UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Maria do Carmo Silva Barreto
INOVAÇÃO TECNOLÓGICA BASEADA NA PRODUÇÃO
DE BIOPOLÍMERO COM VIABILIDADE PARA
INOCULANTE RIZOBIANO
Recife
Abril/2008
Maria do Carmo Silva Barreto
INOVAÇÃO TECNOLÓGICA BASEADA NA PRODUÇÃO
DE BIOPOLÍMERO COM VIABILIDADE PARA
INOCULANTE RIZOBIANO
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação
em
Ciências
Biológicas
da
Universidade Federal de Pernambuco - UFPE,
como requisito parcial para obtenção do Título
de Mestre em Ciências Biológicas.
Área de Concentração: Biotecnologia
Orientador
Prof. Dr. José Luiz de Lima Filho
Co- Orientadores
Profª. Drª. Márcia do Vale Barreto Figueiredo
Prof. Dr. Hélio Almeida Burity
Recife
Abril/2008
Barreto, Maria do Carmo Silva
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímero com
viabilidade para inoculante rizobiano./ Maria do Carmo Silva Barreto . –
Recife: O Autor, 2008.
92 folhas : il., fig. tab.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco.
CCB. Ciências Biológicas, 2008.
Inclui bibliografia.
1. Bioquímica 2. Leguminosas 3. Biopolímeros 4. Rhizobia I. Título.
577.1
CDU (2.ed.)
UFPE
572
CDD (22 ed.)
CCB – 2008-085
Dedico esta dissertação aos meus
pais, pelo apoio ao longo de todos os
caminhos que passei, com amor.
Agradecimentos
A Deus, por ter me dado perseverança, paciência, paz de espírito para
transpor mais esta etapa na minha vida profissional e pessoal.
Aos meus Pais, José Ribeiro Barreto e Maria Almerinda Barreto, pela
minha vida, educação, apoio, carinho e incentivo, e a minha irmã Glauciene
Barreto e cunhado João Rodrigues pelas palavras de apoio e incentivo dado0.
Ao Dr. José Luiz de Lima Filho, por ter acreditado em mim, por todo o seu
apoio e confiança depositada durante o Mestrado.
A Dra. Márcia do Vale Barreto Figueiredo, pelos ensinamentos, conselho,
amor e confiança refletidos em trabalhos. Por sempre nos demonstrar com
exemplos que qualquer objetivo pode ser alcançado, com responsabilidade,
trabalho sério e organização. Meus mais sinceros agradecimentos.
Ao Dr. Helio Almeida Burity, pela acolhida no Laboratório Biologia do Solo
– IPA, agradeço pelo convívio, amizade, ensinamentos, por facilitar a conclusão
dos trabalhos desenvolvidos no laboratório, sempre tendo uma palavra que nos
reconforta e ajuda.
A Dra. Francisca Pessoa França pela ajuda, esclarecimentos e apoio
despendidos.
Ao Dr. José de Paula Oliveira pela amizade, ajuda, atenção e contribuição
despendida durante todo o trabalho.
A Dra. Maria Luiza Bastos pela amizade, apoio, incentivo e carinho.
Aos Doutores, Adália Cavalcanti, Eidy Simões, Maria do Carmo
Catanho, Sônia Formiga da Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária
– IPA, pela convivência, troca de conhecimentos e amizade.
Aos meus Amigos do Laboratório: Marcela Vila Nova, Emmanuella Vila
Nova, Elisângela Cabral, Rafael Barboza, Sue Ellen, Aníbia Vicente, Helane
Costa, Tathiana Alves, André Sueldo, por todos os memoráveis momentos
compartilhados tanto no laboratório, como fora dele, muito obrigado à todos.
À Profª e Dra. Carolina Etienne, pela amizade e ajuda na revisão deste
trabalho, uma pessoa querida que está sempre pronta para ajudar, meu muito
obrigada.
Ao Prof. e Dr. Cosme Rafael, pela ajuda, aconselhamento e correções que
foram indispensáveis para o êxito deste trabalho, muito obrigada.
Ao Dr. Odemar Reis – Estatístico do IPA, pela ajuda despendida durante
os trabalhos, pelas palavras de confiança e ensinamentos.
Aos funcionários do IPA: Almira pela ajuda na aquisição de material
bibliográfico, Rosa Morais pela ajuda e amizade, Waldemar Araújo pela
amizade, palavras de confiança e força, Lúcia, Mário e Rita pelo convívio no dia a
dia, pela ajuda, carinho e amizade.
As Profa. Dra. Glícia Calazans e Profa. Dra. Janete Magali, pela ajuda e
obtenção do equipamento úteis para a conclusão dos trabalhos, muito obrigada.
A Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas
CCB/UFPE Profa. Dra. Suely Lins Galdino pelo apoio e informações
indispensáveis para o funcionamento do mestrado.
A Secretária da Pós-graduação Adenilda Eugênia, pela ajuda e amizade
despendida ao longo do curso.
À CAPES/FACEPE pelo apoio financeiro no fomento da bolsa de mestrado.
A todos aqueles, que, mesmo não mencionados, estiveram ao meu lado,
contribuindo para a minha formação e para a realização deste estudo, o meu mais
sincero agradecimento.
LISTA DE FIGURAS
Fig. 1
16
Classificação dos Fluidos segundo seu comportamento reológico
Fig. 2
Curvas de escoamento de fluidos newtoniano e não newtonianos de
propriedades independentes do tempo de cisalhamento.
Fig. 3
Aspecto do EPS precipitado, sintetizado a partir do ISOL 14 (a) e do
CIAT 899(b) com 168 horas de cultivo.
Variação da viscosidade aparente em função da taxa de cisalhamento
de soluções aquosas de EPS 2,5 % (v/v) de 8 isolados de Rhizobium e
uma estirpe padrão CIAT 899 a 20 °C com tempo de fermentação de 96
h, determinada com viscosímetro rotacional Brookfield (modelo RVT).
Variação da viscosidade aparente em função da taxa de cisalhamento
de soluções aquosas de EPS 2,5 % (v/v) de 8 isolados de Rhizobium e
uma estirpe padrão CIAT 899 a 20 °C com tempo de fermentação de
168 h, determinada com viscosímetro rotacional Brookfield (modelo
RVT).
Procedimento para contagem de células viáveis (UFC) e totais
(Densidade ótica)
Curvas de crescimento microbiano referentes a UFC.mL-1 (a) e
absorbância (560 nm) (b) do inóculo do Isolado 1 com 2,5 % (v/v) em
meio YM incubados a 28 °C e 200 rpm
Curvas de crescimento microbiano referentes a UFC.mL-1 (a) e
absorbância (560 nm) (b) do inóculo do Isolado 2 com 2,5 % (v/v) em
meio YM incubados a 28 °C e 200 rpm
Curvas de crescimento microbiano referentes a UFC.mL-1 (a) e
absorbância (560 nm) (b) do inoculo do Isolado 3 com 2,5 % (v/v) em
meio YM incubados a 28 °C e 200 rpm.
Curvas de crescimento microbiano referentes a UFC.mL-1 (a) e
absorbância (560 nm) (b) do inoculo do Isolado 4 com 2,5 % (v/v) em
meio YM incubados a 28 °C e 200 rpm
Curvas de crescimento microbiano referentes a UFC.mL-1 (a) e
absorbância (560 nm) (b) do inoculo do Isolado 6 com 2,5 % (v/v) em
meio YM incubados a 28 °C e 200 rpm
Curvas de crescimento microbiano referentes a UFC.mL-1 (a) e
absorbância (560 nm) (b) do inóculo do Isolado 11 com 2,5 % (v/v) em
meio YM incubados a 28 °C e 200 rpm.
Curvas de crescimento microbiano referentes a UFC.mL-1 (a) e
absorbância (560 nm) (b) do inóculo do Isolado 14 com 2,5 % (v/v) em
meio YM incubados a 28 °C e 200 rpm
Curvas de crescimento microbiano referentes a UFC.mL-1 (a) e
absorbância (560 nm) (b) do inóculo do Isolado 16 com 2,5 % (v/v) em
meio YM incubados a 28 °C e 200 rpm
Curvas de crescimento microbiano referentes a UFC.mL-1 (a) e
absorbância (560 nm) (b) do inóculo do CIAT 899 com 2,5 % (v/v) em
meio YM incubados a 28 °C e 200 rpm
Concentração de glicose durante a produção de EPS por Rhizobium sp.
(ISOL 14).
Concentração de glicose durante a produção de EPS por Rhizobium sp.
(CIAT 899).
Fig. 4
Fig. 5
Fig. 6
Fig. 7
Fig. 8
Fig. 9
Fig. 10
Fig. 11
Fig. 12
Fig. 13
Fig. 14
Fig. 15
Fig. 16
Fig. 17
16
47
48
49
63
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
Páginas
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Características morfofisiológicas dos Isolados de rizóbios e estirpe 40
padrão CIAT 899 - Rhizobium tropici
Tabela 2
Valores das constantes kat e k γ (Mitshka, 1982)
Tabela 3
Esquema teórico da análise de variância, para experimentos em 96 e
43
168 horas.
Tabela 4
Esquema teórico da análise de variância, para grupo de experimentos.
Tabela 5
Resultados da análise de variância da produção de biopolímero
45
sintetizados por Rhizobium cultivados em 96 e 168 horas de cultivo
Tabela 6
Dados médios das análises individuais e do grupo de experimento
45
Tabela 7
Isolados de rizóbios e estirpe padrão CIAT 899 - Rhizobium tropici
62
Tabela 8
Constituintes químicos da goma produzida pela estirpe de Rhizobium sp
78
(ISOL 14)
42
44
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABELAS
SUMÁRIO
1. Introdução........................................................................................... 1
1.1 Feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) .................................................. 1
1.2 Rhizobium sp................................................................................
3
1.3 Simbiose rizóbio-leguminosa.......................................................
5
1.4 Polissacarídeos de rizóbio...........................................................
8
1.5 Reologia.......................................................................................
13
2. Justificativa........................................................................................
19
3. Objetivos............................................................................................
20
3.1Geral.............................................................................................
20
3.2 Específicos...................................................................................
20
4. Referências........................................................................................
21
5. Capítulo 1...........................................................................................
34
Resumo.............................................................................................
35
Abstract.............................................................................................
36
5.1 Introdução....................................................................................
37
5.2 Material e Métodos .....................................................................
39
5.3 Resultados e Discussão.............................................................
44
5.4 Conclusões.................................................................................
51
5.5 Referências.................................................................................
52
6. Capítulo 2..........................................................................................
57
Resumo............................................................................................
58
6.1 Introdução....................................................................................
59
6.2 Material e Métodos......................................................................
61
6.3 Resultados e Discussão.............................................................
66
6.4 Conclusões.................................................................................
81
6.5 Referências.................................................................................
82
7. Anexos................................................................................................... 87
Normas da Revista World Journal of Microbiology and Biotechnology
Submissão do Artigo
Normas da Revista Scientia Agrária
Trabalhos apresentados no 24º Congresso Brasileiro de Microbiologia - 3 a 6
de Outubro de 2007 em Brasília - Centro de Convenções Ulysses Guimarães
– Brasília / DF
1. INTRODUÇÃO
1.1 Feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.)
O feijoeiro é cultivado em cerca de 100 países em todo o mundo, envolvendo
grande número de gêneros e espécies, dificultando uma análise comparativa dos
índices de produtividade por espécie. Considerando somente o Phaseolus vulgaris L., o
Brasil é o maior produtor, seguido do México. Entretanto, a produção brasileira de feijão
tem sido insuficiente para abastecer o mercado interno, devido à redução na área
plantada, da ordem de 35 %, nos últimos 17 anos (Yokoyama & Stone, 2000). A falta de
tecnologia e o cultivo em solos marginais, devido ao baixo retorno econômico da
cultura, contribuem, decisivamente, para a baixa produtividade do feijoeiro e nesse
quadro, o fornecimento adequado de nutrientes, particularmente o nitrogênio (N) e o
fósforo (P), representam um dos fatores limitantes à obtenção de maiores rendimentos
no Brasil (Araújo, 1994).
