→ FOOD FROM SPIRULINA
→ INTRODUÇÃO
O kit "Food from Spirulina", apresenta uma forma nova e interessante de estudar a fotossíntese.
Usando a luz como fonte de energia, os alunos aumentam a produção de spirulina, observando o
escurecimento da amostra à medida que os micróbios aumentam em número. Para a ocorrência de
fotossíntese a necessidade de carbono é claramente demonstrada ao comparar os resultados com
os de controlo. Por sua vez a taxa de fotossíntese pode ser avaliada através da recolha do oxigénio
produzido. Ao utilizar a spirulina como fonte de alimentação e oxigénio, em contexto real, como
é o caso das viagens espaciais, pretende-se promover o pensamento crítico nos alunos sobre a
experiência.
→ INFORMAÇÃO DE APOIO
A spirulina (Arthropira platensis - Figura 1) é um micróbio simples, unicelular e fotossintético. Faz
parte de um grupo de organismos conhecidos como cianobactérias, devido à sua cor verde-azulada.
Este grupo é normalmente identificado como algas verde-azuladas, mas este é um nome enganoso já
que as algas são eucariotas (as suas células têm núcleos) e as cianobactérias, como outras bactérias,
são procariotas (as suas células não têm núcleo).
Acredita-se que as cianobactérias terão sido dos primeiros organismos a colonizarem o planeta Terra
há 3.5 milhões de anos. Foi, provavelmente, a sua capacidade de produzir oxigénio por fotossíntese
que produziu a atmosfera rica em oxigénio em que vivemos agora e que levou a um aumento da
biodiversidade do planeta.
As cianobactérias são maiores do que a maioria das outras células bacterianas e isto significa que,
ao contrário da maioria das bactérias, podem ser vistas através de um microscópio. Apesar de serem
organismos unicelulares, as células de spirulina juntam-se para formar longos filamentos helicoidais
verdes.
Assim como as plantas, a spirulina é um ser autotrófico.
Isto significa que produz a sua própria comida, usando
a energia do Sol para converter dióxido de carbono em
glicose por meio de fotossíntese. Neste processo a água
é oxidada e produz oxigénio. A equação que representa
a fotossíntese é:
6CO2 + 6H2O -> C6H12O6 + 6O2
Esta simples equação esconde o facto da fotossíntese
ocorrer em duas etapas distintas. A primeira etapa é
conhecida como a etapa dependente da luz, uma vez
que só ocorre se houver uma fonte de energia luminosa.
A luz é usada para separar moléculas de água em
hidrogénio e oxigénio. O processo também produz
uma reserva de energia que é utilizada, juntamente
com o hidrogénio, no final do processo fotossintético.
Para a célula, o oxigénio é um produto indesejado da
fotossíntese, embora também seja utilizado para a sua
respiração.
2
Figure 1: Spirulina vista ao microscópio (X250)
A segunda etapa é conhecida como a etapa independente da luz, uma vez que pode ter lugar mesmo
no escuro. Aqui a energia e hidrogénio produzidos na etapa da luz são utilizados para converter as
moléculas de dióxido de carbono em açúcares de seis carbonos, tipicamente glucose. É a partir desses
açúcares que os hidratos de carbono mais complexos, aminoácidos e outros produtos químicos são
feitos.
É a capacidade de fixar o dióxido de carbono em açúcar dos organismos fotossintéticos que os torna
fundamentais no ciclo do carbono; existem vários processos que adicionam dióxido de carbono à
atmosfera, mas apenas a fotossíntese é capaz de removê-lo. Estes pequenos micróbios unicelulares,
como a spirulina, têm um papel importante no ciclo do carbono devido à abundância.
