões urbanizadas. Tais pontos recebem despejos clandestinos de esgoto, efluentes
industriais e têm sua mata ciliar bastante degradada, além do uso irregular do solo.
FIGURA 3. Mapa mostrando em detalhe a localização dos pontos no Alto
Ribeirão Cambé, onde foram realizados os testes in situ.
Ponto A: Localizado a montante da foz do córrego Cacique, possui
margens desprovidas de vegetação, tem cerca de 2,0 m de largura, águas rasas e fundo
lodoso. Há sinais de assoreamento na área, devido ao uso do solo das margens para
olericultura (Fig. 4).
Ponto B: Localiza-se a jusante da foz do córrego Cacique, também é um
local bastante assoreado, com pouca vegetação nas margens. Possui águas rasas, fundo
lodoso e largura aproximada de 2,0 m (Fig. 5 ).
Ponto C: Localizado a jusante da foz do córrego da Mata, têm pouca
vegetação cobrindo suas margens, largura aproximada de 3,0 m, águas rápidas e fundo
rochoso. Provavelmente recebe efluentes industriais já que localiza-se nos fundos da
CONFEPAR - Cooperativa Central Agroindustrial (Fig. 6 ).
Ponto D: Localiza-se a montante da foz do córrego Baroré e próximo do
início do Lago Igapó IV. Este trecho apresenta largura e profundidade maiores que os
demais, águas calmas e claras. A vegetação aquática é abundante, mas nas margens é
escassa, onde encontram-se muitas moradias e lixo espalhados (Fig. 7 ).
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O Ribeirão dos Apertados, que atravessa o Parque Estadual da Mata dos
Godoy, é um local de corredeira, com mata ciliar razoavelmente preservada, e afastado
da cidade. Por essas características, foi considerado o local de referência, por estar
relativamente livre da ação antrópica (Fig. 8).
FIGURA 4. Fotografia mostrando o local de realização dos testes in situ no Ponto A
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FIGURA 5. Fotografia mostrando o local de realização dos testes in situ no Ponto B.
FIGURA 6. Fotografia mostrando o local de realização dos testes in situ no Ponto C.
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FIGURA 7. Fotografia mostrando o local de realização dos testes in situ no Ponto D.
FIGURA 8. Fotografia mostrando o local da realização dos testes in situ no
Ribeirão dos Apertados (local de referência).
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3.3 Testes in situ
Exemplares jovens de Prochilodus lineatus foram fornecidos pela Estação
de Piscicultura da UEL, para a realização dos testes. Os animais assim obtidos devem
estar livres de contaminação e resistência, visto que nos tanques da piscicultura eles não
entram em contato com nenhum tipo de contaminante.
As gaiolas para o confinamento foram confeccionadas com canos de
material plástico (PVC) e revestidas com tela plástica (malha de 1,5-2,0 mm), permitindo
assim, que a água circule e que os animais se alimentem do sedimento (Fig. 13). Garrafas
plásticas contendo areia foram presas à gaiola a fim de mantê-la em contato com o
sedimento (aproximadamente a 1,50 m de profundidade). As gaiolas utilizadas possuem
volume de 125 litros (50x50x50 cm), e já foram testadas e padronizadas em testes
anteriores realizados na Piscicultura da UEL.
FIGURA 9. Fotografia mostrando a gaiola utilizada nos testes in situ.
Foi utilizado um grupo de 6 animais em cada gaiola, por ponto de
amostragem. Os peixes foram transportados até o local em sacos plásticos contendo
água e oxigênio. Todo cuidado foi tomado no transporte a fim de evitar estresse adicional
aos animais. No local de amostragem os peixes foram transferidos para a gaiola, que
foram então submersas na água, onde ficaram por 168 horas (1 semana).
Decorrido esse período, os animais foram amostrados imediatamente
após sua retirada da gaiola. As amostras de sangue e fígado de cada animal foram
armazenadas em tubos plásticos e mantidas no gelo até a chegada ao laboratório, na
UEL.
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Em cada local de teste in situ foram realizadas determinações da
temperatura e oxigênio dissolvido utilizando-se oxímetro portátil Orion e condutividade
usando condutivímetro portátil Corning CD-55. O pH foi medido no laboratório em
pHmetro de mesa a partir de uma amostra de água coletada em cada local no momento
da colocação e retirada das gaiolas.
3.4 Obtenção das amostras
Imediatamente após a retirada dos peixes da gaiola, estes foram
colocados, um a um, em um balde contendo uma solução diluída de anestésico (0,5 g de
benzocaína diluído em 70 mL de álcool, para cada 5 litros de água) por alguns segundos,
a fim de minimizar o estresse do peixe. Logo após o peixe estar anestesiado, o sangue foi
coletado a partir da veia caudal, utilizando-se seringas descartáveis lavadas com
anticoagulante da marca Liquemine e armazenado em tubos plásticos de 1,5 mL,
devidamente rotulados e mantidos no gelo. Após esse procedimento, o animal foi
sacrificado por secção medular e foram tomadas suas medidas (comprimento total,
padrão e peso).