No Brasil o feijoeiro é cultivado nos mais variados tipos de solos e clima sendo
plantado, preferencialmente, como cultura de subsistência em pequenas propriedades.
O feijão é importante fonte de nutrientes (proteínas, minerais, vitaminas) e calorias na
dieta brasileira (Hungria et al., 2000). Além de apresentar alto conteúdo de carboidratos
componentes de fibra (celulose, hemicelulose e lignina) e digeríveis (amido e sacarose),
encontram-se no feijão alguns oligossacarídeos (rafinose, estaquiose, verbascose). O
feijão também é uma fonte importante de vitaminas hidrossolúveis, como a tiamina, a
riboflavina, a niacina e a folacina, que são vitaminas do complexo B envolvidas na
prevenção de certos defeitos fetais, cardiovasculares e certos tipos de câncer (Costa &
Vieira, 2000).
O feijoeiro é originário das Américas, com centros de origens e domesticação na
Meso América (México-Guatemala) e na Zona Leste dos Andes. Seu cultivo foi
delineado há mais de 7000 anos entre os nativos do Peru, sugerindo seleção da
espécie para a agricultura (Gepts, 1990). As áreas de diferenciação e domesticação do
feijoeiro ocorrem em altitudes entre 500 e 1800 m na América Central e norte da
América do Sul. Diversos tipos selvagens são registrados em altitudes próximas a
1200m (Miranda, 1974). Os feijoeiros provenientes desses materiais mostram grande
amplitude de características morfológicas e fisiológicas. O gênero Phaseolus contém
mais de uma centena de espécies, mas apenas P. vulgaris L., P. coccineus L., P.
acutifolius Gray var. Latifolius Freeman e P. lunatus var. lunatous são cultivadas
comercialmente (Zimmermann & Teixeira, 1988). Dessas, o feijoeiro comum, P. vulgaris
L. é a espécie de maior importância econômica, contribuindo com cerca de 95 % da
produção mundial de Phaseolus. No Brasil, em uma rota inversa à do tráfico de
escravos, P. vulgaris chegou à África e, provavelmente em tempos anteriores, à Ásia
via Filipinas. No século XVI, foi introduzido na Europa e na Califórnia, levado por
intermédio dos espanhóis, trazido da América Central (Mariot, 1989).
Os teores de N nos solos do Brasil são baixos, de um modo geral, situando-se na
faixa de 0,05 % a 0,3 %. Com a intensificação da agricultura, as exigências de adição
de N, bem como a sua remoção, são ampliadas e, consequentemente, se o N retirado
do solo pelas plantas não for reposto, o teor desse nutriente decrescerá rapidamente.
Quanto aos fertilizantes nitrogenados, existe um custo elevado para a síntese dos
mesmos, de cerca de seis barris de petróleo para cada tonelada de amônio produzido,
bem como gastos com o transporte e distribuição do fertilizante, além de outros
(Hungria et al.,1997).
Considerando que o feijoeiro é cultivado principalmente por
pequenos agricultores, em solos muitas vezes deficientes em N mineral, esforços para
a melhoria do processo de simbiose da cultura com rizóbios inoculados nas sementes
podem corresponder a aumentos significativos no rendimento de grãos. Essa via
biológica se torna ainda mais importante quando se leva em consideração os custos
elevados do N mineral, limitando a sua utilização, principalmente pelos pequenos
agricultores. Práticas alternativas para diminuir esses custos precisam ser procuradas,
principalmente no Brasil, que importa fertilizante nitrogenado para satisfazer à demanda
interna (Hungria et al., 2001). Um outro agravante na utilização de fertilizantes
nitrogenados reside na baixa eficiência de sua utilização pelas plantas, raramente
ultrapassando 50 %. Deve-se considerar ainda, que o uso indiscriminado de fertilizantes
nitrogenados resulta em poluição ambiental, pois a lixiviação do N ocorre contaminação
no lençol freático que resultam em acúmulo de formas nitrogenadas, podendo atingir
níveis tóxicos a peixes e ao homem (Hungria et al., 2001).
Dentro deste contexto, destaca-se a necessidade do desenvolvimento de
tecnologias de baixo custo capazes de melhorar os níveis de produtividade dos
pequenos agricultores, responsáveis pela quase totalidade da produção mundial desta
leguminosa, essencial na dieta de grande parte da população brasileira (Dakora, 2003).
1.2 Rhizobium sp.
Este gênero foi classificado em 1932, por Fred et al, e apresenta como
característica células em forma de bastonete curto, Gram-negativas, com dimensões
que variam entre 0,5 e 0,9 µm por 1,2 a 3,0 µm, ocorrendo isolados ou aos pares,
móveis por flagelos polares, subpolares ou peritriquiais, não formam esporos e em
culturas envelhecidas apresentam granulações de poli-β-hidroxibutirato (Urenha et al.,
1994). Apresentam bom crescimento em meio com manitol, sacarose e levedura,
podendo em meios gelificados desenvolver colônias planas, convexas ou umbilicadas;
apresentam normalmente coloração branca e opaca, por vezes translúcidas,
apresentando frequentemente produção de goma de natureza polissacarídica. A
inclusão de Vermelho do Congo no meio de cultura não conduz a uma forte absorção
deste corante pelas colônias, podendo certas estirpes apresentar ligeira absorção. As
estirpes de crescimento rápido produzem colônias de 4 a 6 mm de diâmetro em 5 dias
de incubação a 26-30 °C provocando acidificação do meio de cultura. As estirpes de
crescimento lento produzem colônias com 1 mm de diâmetro em 10 dias de incubação
a 28-30 °C, provocando a alcalinização do meio de cultura. Induzem a formação de
nódulos na raiz de leguminosas compatíveis, colonizando-os e podendo aí desenvolver
atividade diazotrófica em simbiose; utilizam oxigênio como receptor final de elétrons na
cadeia respiratória, são microrganismos aeróbios estrito e a faixa de pH ótimo para seu
desenvolvimento está entre 6 e 7 (Hungria & Araújo,1994).
A literatura relata a presença de reação ácida durante o cultivo, promovendo
queda do pH do meio de cultura (Jordan, 1984). No entanto dados experimentais de
cultivo desta bactéria em fermentador, na presença de sacarose, glutamato
monossódico e extrato de levedura mostram comportamento oposto. As velocidades
específicas máximas de crescimento desta bactéria oscilam em torno de 0,20/h, o que
resulta num tempo de geração de aproximadamente 3,5 h.
Entre as bactérias fixadoras de nitrogênio presentes no solo, cujas populações
são altamente influenciadas pela rizosfera das plantas, o rizóbio é considerado o grupo
mais importante na agricultura tropical pela sua associação com as leguminosas. Esta
simbiose é responsável por uma substancial parte, talvez a maior, do fluxo global de
nitrogênio atmosférico fixado nas formas de amônia, nitrato e compostos orgânicos
(Kahindi et al., 1997). Certamente esta associação é a mais estudada, mas simbioses
envolvendo actinomicetos do gênero Frankia, cianobactérias especialmente a
associação Azolla-Anabaena e organismos heterotóficos fixadores de nitrogênio de vida
livre e associativos, podem também fixar quantidades significativas de nitrogênio sob
condições específicas (Straliotto & Rumjanek,1999).
Atualmente, os rizóbios estão classificados como pertencentes à: domínio:
Bacteria; Filo: Proteobacteria; Classe: Alfaproteobacteria; Ordem: Rhiobiales; e
distribuídos nas Famílias Rhizobiaceae, Phyllobacteriaceae, Bradyrhizobiaceae e
Hiphomicrobiaceae (Garrity & Holt, 2001). Além disso, algumas bactérias capazes de
nodular e fixar N2 em simbiose com leguminosas foram, recentemente, identificadas
como pertencentes à Classe das Betaproteobacteria; Ordem: Burkholderiales; Família:
Burkholderiaceae; Gênero: Burkholderia (Moulin et al., 2001) e, também pertencentes à
Classe das Alfaproteobacterias; Ordem: Rhizobiales; Família: Methylobacteriaceae;
Gênero: Methylobacterium (Sy et al., 2001).
As bactérias que nodulam o feijoeiro foram classificadas inicialmente como
Rhizobium phaseoli, porém, com uma melhor caracterização fisiológica, bioquímica e
genética, essas bactérias foram reclassificadas, após 50 anos, na espécie Rhizobium
leguminosarum bv. phaseoli (Jordan, 1984). Com o estudo de outros isolados e o
avanço nas técnicas de biologia molecular, em um curto período de tempo foi
constatado que as bactérias que nodulavam o feijoeiro apresentavam claramente
características fisiológicas e genéticas distintas, permitindo a sua separação em dois
grupos, denominadas Tipo I e Tipo II (Martínez et al., 1985; Quinto et al., 1985; Brom et
al., 1988). Essas e outras diferenças levaram, em 1991, à definição de uma nova
espécie, R. tropici (tro’ pi. ci. Gr. n. tropikos, trópicos), que incluiria as estirpes do Tipo
II, que foi subdividido em IIA e IIB (Martinez-Romero et al., 1991). As bactérias dessa
nova espécie foram descritas como aeróbias, Gram-negativas, com pH ótimo para
crescimento variando entre 5 e 7, crescendo em temperatura de até 40 °C. As estirpes
estudadas foram isoladas de regiões tropicais, nodulam e fixam N2 com P. vulgaris L.,
Leucaena esculenta e L. leucocephala.
A estirpe IIB CIAT 899 (= ATCC 49672, = UMR 1899, = SEMIA 4077) foi
designada como estirpe padrão (“type strain”) e a estirpe representativa do grupo IIA é
a CFN 299. A estirpe CIAT 899, assim como as outras do Tipo IIB, também é resistente
a metais pesados e aos antibióticos clorofenicol, espectinomicina, carbenicilina e
estreptomicina (Martínez-Romero et al., 1991) e apresenta maior tolerância à acidez
(Graham et al., 1994) e a temperaturas elevadas (Hungria et al., 1993; Mercante et al.,
2002). Somente as estirpes do Tipo IIB crescem em meio Luria-Bertani (LB) (MartínezRomero et al., 1991). Alguns estudos têm descrito diferenças entre os Tipos IIA e IIB,
incluindo análise de PCR com seqüências repetitivas como REP, ERIC, BOX (van
Berkum et al., 1996) e a presença de megaplasmídeos (Geniaux et al., 1995).
1.3 Simbiose rizóbio- leguminosa
Há uma grande diversidade de bactérias capazes de formar simbioses com as
diferentes leguminosas sendo que, até o momento, encontram-se distribuídas dentro de
três ramos filogenéticos principais que são os gêneros Bradyrhizobium, Azorhizobium, e
os chamados rizóbios de crescimento rápido. Estes atualmente encontram-se divididos
em três gêneros Rhizobium, Mesorhizobium e Sinorhizobium, sendo que R. galegae
deve ser brevemente renomeado como um novo gênero (Young & Haukka, 1996;
Lindström et al., 1998). O rizóbio induz, em suas hospedeiras, a formação de estruturas
especializadas chamadas nódulos, onde o nitrogênio molecular é reduzido a amônia.