Num ecossistema fechado (sistema em que não haja trocas de material com o exterior), é vital
que o ciclo do carbono esteja em perfeito equilíbrio. Os ecossistemas fechados recebem energia
do exterior (por exemplo luz solar), teoricamente, a manutenção do ciclo de carbono pode ser
usado como um sistema de suporte à vida durante um voo espacial. Num ecossistema fechado
os produtos produzidos por uma espécie devem ser reutilizados por uma outra. É fácil de perceber
como a spirulina pode ser útil num sistema deste tipo, fornecendo alimentos aos astronautas e
como fonte de oxigénio. Por sua vez o dióxido de carbono exalado pelos astronautas seria utilizado
pela spirulina para fotossíntese.
Uma dieta saudável para o ser humano contém hidratos de carbono, lipídios (gorduras e óleos),
proteínas, vitaminas, minerais, fibras e água. A spirulina pode fornecer uma boa parte desta dieta. A
spirulina foi uma fonte de alimento para os aztecas até o século XVI.
A spirulina é particularmente eficaz na conversão de açúcares em proteína. Os altos níveis de proteína
que contém tornaram-na num reconhecido suplemento alimentar vendido em lojas de alimentos
saudáveis. É também utilizado como um suplemento alimentar de baixo custo para animais, mas o
seu maior potencial é como alimento para seres humanos.
A spirulina contém todos os oito aminoácidos essenciais (aminoácidos que os seres humanos
precisam de obter através da sua alimentação, pois não podem produzi-los) e, portanto, é
considerado importante nos voos espaciais tripulados da ESA. O uso da spirulina está a ser analisado
no programa Melissa. A reciclagem do CO2 da respiração dos astronautas em O2 e o fornecimento
de biomassa para os astronautas consumirem aproximam este sistema a um ecossistema fechado.
Gnocchi (massa preparada à base de batata) de spirulina podem vir a ser a primeira comida gourmet
servida em Marte!
3
→ ATIVIDADE EXPERIMENTAL
Materiais
Material do kit spirulina (ver Figura 2):
•
2 tubos contendo 10 ml de spirulina. Se a spirulina estiver em boas condições os tubos deverão ter uma cor
verde escura. Se apresentarem uma cor verde-clara ou amarelo-esverdeado, a amostra de spirulina pode estar
danificada. Pode ser visível algum aglomerado.
•
Um saco de pó com bicarbonato (+). (O bicarbonato proporciona uma fonte adicional de carbono, porque a
respiração do aluno por si só pode não ser suficiente para a sobrevivência da spirulina).
•
Um saco de pó sem bicarbonato (-).
•
2 tubos contendo 1 ml de solução de micronutrientes.
•
2 frascos de culturas .
•
2 rolhas de borracha.
•
2 tubos de silicone longos.
•
Um tubo de silicone curto.
•
Filtro de ar (0,2 μm) com um conjunto de tubos flexíveis.
Materiais a fornecer pela escola:
•
Marcador permanente ou caneta de acetato.
•
Tesoura.
•
Régua (30cm).
•
Elástico.
•
Luvas de laboratório de latex (sem pó) ou equivalentes. Se não houver, lave bem as mãos antes de manusear o
equipamento.
•
Câmaras de recolha de gás: Duas seringas para gás ou duas provetas de 100mL (mínimo) para recolher o gás
oxigénio produzido (duas garrafas de plástico limpas de 500ml também servem).
•
2 grandes taças / recipientes onde se possam colocar as câmaras de recolha de gás.
•
Água mineral (200 ml) para os frascos de spirulina e água da torneira para a recolha de gás.
•
fósforos grandes / fósforos / isqueiro.
•
Relógio ou temporizador.
•
2 termómetros + fita adesiva.
•
Câmara fotográfica (a câmara de um telemóvel é suficiente).
•
Papel de filtro e funis.
•
Candeeiro de mesa (de preferência incandescente, mas um de baixo consumo de energia poderá também
funcionar).
Figure 2: O conteúdo do kit
4
Notas sobre a Spirulina
Se não usar o kit de imediato, deverá armazená-lo à temperatura ambiente e num local iluminado
(~20 °C).