3.5 Análises das amostras
Utilizando-se das medidas de peso e comprimento total dos peixes, foi
calculado o fator de condição para cada animal. Esse fator fornece um bom indicativo do
status nutricional geral do organismo, o que pode ser usado como indicador de estresse,
já que o fígado aumenta de peso na presença de poluentes (SANCHEZ-HERNANDEZ,
1998). Esse fator foi calculado através da divisão do peso do animal em gramas pelo cubo
do comprimento total do corpo em centímetros e multiplicado por 100.
3.5.1 Determinação do conteúdo de hemoglobina
No laboratório, uma alíquota de sangue total foi utilizada para dosagem
de hemoglobina por meio de método colorimétrico, utilizando-se kit comercial (ANALISA).
As amostras de sangue (5 µL) foram diluídas em 1,25 mL de reagente para hemoglobina
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contendo ferrocianeto. O ferro (II) do grupo heme da hemoglobina, oxihemoglobina e
carboxihemoglobina é oxidado para o estado férrico pelo ferrocianeto, formando
hemiglobina (Hi), que se combina com o cianeto ionizado para produzir cianeto de
hemiglobina (HiCN), sendo medido em 540 nm. Os resultados foram comparados com
soluções padrão (hemoglobina humana), cuja concentração de hemoglobina já foi
determinada (10 mg/dL).
O restante do sangue coletado foi centrifugado, durante 5 minutos a 3000
g, para separação das células do plasma. O plasma obtido foi mantido congelado (- 4º C)
até o momento das análises de íons e metabólitos. O fígado retirado foi mantido
congelado (-80º C) até o momento das análises bioquímicas.
3.5.2 Determinação da concentração plasmática de sódio, potássio e cloreto.
Para a determinação dos íons sódio e potássio foram utilizados 10 µL de
plasma diluído em 1 mL de água milli-Q. Após as diluições apropriadas, as amostras de
plasma foram analisadas em fotômetro de chama (ANALYSER-900) para que se
obtivessem as concentrações dos íons. Na determinação das concentrações plasmáticas
de sódio foram utilizados padrões de sódio de concentração conhecida (2,5 mM, 2,0 mM,
1,5 mM, 1.0 mM e 0,5 mM) e o mesmo foi feito para o potássio, utilizando-se padrões com
as seguintes concentrações desse íon : 0,10 mM, 0,075 mM, 0,050 mM, 0,025 mM e
0,012 mM.
O teor do íon cloreto foi determinado através de kit comercial (ANALISA),
cuja concentração do padrão é conhecida (100 mEq/L). Os íons Cl- reagem com o
tiocianato de mercúrio formando o cloreto mercúrio e íon tiocianato, que reagem com o
íon férrico formando tiocianato férrico, de cor amarela, proporcional à concentração de
cloretos na amostra. Uma alíquota de 5 µL de plasma foi adicionada a 1.750 µL de
reagente de cor e 50 µL de ativador. As amostras foram homogeneizadas em agitador de
tubos
e
as
leituras
foram
realizadas
por
método
colorimétrico,
utilizando-se
espectrofotômetro, no comprimento de onda de 470 nm. As concentrações dos íons
sódio, potássio e cloreto foram expressas em mM/L.
18
3.5.3 Determinação da concentração plasmática de glicose, proteínas totais e
lipídeos totais.
A concentração plasmática da glicose foi determinada através de
metodologia espectrofotométrica, utilizando-se kit comercial (ANALYSA ou CELM). A
glicose oxidase catalisa a oxidação da glicose para ácido glucônico e peróxido de
hidrogênio. O peróxido de hidrogênio formado reage com 4-aminoantipirina e fenol,
através de uma reação oxidativa de acoplamento catalisada pela peroxidase, formando
uma antipirilquinonimina vermelha cuja intensidade de cor é proporcional à concentração
de glicose na amostra analisada. Depois da adição de 10 µL de amostra de plasma a 1
mL do reagente, a solução foi homogeneizada por agitação e encubada por 10 minutos
em banho-maria a 37ºC. A leitura de absorbância foi feita em espectrofotômetro
(SHIMADZU em 505 nm. Foi utilizado padrão de glicose de concentração de 100 mg/dL.
A concentração plasmática de proteínas totais foi determinada através do
método descrito por LOWRY et al., (1951), utilizando-se curva padrão de valores
conhecidos. A curva de calibração foi construída a partir de valores conhecidos de soro
albumina bovina (BSA): 5, 10, 50, 100, 150, 200 e 250 µg/mL de BSA diluídos em água
milli-Q até o volume final de 1 mL.
Para a leitura das amostras, 5 µL de plasma foram diluídos em 995 µL de
água milli-Q. Após a diluição adicionou-se 1 mL do reagente A (1 mL de CuSO4 1%, 1 mL
de tartarato Na-K e 100 mL de NaCO3 2% em NaOH 0,1 N) e 100 µL de reagente B (água
e reativo de Folin 2N diluídos 1:1) nas amostras de plasma e na curva de calibração,
enquanto as amostras eram agitadas em vórtex. Após um repouso de 90 minutos as
amostras foram analisadas em espectrofotômetro no comprimento de onda de 700 nm.
