UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA REABILITAÇÃO
EFEITO DO ANABOLIZANTE DECANOATO DE NANDROLONA NA
PROLIFERAÇÃO, ADESÃO E DIFERENCIAÇÃO DE OSTEOBLASTOS.
TATIANA DIAS DA SILVA
São Paulo, SP
2010
TATIANA DIAS DA SILVA
EFEITO DO ANABOLIZANTE DECANOATO DE NANDROLONA NA
PROLIFERAÇÃO, ADESÃO E DIFERENCIAÇÃO DE OSTEOBLASTOS.
Dissertação apresentada
à Universidade Nove de
Julho, para obtenção do
título
de
Mestre
em
Ciências da Reabilitação.
.
Orientadora: Profa. Dra. Kristianne Porta Santos Fernandes
Co-orientadora: Profa. Dra. Raquel Agnelli Mesquita Ferrari
São Paulo, SP
2010
FICHA CATALOGRAFICA
Silva, Tatiana Dias.
Efeito do anabolizante decanoato de nandrolona na proliferação, adesão
e diferenciação de os teoblastos. / Tatiana Dias Silva. 2010.
46 f.
Dissertação (mestrado) – Universidade Nove de Julho – UNINOVE Ciências da Reabilitação, São Paulo, 2010.
Orientador (a): Profa. Kristianne Porta Santos Fernandes.
1. Osteoblastos. 2. Nandrolona. 3. Proliferação. 4. Adesão. 5.
Diferenciação. 6. Fosfatase alcalina.
CDU 615.8
5
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho ao meu pai Pedro, que proporcionou minha formação
acadêmica e sempre me incentivou para que continuasse estudando e
correndo atrás dos meus sonhos. Meus sinceros e eternos agradecimentos,
pois sem você nada disso seria possível.
6
AGRADECIMENTOS
Várias pessoas contribuíram para esse trabalho. A todas elas deixo aqui meus
sinceros agradecimentos.
À minha amada mãe Maria Madalena Dias por todo amor, carinho e palavras
de encorajamento.
Ao meu marido Eduardo Schalch por sempre acreditar em mim e nunca me
deixar desistir, pela sua paciência, amor, carinho e compreensão nos dias
difíceis.
A minha querida irmã Pollyana Dias da Silva pelo carinho, incentivo e ombro
amigo tantas vezes, pela hospedagem nos dias de rodízio, muito obrigada por
tudo.
Ao meu filho-irmão Ayres Augusto da Silva pelo seu bom humor sempre, e
sua alegria de viver que espantavam a ainda espantam qualquer mau humor,
obrigada por existir na minha vida e fazer meus dias mais felizes.
À minha irmã do coração Bianca Fréo pela amizade sincera, pelo incentivo nos
momentos difíceis, pela disposição em me ajudar sempre, muito obrigada.
À minha orientadora Profa. Dra. Kristianne Porta Santos Fernandes, que
sempre esteve presente em todas as etapas da minha vida profissional e a
quem devo minha trajetória até aqui, sempre foi e será um exemplo pra mim de
competência e capacidade.
À minha co-orientadora e amiga Profa. Dra. Raquel Agnelli Mesquita-Ferrari,
agradeço por toda paciência comigo e dedicação a este trabalho.
À Profa. Dra. Sandra Kallil Bussadori pelas críticas construtivas e suas
correções sempre pertinentes que contribuíram muito para esse trabalho.
7
À Profa. Dra. Márcia Martins Marques pela doação das células OSTEO I que
propiciaram este estudo.
A todos os professores do programa de Mestrado em Ciências da
Reabilitação que de uma maneira ou outra contribuíram para este trabalho com
seus ensinamentos.
A todos os alunos de iniciação científica, especialmente a Nádhia Helena
Costa Souza que me ensinou muito e colaborou de maneira fundamental para
a realização de todos os experimentos.
A todos os funcionários da Uninove, principalmente à Tábata Oliveira que
muito nos auxiliou nas atividades laboratoriais.
A
técnica
do
Centerlab
Sandra
Hiromi
Haramoto
meus
sinceros
agradecimentos.
Ao meu amigo e colega de mestrado Gustavo Tralli Nogueira por todo
companheirismo, cumplicidade e amizade.
Finalmente a Deus por sua intercessão em minha vida.