A spirulina é um organismo vivo e requer luz e nutrientes para sobreviver. Portanto, deverá usar o kit
de imediato e nunca mais do que cinco dias após a sua receção.
A spirulina é sensível à temperatura. Temperaturas acima de 40°C irão matá-la, enquanto
temperaturas abaixo dos 25°C desaceleram o seu crescimento consideravelmente e prejudicam a
produção de oxigénio.
Uma vez que a experiência esteja a decorrer deverá monitorizar a temperatura de sua cultura e
mantê-la à temperatura ótima de 30°C. A experiência deve ser deixada perto de uma fonte de calor
(radiador ou candeeiro de mesa). Evite janelas já que a temperatura pode oscilar.
Cuidados a ter
•
Não aspirar/sugar pelo tubo mais curto ligado ao filtro de ar.
•
Não aspirar/sugar ou soprar para os tubos longos.
•
Não soprar fortemente para a garrafa na etapa 34.
•
Não comer ou beber qualquer um dos produtos desta experiência!
•
Verificar se os alunos têm alergia ao látex antes de calçarem as luvas
5
→ PROCEDIMENTO
Os alunos podem realizar as etapas deste protocolo com assistência do professor. Os passos 13, 15, 18
podem ser mais difíceis de realizar pelos alunos – é recomendado que sejam adultos a realizar essas
etapas.
Nota: Se a inserção de tubos através das rolhas de borracha se tornar problemática, considere a
adição de pequenas quantidades de lubrificante à base de água ou de bálsamo para os lábios no
tubo. Preste muita atenção na etapa 13 se usar lubrificante!
Instalação: avaliar a distância / temperatura e condições de iluminação
1. Lave bem as mãos e calce luvas de laboratório, se disponíveis.
2. Abra o kit.
3. Certifique-se que o inventário está completo e que todo o equipamento está intacto.
4. Usando a caneta, marque um frasco com "+" e o outro com "-".
5. Selecione a área onde a experiência será realizada (evitar áreas frias / e com correntes de ar).
6. Ligue um termómetro a 50 centímetros de distância do candeeiro de mesa e meça a
temperatura. Ligue o candeeiro e registe a temperatura 10 minutos depois.
7. Mova o termómetro para 10 centímetros mais perto e repita a medição após 10 minutos.
8. Repita o passo 7 até à leitura do termómetro ultrapassar os 40 graus Celsius. Não exceda a
temperatura máxima do termómetro.
9. Assinale a distância em que obteve uma temperatura entre 30 e 40 graus Celcius. Os frascos
serão colocados a esta distância da fonte de luz.
10. Se possível, use um fotómetro (aparelho que mede a intensidade da luz) e registe a
intensidade da luz a estas distâncias, apresente os dados num gráfico (existem aplicações
para smartphones gratuitas que poderão fazer medições aproximadas). Idealmente a
iluminação deve estar entre 5 e 50 kilolux.
11. Traçar a curva dos resultados, temperatura e intensidade da luz.
Nota: Muita luz pode ser prejudicial para a spirulina, especialmente quando as culturas são de baixa
densidade. Por favor, permaneçam dentro da faixa indicada.
Configuração do Tubo "+"
12. Usando uma tesoura, corte através das extremidades de uma das rolhas de borracha. Esta
rolha de borracha deverá agora ter dois furos abertos.
Nota: Se foi aplicado bálsamo labial, garanta que a parte lubrificada não se estende para fora da
parte mais estreita da rolha na etapa 13.
13. Pegue no tubo de silicone curto e empurre-o suavemente através dos furos na tampa até que
14 centímetros dos tubos ultrapassem a extremidade mais estreita da rolha de borracha.
14. Para os tubos que se estendem para fora da extremidade mais larga da rolha de borracha,
coloque a unidade de filtros usando o tubo macio fornecido nesse conjunto.