Os lipídeos séricos, incluindo os ácidos graxos insaturados livres e
esterificados e o colesterol livre e seus ésteres, reagem com a vanilina em meio fosfórico,
primeiro reagindo com ácido sulfúrico aquecido. Dessa forma, 10 µL de amostra de
plasma foram adicionados a 500 µL de ácido sulfúrico concentrado. Os tubos foram
devidamente embalados em papel alumínio e encubados em banho-maria a 100ºC por 10
minutos. Após esse período, uma alíquota de 40 µL da solução (amostra + ácido sulfúrico)
foi transferida para outros tubos de ensaio contendo 1 mL do reativo de cor. Os tubos
foram agitados suavemente e encubados em banho-maria a 37º C por 10 minutos. As
amostras foram analisadas em espectrofotômetro, em 530 nm, e os valores de
absorbância foram comparados com o valor do padrão de concentração conhecida (1000
mg/dL).
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3.5.4 Determinação da atividade hepática das enzimas glutationa transferase e
catalase.
Para análise da glutationa transferase (GST) e catalase foram utilizadas
as amostras do fígado. Para tanto, fragmentos do fígado foram pesados, homogeneizados
em tampão fosfato (10 x o volume), e centrifugados durante 20 minutos em centrífuga
refrigerada (4º C) a 14737,47 g. Logo após a centrifugação o sobrenadante foi separado
para as análises.
A dosagem de GST foi realizada de acordo com KEEN et al. (1976).
Foram utilizados 10 µL do sobrenadante do fígado de cada amostra, ao qual foram
adicionados 970 µL de tampão de reação (fosfato de potássio 0,1 M pH 7,0) contendo o
substrato: 10 µL de 1- cloro- 2,4- di-nitrobenzeno (CDNB) 100 mM em etanol e 10 µL de
glutationa reduzida (GSH) 100 nM em tampão fosfato de potássio 0,1 M e pH 7,0.
Imediatamente após a homogeneização do conteúdo foi feito o registro da absorbância,
durante 0,5 ou 1 minuto, em espectrofotômetro, no comprimento de onda de 340 nm.
A atividade da enzima catalase foi determinada através da quantificação
da velocidade de decomposição da água oxigenada (H2O2) pela enzima, através do
decréscimo de absorbância a 240 nm durante 0,5 ou 1 minuto. O meio de reação continha
TRIS HLC 1M; EDTA 5 mM; pH 8,0; H2O2 30%. Para a leitura espectrofotométrica foram
utilizados 1980 µL do meio de reação e 20 µL do sobrenadante das amostras. Os valores
de atividade das enzimas glutationa e catalase foram expressos em mU (nmol/min/mg de
proteína) e U (µmol/ min/ mg de proteína). Para o cálculo das atividades das enzimas foi
calculada a concentração de proteínas totais do sobrenadante do fígado, seguindo-se o
método descrito por LOWRY et al., (1951).
A atividade enzimática da catalase e da glutationa transferase foi
determinada através das seguintes fórmulas:
Atividade da catalase =
∆ absorbância / minuto
0,01* x 0,071** x [proteína mg/mL]
Atividade da glutationa =
∆ absorbância / minuto
0,01* x 9,6 ** x [proteína mg/mL]
20
Onde:
* diluição
** coeficiente de extinção da enzima
∆ delta de absorbância
[ ] concentração de proteína no fígado em mg/mL
3.6 Análise dos resultados
Os resultados obtidos nos 5 pontos de amostragem foram comparados
entre si empregando-se a análise de variância – critério único – para verificar a existência
de diferenças significativas entre as médias obtidas em cada parâmetro analisado de
cada localidade. Com a indicação de valores significativos de F, procedeu-se a realização
do teste de Student-Newman-Keuls (SNK) para a identificação das diferenças. Foram
considerados significativos valores de P ≤ 0,05 e os testes foram realizados de acordo
com ZAR (1996).
21
4 RESULTADOS
Durante a realização deste trabalho foi realizado um teste in situ em cada
um dos quatro pontos no alto Ribeirão Cambé e um teste no local de referência no
Ribeirão dos Apertados, entre os meses de agosto e setembro de 2002 (Tabela 1).
TABELA 1- Datas referentes aos dias de realização dos testes in situ nos 4 pontos no alto
Ribeirão Cambé e no local de referência (Ribeirão dos Apertados). O período corresponde
a 168 horas e (n) indica o número de animais amostrados.
Locais
Ribeirão dos Apertados
Ponto A
Ponto B
Ponto C
Ponto D
Datas
20/08 a 27/08
06/09 a 13/09
10/09 a 17/09
05/09 a 12/09
28/08 a 4/09
n=6
n=6
n=6
n=6
n = 5*
* Um dos animais fugiu no momento da retirada da gaiola
4.1 Parâmetros ambientais e fator de condição
Os parâmetros físico-químicos da água dos locais de realização dos
testes in situ (pH, oxigênio dissolvido, temperatura da água e condutividade) estão
mostrados na Tabela 2. O ponto A apresentou os valores mais baixos de pH e oxigênio
dissolvido e no ponto D foram encontrados os maiores valores de condutividade.