8
RESUMO
A osteoporose é um importante problema de saúde pública no mundo
todo. Assim, estudar fatores que possam influenciar a regeneração óssea é de
fundamental importância na prevenção e recuperação clínica de pacientes
idosos. Como os esteroides anabolizantes vêm sendo indicados nestes
quadros, o objetivo desse trabalho foi avaliar in vitro o efeito do anabolizante
esteróide decanoato de nandrolona nas concentrações de 5, 10, 25 e 50μM
sobre a proliferação, adesão e diferenciação de osteoblastos (linhagem
OSTEO-1). Para a análise da proliferação celular, foram realizadas curvas de
crescimento após 24, 48 e 72 horas de cultivo utilizando o método MTT. A
avaliação do efeito do anabolizante sobre a adesão celular foi realizada pelo
mesmo método após 20, 40 e 60 minutos do plaqueamento. Já a avaliação da
diferenciação celular foi realizada por meio da mensuração da concentração da
enzima fosfatase alcalina em lisados de culturas celulares, utilizando um kit
comercial específico, após 72 horas de cultivo. Culturas não tratadas serviram
como controle. Para cada condição experimental, foram realizados 3
experimentos em quadruplicata e os resultados foram submetidos à análise
estatística, utilizando ANOVA/Tukey (p ≤ 0,05). Os resultados demonstraram
que após 72 horas de cultivo, houve diminuição estatisticamente significante na
proliferação de osteoblastos tratados com nandrolona 50μM, porém este
mesmo grupo demonstrou um aumento estatisticamente significante na
diferenciação celular em comparação ao grupo controle. Já com relação à
adesão celular, houve aumento estatisticamente significante nos grupos que
receberam anabolizante na concentração de 25μM após 40 e 60 minutos de
incubação. Embora o tratamento com anabolizante na dosagem de 50μM tenha
demonstrado favorecer a diferenciação dos osteoblastos, esta mesma
dosagem não aumentou a adesão celular. Assim, há necessidade de continuar
avaliando o efeito do decanoato de nandrolona no tecido ósseo, utilizando
modelos in vitro e in vivo a fim de estabelecer a adequação de seu uso e de
sua dosagem na prevenção e tratamento da osteoporose.
Palavras chave: Osteoblastos; Nandrolona; Proliferação celular; Adesão
celular; Diferenciação celular; Fosfatase alcalina.
9
ABSTRACT
Osteoporosis is an important public health problem worldwide. The study
of factors that may influence bone regeneration is of fundamental importance in
the prevention of osteoporosis and clinical rehabilitation of elderly patients.
Because anabolic steroids have been indicated for the treatment of such cases,
the objective of this study was to evaluate the in vitro effects of the anabolic
steroid nandrolone decanoate at concentrations of 5, 10, 25, and 50 μM on the
proliferation, adhesion and differentiation of osteoblasts (osteo-1 cell line). For
the analysis of cell proliferation, growth curves were obtained after 24, 48 and
72 hours of culture using the MTT method. This same method was used to
evaluate the effects of the anabolic steroid on cell adhesion 20, 40 and 60
minutes after plating. However, cell differentiation was evaluated by measuring
alkaline phosphatase enzyme concentration in lysed cells after 72 hours of
culture, using a specific commercial kit. Untreated cultures were used as
controls. For each experimental condition, 3 experiments were performed in
quadruplicate. Experimental data were statistically analyzed using analysis of
variance (ANOVA) followed by Tukey’s post-hoc multiple comparison test (p ≤
0.05). The results showed that there was a significant decrease in the
proliferation of osteoblasts treated with 50 μM nandrolone decanoate after 72
hours of culture; however, cell differentiation increased significantly in this group
compared with the control group. Also, a significant increase in cell adhesion
was found in the groups treated with 25 μM nandrolone decanoate after 40 and
60 minutes of incubation. It was observed that the treatment with anabolic
steroid at a concentration of 50 μM increased osteoblast differentiation, but not
cell differentiation. Therefore, further studies on the effects of nandrolone
decanoate on bone tissue using in vivo and in vitro models are necessary to
determine its appropriate use and dosage in the prevention and treatment of
osteoporosis.
Keywords: Osteoblasts; Nandrolone; Cell proliferation; Cell adhesion; Cell
differentiation; Alkaline phosphatase.
10
SUMÁRIO
1. CONTEXTUALIZAÇÃO...............................................................................13
2. ESTUDO.......................................................................................................17
3. CONSIDERAÇÕES FINAIS.........................................................................33
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................37
ANEXO I: Protocolo de submissão de artigo para publicação Revista
Brasileira de Fisioterapia................................................................................47
ANEXO II: Artigo Publicado na Revista Fisioterapia Brasil.........................48
ANEXO III: Artigo Publicado na Revista Lasers and Medical Science.......49
11
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Proliferação celular mensurada pelo método MTT como densidade
óptica (DO), das culturas de células OSTEO-1 do grupo controle e dos grupos
experimentais
tratados
com
diferentes
concentrações
do
anabolizante
decanoato de nandrolona (5, 10, 25 e 50μM) após períodos de incubação de
24, 48 e 72 horas...............................................................................................22
Figura 2. Adesão celular mensurada como absorbância (método MTT) das
culturas de células OSTEO-I tratadas com anabolizante decanoato de
nandrolona nas concentrações 5, 10, 25 e 50μM após 40 e 60 minutos de
incubação...........................................................................................................23
Figura 3. Diferenciação celular mensurada por meio da dosagem da atividade
da fosfatase alcalina das culturas de células OSTEO-I tratadas com
anabolizante decanoato de nandrolona nas concentrações 5, 10, 25 e 50μM
após 72 horas de incubação..............................................................................24
12
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANOVA - Análise de variância
ALP - atividade de fosfatase alcalina
AR - receptor para andrógeno
BMD - densidade mineral do osso
DHEA hormônio esteróide dehidroepiandrosterona
DHT hormônio esteróide 5a-diidrotestosterona
DMEM - Meio Eagle Modificado por Dulbecco
DO - densidade óptica
DV – desvio padrão
MC3T3 linhagem celular de pré osteoblastos derivados de ratos
FNR - receptor de fibronectina
HOB - funções metabólicas dos osteoblastos
IGF-I - insulina tipo I
MAP - proteína motogênica ativada
MTT - (3-[4,5-Dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide; Thiazolyl
blue
OSTEO-1 Linhagem celular de osteoblastos derivados da calvária de ratos
PBS - Phosphate-buffered saline (solução salina tamponada com fosfato
SFB – Soro fetal bovino
TGF-b2 - fator transformador de crescimento beta 2.