Os estudos têm demonstrado o alto grau de especialização desenvolvido durante o
processo evolutivo desta simbiose, havendo importantes relações de especificidade e
grandes possibilidades de manipulação deste conhecimento visando melhorar a
eficiência simbiótica. Devido à sua importância econômica, os estudos da interação
rizóbio-leguminosas tem tido um bom suporte econômico quando comparado às demais
áreas de pesquisa agronômica em diversas partes do mundo, sendo que atualmente é
a interação planta-microrganismo mais bem estudada (Straliotto & Rumjanek,1999).
Sob condição de limitação de nitrogênio mineral, as bactérias do gênero
Rhizobium,
Bradyrhizobium,
Mesorhizobium,
Sinorhizobium,
Allorhizobium,
coletivamente chamadas de rízóbio formam nódulos simbióticos nas raízes de
leguminosas. Nos anos recentes outras, α-proteobacterias tem sido apresentadas como
produtoras de nódulos em leguminosas (Moullin et al., 2002) Methylobacterium (Sy et
al., 2001); Blastobacter (Van Berkun e Eardly, 2002), e Devosia (Rivas et al., 2002).
Nestes nódulos simbióticos, a bactéria, na forma de bacteróides, convertem o N
atmosférico em amônia, que é incorporada em diversas formas de N orgânico para a
utilização por plantas da família das leguminosas.
O nitrogênio é o elemento mais abundante na atmosfera terrestre (em torno de
79 %), estando presente principalmente na forma diatômica (N2) e é um dos principais
macronutrientes dos vegetais. Algumas bactérias que coexistem em simbiose ou não
nas raízes de plantas, possuem enzimas com a capacidade de redução do nitrogênio
atmosférico, transformando-o em amônia e posteriormente em elementos essenciais
(Lodeiro et al. 2000).
As leguminosas têm, ao seu dispor, duas fontes de nitrogênio: o mineral,
proveniente do solo e/ou fertilizante, e o nitrogênio fixado biologicamente através da
simbiose com os rizóbios. Entretanto, a subida vertiginosa dos preços dos adubos
nitrogenados devido ao consumo de energia fóssil em sua fabricação, aliada aos graves
problemas de poluição causados pelo uso intensivo desses adubos, tem deixado à
agricultura dos países em desenvolvimento e dos desenvolvidos apenas as alternativas
de maximizar a fixação biológica de nitrogênio, otimizar a distribuição e emprego dos
compostos nitrogenados dentro das plantas e tornar mais eficiente a utilização de
carboidratos pelos nódulos (Neves, 1992).
O crescimento e a produção das leguminosas são, pelo menos em parte, o
resultados da interação entre as cultivares das plantas, as estirpes de Rhizobium e as
condições ambientais em que o sistema simbiótico se desenvolve e que afetam a
assimilação, distribuição e utilização do carbono e nitrogênio pelas plantas. A
disponibilidade de nitrogênio para as sementes em desenvolvimento determina a
produção e depende de uma fixação de nitrogênio que se prolongue até o período de
enchimento dos grãos (Neves & Rumjanek, 1995; Rumjanek et al., 2002).
As plantas dependentes da fixação biológica do N requerem mais fosfato (P) que
as plantas que usam exclusivamente N mineral. Os níveis baixos de P podem afetar a
simbiose, ao diminuir o suplemento de fotossintato ao nódulo, reduzir a taxa de
crescimento bacteriano e a população total de Rhizobium e Bradyrhizobium (Keyser &
Munns, 1979)
A fixação biológica do nitrogênio dar-se-á mediante a presença de nódulos nas
raízes induzidos pela infecção das raízes pelas bactérias (Uribe, 1994). O
desenvolvimento dos nódulos serão iniciados pela troca de sinais químicos moleculares
entre a planta e o simbionte (Singleton et al., 1992, Hungria, et al., 2000).
Os nódulos e a planta hospedeira são perfeitamente interligados por meio de
vasos xilemáticos e floemáticos e, portanto, totalmente integrados em termos hormonais
e nutricionais. O processo de fixação do nitrogênio também requer um suprimento
contínuo de carboidratos que fornecem tanto a energia para a redução do nitrogênio
quantos os esqueletos de carbono necessários à assimilação da amônia produzida.
Durante os processos de infecção e desenvolvimento dos nódulos, energia é
necessária às divisões celulares, e é obtida da oxidação dos carboidratos produzidos
na parte aérea da planta hospedeira (Neves, 1992, Silveira et al., 2001; Moreira &
Siqueira, 2006).
Devido à existência de uma grande diversidade de espécies nativas de bactérias
fixadoras de nitrogênio, é necessária a obtenção de estirpes de Rhizobium de alta
qualidade capazes de sobreviver e competir pela fixação eficiente do nitrogênio
atmosférico na leguminosa alvo (Moawad et al., 1998, Silveira et al., 2001, Figueiredo et
al., 2001; 2002).
A nodulação é um processo de multi-passos que envolvem plantas específicas e
expressão genética bacteriana compatível. Os resultados de várias trabalhos, têm
indicado a participação de mediadores químicos no período inicial do processo de
infecção das raízes das leguminosas. Flavonoides específicos são reconhecidos pelo
rizóbio e, em alguns casos, este é um importante aspecto de reconhecimento do
hospedeiro. Se o flavonoide for reconhecido, ocorrerá a síntese de sacarídeos nas
células bacterianas através da ação de vários produtos de genes e, resultando a
produção de uma pequena família de lipo-oligossacarídeos. A estrutura dos tipos de
lipo-oligossacarídeos é o maior determinante da especificidade do hospedeiro
(Laeremans & Vanderleyden, 1998; Diouf et al., 2000; Dakora, 2003).
1.4 Polissacarídeos de Rizóbio
Biopolímeros são polissacarídeos microbianos, também conhecidos como gomas ou
exopolissacarídeos (EPS), que tem a capacidade de fornar géis e soluções viscosas em
meio aquoso (Moreira et al., 2003). Tendo sido observados nas últimas décadas
progressos significativos em relação à identificação, caracterização e utilização de
polissacarídeos sintetizados por microrganismos (Padilha, 1997).
Kay et al (1993) enfatizam que os biopolímeros são, na sua maioria, compostos
atóxicos, biodegradáveis, produzidos extracelularmente por microrganismos não
patogênicos a partir de fermentações em batelada com eficiência próxima a 50% na
conversão do substrato.
O termo goma, tal como usado tecnicamente pelas indústrias, refere-se aos
polissacarídeos de origem vegetal ou microbiana e seus derivados de alto peso
molecular, que, quando solubilizados em água fria ou quente, produzem suspensões ou
soluções viscosas, podendo formar géis a baixas concentrações (Lopes, 1989; Whistler
& BeMiller, 1993).
As bactérias Gram-negativas apresentam a parede celular mais fina, conseqüência
da menor quantidade de peptidoglicano, em comparação às Gram-positivas, e tem
como maior componente um macropolímero, denominado lipopolissacarídeo. A
presença do lipopolissacarídeo fornece uma barreira hidrofílica à superfície celular. Em
muitas bactérias, a hidrofilicidade da superfície celular é aumentada pela presença de
uma camada de EPS. O EPS pode estar organizado de modo a formar uma camada
coesiva e aderente, denominada “cápsula” ou consistir em um polissacarídeo livre e
“mucilaginoso” (slime), com pouca ou nenhuma aderência celular. O termo EPS ou
exopolissacarídeo pode ser usado tanto para descrever o polissacarídeo mucilaginoso
como o capsular (Portilho, 2002).
Várias bactérias pertencentes à família Rhizobiaceae são produtoras de EPS na
cultura, esses EPS rizobianos são heteropolissacarídeos de espécie ou estirpeespecíficos, compostos de diferentes tipos de monossacarídeos (Becker & Pühler,
1998). Existem evidências de que a composição de EPS varia, não só entre os diversos
gêneros, mas também com mudanças no meio ambiente bacteriano (Karr et al., 2000),
e alterações na constituição das unidades repetitivas podem afetar a habilidade
simbiótica do bacterióide (Wielbo et al., 2004). Porém, os mecanismos de
desenvolvimento simbiótico e de infecção ainda não estão claros e, por isso, existe
contínuo interesse em se elucidar a genética, a biologia molecular e a bioquímica de
EPS e de superfície de origem bacteriana.
Os polissacarídeos sintetizados por bactérias do gênero Rhizobium, tais como
succinoglicanas e galactoglucanas (Zevenhuizen, 1997), têm sido extensivamente
estudados na tentativa de melhor compreender sua participação na simbiose. Muitos
trabalhos têm sido desenvolvidos com o objetivo de revelar a composição química, a
biossíntese e informações genéticas destas biomoléculas, e relacionar suas estruturas
químicas às propriedades de infestação das bactérias nas plantas hospedeiras (Canter
Cremers et al., 1991), uma vez que estes biopolímeros parecem ser determinantes da
especificidade simbiótica (Gil-Serrano et al., 1992).
Os EPSs, segundo Costerton (1987), possibilitam vida livre à bactéria, permitindo a
aderência e colonização à superfícies sólidas onde nutrientes se acumulam. Eles
envolvem as membranas das células protegendo-as do dessecamento e outros
estresses ambientais, além de poder ajudar na fixação de minerais e nutrientes
próximos à bactéria (Sutherland, 1988; Whitfield, 1988).
Rhizobia de rápido crescimento sintetizam diferentes EPS: EPS de alta massa
molecular, o qual é excretado para o meio, e resulta no aumento da viscosidade do
meio de cultivo; CPS neutro e insolúvel, depositado como uma massa volumosa ao
redor da célula; e β-1, 2-glucanas cíclicas, acumuladas no espaço periplasmático e
excretadas para o meio (Zevenhuizen, 1986). Os EPS despertam maior interesse
porque podem ser recolhidos diretamente do meio para o qual são secretados. Esses
microrganismos podem também formar glucanas neutras unidas glicosidicamente por
ligações tipo β-1,4, presentes como microfibrilas celulósicas de baixo massa molecular
(Zevenhuizen,1986;
Breedveld et al., 1993) e, algumas vezes no meio de cultura,
podem ser encontrados compostos de baixa massa molecular semelhantes aos das
unidades monoméricas do EPS (Breedveld et al., 1990).
A síntese de EPS ácido, CPS neutro e poli-β-hidroxibutirato (PHB) por Rhizobium
é fortemente dependente das condições de cultivo, das linhagens utilizadas, assim
como
da
fase
de
crescimento,
levando
a
resultados
que
podem
variar
consideravelmente (Zevenhuizen, 1981; 1986; Tombolini & Nuti, 1989). A produção de
EPS por Rhizobium leguminosarum, R. phaseoli e R. trifolii segue associada ao
crescimento, enquanto que R. meliloti excreta principalmente polissacarídeos de baixa
massa molecular quando a proliferação celular está limitada pela falta de nitrogênio, em
excesso de fonte de carbono ainda presente no meio.
Zevenhuizen (1986), investigando a influência das condições de cultivo nas
quantidades de EPS, CPS e glucanas sintetizadas por Sinorhizobium meliloti TA-1
através de cultivos em meio de sais contendo ácido glutâmico (0,1 %) e manitol (1 %),
em frascos de 100 mL agitados a 25 ºC, verificou que determinadas condições
direcionavam a síntese polissacarídica para um produto específico. A produção de EPS
era favorecida em ar saturado com O2, a de CPS sob condições limitantes de nitrogênio
e moderado suprimento de O2, e a produção de β-1,2-glucanas, em meio contendo uma
concentração quatro vezes maior da fonte de nitrogênio, produzindo uma alta
densidade celular e consequentemente uma limitação severa de O2.