15. Pegue no tubo de silicone longo e empurre-o suavemente através do outro furo na extremidade
mais larga da rolha até que só apareça a parte mais estreita da rolha.
16. Guarde para ser usado mais tarde.
6
Configuração do Tubo "-"
17. Usando uma tesoura, corte UMA das extremidades da outra rolha de borracha. Esta rolha
de borracha deve agora ter apenas um furo.
18. Pegue no tubo de silicone longo e empurre-o suavemente pelo furo aberto na ponta mais
larga da rolha até que só apareça na parte mais estreita da rolha.
19. Guarde para ser usado mais tarde.
Configuração da câmara de recolha de gás
20.Encha o(s) copo(s) grande(s) ou recipiente(s) até cerca de ¾ da capacidade com água da
torneira.
21. Encha provetas graduadas (ou garrafas de 500 ml) com água da torneira – assegure-se que
estes estão cheios.
22. Inverta os recipientes da etapa anterior, de modo a que fiquem com a abertura para baixo e
contenham ainda água (terá que fechá-los). Repita o procedimento com ambos os cilindros /
garrafas. Estes dispositivos irão recolher todo o gás produzido a partir da spirulina. Se algum
gás for acidentalmente preso na inversão marque-o como "ponto zero" com a caneta.
23. Pegue no tubo de silicone longo destinado para o Frasco '-' (passos 17-19) e empurre com
cuidado a extremidade a partir da rolha de borracha através da abertura do cilindro / garrafa
mantendo-o sempre dentro de água. Os tubos devem estar o mais alto possível no recipiente
invertido.
24.Repetir o passo 23 com tubo de silicone destinado ao Frasco “+” (etapas 12-16).
Preparação da solução para os frascos
25.Coloque 100ml de água mineral à temperatura ambiente em cada frasco ('-' e '+').
26.Em cada frasco, adicione cuidadosamente o conteúdo (~ 1 ml) dos tubos fornecidos. Pode
precisar de abanar o tubo com o dedo para obter a maior parte do conteúdo do tubo.
27. No frasco '-', adicione o conteúdo em pó do saco rotulado '-' (corte o saco abaixo do selo para
facilitar a extração do conteúdo).
28.Para o frasco '+', adicione o conteúdo em pó do saco rotulado '+' (corte o saco abaixo do selo
para facilitar a extração do conteúdo).
29.Tape os frascos (tampa azul) e agite suavemente até que o conteúdo se dissolva.
Início da experiência
30.Retire a tampa do frasco '-' e adicione todo o conteúdo de uma amostra de spirulina.
31. Agite o frasco '-' delicadamente e adicione a rolha de borracha com o tubo longo (passos 1719), até que o frasco esteja vedado.
32. Retire a tampa do frasco '+' e adicione todo o conteúdo de uma amostra de spirulina.
7
33. Agite o frasco '+' suavemente e insira o tubo que se estende a partir da extremidade mais
estreita da tubagem '+'. (Passos 12-16). Não sele este frasco AINDA.
34.Mantendo o frasco aberto, peça a um estudante que expire durante 20 segundos para o
filtro de modo a que o gás exalado borbulhe através da suspensão de spirulina.
35. Feche o frasco '+', segurando a rolha de borracha com firmeza.
36.Sele o conjunto inserindo o tubo flexível no tubo do filtro e fixando-o nesta posição com o
elástico.
37. Observe e marque os níveis de gás em cada câmara de recolha de gás com um marcador.
38.Coloque todos os frascos ('+' e '-') e câmaras de recolha de gás próximos na área selecionada
no início (passos 5-10).
39.Coloque um termómetro no lado de cada frasco para monitorizar a temperatura do
conjunto.
40.Mantenha os frascos na posição vertical durante toda a experiência.