13
1.
CONTEXTUALIZAÇÃO
A osteoporose é um problema de saúde mundial. Os pacientes mais
atingidos por esta condição são os idosos e neste grupo, em especial as
mulheres de baixo peso corpóreo1-3.
A etiologia da osteoporose em mulheres está associada à redução da
massa muscular e do nível de hormônios ligados a formação óssea, como os
derivados andrógenos, o fator de crescimento semelhante à insulina tipo I (IGFI) e o hormônio de crescimento3-10.
As fraturas geradas pelo enfraquecimento dos ossos trazem quadros de
alta morbidade e mortalidade principalmente para as idosas1-3. Os homens têm
risco de fraturas de apenas 15% enquanto as mulheres 40%, assim os homens
estão mais protegidos da osteoporose e de fraturas relacionadas. Portanto a
compreensão da fisiologia do esqueleto masculino pode levar a novos
tratamentos e à prevenção desta doença11.
Os andrógenos e os estrógenos circulam nos gênero feminino e
masculino, em níveis diferentes e influenciam a modelagem do esqueleto de
maneira distinta12,13.
Os
estrógenos
agem
para
manter
a
massa
óssea
adulta
predominantemente por meio da inibição da reabsorção pelos osteoclastos, ou
seja, protegem o esqueleto de uma maior perda13.
Já os andrógenos parecem ter a função de manter a massa óssea em
adultos e de influenciar o crescimento e a modelagem do esqueleto. Suas
ações podem também ser parcialmente mediadas por um receptor estrogênico
após a sua conversão para estrógeno por meio da ação da enzima
aromatase14-17.
Existem especulações de que os efeitos dos andrógenos sobre o
esqueleto sejam advindos do aumento da massa muscular que sabidamente
gera aumento na densidade óssea18-22.
Terapias de reposição hormonal tanto com estrógeno quanto com
andrógeno natural (como a dihidrotestosterona) ou sintético (como o decanoato
de nandrolona) tem se mostrado eficazes nos quadros de perda óssea
principalmente por modularem o metabolismo e a sobrevivência de
osteoblastos e osteoclastos20,23-30.
14
Ação dos andrógenos sobre os osteoblastos
O mecanismo de ação dos andrógenos sobre as células ósseas ainda
não está totalmente caracterizado16,26,31-34.
Por um lado, existem evidências que indicam que os andrógenos atuam
diretamente
sobre
os
osteoblastos,
estimulando
seu
crescimento
e
diferenciação e inibindo sua apoptose4-6,8,26,31-44. Já outros estudos relatam que
a terapia com andrógenos não altera ou até inibe as funções dos
osteoblastos45-51.
De modo geral, tem sido observado que o efeito dos andrógenos sobre
as células ósseas in vitro depende da dose e do tempo de tratamento21,31,42,52.
Esta dualidade na resposta provavelmente está associada aos
receptores celulares e a afinidade dos receptores ao tipo de andrógeno
envolvido, de maneira que cada tipo celular apresenta uma concentração
mínima abaixo da qual as células tornam-se não responsivas8,31,45,47-49,52.
Mesmo diferentes linhagens do mesmo tipo celular podem exibir níveis
de receptores variados, respondendo aos andrógenos de maneira ou em
velocidade diferenciada e esta variação pode estar ligada ao nível de
diferenciação25,31,50.
Receptores celulares para andrógenos (AR)
A presença dos receptores para andrógeno (AR) já foi demonstrada em
culturas de células osteoblatos humanos de ambos os gêneros35,53,54, em
células
de
osteossarcoma
humano55
e
em
diferentes
linhagens
de
osteoblatos25,50,56,57.
Os esteróides sexuais atuam nos osteoblastos por meio de interações
diretas com os seus receptores celulares ou indiretamente por meio da
formação de complexos entre os receptores e outros reguladores de
transcrição20,27-29,58-61.
Os andrógenos são capazes de aumentar a expressão de AR em
culturas de osteoblastos45,47-49,52. Além da maior expressão dos receptores, os
15
andrógenos também geram maior estabilidade de sua ligação aumentando
assim a capacidade dos osteoblastos responderem aos seus efeitos31,48,52,62.
Ação dos andrógenos sobre a adesão dos osteoblastos
A adesão das células ósseas a matriz extracelular é um requisito
fundamental
para
o
seu
desenvolvimento,
diferenciação,
função
e
sobrevivência63-66.