TABELA 2- Valores de pH, oxigênio dissolvido (mgO2/L), temperatura da água (ºC) e
condutividade (µs/cm) obtidos no momento da realização dos testes no Ribeirão Cambé e
no Apertados. Os valores indicam as medidas realizadas no 1º dia e no último dia do
experimento.
Local
pH
Apertados
Ponto A
Ponto B
Ponto C
Ponto D
7,94 – 7,33
7,02 – 7,10
7,74 – 7,56
7,24 – 7,44
7,63 – 7,40
Oxigênio
(mgO2/L)
10,8 – 7,30
5,65 – 4,45
6,73 – 5,93
7,90 – 7,28
6,48 – 7,52
Temperatura
(ºC)
17,6 – 17,7
22,4 – 21,7
21,3 – 22,4
19,4 – 21,7
19,7 – 15,0
Condutividade
(µ
µs/cm)
75 - 55
95 – 103
110 - 101
116 – 115
271 – 176
Precipitação
(mm)
0,0
17,2
51,4
12,4
22,0
Os dados de precipitação indicam a somatória da precipitação nos 7 dias do experimento e dos 3 dias que
antecederam a colocação das gaiolas.
22
A biometria dos animais permitiu o cálculo do fator de condição, e os
valores do peso (g), comprimento total e padrão (cm) e fator de condição (K) estão
mostrados na Tabela 3.
TABELA 3- Valores de peso (g), comprimento total e padrão (cm) e fator de condição dos
curimbas utilizados nos testes in situ nos diferentes locais de amostragem.
Local
(n)
Apertados (n=6)
Ponto A (n=6)
Ponto B (n=6)
Ponto C (n=6)
Ponto D (n=5)
Peso
(g)
21,62 ± 5,22
30,92 ± 5,64
24,03 ± 4,82
26,73 ± 3,87
30,02 ± 6,37
Comprimento
total (cm)
13,23 ± 0,98
15,21 ± 1,18
13,90 ± 1,01
14,00 ± 0,71
14,82 ± 0,87
Comprimento
padrão (cm)
10,69 ± 0,86
11,53 ± 0,76
10,93 ± 0,82
11,10 ± 0,68
11,46 ± 0,75
Fator de
Condição (K)
0,92 ± 0,07
0,87 ± 0,09
0,89 ± 0,10
0,98 ± 0,13
0,91 ± 0,05
Os valores indicam a média ± o desvio-padrão e entre parênteses está mostrado o número de animais
amostrados em cada ponto.
O fator de condição não variou significativamente entre os animais
submetidos aos testes in situ nos diferentes pontos amostrados (F = 0,341; P = 0,341).
4.2 Análise do conteúdo de Hemoglobina
Os valores referentes ao conteúdo de hemoglobina do sangue dos
animais submetidos aos testes nos diferentes pontos do alto ribeirão Cambe estão
mostrados na Tabela 4. Os resultados do conteúdo de hemoglobina obtidos para os
animais do Ribeirão dos Apertados não serão considerados nas análises por serem muito
elevados, provavelmente devido a algum problema na manipulação da amostra. Para a
análise estatística foi utilizado o valor do conteúdo de hemoglobina (média de 6,89 g/dL ±
1,73) obtido no trabalho de WINKALER (2002) para curimbas confinados pelo mesmo
período de tempo no Ribeirão dos Apertados, na mesma época do ano (Fig. 10), sendo
que não foram encontradas diferenças significativas entre os resultados.
TABELA 4- Valores do conteúdo de hemoglobina (g/dL) dos curimbas confinados nos
pontos de amostragem durante a realização dos testes in situ.
Local
Apertados
Ponto A
Ponto B
Ponto C
Ponto D
Hb (g/dL)
6,11 ± 1,20 (n=6)
4,77 ± 1,14 (n=6)
7,30 ± 1,93 (n=6)
6,99 ± 2,22 (n=5)
Os valores indicam média ± desvio-padrão e o número de animais amostrados (n).
23
Hemoglobina
♦
Hemoglobina (g/dL)
8
6
4
2
0
Apertados
Ponto A
Ponto B
Ponto C
Ponto D
FIGURA 10. Conteúdo de hemoglobina (g/dL) dos animais confinados nos 5 locais de
realização dos testes in situ. As barras mostram a média e as linhas verticais o erro
padrão. (♦) indica a média obtida no trabalho de WINKALER (2002) para o Ribeirão dos
Apertados.