Consulte a Figura A1 para a montagem do frasco '+':
IMPORTANTE:
Notas sobre a localização da experiência
Embora as condições ideais sejam de 30 graus
Celsius e luz solar intensa, estas não são
facilmente reproduzíveis em muitas salas de
aula. Por favor aproximem-se destas condições,
assegurando luz suficiente, seguindo os passos
de preparação (5-10) e mantendo a experiência
o mais perto de 30 graus possível. Por favor,
evite flutuações de temperatura.
Figure A1: Exemplificação da montagem.
8
Diariamente (consulte as tabelas em anexo)
Nota: A experiência pode levar alguns dias (5-7 dias) antes de mostrar sinais óbvios de produção de
gás, devido a uma fase de 'atraso' que a spirulina tem ao ser diluída 1/10.
41. Tire uma foto do conjunto - tente tirar uma foto semelhante todos os dias.
42.Agite suavemente os frascos para voltar a suspender a spirulina.
43.Faça o registo da cor da cultura (após a suspensão).
44.Terminar a experiência se houver crescimento de bactérias ou fungos (verifique a produção
em excesso de gás num curto espaço de tempo).
45.Repita os passos 41-44 até que haja pouca ou nenhuma produção de gás em todos os
frascos. (Pode durar até duas semanas).
OPCIONAL: Pode querer medir outros parâmetros, como pH. Lembre-se que a remoção das rolhas de
borracha dos frascos irá afetar a qualidade do gás recolhido na câmara de recolha de gás.
No final da experiência
46.Apresente os seus dados num gráfico - Volume de gás recolhido / hora.
47.Apresente os seus dados num outro gráfico em função da cor.
48.Teste o gás produzido: remova o tubo longo da câmara de recolha de gás. Inverta as
câmaras mantendo-as seladas. Segure um fósforo incandescente perto da abertura de cada
câmara e retire o selo - o oxigénio vai fazer a chama brilhar mais vigorosamente.
49.Teste da biomassa produzida: Pese um papel de filtro limpo (use uma escala adequada
capaz de μg (microgramas) de precisão). Usando o papel de filtro e funil, filtre a suspensão
de spirulina lentamente. Tente manter o filtrado perto da parte inferior do filtro. Permitir
que o papel de filtro seque naturalmente durante cerca de 4 dias. Pese o papel de filtro. A
diferença de peso será a da massa de spirulina produzida (massas estimadas: cada amostra
contém ~10 μg - no final da experiência é de esperar ~ 100 μg).
50.Se a sua escola não possui balanças adequadas (precisão de μg) pode comparar a
área ocupada pela spirulina no papel de filtro e comparar os dois frascos, controlo (-) e
experiência (+)
Cuidado: não comer esta Spirulina!
Nota final: Caso queira manter a cultura de spirulina, consulte o protocolo experimental original da
ESA para mais detalhes de como o fazer.
9
→ TABELAS
→ TABELA 1
Distância (cm)
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Intensidade luminosa
11
Temperatura (0C)
→ TABELA 2
Dia
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Temperatura (0C)
Gas (+)
Gas (-)
Comentários
LABORATORY FOR MOLECULAR
AND CELLULAR BIOLOGY
PROTOCOL VERSION :
02
DATE
STANDARD OPERATING PROCEDURE
: 2009-05-27
AUTHOR:
ZARROUK-UBP
PAGE :
Culture medium for Arthrospira sp
PCC8005
Ilse Coninx
1/1
1. Introduction
Zarrouk is an alkaline saline culture medium for the bluegreen photosynthetic cyanobacterium
Arthrospira sp.
2. Composition
The medium is prepared according to the optimization of G.Cogne from UBP (G. Cogne,2002
) In this optimised composition, the macro-elements solutions (solution 1 and 2) slightly
different from the original ZARROUK macro-elements solutions (Zarrouk, 1966 ). The number
of products in the trace-element solution are decreased and some elements are reduced in
concentration in the new protocol.