As células ósseas humanas estão ancoradas na matriz orgânica do osso
por meio de receptores que fazem parte da superfamília das integrinas. Os
receptores tipo integrina são glicoproteínas de superfície que possuem uma
cadeia α ligada de maneira não covalente a uma cadeia β67.
Dentre as várias subunidades da integrina, a α-5 e a β-1 são as mais
comuns nas células ósseas e constituem o receptor para fibronectina (FNR)68.
Os FNR humanos interagem de maneira abundante com as proteínas da matriz
óssea, em especial com a fibronectina e o colágeno I67-69.
Os andrógenos exibem parte de seus efeitos positivos sobre o
metabolismo ósseo por meio do estímulo a expressão do gene TGFβ2 41. Já foi
demonstrado que fatores de crescimento da família TGFβ levam a um aumento
da expressão gênica de fibronectina e de receptores de proteínas de
adesão64,70,71, aumentando assim a capacidade de adesão dos osteoblastos à
matriz extracelular.
Ação dos andrógenos sobre a diferenciação dos osteoblastos
A fosfatases alcalinas são reconhecidas como marcadores que refletem
a diferenciação dos osteoblastos4. Estas enzimas são glicoproteínas de
superfície que hidrolizam uma variedade de ésteres monofosfatados. Elas
agem no processo de mineralização óssea por meio de vários mecanismos:
aumentando a concentração local de fosfato inorgânico; destruindo inibidores
16
de crescimento de cristais; agindo como transportadoras de fosfato; ou ainda
atuando como proteínas ligadoras de cálcio72.
Definir o papel dos androgênios na diferenciação osteoblástica tem sido
difícil31-34,36.
A descrição dos efeitos dos andrógenos neste processo inclui relatos de
estímulo5,6,8,41,64,73-78; inibição46,79 e ainda ausência de efeito42,50,52.
O derivado andrógeno decanoato de nandrolona tem sido utilizado na
terapia de reposição hormonal visando a prevenção dos quadros de
osteoporose, porém poucos estudos avaliam seu papel sobre o metabolismo
ósseo em nível celular. Este estudo visa contribuir para esclarecer esta lacuna
no conhecimento sobre a ação deste fármaco em células ósseas.
17
2.
ESTUDO
Artigo submetido para publicação na Revista Brasileira de Fisioterapia
EFEITO
DO
ANABOLIZANTE
DECANOATO
DE
NANDROLONA
NA
PROLIFERAÇÃO, ADESÃO E DIFERENCIAÇÃO DE OSTEOBLASTOS
TRATADOS COM ANABOLIZANTE
TATIANA DIAS DA SILVA1, RAQUEL AGNELLI MESQUITA FERRARI2,
NADHIA HELENA COSTA SOUZA3, ÉRICKA CONSTANTINOV PIEDADE3,
SANDRA KALIL BUSSADORI2, KRISTIANNE PORTA SANTOS FERNANDES2
1
Aluna do Curso de Mestrado, Departamento de Ciências da Reabilitação,
Universidade Nove de Julho / São Paulo / SP / Brasil
2
Doutor, Professor Integral, Curso de Mestrado em Ciências da Reabilitação,
Universidade Nove de Julho / São Paulo / SP / Brasil
3
Graduando, Curso de Fisioterapia, Universidade Nove de Julho / São Paulo /
SP / Brasil
Autor correspondente: Kristianne Porta Santos Fernandes
Av. Francisco Matarazzo, 612, Água Branca, São Paulo, SP, CEP. 05001-100.
Phone:
(11)
3665-9325,
fax:
(11)
3365-9301,
e-mail:
[email protected]
Título
para
as
páginas
do
artigo:
PROLIFERAÇÃO,
ADESÃO
E
DIFERENCIAÇÃO DE OSTEOBLASTOS TRATADOS COM ANABOLIZANTE.
Título em inglês: PROLIFERATION, ADHESION AND DIFFERENTIATION OF
OSTEOBLASTS treated with steroid
Palavras chave: osteoblastos, nandrolona, proliferação, adesão, diferenciação,
fosfatase alcalina
18
Keywords: osteoblasts, nandrolone, cell proliferation, adhesion, differentiation,
alkaline phosphatase
Resumo:
Estudar fatores que possam influenciar a regeneração óssea é de
fundamental importância na recuperação clínica de pacientes que sofreram
traumatismos e perdas ósseas. Vários recursos terapêuticos e medicamentos
têm sido estudados e utilizados no tratamento destas condições, porém existe
necessidade do estabelecimento de protocolos que determinem dosagens e
regime de duração bem como, avaliem seus efeitos em nível celular. Sendo
assim, o objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito do anabolizante decanoato
de nandrolona sobre a proliferação, adesão e diferenciação de osteoblastos
(linhagem OSTEO-1). Para a análise da proliferação celular, realizamos curvas
de crescimento após 24, 48 e 72 horas de cultivo, utilizando o método MTT. A
avaliação da adesão celular foi realizada pelo mesmo método após 20, 40 e 60
minutos do plaqueamento. A diferenciação celular foi avaliada por meio da
dosagem da enzima fosfatase alcalina em lisados das culturas utilizando um kit
comercial específico, após 72 horas de cultivo. Culturas não tratadas serviram
de controle. Os osteoblastos foram cultivados na presença do anabolizante nas
concentrações de 5, 10, 25 e 50μM. Para cada condição experimental, foram
realizados 3 experimentos em quadruplicata e os resultados foram submetidos
à análise estatística, utilizando ANOVA/Tukey (p ≤ 0,05). Os resultados
demonstraram que após 72 horas de cultivo, houve diminuição estatisticamente
significante na proliferação de osteoblastos tratados com nandrolona 50μM.