Em todas as linhagens, o acúmulo de glicogênio celular, β-1,2-glucana e PHB
são apenas iniciados sob condições limitantes do crescimento celular (Zevenhuizen &
Ebbink,1974). Quando há exaustão da fonte de carbono externa, glicogênio e PHB são
metabolizados pelas células, sustentando assim sua longevidade e atuando como
material de reserva (Zevenhuizen,1981).
Células de R. leguminosarum bv. phaseoli e bv. trifolii sintetizam EPS contendo
ácido urônico, PHB e/ou glicogênio, e ainda, CPS não metabolizável e pequenas
quantidades de β-1,2-glucana. R. melioti sintetiza EPS livre de ácido urônico, PHB e/ou
glicogênio e elevadas concentrações de β-1,2-glucana (Zevenhuizen, 1981).
EPS ácidos, elaborados por bactérias do gênero Rhizobium, apresentam, exceto
por pequenas diferenças, uma viscosidade extraordinária na composição e nas
propriedades estruturais entre linhagens de diferentes espécies (Zevenhuizen,
1971;1973 e Zevenhuizen & Scholten-Koerselman,1979). Os dois tipos mais comuns de
EPS de rizóbio (espécies de rápido crescimento), obtidos após a precipitação com 3
volumes de etanol, são: EPS (da S. meliloti), sem ácido urônico e que apresenta na
composição molar D-glucose; D-galactose: ácido pirúvico (7:1:1)
denominado de
polissacarídeop Tipo I e, EPS (da R. leguminosarum bv. phaseoli e bv trifolii) com
composição molar D-glucose:D-galactose:ácido D-glucurônico:ácido pirúvico (5:1:2:2)
denominado de polissacarídeo Tipo II (Zevenhuizen,1981).
As frações poliméricas precipitáveis com três volumes de etanol são produtos de
elevada massa molecular, com caráter ácido, os quais resultam em soluções aquosas
altamente viscosas. Polissacarídeos do Tipo I são produtos comuns excretados de
linhagens de S. meliloti e de Agrobacterium (Hisamatsu et al.,1982), sendo também
sintetizados por bactérias de origem totalmente diferente, tal como Alcaligenes faecalis
(Harada & Amemura, 1981). S. melioti sintetiza geralmente um EPS de elevada massa
molecular, do tipo succinoglicana, com a composição glucose: galactose: piruvato:
succinato: acetato (7:1:1:1:1) (Cinquini Dantas, 1992; Matulová et al, 1994; Ridoult et
al.,1997).
Algumas linhagens de Rhizobium apresentam composições de EPS desviadas
dos tipos mais comuns mencionados acima, tais como R. leguminosarum bv. phaseoli
linhagem K-82 com EPS de composição molar D-glucose:D-galactose: ácido urônico:
ácido pirúvico
(1:1:1:1) e S. meliloti
SU-234 que produz EPS correspondente ao
polissacarídeo Tipo II (Zevenhuizen, 1981).
Um considerável número de polissacarídeos produzidos por muitas linhagens de
rizóbio não está disperso livremente no meio, mas sim presente como um material
viscoso amorfo ao redor da célula. Tais polissacarídeos, como a curdlana, podem ser
extraídos com a simples adição de NaOH 0,5 M, seguida de precipitação pela
neutralização com HCl. Curdlana, uma β-1,3-glucana linear gelificante, pode ser
produzida por Agrobacterium
e por algumas linhagens de Rhizobium (Harada &
Amemura, 1981; Zevenhuizen, 1986), assim como pela bactéria Alcaligenes faecalis
bv. myxogenes (Harada et al., 1966; Phillips et al.,1983; Lawford & Rousseau,1989). O
derivado sulfatado deste homopolímero apresenta atividades anticoagulantes e
antitrombóticas, além de exibir efeito inibitório à infecção in vitro do vírus HIV-1
(Jagodzinsski et al., 1994). Além dos polissacarídeos neutro e ácido de elevada massa
molecular, as espécies de Rhizobium, assim como bactérias do gênero Agrobacterium,
excretam carboidratos de baixa massa molecular os quais tem sido caracterizados
como
β-1,2-glucanas
(York
et
al.,
1980).
Estas
glucanas
se
acumulam
preferencialmente no espaço periplásmico da célula (Abe et al., 1982), mas são
também excretadas para o meio juntamente com EPS ácidos. Aparentemente estes
carboidratos não apresentam uma função específica, uma vez que experimentos
realizados não sugerem a sua utilização como fonte de carbono, ou de energia pelas
células, após a exaustão da fonte de carbono exógena. Entretanto, acredita-se que β1,2-glucanas sejam importantes durante processo de infestação de raízes de plantas.
Células mutantes de S. meliloti não sintetizadoras de β-1,2-glucanas induziram somente
a formação de pseudonódulos em alfafa (Breedveld et al.,1990).
As β-1,2-glucanas cíclicas são moléculas com grande potencial de utilização,
dado o espaço interno relativamente hidrofóbico, podendo ser apropriadas como
agentes de inclusão, comparáveis às ciclodextrinas, constituídas de 6 a 8 resíduos de
glucose unidos por ligações α-1,4. Os espaços internos de ambas as moléculas são
praticamente semelhantes. Contudo a solubilidade da β-1,2-glucana cíclica é maior em
relação à ciclodextrinas (Breedveld et al .,1990).
Glicogênio e PHB estão presentes nas células de Rhizobium, sendo que
algumas vezes ocorre separadamente em diferentes linhagens, mas na sua maioria
ambos os compostos aparecem juntos em células de uma mesma linhagem.
Vários biopolímeros tem sido produzidos e utilizados comercialmente, entre eles:
Dextrana (produzida por bactérias dos gêneros Leuconostoc e Streptococcus), Xantana
(produzida por bactérias do gênero Xanthomonas), Curdulana (produzida pelas
bactérias Alcaligenes faecalis bv. mixogenes e Agrobacterium radiobacter), Alginato
bacteriano (produzido por bactérias dos gêneros Azotobacter, principalmente
Azotobacter vinelandii, e Pseudomonas), Zanflo (produzido pela bactéria Erwinia
tahitica), Gelana (produzida pela bactéria Sphingomonas paucimobilis, anteriormente
classificada como Pseudomonas elodea), Welana (produzida por espécies de
Alcaligenes), Escleroglucana (produzida por diferentes espécies de Sclerotium),
Pululana (produzida pelo fungo Aureobasidium pullulans), Celulose bacteriana
(produzida pela bactéria Acetobacter xilinum) (Sutherland, 1992; Martins & Sá-Correia,
1993; Giavasis el al., 2000; Maugeri, 2001; Giavasis et al., 2003; Kalogiannis et al.,
2003; Campbell et al., 2003).
Outros biopolímeros que estão em estudo, não sendo produzidos em escala
industrial, podem ser citados, tais como: indicana (produzida por Beijerinckia indica),
emulsana (produzida por Acinetobacter calcoaceticus), pululana (produzida pela
levedura
Rhodotorula
bacarum),
ciclossoforanas
(produzidas
por
Rhizobium,
Agrobacterium e algumas espécies de Xanthomonas), clairana (produzida por
Beijerinckia sp.), diutana (produzida pelo gênero Sphingomonas) (Maugeri, 2001;
Navarrete & Shah, 2001; Chi & Zhao, 2003; Moreira et al., 2003). Até o momento,
dextrana e xantana são, praticamente, os únicos polissacarídeos microbianos
comercializados em larga escala. A goma gelana é o terceiro polissacarídeo produzido
comercialmente por biossíntese microbiano, utilizado na indústria de alimentos
(Maugeri, 2001).
1.5 Reologia
A etmologia da palavra rheologia tem raiz e busca significado nos vocábulos
gregos rheo = deformação e logia = ciência ou estudo. Portanto, reologia é a ciência
que estuda como a matéria se deforma ou escoa, quando submetida a esforços
originados por forças externas Schlumberger (1982). Estuda o comportamento
deformacional e do fluxo de matéria submetido a tensões, sob determinadas condições
termodinâmicas ao longo de um intervalo de tempo. Inclui propriedades como:
elasticidade, viscosidade e plasticidade. No caso mais simples, a propriedade reológica
de interesse no caso de sólidos é a sua elasticidade, e nos fluidos é a viscosidade, que
pode ser interpretada como a resistência interna ou fricção interna do fluido oferece
para escoar ou também como a medida da fricção interna de um fluído . Quanto mais
viscosa o fluido, mais difícil de escoar e maior o seu coeficiente de viscosidade
(Pasquel,1999).
As propriedades reológicas das soluções de polímeros mudam com a natureza
do soluto, dependem da massa molecular média, da estrutura molecular, dos grupos
acetil ou piruvato (Casas et al., 2000; Moradi-Araghi, 2000; Diltz & Zeller, 2001;
Navarrete et al., 2001).
Viscoelasticidade é uma das propriedades reológicas mais simples de
substâncias de comportamento reológico complexo, como são os biopolímeros, uma
vez que soluções de biopolímeros com interesse de aplicação comercial exibem
propriedades viscoelásticas, isto é, a capacidade de formar géis verdadeiros em baixas
concentrações e, portanto, com características intermediárias entre sólidos e fluídos
(Szczesniak, 1993).
Entretanto, uma das importantes indicações de que um biopolímero tem
propriedades funcionais com viabilidade de aplicação comercial como agente
espessante, estruturante ou gelificante, é o resultado da medida da viscosidade
aparente de suas soluções aquosas (Szczesniak, 1993).
A viscosidade de uma solução polimérica é uma função do tamanho e da forma e
conformação que adotam suas moléculas no solvente, sendo que no caso de alimentos
e bebidas, o solvente é uma solução de outros solutos. Assim sendo, as soluções das
gomas são dispersões de moléculas hidratadas e/ou agregados de moléculas
hidratadas, e seu comportamento reológico é determinado pelo tamanho, forma,
facilidade de deformação ou flexibilidade, e presença e magnitude da carga elétrica
nessas moléculas hidratadas e/ou agregados. As soluções de polissacarídeos exibem
dois tipos gerais de comportamento reológico: pseudoplástico e tixotropia. As soluções
da maioria das gomas experimentam uma diminuição da viscosidade com o aumento da
temperatura, sendo que a goma xantana é uma exceção entre 0 e 100 º C (Pasquel,
1999).
Na Viscoelasticidade os líquidos viscosos não possuem forma geométrica
definida e escoam irreversivelmente quando submetidos a forças externas. Por outro
lado, os sólidos elásticos apresentam forma geométrica bem definida e se deformados
pela ação de forças externas, assumem outra forma geométrica de equilíbrio. Muitos
materiais apresentam um comportamento mecânico intermediário entre estes dois
extremos, evidenciando tanto características viscosas como elásticas e, por este
motivo, são conhecidos como viscoelásticos.
Quanto à deformação, os fluidos podem ser classificados em:
¾ Reversíveis ou elásticos: são sistemas que não escoam; sua deformação é
reversível e o sistema obedece à Lei de Hooke.
¾ Irreversíveis ou viscosos: são sistemas que escoam; sua deformação é
irreversível e o sistema obedece à Lei de Newton, de viscosidade constante.
Também podem ser classificados quanto à relação entre a taxa de deformação e a
tensão de cisalhamento:
¾ Fluidos Newtonianos: sua viscosidade é constante, seguem a Lei de
Newton. Esta classe abrange todos os gases e líquidos não poliméricos e
homogêneos. A relação entre a taxa de deformação e a tensão de cisalhamento
é linear e o coeficiente angular da reta é a viscosidade (Severs, 1962).
Ex.: água, leite, soluções de sacarose, óleos vegetais.
¾ Fluidos Não Newtonianos: a relação entre a taxa de deformação e a tensão de
cisalhamento não é constante. A relação é não linear e o coeficiente angular
(viscosidade) varia com a taxa de deformação (Severs, 1962).