2.1. Macro-elements
Solution 1
Components for 1L medium, but dissolved in 500 mL
Component
g/L
Authorized supplier
K2HPO4
0.5 g
MERCK MERCK / VWR
NaHCO3
10.5 g
MERCK / VWR
Na2CO3
7.6 g
MERCK / VWR
Solution 2
Components for 1L medium, but dissolved in 500 mL
Component
g/L
Authorized supplier
NaNO3
2.5 g
MERCK / VWR
K2SO4
1.0 g
MERCK / VWR
NaCl
1.0 g
MERCK / VWR
MgSO4. 7 H2O
0.08 g or 8 mL from 1% solution
MERCK / VWR
CaCl2
0.03 g or 3 mL from 1% solution
MERCK / VWR
FeSO4. 7 H2O
0.01 g or 1 mL from 1% solution
SIGMA
EDTA
0.08 g or 8 mL from 1% solution
SIGMA
LABORATORY FOR MOLECULAR
AND CELLULAR BIOLOGY
STANDARD OPERATING PROCEDURE
ZARROUK-UBP
Culture medium for Arthrospira sp
PCC8005







PROTOCOL VERSION :
02
DATE
: 2009-05-27
AUTHOR:
PAGE :
Ilse Coninx
1/1
All products for trace-elements are weighed and dissolved separately in a total
volume of 1 L milliQ water.
All products should be dissolved before autoclavation!
Check the pH of the solutions before autoclavation
The pH should be around 9.5
Sterilize all solutions by wet-heat sterilisation at 121°C, and 1 bar for 20 minutes.
After cooling of all the solutions, mix 250 mL macro-element solution 1 and 250 mL
macro-element solution 2
Add macro-element solution to the agar, approximately 60 à 70°C
Add 1 mL of the trace-elements to the macro-element (mixed) solution
4. Storage

Liquid zarrouk medium should be stored at 4°C and used within 6 months.

Trace-elements should be stored at 4°C and used within 1 year
5. Disposal

If the medium is contaminated or expired, disinfect and neutralise the medium before
storage in liquid waste containers.
6. References
G. Cogne et All; 2002, Uptake of Macrominerals and Trace Elements by the Cyanobacterium
Spirulina platensis (Arthrospira platensis PCC 8005) Under Photoautotrophic Conditions:
Culture Medium Optimization
DOI: 10.1002/bit.10504
LABORATORY FOR MOLECULAR
AND CELLULAR BIOLOGY
STANDARD OPERATING PROCEDURE
ZARROUK-UBP
Culture medium for Arthrospira sp
PCC8005
PROTOCOL VERSION :
02
DATE
: 2009-05-27
AUTHOR:
PAGE :
Ilse Coninx
1/1
2.2. Trace-elements
Components for 1L medium,
Component
g/L
Authorized supplier
MnCl2. 4H2O
0.23 g or 23 mL from 1% solution
MERCK / VWR
ZnSO4. 7 H2O
0.11 g or 11 mL from 1% solution
CuSO4. 5 H2O
0.03 g or 3 mL from 1% solution
2.3. Agar
Components for 1L medium, but dissolved in 500 mL
Component
g/L
Authorized supplier
Agar
15 g
INVITROGEN
3. Medium preparation
Liquid







Agar



All products for the macro-elements are weighed and dissolved separately in a total
volume of 500 mL milliQ water.
All products for trace-elements are weighed and dissolved separately in a total
volume of 1 L milliQ water.
All products should be dissolved before autoclavation !
Check the pH of the solutions,
The pH should be around 9,5
Sterilize all solutions by wet-heat sterilisation at 121°C, and 1 bar for 20 minutes.
After cooling of all the solutions, mix 500 mL macro-element solution 1 and 500 mL
macro-element solution 2
Add 1 mL of the trace-elements to the macro-element (mixed) solution
All products for the macro-elements should be double concentrated
All products for the macro-elements are weighed and dissolved separately in a total
volume of 250 mL milliQ water.
500 mL 1,5% agar solution is prepared
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