Houve aumento estatisticamente significante na adesão celular nos grupos que
receberam anabolizante na concentração de 25μM após 40 e 60 minutos de
incubação. Quanto a diferenciação celular houve aumento estatisticamente
significante entre o grupo que recebeu anabolizante 50μM e o grupo controle.
Como a diferenciação e o aumento na adesão celular são etapas importantes
no reparo ósseo, o aumento observado nestes processos pela presença do
anabolizante pode indicar que este derivado esteróide pode exercer um papel
importante neste processo. Porém há necessidade de continuar avaliando o
19
efeito deste medicamento em estudos in vitro e in vivo a fim de estabelecer os
melhores parâmetros para obter bioestimulação em reparos ósseos.
Introdução
De modo geral, o estado dos hormônios sexuais reflete o estado da
massa óssea, de tal forma que uma deficiência hormonal reconhecidamente
leva a uma perda óssea progressiva1-6.
De fato, as concentrações de testosterona livre correlacionam-se com a
densidade mineral do osso (BMD) em homens idosos, entretanto os níveis de
testosterona também são correspondentes a massa e à força muscular7.
O tratamento com testosterona também é efetivo em diminuir a perda
óssea que ocorre no envelhecimento, mas somente em homens que ainda
exibem baixos níveis de testosterona8-9. Inversamente, homens que estão
passando por privação androgênica, para tratamento de câncer de próstata
exibem densidade óssea diminuída10 e um aumento de casos de fraturas
ósseas11.
Em modelos animais de simulação de hipogonadismo foi observado um
efeito benéfico da terapia com andrógenos no compartimento trabecular com
aumento da massa óssea. Entretanto, este relativo aumento na massa óssea
estava correlacionado à supressão da reabsorção, com diferenças na microarquitetura que demonstravam um aumento no trabeculado ósseo, mas não na
espessura óssea12.
Existem também relatos que ligam o efeito dos andrógenos ao aumento
da massa óssea cortical gerado pela expansão da espessura do periósteo13-14.
Recentemente foi mostrado que as conseqüências da ação dos
androgênios são específicas para cada compartimento ósseo; assim, os efeitos
anabólicos são exibidos exclusivamente na superfície do periósteo, porém em
osteoblastos maduros, os andrógenos inibem a osteogênese com efeitos
negativos sobre a qualidade da matriz e a resistência óssea. Assim, um
aumento da sinalização andrógena dirigida para o osso pode resultar em
diminuição do turnover ósseo e inibição da formação óssea pelos osteoblastos
diferenciados. Estes resultados indicam que a ação direta dos androgenos
sobre os osteoblastos maduros pode não ser anabólica. Este fato também gera
preocupações sobre o abuso no uso de anabolizantes no esqueleto em
20
desenvolvimento ou no tratamento de alta dose em adultos hormonalmente
sadios6,15.
Similarmente, os estudos in vitro também têm exibido dificuldade em
definir adequadamente o papel dos andrógenos.
O objetivo deste trabalho foi analisar a efeito do anabolizante decanoato
de nandrolona (derivado da testosterona) sobre a proliferação de osteoblastos,
já que estas células são fundamentais no processo de reparação óssea e o
sucesso de qualquer tratamento reabilitador depende da sua adesão,
diferenciação e proliferação.
Material e Métodos
Cultura Celular
As células utilizadas foram osteoblastos da linhagem OSTEO-1
cultivadas em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Cultilab,
Campinas, SP, Brasil) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB,
Cultilab) e 1% de solução antibiótica-antimicótica (Cultilab), sempre a 37°C em
um ambiente úmido e a 5% CO2. As células foram mantidas em estado de
subconfluência e repicadas a cada 2 ou 3 dias.
Experimentos
Antes dos experimentos, todas as culturas foram examinadas e a sua
viabilidade foi confirmada pelo método de exclusão do azul de trypan. Após a
contagem celular, as células foram cultivados na presença do anabolizante
decanoato de nandrolona (Deca Durabolin® Organon, São Paulo, SP, Brasil)
nas concentrações de 5, 10, 25 e 50μM. As células do grupo controle não
foram tratadas com anabolizante (D’Ascenzo et al 2007).
Avaliação da proliferação celular (método MTT)
As células dos diferentes grupos experimentais foram distribuídas (104
células/poço) em placas de 96 poços e incubadas em um ambiente úmido com
5% de CO2 por 24, 48 e 72 horas.