Além disso, os fluidos não newtonianos ainda podem ser classificados em:
viscoelásticos, dependentes e independentes do tempo (Figura 1).
A Figura 2 mostra o comportamento reológicos do fluido newtoniano e dos fluidos
não newtonianos independentes do tempo.
O comportamento reológico dos fluidos pode ser caracterizado através da
relação entre a tensão de cisalhamento (força/área cisalhada) e a taxa de deformação.
Normalmente, os polímeros em solução diluída demonstram um comportamento de
líquido newtoniano. Em solução concentrada ou no estado fundido, os polímeros
apresentam um comportamento reológico distinto que lhes confere a denominação de
fluidos não-newtonianos (Tager, 1978).
Newtoniano
Viscoelásticos
Fluidos
Reopéticosticos
Não
Newtoniano
Dependentes
do tempo
Tixotrópicos
Dilatantes
Independentes
do tempo
Sem tensão de
cisalhamento
inicial
Pseudoplásticos
Com tensão de
cisalhamento
inicial
Plásticos de
Bingham
HerschelBulkley
Figura 1. Classificação dos Fluidos segundo seu comportamento reológico.
Figura 2. Curvas de escoamento de fluidos newtoniano e não
newtonianos de propriedades independentes do tempo de cisalhamento.
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
Barreto, M. C. S.
Os fluidos não-newtonianos cujas propriedades reológicas são independentes do
tempo, temos diversos tipos de comportamento de materiais que são denominados
viscoplásticos ou de Bingham, dilatante e pseudoplásticos.
Os materiais viscoplásticos ou de Bingham necessitam de uma tensão inicial
para começarem a deformação cisalhamento mantendo, então, a relação entre tensão
e taxa de deformação que pode ser constante ou não. Em soluções de polímeros de
alto peso molecular, muitas vezes uma tensão de cisalhamento mínima se faz
necessária a fim de vencer as interações intermoleculares existentes. Só após o
colapso destas ligações ocorre o escoamento do fluido. Como exemplos destes fluidos,
podem ser citados a margarina, polpa de papel e a maioria das tintas (Bretas, 1987).
Os materiais com comportamento dilatante ou pseudoplástico não necessitam de
uma tensão mínima para escoarem, mas a viscosidade destes fluidos varia de forma
não linear com a taxa de deformação (Cheremisinoff, 1993).
Os materiais pseudoplásticos incluem a maioria dos fluidos não-newtonianos,
como, por exemplo, soluções poliméricas, acetato de celulose, maionese, suspensões
de polpa de papel e pigmentos (Cheremisinoff, 1993). A maioria dos polímeros
sintéticos no seu estado fundido e das soluções aquosas de polissacarídeos são
exemplos de materiais pseudoplásticos (Lopes, 1989).
O termo dilatância é empregado normalmente para descrever tanto uma
expansão de volume, sob cisalhamento, como para caracterizar o aumento de
viscosidade de certos fluidos com o aumento da velocidade de cisalhamento. Neste
último aspecto, a dilatância é observada como fenômeno inverso à pseudoplasticidade
(Bauer & Collins, 1967). O comportamento dilatante pode ser observado em
suspensões muito concentradas, em que as partículas constituintes são irregulares e
não se orientam facilmente, ou em polímeros fundidos onde há formação de cristais
durante o processo de escoamento (Lopes e Andrade, 1991).
Como exemplos de
dilatantes podemos citar as suspensões aquosas de dióxido de titânio, suspensões de
amido de milho em etilenoglicol/água, goma arábica, areia de praia molhada, entre
outros (Lopes e Andrade, 1991; Cheremisinoff, 1993).
.
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
Barreto, M. C. S.
Os fluidos não-newtonianos cujas propriedades reológicas são dependentes do
tempo temos diversos tipos de comportamento de materiais que são denominados de
reopéticos e tixotrópicos, Materiais que se tornam mais viscosos durante a
transformação em cisalhamento suave são chamados reopéticos, exibem um aumento
da viscosidade com o aumento da velocidade de cisalhamento, a uma velocidade de
cisalhamento constante (suspensão de gesso, solos), e os que se tornam menos
viscosos são chamados tixotrópicos (tinturas, vários lubrificntes) (Cheremisinoff, 1993).
Os materiais tixotrópicos são inevitavelmente pseudoplásticos, mas nem todo
pseudoplástico é tixotrópico (Lenk, 1978).
Uma outra categoria de fluidos não-newtoniano é representada pelos fluidos
viscoeslásticos. Um material é descrito como viscoelástico quando, em suas
propriedades mecânicas, parte da energia é armazenada e outra parte é dissipada,
como calor. Na verdade, todos os corpos reais são viscoelásticos (Graessley, 1984).
Um fluido viscoelástico em equilíbrio, quando submetido à uma tensão cisalhante,
responde de dois modos sobrepostos. Primeiro, o material exibe uma resposta elástica,
que corresponde ao deslocamento das moléculas de sua posição inicial para uma nova
posição de equilíbrio. Isto ocorre logo após a aplicação da tensão e é chamado de
tempo de relaxamento. O segundo modo de resposta à tensão é o escoamento viscoso,
iniciando-se também logo que esta é aplicada. O escoamento viscoso é, por
conseguinte, irreversível espontaneamente, podendo continuar mesmo após o alívio da
tensão (Tager, 1978). Como exemplos desta classe de fluídos, polímeros como o
náilon, várias soluções poliméricas e geléias (Cheremisinoff, 1993).
O estudo reológico de sistemas poliméricos tem auxiliado, tanto na compreensão
da estrutura molecular de muitos tipos de polímeros, quanto na forma como esta
conformação estrutural afeta o comportamento reológico, quer em condições
permanentes, quer em deformação intermitente. A viscosidade e a elasticidade são as
duas faces que tendem a caracterizar a maneira como um material reage a uma tensão
imposta (Machado, 2002).
A estrutura química de cada biopolímero, bem como os grupos substituintes que
ele possui determinam suas características reológicas e, portanto, suas potenciais
aplicações (Pace, 1991).
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
Os
polissacarídeos
propriedades
físicas,
microbianos
incluindo
as
variam
Barreto, M. C. S.
consideravelmente
características
reológicas
em
suas
influenciando
marcadamente o processo fermentativo (Sutherland, 1990).
2. JUSTIFICATIVA
A relevância deste trabalho consiste na necessidade do desenvolvimento de
tecnologias de baixo custo capazes de melhorar os níveis de produtividade do feijoeiro,
podendo ser favorecido pelo estudo do comportamento da produção de polissacarídeos
por Rhizobium sp, onde os resultados permitirão avaliar a produção do biopolímero
sintetizado, como uma alternativa viável e promissora, principalmente, pelo uso de
bioproduto para formulação de inoculante, visando incrementar a contribuição no
processo da Fixação Biológica de Nitrogênio, podendo gerar no futuro insumos
biológicos capazes de promover saltos qualitativos para a agricultura.
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Barreto, M. C. S.
3. OBJETIVOS
3.1 Geral
Obter isolados de rizóbios para maior eficiência no desenvolvimento da planta, visando
selecionar microrganismos para produção de polissacarídeos extracelulares e que
possuam capacidade para produzir biopolímero.
3.2 Específicos
ª Estudo cinético do cultivo de rizóbios para determinar as condições culturais que
assegurem uma produção eficiente de polissacarídeos;
ª Determinar quais os melhores isolados produtores de polissacarídeo, em meio
líquido (g.L-1);
ª Estudar parâmetros na produção de exopolissacarídeo formado pelas estirpes de
rizóbio, tais como volume de inóculo e o comportamento viscosimétrico da
dispersão do polissacarídeo;
ª Avaliar
a
influência
do
tempo
na
produção
do
polissacarídeo,
pelo
acompanhamento de consumo de substrato e de formação do produto;
ª Determinar a composição quimica e a dosagem de sacarose das melhores
estirpes produtoras de polissacarídeo;
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Barreto, M. C. S.
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABE, M; AMEURA, A. & HIGASHI, S. Studies on cyclic β-1,2-glucan obtained from
periplasmic space of Rhizobium trifolii cells. Plant and Soil, v. 64, p. 315-324. 1982.
ARAÚJO, R.S. Fixação biológica do nitrogênio em feijão. In: ARAÚJO, R.S.; HUNGRIA,
M. (Ed.). Microrganismos de importância agrícola. Brasília: Embrapa-SPI, 1994.
p.91-120.
BALATTI, A. P. Producción de inoculantes para leguminosas. La Pampa: Facultad de
Ciências Exactas Y Naturales de la Universidad Nacional de La Pampa, 1992. 152p.
BAUER, W. H; COLLINS, E. A. Thixotropy and dilatancy. In: Erick, F. R. (Ed.).
Rheology, theory and application. New York: Academic Press, 1967, v. 4, cap. 8, p. 423459.
BECKER, A.; PÜHLER, A. Production of exopolysaccharides. In: Spaink, H. P.;
Kondorosi, A.; Hooykaas, J. J. (Ed.). The Rhizobiaceae. Dordrecht: Kluwer Academic
Publishers, 1998. p. 97-118.
BOIARDI, J. L.; BALATTI, A. P; MAZZA, L. A. Cultivos de Rhizobium phaseoli en
sistema sumergido. Rev. Fac. Agron., v. 4, p. 19-27. 1983.
BREEDVELD, M.W; ZEVENHUIZEN, L..P.T.M; ZEHNDER, A.J.B. Excessive excretion
of cyclic β-(1,2)-glucan by Rhizobium trifolii TA-1. Applied and Environmental
Microbiology, v. 56, n. 7, p. 2080-2086. 1990.
BREEDVELD, M.W; ZEVENHUIZEN, L. P.T.M; CANTER CREMERS, H. C. J. &
ZEHNDER, A. J. B.
extracellular
Influence of growth conditions on production of capsular and
polysaccharides
by
Leeuwenhoek, v. 64, p. 1-8. 1993.
Rhizobium
leguminosarum.
Antonie
Van
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
Barreto, M. C. S.
BRETAS, R. S. A reologia dos biopolímeros para leigos e iniciados. Plástico Moderno,
v. 175, p. 28-35, 1987.
BROM, S; MARTÍNEZ, E; D’ÁVILA, G; PALACIOS, R. Narrow and broad-range
symbiotic plasmids of Rhizobium spp. strains that nodulate Phaseolus vulgaris. Applied
and Environmental Microbiology, Washington, v.54, p.1280-1283. 1988.
CAMPBELL, B. S.; MCDOUGLALL, B. M.; SEVIOUR, R. J. Why do exopolysaccharide
yield from the fungus Aureobasidium pullulans fall during batch culture fermentation?.
Enzyme and microbial Technology,v. 33, p. 104-112. 2003.
CANTER CREMERS, H.C.J.; STEVENS, K.; LUGTENBERG, B.J.J.; WIJFFELMAN,
C.A.; BATLEY, M.; REDMOND, J.W.; BREEDWELD, M.W.; ZEVENHUIZEN, L.P.T.M.
Unusual structure of the exapolysaccharide of Rhizobium leguminosarum bv. vicie strain
248. Carbohydrate Research, v. 218, p. 185-200. 1991.
CASAS, J. A; SANTOS, V. E; GARCIA-OCHOA, f. Xanthan gum production under
several operational condictions: molecular structure and rheological properties. Enzyme
and Microbial Technology, v. 26, p. 282-291, 2000.
CHEREMISINOFF, N. P. An introduction to polymer rheology and processing. USA: C
Press, 1992. 280p.
