A bactéria E.coli e a sua resistência ao antibiótico ampicilina
Problema: Será que a bactéria E.coli desenvolve resistência ao antibiótico ampicilina?
Procedimento:
O procedimento realizado teve como base as orientações fornecidas pelo “Ciência
Viva”, no entanto tivemos que ajustar os diferentes passos às condições existentes no
laboratório da escola.
Assim, vamos exemplificar algumas das etapas realizadas, ilustrando com as fotografias
retiradas ao longo da actividade experimental.
Fig. 1- Embrulhar o material de vidro em papel
de Kraft para ser colocado na estufa a 170 ºC .
Fig. 3 - Material na estufa
Fig. 6 – Misturar os componentes no balão de
Erlenmyer e ferver se contiver agar.
Fig. 2 - Realização de rolhas de algodão
hidrófobo e gaze para os balões de Erlenmeyer.
Fig. 5 - Pesar os diferentes componentes do meio LB
sem agar e com agar.
Fig. 9 – Esterilizar o meio de cultura no
autoclave
Fig. 10 – Preparar as caixas de Petri com meio de
cultura
Fig. 12 – Esterilização da ansa de inoculação para realização
da técnica do riscado.
Fig. 14 – Técnica do riscado para
obtenção de colónias de E. coli
Fig. 11 – Preparação do material para inocular as placas com E.
coli (Câmara de fluxo laminar).
Fig. 13 – Retirar a E.coli do tubo Eppendorf
Fig. 15 – Raspar uma colónia de E.coli na placa que esteve
24 horas na incubação
Fig. 16 – Prepara a cultura -mãe
Fig. 18- Obtenção das diluições da cultura-mãe em
tubos de ensaio com PBS
Fig. 20- Inocular a Placa mãe+Ap.
Colocar três gotas em cada sector da placa
Fig. 17 – Obtenção da cultura -mãe após incubação a 37 ºC
Fig. 19- Homogeneizar bem o conteúdo
do tubo de ensaio no vórtex
Fig. 22- Obtenção das placas com e sem
ampicilina a partir dos tubos A e B
Representações esquemáticas que ajudam a realizar o procedimento laboratorial
- Preparar de 4 tubos PBS – 1, 2, 3, 4- com 9 mL de PBS
1 mL
C.
Mãe
1 mL
1 mL
1
2
1 mL
3
4
Nota: Entre cada transferência misturar bem o conteúdo do tubo de ensaio.
- Colocar 3 gotas uniformemente espaçadas de 10 µl de cada um dos tubos, seguindo esquema
acima representado.
C.
10-2
Mãe
10-3
10-6
Placa A:
10-5
4
10
-4
1
Mãe+AP
2
3
- Inocular um tubo de 10 mL de meio+ 10 µl de cultura –mãe
Tubo A- 10 mL de
meio LB+ 100 µl
cultura-mãe
- Inocular um tubo de 10 mL de meio+ 10 µl de ampicilina +100 µl de cultura –mãe.
Tubo B- 10 mL de meio
LB+ 10 µl de ampicilina+
100 µl cultura-mãe
- Numerar 8 tubos PBS- 9 mL de PBS.
Tubo A
1 mL
C. Mãe
1 mL
1
1 mL
2
1 mL
3
1 mL
4
1 mL
5
1 mL
1 mL
6
7
8
- Dividir duas placas de Petri que possuem o meio de cultura LB+Agar com e sem
ampicilina em 5 cunhas iguais e rotulá-las.
Colocar 3 gotas uniformemente
4
espaçadas de 10 µl de cada tubo
10-6
de acordo com o esquema
10-7
10-10
8
10-9
10
5
Rotular a Placa
Grupo A - Ap
-8
Rotular a Placa
Grupo A + Ap
6
7
Nota - Efectuar estes mesmos procedimentos com o tubo B
Resultados obtidos:
- Não houve crescimento de unidades formadoras de colónias (UFC) nas seguintes placas:
Placa Mãe+Ap, Placa A-Ap, Placa A+Ap, e Placa B+ Ap
- Houve o crescimento de algumas unidades formadoras de colónias na placa B sem ampicilina
Fig. 21- Placa de Petri onde houve o crescimento de UFC
Fig. 21- Placas de Petri após a incubação
- Cálculos efectuados:
Placa B-AP
10-6
2
2x
10-7
2
106
2x
10-8
2
107
2x
10
8
Conclusões: Os resultados indicam que as bactérias que estiveram no tubo B em contacto com a ampicilina, não
morreram todas, pois quando as bactérias são colocadas a crescer num meio sem antibiótico (placa B-ap) algumas
bactérias formam UFC. No entanto, a resistência desenvolvida ao antibiótico não foi possível de ser analisada, pois
a E. coli não se desenvolve na placa B+Ap . Seria de esperar que as bactérias mais resistentes ao antibiótico
formassem colónias nesta placa.
Através da execução deste trabalho laboratorial desenvolvemos competências no trabalho laboratorial na
área da Microbiologia. Apesar do nosso esforço e rigor técnico os resultados não ocorreram conforme o esperado.