Ao final dos diferentes períodos experimentais, a proliferação celular foi
avaliada
por
meio
do
ensaio
MTT
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5,-
diphenyltetrazolium bromide) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Para tanto,
o MMT foi adicionado às culturas celulares numa concentração de 0.5 mg/mL e
as células foram incubadas num ambiente úmido,contendo 5% CO2 , a 37° por
21
3 h. Depois deste período, 100 μL de isopropanol foi adicionado em cada poço
para dissolver os cristais formazan. A absorbância foi medida a 620 nm usando
um leitor de microplacas (Anthos2020, Anthos Labtec Instruments, Wals,
Austria). Os dados de densidade óptica (DO) medidos como absorbância
(correspondente à proliferação celular) foram obtidos em quadruplicata e estão
representados como médias ± valores de desvio padrão (DV).
Ensaio de adesão celular
A quantificação da adesão celular foi realizada de acordo com técnica
descrita previamente16-17 com algumas modificações. Após a contagem celular,
as células foram tratadas com anabolizante nas concentrações de 5, 10, 25 e
50μM. As células do grupo controle não receberam tratamento.
Alíquotas de 0.2 ml de suspensão celular foram semeadas em placas de
96 poços (5x104 células por poço). Após períodos de incubação de 20, 40 e 60
minutos em estufa de cultivo celular, as placas foram lavadas 3 vezes com PBS
(0,1 ml) para remoção das células não aderentes. A adesão celular foi
quantificada indiretamente pela técnica de MTT da mesma maneira descrita
anteriormente.
Todos os experimentos foram repetidos 3 vezes, de forma independente,
e os dados de densidade óptica (DO) medidos como absorbância
(correspondente à adesão celular) foram obtidos em quadruplicata e estão
representados como médias ± valores de desvio padrão (DV).
Ensaio de diferenciação celular (dosagem de fosfatase alcalina)
A determinação da concentração da fosfatase alcalina nos lisados
celulares indica a diferenciação de osteoblastos18. De forma a permitir esta
avaliação, após a contagem celular, os osteoblastos foram incubados em
placas de cultura de fundo chato com 24 poços (105 células por poço) e
mantidos em DMEM (10% de soro fetal bovino).
Os osteoblastos então receberam tratamento com anabolizante nas
concentrações de 5, 10, 25 e 50μM. As células do grupo controle não
receberam tratamento.
22
Após períodos de incubação de 72 horas, as células foram lavadas com
PBS 1X e tratadas com tampão de lise (PBS 1x + 0,1% Triton X-100) por 10
minutos.
Os lisados foram então centrifugados a 8.000 rpm por 5 min a 2°C e os
sobrenadantes foram recolhidos e estocados a -80°C.
A concentração da enzima fosfatase alcalina foi determinada utilizando
kit comercial (Labteste, Belo Horizonte, MG, Brasil), as amostras foram
colocadas no leitor de absorbância de 405 nm (LabMax 240, Lagoa Santa,
Minas Gerais, Brasil) e processadas a 37ºC. Cada experimento foi repetidos 2
vezes de forma independente e cada amostra foi feita em duplicata.
Análise Estatística
As comparações entre os grupos foram realizadas usando análise de
variância (ANOVA) e o teste Tukey foi usado para determinar diferenças
significativas entre os grupos. Valores de p≤ 0.05 foram considerados
estatisticamente significantes. Os dados foram analisados usando o software
estatístico GraphPad Prism 4.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
Resultados
Efeito do anabolizante decanoato de nandrolona na proliferação celular (5, 10,
25 e 50μM)
Não houve diferença estatisticamente significante entre a proliferação
celular (avaliada pelo método MTT) das culturas controle e das tratadas com o
anabolizante decanoato de nandrolona nas diferentes concentrações e tempos
experimentais, com exceção do período de incubação de 72h na concentração
de 50μM, onde foi observada uma diminuição estatisticamente significante na
proliferação celular entre osteoblastos tratados com anabolizante e as culturas
controle (figura 1).
23
*
Figura 1: Proliferação celular mensurada pelo método MTT como densidade
óptica (DO), das culturas de células OSTEO-1 do grupo controle e dos grupos
experimentais
tratados
com
diferentes
concentrações
do
anabolizante
decanoato de nandrolona (5, 10, 25 e 50μM) após períodos de incubação de
24, 48 e 72 horas.
Efeito do anabolizante decanoato de nandrolona na adesão celular
Houve aumento estatisticamente significante com relação ao grupo
controle na adesão das células tratadas com anabolizante decanoato de
nandrolona na concentração de 25 μM após 40 e 60 minutos de incubação
(figura 2).
24
Figura 2. Adesão celular mensurada como absorbância (método MTT) das
culturas de células OSTEO-I tratadas com anabolizante decanoato de
nandrolona nas concentrações 5, 10, 25 e 50μM. Houve aumento
estatisticamente significante na adesão celular (com relação aos respectivos
grupos controles) no grupo que recebeu anabolizante na concentração de 25
μM após 40 e 60 minutos de incubação.
Efeito do anabolizante decanoato de nandrolona na diferenciação celular
Houve aumento estatisticamente significante na concentração da enzima
fosfatase alcalina (com relação ao grupo controle) no grupo que recebeu
anabolizante na concentração de 50 μM após 72 horas de incubação (figura 3).