CHI, Z. & ZHAO, S. Optimization of medium and cultivation conditions for pullulan
production by a new pullulan producing yeast strain. Enzyme and microbial
technology, v. 33, p. 206-211. 2003.
CINQUINI DANTAS, L. A.
Etudes Structurales et Proprietes en Solution d'un
Exopolysaccharide Secrete par une Souche Mutee de Rhizobium meliloti. 1985. These
D. Sc., Centre de Recherches sur les Macromoléculaes Végétales (CNRS), 1992.
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
Barreto, M. C. S.
COSTA, J.G.C. & VIEIRA, N.R.A. Qualidade, classificação comercial e manejo póscolheita. In: YOKOYAMA, L. P. & STONE, L.F. (Ed.) Cultura do feijoeiro no Brasil:
Características da Produção. Santo Antônio de Goiás: EMBRAPA Arroz e feijão,
2000. p.51-64.
DAKORA F. D. Defining new roles for plant and rhizobial molecules in sole and mixed
plant cultures involving symbiotic legumes. New Phytologist, v. 158, p. 39-49. 2003.
DILTZ, S; ZELLER, S. G. Location of O-acetyl groups in S-657 using the reductive
cleavage method. Carboydrate Research, v. 331, p. 265-270, 2001.
DIOUF, A.; LAJUDIE, P.; NEYRA, M.; KERSTERS, K.; GILLIS, M.; MARTINEZROMERO, E.; GUEYE, M. Characterization of rhizobia that nodulate Phaseolus vulgaris
in West Africa (Senegal and Gambia). International Journal of Systematic and
Evoluationary Microbiology v. 50, p. 159-170. 2000.
FIGUEIREDO, M.V.B.; BEZERRA-NETO, E.; BURITY, H.A. Water stress response on
the enzymatic activity in cowpea nodules. Brazilian Journal of Microbiology, v. 32,
p.195-200. 2001.
FIGUEIREDO, M.V.B., BURITY H. A., MERGULHÃO A. C. E. S., ARAÚJO W. M.,
SALINAS C. R., SILVEIRA J. A. G. Respuesta a la inoculación de Bradyrhyzobium sp.
en caupí (vigna unguiculata L. Walp.) utilizando diferentes substratos de cultivos
alternativos. Investigación Agraria - Produción y protección vegetales, v.17, n. 1,
Abril, p. 27-34. 2002.
GARRITY, G. M. & HOLT, J. G. The road map to the Manual. In: KRIEG, N.R. & HOLT,
J.G. (Ed.) Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. 2 ed., Baltimore: The Williams
& Wilkins, 2001. p. 119-154.
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
Barreto, M. C. S.
GENIAUX, E; FLORES, M; PALACIOS, R; MARTÍNEZ, E. Presence of megaplasmids in
Rhizobium tropici and further evidence of differences between the two R. tropici
subtypes. International Journal of Systematic Bacteriology, London, v.45, p.392394. 1995.
GEPTS, P. Biochemical evidence bearing on the domestication of Phaseolus
(Fabacease) beans. Economic Botany, New York, v. 44, p. 28-38. 1990.
GIAVASIS, I.; HARVEY, L. M.; MCNEIL, B. Gellan gum. Critical Reviews
Biotechology, v. 20, n.3, p. 117-211. 2000.
GIAVASIS, I.; ROBERTSON, I.; MCNEIL, B.; HARVEY, L. M. Simultaneous and rapid
monitoring of biomass and biopolymer production by Sphingomonas paucimobilis using
fourier transform-near infrared spectroscopy. Biotechnology Letters, v. 25, p. 975979. 2003.
GIL-SERRANO, A,; GONZÁLEZ-JIMENNEZ, I.; TEJERO-MATEA, P.; DEL JUNCO,
A.S.; MEGIAS, M.; ROMERO-VÁSQUEZ, M.J. Structure of the acidic exopolysaccharide
secreted by Rhizobium leguminosarum biovar.phaseoli
CFN42. Carbohydrate
Research, v. 225 , p.169-174. 1992.
GRAESSLEY, W. W. Viscoelasticity and flow in polymer melts and concentrated
solutions. In: Physical properties of polymers. American Chemical Society, Washington,
1984, p. 97-163.
GRAHAM, P.H.; DRAEGER, K.J.; FERREY, M.L.; CONROY, M.J.; HAMMER, B.E.;
MARTÍNEZ, E.; ARONS, S. R.; QUINTO, C. Acid pH tolerance in strains of Rhizobium
and Bradyrhizobium, and initial studies on the basis for acid tolerance of Rhizobium
tropici UMR1899. Canadian Journal of Microbiology, Ottawa, v.40, p.198-207. 1994.
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
Barreto, M. C. S.
HARADA, T. E AMEMURA, A. Bacterial β-glycans: succinoglycan and curdlan. Mem.
Inst. Sci. nd. Res. Osaka University, v. 38, p. 37-49. 1981.
HARADA, T., MASADA, M., FUJIMORI, K. & MAEDA, I. Production of a firm, resilient
gel-forming polysaccharide by a mutant of Alcaligenes faecalisvar. Myxogenes 10C3.
Agr. Biol. Chem., v. 30, n. 2, p. 196-198. 1966.
HISAMATSU, M., AMEMURA, A. , MATSUO, T., MATSUDA, H. & HARADA, T. Cyclic
(1→2)-β-D-glucan and the octasaccharide repeating-unit of succinoglycan produced by
Agrobacterium. Journal of General Microbiology, v. 128, p. 1873-1879. 1982.
HUNGRIA, M.; FRANCO, A. A.; SPRENT, J. I. New sources of high-temperature
tolerant rhizobia for Phaseolus vulgaris L. Plant and Soil, Dordrecht, v.149, p.103-109.
1993.
HUNGRIA, M.; ARAÚJO, R. S.. Manual de métodos empregados em estudos de
microbiologia agrícola. Brasília: EMBRAPA, 1994. 542p.
HUNGRIA, M. & ARAÚJO, R. S. Manual de métodos empregados em estudos de
microbiologia agrícola. In: Hungria, M. ed. Metabolismo de carbono e do nitrogênio
nos nódulos. Brasília, D.F.: EMBRAPA. Serviço de Produção e Informação...,1994. p.
250-283.
HUNGRIA, M.; VARGAS, M.A.T.; ARAÚJO, R.S. Fixação biológica do nitrogênio. In:
Vargas, M.A.T.; Hungria, M., ed. Biologia dos solos dos cerrados. Planaltina:
EMBRAPA-CPAC, 1997. p.189-295.
HUNGRIA M & VARGAS M. A. T. Environmental factors affecting N2 fixation in grain
legumes in the tropics, with an emphasis on Brazil. Field Crops Research, v. 65, p.
151-164, 2000.
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
Barreto, M. C. S.
HUNGRIA, M.; CAMPO, R.; CHUEIRE, L.; GRANGE, L.; MEGÍAS, M. Symbiotic
effectiveness of fast-growing rhizobial strains isolated from soybean nodules in Brasil.
Biology and Fertility of Soils, Berlin, v. 33, n. 5, p.387-394. 2001.
IPT. 1993a. Estudo da produção e utilização de inoculantes para fixação biológica de
Nitrogênio em Feijão. São Paulo: IPT, 60p. (Relatório Técnico Parcial, 30.989/93).
JAGODZINSKI, P. P; WIADERKIEWICZ, R; KURZAWSKI, G; KLOCZEWIAK, M;
NAKASHIMA, H; HYJEK, E; YAMAMOTO, N; URYU, T; KANEKO, Y; POSNER, M. R. &
KANNENBERG,
E.
L.;
REUHS,
B.D;
FORSBERG,
S;
CARLSON,
R.
W.
Lipopolysaccarides and K -antigens: Their structures, biosynthesis and functions. In.
Spaink, H.P; Kandorosi, A; Kooykaas, J. J. The Rhizobiace. Molecular Biology of
Model Plant- associated bacteria, 1998. 565p
JORDAN, D. C. Rhizobiaceae Conn 1938. In: KRIEG, N. R.; HOLT, J.G. (Ed.) Bergey’s
Manual of systematic bacteriology. Baltimore/London: Williams & Wilkins, 1984.
p.235-244.
KAY, A., ISHINO, T., ARASHIDA, T. Et al. Biosynthesis of curdlan from culture media
containing
13
C-labeled glucose as carbon source. Carbohydrate Research, v. 240, p.
153-159. 1993.
KALOGIANNIS, S.; IAKOVIDOU, G.; LIAKOPOULOU-KYRIAKIDES, M.; KYRIAKIDIS,
D. A.; SKARACIS, G. N. Optimization of xanthan gum production by Xanthomonas
campestris grown in molasses. Process Biochemistry, v. 39, p. 249-256. 2003.
KARR,
D.
B.;
LIANG,
R.
T. ;
REUHS, B.
L.;
EMERICH,
D.
W.
Altered
exopolysaccharides of Bradyrhizobium japonicum mutants correlate with impaired
soybean lectin binding, but not with effective nodule formation. Planta, v. 211, p. 218226. 2000.
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
Barreto, M. C. S.
KEYSER, H.H. & MUNNS, D.N. Tolerance of rhizobia to acidity, aluminum and
phosphate. Soil Sci. Soc. Am. J. v. 43 , p. 519-523. 1979.
LAEREMANS, T. & VANDERLEYDEN, J. Infection and nodulation signaling in
rhizobium-Phaseolus
vulgaris
symbiosis.
World
Journal
of
Microbiology
&
Biotecnology , v.14, n.6, p. 787-808. 1998.
LAWFORD, H. & ROUSSEAU, J. "Effect of oxygen on the rate of β-1,3-glucan microbial
exopolysaccharide production". Biotechnology Letters, v. 11, n. 2, p. 125-130. 1989.
LODEIRO, A.R.; GONZÁLEZ, P.; HERNÁNDEZ, A.; BALAGUÉ, L.J.; DAVELUKES, G.
Comparison of drought tolerance in nitrogen-fixing and inorganic nitrogen-grow common
beans. Plant Science, v. 154, p. 31-41. 2000.
LOPES, L. M. A. Caracterização viscosimétrica de misturas das gomas xantanas e
guar. 1989. 281p. Dissertação (Mestrado) – Instituto de Macromoléculas, Universidade
Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro: UFRJ/IMA, 1989.
LOPES, L; ANDRADE, C. T. Comportamento Reológico de polímeros. Revista de
Química Industrial, n. 686, p. 17-19, 1991.
MACHADO, J. C. V. Reologia e escoamento de fluidos. 1. ed. Editora Interciência, p. 112, 39-44, 95-107, 2002.
MARIOT, E.J. Ecofisiologia do feijoeiro. O feijão no Paraná. Londrina. P.25-41 (IAPAR.
Circular 63). 1989.
MARTINS, L. O; SÁ-CORREIA, I. Temperatura profiles of gellan gum synthesis and
activities of biosynthetic enzimes. Biotechnology Applied Biochemistry, v. 20, p.
385-395. 1993.
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
Barreto, M. C. S.
MARTÍNEZ-ROMERO, E.; SEGOVIA, E.; MERCANTE, F.M.; FRANCO, A.A.; GRAHAM,
P.H.; PARDO, M.A. Rhizobium tropici, a novel species nodulating Phaseolus vulgaris L.
beans and Leucaena sp. trees. International Journal of Systematic Bacteriology,
Washington, v.4, p.417-426. 1991.
MARTINEZ, E.; PARDO, M.A.; PALACIOS, R.; CEVALLOS, M.A. Reiteration of nitrogen
fixation gene sequences and specificity of Rhizobium in nodulation and nitrogen fixation
in Phaseolus vulgaris. Journal of General Microbiology, London, v.131, p.1779- 1786,
1985.