4.3 Análise dos parâmetros iônicos
Os animais confinados nos pontos A, B e C apresentaram valores de
sódio plasmático significativamente menores que os animais do Apertados e do Ponto D
(F = 6.23; P = 0,001). Os valores da concentração de potássio nos animais confinados
nos Pontos A e D mostraram-se significativamente maiores que os do local de referência,
o Apertados (F=3,39; P=0,026), já os valores para o cloreto plasmático dos animais
testados não apresentaram variação significativa entre os pontos testados (F=2,07;
P=0,116). Os valores dos íons testados estão apresentados na Tabela 5.
TABELA 5- Concentrações plasmáticas de sódio (mM/L), potássio (mM/L) e cloreto
(mM/L) dos animais confinados nas gaiolas durante a realização dos testes in situ.
Local
(n)
Apertados
Na+
(mM/L)
158,94 ± 14,10
(n=6)
(n=6)
(n=6)
Ponto A
144,62 ± 5,45 * #
4,21 ± 0,78 *
106,91 ± 5,83
(n=6)
(n=6)
(n=6)
Ponto B
142,4 ± 4,08 * #
3,81 ± 0,45
111,79 ± 9,01
(n=6)
(n=6)
(n=6)
Ponto C
141,12 ± 7,63 * #
3,40 ± 0,80
101,35 ± 3,18
(n=6)
(n=5)
(n=6)
157,40 ± 5,27
4,3 ± 0,31 *
110,22 ± 8,58
Ponto D
K+
(mM/L)
3,05 ± 0,87
Cl(mM/L)
111,01 ± 8,31
(n=5)
(n=5)
(n=5)
Os valores indicam média ± desvio-padrão e número de animais amostrados em cada ponto (n).
* indica diferença significativa em relação ao Ribeirão dos Apertados. # indica diferença significativa em
relação ao Ponto D.
24
Sódio Plasmático
200
a)
*
(m M)
150
*
*
Ponto B
Ponto C
100
50
0
Apertados
Ponto A
Ponto D
Potássio Plasmático
b)
6
5
*
*
(m M)
4
3
2
1
0
Apertados
Ponto A
Ponto B
Ponto C
Ponto D
Cloreto Plasmático
c)
100
(m M)
80
60
40
20
0
Apertados
Ponto A
Ponto B
Ponto C
Ponto D
FIGURA 11. Concentrações plasmáticas de sódio (a), potássio (b) e cloreto (c) dos
animais confinados nos 5 locais de realização dos testes in situ. As barras indicam a
média e as linhas verticais o erro padrão. (*) indica valores significativamente diferentes
do Apertados (P< 0.05)
4.4 Análise dos parâmetros metabólicos
Os valores das concentrações plasmáticas de glicose, proteínas totais e
lipídeos dos animais confinados nos 5 locais estão apresentados na Tabela 6 e Fig. 11. A
glicemia dos animais confinados no ponto A foi significativamente maior que aquela dos
animais do Apertados e do Ponto D (F=4.68; P =0.006). O teor de lipídeos plasmáticos
25
não variou significativamente dentre os animais confinados nos diferentes locais (F=0,23;
P=0.919). A concentração plasmática de proteínas totais dos animais confinados em
todos os pontos do Ribeirão Cambé foi significativamente menor do que a encontrada
para os peixes confinados no Ribeirão dos Apertados (F=20,71; P=0.00).
TABELA 6- Concentrações plasmáticas de glicose (mg/dL), lipídeos (mg/dL) e proteínas
totais (mg/dL) dos animais confinados nos 5 locais de realização dos testes in situ.
Local
(n)
Apertados
Glicose
(mg/dL)
24.71 ± 13.73
Lipídeos
(mg/dL)
452,95 ± 172.61
Proteínas totais
(mg/dL)
3.07 ± 0.44
(n=6)
(n=5)
(n=6)
62.09 ± 26.27 * #
454.16 ± 131.52
1.89 ± 0.15 *
(n=6)
(n=6)
(n=6)
Ponto B
40.0 ± 13.24
449.46 ± 127.51
1.81 ± 0.12 *
(n=6)
(n=6)
(n=6)
Ponto C
44.40 ± 9.68
487.05 ± 79.55
2.15 ± 0.33 *
(n=6)
(n=6)
(n=6)
Ponto D
35.08 ± 2.84
411.82 ± 118.52
2.22 ± 0.11 *
Ponto A
(n=5)
(n=5)
Os valores indicam média ± desvio-padrão e o número de animais amostrados (n).
* Indica diferença significativa em relação ao Ribeirão dos Apertados
# Indica diferença significativa em relação ao Ponto D
a)
Glicose Plasmática
*
78
65
(mg/dL)
52
39
26
13
0
Apertados
b)
Ponto A
Ponto B
Ponto C
Ponto D
Lipídeos Totais
600
500
(mg/dL)
400
300
200
100
0
Apertados
Ponto A
Ponto B
Ponto C
Ponto D
(n=5)
26
Proteínas totais
C)
3,5
3
(mg/dL)
2,5
*
2
*
*
Ponto C
Ponto D
*
1,5
1
0,5
0
Apertados
Ponto A
Ponto B
FIGURA 11. Concentrações plasmáticas de glicose (a), lipídeos totais (b) e proteínas
totais (c) obtidos com os animais confinados nos 5 locais de realização dos testes in situ.