25
10
*
9
Fosfatase Alcalina (U/l)
8
7
6
5
*
4
3
2
1
0
controle
nandro 5
nandro 10
nandro 25
nandro 50
Figura 3. Diferenciação celular mensurada por meio da dosagem da atividade
da fosfatase alcalina das culturas de células OSTEO-I tratadas com
anabolizante decanoato de nandrolona nas concentrações 5, 10, 25 e 50μM.
Houve aumento estatisticamente significante na concentração da enzima
fosfatase alcalina (com relação ao grupo controle) no grupo que recebeu
anabolizante na concentração de 50 μM após 72 horas de incubação.
Discussão
O conhecimento dos fatores que regulam o crescimento do tecido ósseo
e de sua contínua remodelação relacionada a eventos de formação e
reabsorção é fundamental para determinar a abordagem terapêutica ideal
frente a traumas e patologias neste tecido.
Uma das maneiras de adquirir este conhecimento é por meio do
isolamento das células do tecido ósseo em cultura, já que estas podem
também nesta condição, exibir respostas metabólicas tecido-específicas, bem
como realizar a biossíntese de componentes estruturais do osso19-22.
O uso de esteróides androgênicos, como a nandrolona, tem sido
indicado para se obter efeitos anabolizantes sobre os tecidos ósseo e
muscular23-25.
26
No presente estudo, o tratamento com o esteróide decanoato de
nandrolona, um derivado da testosterona, não foi capaz de gerar um efeito
anabólico sobre a proliferação de osteoblastos nos períodos de 24, 48 e 72
horas, com exceção do tratamento com a concentração de 50μM, onde após
72 h de cultivo, houve uma diminuição estatisticamente significante na
proliferação celular entre osteoblastos tratados com anabolizante e as culturas
controle.
Por outro lado, nesta mesma concentração e período experimental podese observar um aumento na concentração da enzima fosfatase alcalina, que
indicando que nestas culturas as células estavam sofrendo diferenciação
celular, justificando assim a diminuição de sua proliferação.
Os efeitos dos androgênios na diferenciação dos osteoblastos são
bastante controversos, desde estimulantes, efeito inibitório e nenhum efeito
sobre a fosfatase alcalina26-36.
Já com relação à proliferação celular, Kasperk30 et al. (1997) foram os
primeiros pesquisadores a descrever um aumento dose-dependente na
proliferação de osteoblastos (derivados de culturas primárias de calvária de
camundongos, de culturas primárias de osteoblastos humanos e de linhagem
de osteosarcoma) após tratamento com 5α-DHT (5a-Dihidrotestosterona), nas
concentrações 10-8 to 10-11 molar, sendo que os picos de estímulo à
proliferação celular puderam ser observados nas concentrações de 10-9 M.
Estudos
subseqüentes
demonstraram
que
culturas
primárias
e
transformadas de osteoblastos derivadas de diferentes espécies tratadas com
beta estradiol, dihidrotestosterona, testosterona e outros derivados andrógenos
exibem diferentes níveis de resposta proliferativa aos anabolizantes26,30-31,37-39.
Já outros estudos indicaram inibição na proliferação de osteoblastos
derivados de linhagens humanas de osteosarcoma e de osteoblastos fetais
após tratamento com 5α dihidrotestosterona27,32.
Vários
autores
acreditam
que
as
diferenças
de
resposta
dos
osteoblastos em ao tratamento com andrógenos estariam ligadas a afinidade
dos andrógenos aos seus respectivos receptores celulares ou ao nível destes
receptores nas células analisadas26,28,30-31,37-43.
27
Mesmo diferentes linhagens do mesmo tipo celular podem exibir níveis
de receptores variados, respondendo aos andrógenos de maneira ou em
velocidade diferenciada27,40.
Já outros autores postulam que a modulação da resposta celular
também pode estar ligada a exposição prévia do doador a hormônios
esteróides e ao seu grau nutricional de vitamina D31,39,44.
Nossos resultados com relação à adesão celular demonstraram que
houve aumento na adesão celular (estatisticamente significante com relação ao
grupo controle) na adesão das células tratadas com anabolizante decanoato de
nandrolona na concentração de 25 μM após 40 e 60 minutos de incubação. A
adesão de células ósseas pela matriz extracelular é um requisito fundamental
para o desenvolvimento e função do osteoblasto. Receptores de adesão se
conectam a matriz extracelular com o citoesqueleto e transmitem a deformação
da matriz na célula45.
Outros derivados androgênicos já demonstraram ter a capacidade de
induzir o aumento da capacidade de adesão dos osteoblastos45-47.
Nossos resultados agregam ao conhecimento sobre o decanoato de
nandrolona, o fato de que seu uso pode promover aumento da adesão e da
diferenciação dos osteoblastos, contribuindo assim para o aumento da
densidade óssea e diminuição de sua reabsorção48-50.
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33
3.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
O osso é o tecido conjuntivo responsável pelas funções de suporte e
proteção do organismo vertebrado conjuntivo cuja matriz extracelular é
mineralizada. Essa peculiaridade confere a esse tecido as propriedades ideais
para a realização das funções de suporte e proteção do organismo vertebrado.