MATULOVÁ, M; TOFFANI, R; NAVARINI, L.; GILLI, R; PAOLETTI, S. & CESARO, A.
"NMR analysis of succinoglycans from different microbial sources: partial assignment of
their 1H and
13
C NMR spectra and location of the succinate and the acetate groups".
Carbohydrate Research, v. 265, n. 2, p. 167-173. 1994.
MAUGERI, F. Produção de polissacarídeos. In: Lima, U. A.; Aquarone, E.; Borzani, W.;
Schmidell, W. Biotecnologia Industrial: Processos Fermentativos e Enzimáticos.
São Paulo: Ed. Edgard Blücher Ltda, v. 3. 2001.
MERCANTE, F. M.; GOI, S. R.; FRANCO, A. A. Importância dos compostos fenólicos
na interação entre espécies leguminosas e rizóbio. Revista Universidade Rural, Série
Ciências da Vida. v. 22, n.1, p.65-81, 2002.
MOAWAD, H. et al. Improvement of biological nitrogen fixation in Egiptian Winter
legumes through better management of Rhizobium. Plant and Soi, v. 204 n. 1, p. 95106. 1998.
MORADI-ARAGHI, A. A review of thermally stable gels for fluid division in petroleum
production. Journal of Petroleum Science and Engineering, v. 26, p. 1-10, 2000.
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
Barreto, M. C. S.
MOREIRA, A. N.; DEL PINO, F. A. B.; VENDRUSCOLO C. T. Estudo da produção de
biopolímeros via enzimática através da inativação e lise celular e com células viáveis de
Beijerinckia sp. 7070. Ciência e Tecnologia de Alimentos, v.23, n.2, p. 300-305. 2003.
MOREIRA F M S & SIQUEIRA J. O. Microbiologia e bioquímica do solo. Editora UFLA
2ªedição. 2006. 729p.
MOULIN L.; MUNIVE, A.; DREYFUS, B.; BOIVIN-MASSON, C. Nodulation of legumes
by members of the B-subclass of Proteobacteria. Nature, London, v.411, p.948-950.
2001.
MOULIN, L., CHEN, W-M., BÉNA, G., DREYFUS, B., BOIVIN-MASSSON, C. Rhizobia:
the family is expanding. Pages 61-65 in: Nitrogen Fixation: Global Perspectives. T.
Finan, M. O’Brian, D. Layzell, K. Vessey, and W. Newton, eds. CAB International. 2002.
NAVARRETE, R. C.; SHAH, S. N. New biopolymer for coiled tubing applications.
Society of Petroleum Engineers 68487, Richardson, TX, USA, p.1-10. 2001.
NAVARRETE, R. C; SEHEULT, J. M; COFFEY, M. D. New biopolymer for drilling, drillin, completions, spacer, and coil-tubing fluid, part II. International Symposium on oilfield
chemistry. SPE 64982, Houston, TX, p.1-15, 2001.
NEVES, M.C.P. Como os microrganismos do solo obtêm energia e nutrientes. In:
CARDOSO, E.J.B.N.; TSAI, S.M.; NEVES, M.C.P. Microbiologia do Solo. Sociedade
Brasileira de Ciências do Solo, 1992. p.17-31.
NEVES, M.C.P. & RUMJANEK, N.G. Ecologia de rizóbios em climas tropicais. Série
documento, nº 23, EMBRAPA - CNAPB, Jul. 1995.
PADILHA, F. F. Síntese e caracterização de biopolímeros por Beijerinckia sp 7070.
1997. Dissertação de Mestrado – Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, Universidade
Federal de Pelotas (UFPel), Pelotas, 1997.
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
Barreto, M. C. S.
PASQUEL, ANTONIO. Gomas: utilização e aspectos reológicos. Bol. SBCTA, v. 33, n.
1, p. 86-97, 1999.
PHILLIPS, K. R., PIK, J., LAWFORD, H. G., LAVERS, B., KLIGERMAN, A. &
LAWFORD, G. R. Production of curdlan-type polysaccharide by Alcaligenes faecalis in
batch and continuous culture. Can. J. Microbiol., v. 29, p. 1331-1338. 1983.
PORTILHO, M. Avaliação da produção de exopolissacarídeo insolúvel por 2 linhagens
de Agrobacterium sp. 2002. 86p. Tese de Doutorado, Faculdade de engenharia de
Alimentos, Departamento de Ciência de Alimentos, UNICAMP, 2002.
QUINTO, C; FLORES, M; LEEMANS, J; CEVALLOS, M.A; PARDO, M.A; AZPIROZ, R;
GIRARD, M.L; CALVA, E; PALACIOS, R. Nitrogenase reductase: A functional multigene
family in Rhizobium phaseoli. Proceedings of the National Academy of Sciences of
U.S.A., Washington, v.82, p.1170-1774. 1985.
RIVAS R; VELAZQUEZ E; WILLEMS A; VIZCAINO N; SUBBA-RAO NS; MATEOS PF;
GILLIS M; DAZZO FB; MARTINEZ-MOLINA E. A new species of Devosia that forms a
unique nitrogen-fixing root-nodule symbiosis with the aquatic legume Neptunia natans
(L.f.) Druce Applied and Environmental Microbiology v. 68, p. 5217-5222. 2002.
SEVERS. E. T. Introduction to rheology. In: Rheology of polymers, New York: Reinhold
Publishing Corporation, 1962. Cap. 2, p. 8-21.
SILVEIRA, J.A.G. DA; COSTA, R.C.L. DA; OLIVEIRA, J.T.A. Drought-induced effects
and recovery of nitrate assimilation and nodule activity in cowpea plants inoculated with
Bradyrhizobium spp. under moderate nitrate level. Brazilian Journal of Microbiology
v. 32, p.187-194. 2001.
SINGLETON, P.W; BOHLOOL, B.B; NAKAO, P.L. Legume response to rhizobial
inoculation in the tropics: muths and realities. In: Mythes and Science soils in the tropics.
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
Barreto, M. C. S.
SSSP Special Publication n.29. Madison. Soil Science Society of America. p.35-155.
1992.
STRALIOTTO, R; RUMJANEK, N.G. Aplicação e Evolução dos Métodos Moleculares
para o Estudo da Biodiversidade do Rizóbio. Seropédica: Embrapa Agrobiologia, nov.
(Embrapa-CNPAB. Documentos, 93). 58p.1999.
SUTHERLAND, I. W.. Bacterial surface polysaccaharides structure and function.
International Review of Cytology, v. 113, p. 187-231. 1988
SUTHERLAND, I. W. & TAIT, M. I. Biopolymers. Encyclopedia of Microbiology, v.1,
1992.
SY, A; GIRAUD, E; JOURAND, P; GARCIA, N ; WILLEMS, A ; DE LAJUDIE, P; PRIN,
Y; NEYRA, M; GILLIS, M; BOIVIN-MASSON, C; DREYFUS, B. Methylotrophic
Methylobacterium bacteria nodulate and fix nitrogen in symbiosis with legumes. Journal
of Bacteriology 183: 214-220. 2001.
TAGER, A. Physical Chemistry of Polymers, 2. ed. Moscow: Mir Publishers, 1978, 652
p.
TOMBOLINI, R. & NUTI, M. P. Poly(β-hydroxyalkanoate) biosynthesis and accumulation
by different Rhizobium species. FEMS Microbiology Letters, v. 60, p. 299-304. 1989.
URIBE, L. Formación de nódulos de rhizobium: Factores que puedem conferir ventaja
copetitiva. Agronomia Costarricense 18(1) : p.121-131. 1994.
URENHA, L. C. et al.. Produção de biomassa celular de rizóbio. In: Hungria, M; Araújo,
R. S. Manual de métodos empregados em estudos de microbiologia agrícola.
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Centro Nacional de Pesquisa de Soja –
Brasília :EMBRAPA – SPI, 1994. 542p.
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
Barreto, M. C. S.
VAN BERKUM, P.; BEYENE, D.; EARDLY, B.D. Phylogenetic relationships among
Rhizobium species nodulating the common bean (Phaseolus vulgaris L.). International
Journal of Systematic Bacteriology, Baltimore, v. 46, p. 240-244. 1996.
VAN BERKUM, P., EARDLY, B.D. The aquatic budding bacterium Blastobacter
denitrificans is a nitrogen-fixing symbiont of Aeschynomene indica. Applied and
Environmental Microbiology v. 68, p. 1132-1136. 2002.
WHITFIELD,
C.
Bacterial
extracellular
polysaccaharides.
Canadian
Journal
Microbiology, v. 34, p. 415-420. 1988.
WHISTLER, R. L., BEMILLER, J. N. Industrial gums, 3 ed. San Diego: Academic Press,
1993. 642p.
WIELBO, J.; MAZUR, A.; KROL, J.; MARCZAK, M.; KUTKOWSKA, J.; SKORUPSKA, A.
Complexity of phenotypes and symbiotic behaviour of Rhizobium leguminosarum biovar
trifolii exopolysaccharide mutants. Archives of Microbiology, v. 182, p. 331-336. 2004.
YOKOYAMA, L.P. & STONE, L.F. Qualidade, classificação comercial e manejo
pócolheita. In: YOKOYAMA, L.P. & STONE, L.F. (Ed.) Cultura do feijoeiro no Brasil:
Características da Produção. Santo Antônio de Goiás: EMBRAPA-Arroz e feijão,
2000. p.51-64.
YORK, W. S., MCNEIL, M., DARVILL, A. G. & ALBERSHEIM, P. Beta-2-linked glucans
secreted by fast-growing species of Rhizobium. Journal of Bacteriology, v. 142, p.
243-248. 1980.
ZEVENHUIZEN, L.P.T.M. Chemical composition of exopolysaccharides of Rhizobium
and Agrobacterium. Journal of General Microbiology, v. 68, p. 239-243. 1971.
____________________
Methylation
analysis
of
acidic
exopolysaccharides
Rhizobium and Agrobacterium. Carbohydr. Res., v. 26, p. 409-419. 1973.
of
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
Barreto, M. C. S.
_____________________ Cellular glycogen, β-1,2-glucan, poly-β-hydroxybutyric acid
and extracellular polysaccharides in fast-growing species of Rhizobium". Antonie van
Leeuwenhoek, v. 47, p. 481-497. 1981.
_____________________ Selective synthesis of polysaccharides by Rhizobium trifolii,
strain TA-1". FEMS Microbiology Letters, v. 35, p. 43-47. 1986.
____________________ Succionoglycan and galactoglucan. Carbohydrate Polymers
v. 33, p. 139-144. 1997.
_____________________ & EBBINK, A. G. Interrelations between glycogen, poly-βhydroxybutiric acid and lipids during accumulation and subsequent utilization in a
Pseudomonas. Antonie van Leeuwenhoek, v. 40, p. 103-120. 1974.
______________________ & Scholten-Koerselman, H. J. Surface carbohydrates of
Rhizobium. I. β-1,2-Glucans. Antonie van Leeuwenhoek, v. 45, p.165-175. 1979.
ZIMMERMANN, M.J.O. & TEIXEIRA, M.G. Origem e evolução. In: Zimmermann, M.J.O.;
Rocha, M.; Yamada, T. eds. Cultura do feijoeiro: Fatores que afetam a
produtividade. Piracicaba: Associação Brasileira para Pesquisa da Potassa e do
Fosfato. 1988. p.50-79.
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
Barreto, M. C. S.
5. CAPÍTULO 1
BIOPOLÍMEROS SINTETIZADOS POR Rhizobium sp. :
PRODUÇÃO E COMPORTAMENTO REOLÓGICO.
Barreto M. C. S. 1,2, Figueiredo M. V. B. 2, Burity H. A.2, Lima-Filho J. L. 1.