As barras indicam a média e as linhas verticais o erro padrão.(*) indica valores
significativamente diferentes do Apertados (P<0.05).
4.5 Análise dos parâmetros bioquímicos
Os valores da atividade das duas enzimas nos 5 pontos amostrados estão
mostrados na Tabela 7. Os valores da atividade hepática da glutationa transferase foram
significativamente maiores nos Pontos B e D em relação ao Ponto A (F=3.72; P=0.017).
Já os valores da atividade hepática da catalase foram significativamente maiores nos
Pontos A, B e C em relação ao Ponto D (F=5.06; P=0.004). Para ambas as enzimas não
foram verificadas diferenças significativas entre os animais confinados nos diferentes
pontos do Ribeirão Cambé e o local de referência (Fig. 12).
TABELA 7- Atividade hepática da catalase e da glutationa transferase dos animais
confinados nos 5 pontos durante a realização dos testes in situ.
Local
(n)
Apertados (n=6)
Ponto A (n=6)
Ponto B (n=6)
Ponto C (n=6)
Ponto D (n=5)
Glutationa
(mU)
54.91 ± 17.83
38.13 ± 16.83
67.34 ± 16.09 ♣
53.25 ± 14.45
70.38 ± 13.65 ♣
Catalase
(U)
16.39 ± 4.44
19.74 ± 1.82 #
21.13 ± 2.05 #
21.99 ± 3.44 #
12.68 ± 6.80
O valores indicam média ± desvio-padrão e número de animais amostrados em cada ponto (n).
♣ Indica diferença significativa em relação ao Ponto A.
# Indica diferença significativa em relação ao Ponto D.
27
a)
Glutationa Transferase
90
80
70
(mU)
60
50
40
30
20
10
0
Apertados
b)
Ponto A
Ponto B
Ponto C
Ponto D
Catalase
25,00
20,00
(U)
15,00
10,00
5,00
0,00
Apertados
Ponto A
Ponto B
Ponto C
Ponto D
FIGURA 13. Atividade hepática das enzimas glutationa transferase (a) e catalase (b) dos
animais confinados nos 5 locais de realização dos testes in situ. As barras indicam a
média e as linhas verticais o erro padrão.
28
5. DISCUSSÃO
As funções fisiológicas dos peixes, como regulação osmoiônica, atividade
de enzimas detoxificantes e consumo de energia podem sofrer variações dependendo do
sexo, idade e estado nutricional do animal. Para reduzir essa interferência foram utilizados
nesse trabalho apenas peixes jovens, com média de peso e tamanhos semelhantes e
imaturos sexualmente, tentando-se assim, padronizar as respostas apresentadas.
O próprio manejo dos animais durante o experimento pode induzir a uma
série de respostas, como por exemplo aumento na diurese e variação nos níveis
hormonais, independente da presença de poluentes na água (HEATH, 1987).
Levando-se isso em consideração, foi utilizado nesse trabalho o
anestésico benzocaína momentos antes da amostragem, como forma de reduzir os
efeitos do manejo sobre as respostas, e como esse procedimento foi aplicado em todos
os animais, as possíveis interferências que o anestésico poderia causar ficam
padronizadas.
Entre os parâmetros que sofrem influência do estresse estão a
osmolaridade plasmática bem como a concentração individual de alguns íons, como
sódio, potássio e cloreto. Esses íons são extremamente importantes na manutenção da
homeostase do animal, já que teleósteos dulcícolas necessitam constantemente captar
íons do ambiente contra um gradiente de concentração e eliminar o excesso de água
ganhado via osmose (JOBLING, 1995). Para isso produzem uma grande quantidade de
urina diluída e utilizam principalmente as células de cloreto das brânquias para transportar
sódio e cloreto da água para o sangue.
Nesse trabalho verificou-se que os animais confinados nos pontos A, B e
C apresentaram valores de sódio plasmático significativamente menores que os animais
do local de referência (Tabela 5).
Por outro lado, os peixes do ponto D apresentaram concentração
plasmática de sódio significativamente maior que os animais confinados nos demais
pontos do alto Cambé. Esse fato pode, em parte, ser entendido no Ponto D como uma
conseqüência da alta condutividade desse local (Tabela 2). Isso quer dizer que a água
nesse ambiente contém muitos sais, que podem portanto, ser mais facilmente captados
pelas brânquias.
Valores mais baixos na concentração de sódio e cloreto, como foram
encontrados nos Pontos A , B e C podem ser decorrentes da presença de poluentes na
água, como metais por exemplo. STAURNES et al (1984) encontraram resultados
29
semelhantes quando expuseram trutas ao alumínio em pH 5 por um período de 4 a 7 dias.
Uma possível explicação seria o decréscimo de até 25% da atividade da enzima Na-K
ATPase nas brânquias, devido à presença do metal.