Além disso, o osso também é responsável pelo equilíbrio da homeostasia
mineral80.
O tecido ósseo é constituído por uma matriz extracelular complexa e
estruturalmente sofisticada, composta por uma parte orgânica (25%), outra
inorgânica (70%) e água (5%). O componente inorgânico é quase todo
representado por hidroxiapatita, enquanto que a porção orgânica é constituída
por células e proteínas de matriz, incluindo colágeno tipo I (90%) e proteínas
não-colágenas. As células que compõem o tecido ósseo são divididas em três
grupos: osteoblastos (células proliferativas e produtoras de matriz orgânica);
osteócitos (células maduras, produtoras de matriz mineralizada que se situam
em cavidades no interior de lacunas e são terminalmente diferenciadas); e
osteoclastos (células gigantes, móveis, multinucleadas, cuja principal função é
reabsorver o tecido ósseo, participando assim, do processo de remodelação
deste tecido)81-84.
A deposição de matriz óssea pelas células de linhagem osteoblástica é
regulada por fatores extrínsecos, como os fatores de crescimento locais e
sistêmicos e forças físicas, e fatores intrínsecos, tais como fase do ciclo celular,
estagio de maturação e idade82.
O conhecimento básico dos fatores que regulam o crescimento do tecido
ósseo e, de sua contínua remodelação relacionado a eventos de formação e
reabsorção ligados a traumas e patologias, permite intervenções clínicas mais
racionais nestes processos.
Uma das maneiras de adquirir estes conhecimentos é por meio do
isolamento das células do tecido ósseo em cultura, as quais podem exibir
respostas metabólicas do tecido - específicas, bem como realizar a biossíntese
de componentes estruturais do osso85,86.
Estudos in vitro utilizando cultura de células têm sido muito usado devido
à facilidade de padronização da amostra, cujo controle de pH, temperatura,
34
pressão osmótica, tensão de Co2 e O2 podem ser obtido de maneira precisa,
além das amostras serem totalmente homogêneas87,90.
Os osteoblastos in vitro, de forma semelhante aos osteoblastos in vivo,
atravessam três fases distintas no seu desenvolvimento: proliferação,
maturação e mineralização e expressam proteínas próprias do osso, além de
terem a capacidade de formar nódulos ósseos mineralizados84,88,89.
Porém, quando se trata de definir o papel dos esteroides sobre o tecido
ósseo, os estudos in vitro também apresentam grandes variações em seus
resultados.
Alguns
estudos
demonstraram
que
os
andrógenos
dramaticamente a proliferação e a maturação de células ósseas
8,32,91
afetam
, enquanto
outros não chegaram a resultados positivos45. Já foi descrito também que os
andrógenos
são
capazes
de
inibir
diretamente
a
atividade
de
osteoclastos20,27,28,91,92.
No presente estudo, o tratamento com o esteróide decanoato de
nandrolona, um derivado da testosterona, não foi capaz de gerar um efeito
anabólico sobre a proliferação de osteoblastos nos períodos de 24, 48 e 72
horas, e inclusive gerou diminuição da proliferação óssea na concentração de
50μM, após 72 h de cultivo. Porém,nesta mesma concentração e no mesmo
período experimental, encontrou-se um aumento na concentração de fosfatase
alcalina, o que indica que estas células estavam passando por um processo de
diferenciação celular, o que justifica a diminuição de sua proliferação.
Já com relação à adesão celular, nosso estudo demonstrou que houve
um aumento estatisticamente significante com relação ao grupo controle na
adesão das células tratadas com anabolizante decanoato de nandrolona na
concentração de 25 μM após 40 e 60 minutos de incubação, assim como em
outros
relatos
do
uso
de
derivados
androgênicos
em
culturas
de
osteoblastos64,70,71.
A resposta celular aos andrógenos parece estar vinculada ao nível de
seus receptores celulares, de maneira que cada tipo celular apresenta uma
concentração mínima abaixo da qual as células tornam-se não responsivas a
estes hormônios31,45,47-49,52. Mesmo diferentes linhagens do mesmo tipo celular
podem exibir níveis de receptores variados, respondendo aos andrógenos de
maneira ou em velocidade diferenciada30,51.
35
Além disso, a resposta celular aos andrógenos depende da espécie
animal, da localização esquelética dos osteoblastos e de seu estágio de
diferenciação26.
Considerando estas variáveis, parece claro que há necessidade de
ampliar este estudo com um intervalo maior de tempo e de concentrações e
ainda avaliar o papel deste derivado em nível molecular. Por outro lado, este
estudo descreve o papel do decanoato de nandrolona sobre a proliferação,
diferenciação e adesão de osteoblastos derivados da calvária de ratos,
agregando estas informações ao conhecimento sobre a ação dos andrógenos e
seus derivados sobre o tecido ósseo.
36
4.
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ANEXO I: Protocolo de submissão de artigo para publicação Revista
Brasileira de Fisioterapia
45
ANEXO II: Artigo Publicado na Revista Fisioterapia Brasil
46
ANEXO III: Artigo Publicado na Revista Lasers and Medical Science