Nos animais confinados nos pontos A e D também se observou valores
significativamente maiores de potássio que nos animais do local de Referência (Fig. 10), o
que confirma o que já foi descrito em outros trabalhos sobre a atuação do cobre inibindo a
enzima Na-K ATPase nas membranas. Isso prejudica a tomada de sódio e cloreto e
permite que o potássio se difunda passivamente para o sangue. Pelo fato da regulação
osmoiônica sofrer diretamente os efeitos de poluentes presentes na água, seja alterando
a atividade enzimática, aumentando a produção de urina ou a permeabilidade das
membranas; a avaliação da concentração de certos íons no plasma mostra ser um
biomarcador bastante sensível para o monitoramento ambiental.
Peixes expostos a qualquer tipo de estresse mostram concentrações
plasmáticas elevadas de corticosteróides e adrenalina (MAZEAUD, 1981). Isso pode
desencadear uma inibição da tomada de alimento ou indiretamente atuar alterando os
níveis de glicose no sangue.
COLGAN (1973) mostrou que o apetite nos peixes pode ser suprimido por
níveis muito elevados de glicose no sangue. Esse dado corrobora com o que foi
observado neste trabalho, para os animais confinados no Ponto A. Foi encontrada nesse
local a maior concentração de glicose plasmática (Tabela 6) e também o menor valor para
o fator de condição (Tabela 3). Isso pode indicar que esses animais se alimentaram
menos já que sua glicemia estava muito alta. O autor explica que isso provavelmente
ocorre devido a mudanças hormonais decorrentes do estresse, e que tais mudanças
promovem uma maior mobilização das reservas de glicogênio do fígado para o sangue,
suprindo assim, a necessidade do animal, que portanto, deixa de se alimentar. Os animais
confinados nos outros pontos do alto ribeirão Cambé não apresentaram grandes
variações na sua glicemia nem nos valores do fator de condição (Fig. 11 e 8).
A mobilização de energia é normalmente requerida quando um animal
passa por uma situação estressante. Nesses casos ele deixa de investir energia em
processos como crescimento e reprodução e passa a concentra-la em processos vitais
como respiração, locomoção, reparo tecidual e regulação iônica (BONGA, 1997). Essa
energia extra pode ser proveniente das reservas do animal, como os lipídeos, que
apresentarão então, um decréscimo na sua concentração plasmática (HUGGET, 1992).
Não foram observadas variações significativas nos níveis de lipídeos
plasmáticos nos animais testados nesse trabalho (Fig. 11), o que pode estar indicando
30
que estes animais não estejam mobilizando reservas, e sim, conseguindo a energia
necessária para seu metabolismo a partir da quebra de glicose.
Uma outra fonte de energia que pode ser utilizada pelos animais é a
mobilização de proteínas, dessa forma o animal consegue energia por meio da oxidação
de aminoácidos. O glicogênio e os lipídeos são as fontes primárias de energia, já que as
proteínas são, fundamentalmente, componentes estruturais do organismo. Entretanto,
quando o animal passa por um estresse intenso ou de longa duração ele pode vir a
mobilizar suas proteínas para obter a energia requerida na manutenção da homeostase
(TAKASUSUKI, 2000).
Neste trabalho foram observados valores mais baixos de proteína
plasmática nos locais do Alto Ribeirão Cambé em comparação a referência (Fig. 11).
Valores mais baixos de proteína podem indicar algum tipo de estresse nutricional onde o
animal passa a mobilizar suas reservas protéicas (ADAMS, 1990). Os valores do fator de
condição para os animais amostrados poderiam comprovar essa teoria se tivessem sido
baixos, indicando que os animais não se alimentaram bem durante o confinamento.
Entretanto, como já foi mencionado, não houve diferenças significativas no fator de
condição dos animais, o que provavelmente indica que eles não tiveram seu ganho de
peso comprometido em decorrência dos testes. Outra hipótese para esse tipo de resposta
é a da hemodiluição, que de fato ocorreu nos animais confinados nos pontos A, B e C.
como indicado pela redução nos teores plasmáticos de Na+.
Variações hematológicas podem ser respostas a estressores ambientais,
como agentes químicos, e normalmente são resultado da perda ou ganho de água, o que
varia o hematócrito, e conseqüentemente o conteúdo de hemoglobina encontrado
(HEATH, 1987). Portanto, um animal pode apresentar anemia não devido a problemas na
hematopoiese mas sim devido a problemas de osmoregulação.
Neste trabalho foi encontrado um valor muito alto para o conteúdo de
hemoglobina no Ribeirão dos Apertados (média de 18,03 g/dL), o que provavelmente
deve ser resultado de problemas na manipulação das amostras, já que os valores para o
conteúdo de hemoglobina para Prochilodus lineatus variam em torno de 6 a 10 g/dL.
Portanto, ao se comparar os valores deste trabalho para os para os locais testados com o
valor de hemoglobina do Apertados do trabalho de WINKALER (2002), não foram
apontadas diferenças significativas (Fig. 9), o que pode estar indicando que os animais
confinados no Alto Ribeirão Cambé não estejam sofrendo algum dano hematológico em
decorrência de poluentes no ambiente. Houve apenas uma tendência dos animais
31
confinados no Ponto B de apresentarem valores mais baixos para o conteúdo de
hemoglobina, o que pode ser decorrente da presença principalmente de metais na água.
A maior parte dos xenobióticos é biotransformada no fígado por meio de
enzimas detoxificantes. As reações de biotransformação normalmente tornam os
contaminantes mais hidrofílicos e polares, dificultando assim, sua passagem pelas
membranas e assimilação no tecido adiposo (HEATH, 1987).
Tais reações envolvem duas fases, sendo que a primeira inclui reações
de oxidação, redução e hidrólise com o intuito de formar metabólitos que serão depois
utilizados como substratos para as reações da fase II (KOBAYASHI, 1978). Essa fase, por
sua vez, envolve reações de conjugação tanto de compostos endógenos (como
hormônios esteróides) como dos xenobióticos. Ela é mediada por uma série de enzimas,
dentre as quais a glutationa transferase (GST) faz parte.
De acordo com HEATH (1987), a glutationa é uma molécula que parece
estar envolvida na detoxificação de xenobióticos orgânicos em diversos animais,
entretanto pouco se sabe sobre sua atuação sobre compostos metálicos.
Vários trabalhos demonstraram o aumento da atividade hepática da GST
em decorrência da exposição dos animais a compostos orgânicos (ANDERSSON et al.,
1985; GOKSØYR, et al., 1987 apud HUGGET, 1992).
Neste trabalho foram encontrados valores mais altos de atividade
hepática da glutationa transferase nos animais confinados nos Pontos B e D (Tabela 7).
Estas duas localidades enfrentam muito diretamente problemas com descarga irregular de
esgoto, já que existem residências muito próximas de suas margens. Outro fator a ser
considerado é a possível presença de efluentes de origem agrícola no Ponto B, que
atravessa áreas com pequenas plantações. Os efeitos da contaminação orgânica sobre a
atividade da glutationa transferase já foram descritos por STIEN et al. (1997) em percas
confinadas numa baía do Mediterrâneo sujeita principalmente a exposição
a PCBs
(bifenilas policloradas). Outro trabalho ainda mostrou um aumento rápido na atividade da
glutationa transferase depois de exposição a amônia ou fenóis (CHATTERJEE &
BHATTACHARYA, 1984, apud HEATH, 1987).
Estudos recentes têm mostrado a relação entre a exposição a
contaminantes ambientais e a formação de radicais livres e oxiradicais em diferentes
grupos animais. Mesmo não sendo um radical livre verdadeiramente, o peróxido de
hidrogênio (H2O2) é um composto muito reativo e participa da produção de hidroxi-radicais
(HUGGET, 1992). Os radicais livres são produzidos tanto endogenamente como por via
exógena, a partir reações de óxido-redução induzidas por contaminantes.
32
A enzima catalase também tem papel importante na detoxificação de
compostos tóxicos, como o H2O2, possuindo então uma ação antioxidante (STEGEMAN et
al., 1989). A formação de radicais livres é extremamente prejudicial ao organismo já que
pode se unir a qualquer componente celular, como ácidos nucléicos e lipídeos de
membrana, e induzindo a carcinogênese.
Alguns compostos podem causar aumento na oxidação de ácidos graxos,
que por sua vez aumentam a produção de H2O2. Nestes casos, a atividade hepática da
catalase sofre aumento, como o que foi observado por MATKOVICS et al. (1980, apud
HUGGET, 1992) ao expor camundongos ao Paraquat Resultados semelhantes também
foram encontrados em animais expostos a PAH (hidrocarbonetos aromáticos policíclicos)
e efluentes de fábrica de papel e celulose.
Neste trabalho, os animais confinados no Ponto D apresentaram valores
significativamente mais baixos para a atividade hepática da catalase que os demais
animais, exceto para os animais do local Referência, dos quais não foram diferentes
(Tabela 7). Esse resultado indica uma baixa atividade da enzima catalase, o que, por sua
vez, pode estar relacionado com as temperaturas mais baixas registradas para o ponto D.
Como os teleósteos são animais caracteristicamente pecilotermos, em temperaturas
menores há uma redução proporcional do metabolismo energético, levando a um
decréscimo do metabolismo oxidativo e conseqüentemente da geração de radicais livres.
A partir desses resultados apresentados pode-se perceber a relevância
de trabalhos deste tipo para avaliação tanto da qualidade ambiental quanto dos melhores
parâmetros a serem usados em cada situação.
Os testes realizados nas 4 localidades do Alto Ribeirão Cambé sugerem
que existe um comprometimento da qualidade de suas águas, já que os peixes
confinados nestes locais apresentaram algumas alterações funcionais geralmente
relacionadas com contaminação. Entretanto, trata-se de um trabalho preliminar que
apontou para problemas que devem ser estudados mais a fundo, com futuras repetições
dos testes em outras épocas do ano, inclusive para se avaliar se a contaminação dos
locais, bem como as respostas observadas, sofrem algum tipo de variação sazonal.
33
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