1
Universidade Federal de Pernambuco, Rua Nelson Chaves s/n, Cidade
Universitária,
Recife – PE, Brasil.
2
Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária – IPA, Laboratório Biologia do
Solo, Av. Gal. San Martin, 1371, Bongi, Recife – PE , Brasil
* Autor de correspondência: Maria do Carmo Silva Barreto. Empresa Pernambucana de Pesquisa
Agropecuária – IPA, Laboratório Biologia do Solo, Av. Gal. San Martin, 1371, Bongi, Recife – PE ,
Brasil. E-mail: [email protected]
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
Barreto, M. C. S.
RESUMO
Os biopolímeros polissacarídicos de origem microbiana, sintetizados por bactérias,
fungos e leveduras são também conhecidos como goma devido a sua capacidade de
formar soluções viscosas e géis em meio aquoso. A produção de exopolissacarídeos
(EPS) microbianos tem sido objeto de intensa pesquisa, tendo em vista seu elevado
potencial de aplicação em diferentes setores. No entanto os polissacarídeos
sintetizados por bactérias do grupo Rhizobium, tem sido estudados na tentativa de
melhor compreender sua participação na simbiose leguminosa X Rhizobium, uma vez
que estes biopolímeros parecem ser determinantes da especificidade simbiótica,
entretanto a precisa função destas moléculas ainda está sendo investigada. No
processo de produção e viscosidade de polissacarídeo a ser obtido, deve-se considerar
desde o microrganismo em estudo até a determinação dos parâmetros de agitação,
tempo de incubação, excesso ou ausência de carboidratos e volume de inoculo, onde
se destaca o meio de produção e sua influência na síntese, no rendimento e na
composição dos EPS. O objetivo deste trabalho foi avaliar a produção e viscosidade de
biopolímeros obtidos de 8 isolados de Rhizobium sp. comparados com a estirpe padrão
Rhizobium tropici (CIAT 899) em diferentes tempos de cultivo. O biopolímero foi obtido
através de agitação, em incubador agitador. As condições foram: 28 °C, 200 rpm por 96
e 168 horas em meio YM modificado. Foram avaliados: a produção, pela massa seca
da solução aquosa dos biopolímeros a 2,5 % (v/v) através da técnica da massa seca e
após a secagem do produto foi realizada em dissecador à temperatura de 30 °C, até
massa constante. Para medidas de viscosidade, as amostras foram determinadas em
viscosímetro rotacional Brookfield (modelo RVT, Spindle 1) a 20 °C, a diferentes taxas
de cisalhamento. Os resultados mostraram que os isolados no tempo de fermentação
de 168 horas apresentou maior produção de EPS. Com o aumento do tempo também
houve um aumento da viscosidade para todos os isolados.
Palavras Chave: Exopolissacarídeos (EPS), reologia, rizóbio.
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
Barreto, M. C. S.
ABSTRACT
The biopolymers are polysaccharide from microbial origin, synthesized by bacteria, fungi
and yeast. They are also known as gums due to their capacity to produce viscous
solutions and gel in an acquoso medium. The production of microbial Exopolysaccharide
(EPS) has been an object of intensive research, due to its high application and potential
in different fields. However, the
polysaccharide synthesized by bacteria from
Rhizobium, have been studied to help understand their participation in the leguminous
symbiosis X Rhizobium since these biopolymers seem to determine the symbiotic
specificity, however, the precise function of those molecules are still to be seen to.
During the process of production and viscosity of polysaccharide, it should be
considered from the microorganism being studied to the determination of rotatory
parameters, time of incubation, excess or lack of carbohydrates and inocule volume, in
which the production medium and its influence on the synthesis is highlighted in the
yield and composition of exopolysaccharides. The aim of this research is to evaluate the
production and viscosity of biopolymers obtained form 8 isolated Rhizobium sp
compared to standard strain Rhizobium tropici (CIAT 899) in different culture timing. The
biopolymer was obtained through rotation, in shakers. The conditions were: 28°C,
200rpm per 96 and 168 hours in modified YM medium. The following items were
evaluated: the production, via dry weight of acquoso solution of biopolymers at 2.5%
(v/v) through the technique of dry weight and after drying the product, which was done in
a dessicator at 30°C, with constant weight. For measuring viscosity, the samples were
identified by using a rotational Brookfield (model RVT, Spindle 1) viscometer at 20°C,
and shear rate. The results showed that the isolated ones had a bigger production within
168 hours of fermentation time. Besides, by increasing the time, there was also an
increase of viscosity for all the isolated ones.
Keywords: Exopolysaccharide(EPS), rheology, rhizobia.
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Barreto, M. C. S.
5.1 Introdução
Os biopolímeros polissacarídicos de origem microbiana, sintetizados por bactérias,
fungos e leveduras são também conhecidos como goma devido a sua capacidade de
formar soluções viscosas e géis em meio aquoso. Esses polissacarídeos de cadeia
complexa também são conhecidos como gomas devido a sua capacidade de formar
soluções viscosas e géis em meio aquoso.
Um grande número de bactérias conhecidas produz quantidades abundantes de
exopolissacarídeos (EPS), particularmente as patogênicas de plantas como as
Xanthomonas, Erwinia e as bactérias fixadoras de nitrogênio Rhizobium, Beijerinkia e
Azotobacter (Vermani et al. 1995). Destas, os exopolissacarídeos de Xanthomonas
campestris (xantana), Sphingomonas paucimobilis e Pseudomonas elodea (gelana),
Acetobacter xylinum (celulose) e Rhizobium sp. (succinoglucana) estão sendo
comercializados (Sutherland 2001).
Os polissacarídeos extracelulares sintetizados por bactérias do gênero Rhizobium
têm sido estudados na tentativa de melhor compreender sua participação na simbiose
leguminosa x Rhizobium, uma vez que estes biopolímeros parecem ser determinantes
da especificidade simbiótica, entretanto a precisa função destas moléculas ainda está
sendo investigada.
Segundo Costerton (1987), os EPS possibilitam vida livre à bactéria, permitindo a
aderência e colonização à superfícies sólidas onde os nutrientes se acumulam. Eles
envolvem as membranas das células protegendo-as do dessecamento e outros
estresses ambientais, além de poder ajudar na fixação de minerais e nutrientes próximo
a bactéria (Sutherland, 1988; Whitfield, 1988). Ainda segundo Costerton (1987), os
EPS podem ser homopolímeros ou heteropolímeros e possuem uma variedade de
substituintes não carboidratados. Entre os homopolímeros encontrados em bactérias
que interagem com plantas, as mais comuns são as glucanas periplasmáticas β (1-2)
que estão presentes em Rhizobiaceae (Otoboni, 2001).
Os polissacarídeos bacterianos hidrossolúveis vêm sendo utilizados pelas indústrias
como emulsificantes, estabilizantes, espessantes, agentes de suspensão e dependendo
de sua natureza química, as gomas microbianas podem também ser empregadas como
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promotoras de gelificação. No entanto os polissacarídeos sintetizados por bactérias do
gênero Rhizobium, tais como succinoglicanas e galactoglucanas (Zevenhuizen, 1997;
Younes et al., 2000) têm sido estudados na tentativa de melhor compreender sua
participação na simbiose.
A produção de EPS microbianos tem sido objeto de intensa pesquisa, tendo em
vista seu elevado potencial de aplicação em diferentes setores, pois não se encontra
exposta às alterações climáticas ou à problemas nas colheitas, que prejudicam a oferta
e alteram o custo de produção das gomas tradicionais. No processo de produção de
polissacarídeos deve-se considerar desde o microrganismo em estudo até a
determinação dos parâmetros de agitação, tempo de incubação, excesso ou ausência
de carboidratos e volume de inóculo, onde se destaca o meio de produção e sua
influência na síntese, no rendimento e na composição dos EPS (Faria 2002).
Na literatura estão descritos vários meios de produção, entretanto a composição
qualitativa é a mesma e cada suplemento apresenta uma determinada função na
produção de polissacarídeo. Basicamente, os meios para produção de polissacarídeos
apresentam uma fonte de fósforo e potássio (fosfato de potássio) e nitrogênio (sulfato
de amônio) em concentrações adequadas para o crescimento do microrganismo; uma
fonte de carbono (glicose, sacarose, manose, frutose e outras) como reserva energética
e ainda oligoelementos como Na1+, K1+, Ca2+, Mg2+, Fe2+ e outros, os quais têm um
papel importante como cofatores enzimáticos nas vias de produção do polissacarídeo
(Martins et al. 1990; Wong 1993; Madi et al. 1997).
Soluções de biopolímeros bacterianos com propriedades reológicas interessantes
do ponto de vista industrial geralmente exibem propriedades pseudoplásticas,
viscoelásticas e tensão residual elevada (Sutherland 2001), porém a viscosidade
aparente do caldo de fermentação era o parâmetro utilizado para avaliar a qualidade do
biopolímero (Scamparini 1991; Bueno & Garcia-Cruz 2000).
Dos parâmetros que
interferem na viscosidade dos polímeros, pode-se citar o tipo de estrutura molecular e
concentração de polímero. A viscosidade da solução aquosa de um polissacarídeo está
diretamente relacionada com a rigidez de sua molécula que, por sua vez, depende da
sua estrutura, principalmente da estrutura primária e secundária, a qual está
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diretamente relacionada à bactéria utilizada e às condições operacionais do processo
de produção (Bradshaw et al., 1983).
A seleção de microrganismos que produzam polissacarídeos com propriedades
funcionais economicamente interessantes bem como os estudos para otimizar o
rendimento e a produtividade dos processos fermentativos na obtenção destes é um
desafio constante (Boza, 2002). A seleção da linhagem deveria ser o primeiro passo
quando se tenta um processo específico de produção.
Dentro deste contexto, este trabalho teve como objetivo geral avaliar a produção e
viscosidade de EPS, obtidos de 8 isolados de Rhizobium sp. comparados com a estirpe
padrão Rhizobium tropici (CIAT 899) em diferentes tempos de cultivo.
5.2 Material e Métodos
Microrganismos
Foram utilizadas as bactérias pertencentes ao gênero Rhizobium, 8 isolados (nativos
da região do sertão de Pernambuco – Araripina) do banco de germoplasma da
Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária - IPA, resistentes a alta
temperatura e formadoras de goma e uma estirpes padrão Rhizobium tropici (CIAT 899)
obtidas do Centro Nacional de Pesquisa em Agrobiologia - CNPAB/ EMBRAPA.
As estirpes descritas na Tabela 1 foram mantidas em meio YMA (Vincent, 1970 modificado) contendo (g.L-1): sacarose (30 g); extrato de levedura (0,4 g); 1 mL de
K2HPO4 a 10 %; 4 mL de KH2PO4 a 10 %; 2 mL de MgSO4.7H2O a 10 %; 1 mL de NaCl
a 10 %; 5 mL de Azul de Bromotimol 0,25 % em KOH a 0,2N; ou 10 mL de Vermelho
Congo a 0,25 %.
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Tabela 1. Características morfofisiológicas dos Isolados de rizóbios e da estirpe padrão
CIAT 899 - Rhizobium tropici.
Tamanho
das
colônias
Tempo
Crescimento
(dias)
pH
Transparência
Hospedeiro
Origem
ISOL-1
> 1 mm
2
Alcalino
Translúcido
Phaseolus vulgaris
Araripina-PE
ISOL-2
> 1 mm
2
Alcalino
Opaco
Phaseolus vulgaris
Araripina-PE
ISOL-3
> 1 mm
2
Alcalino
Opaco
Phaseolus vulgaris
Araripina-PE
ISOL-4
> 1 mm
2
Alcalino
Opaco
Phaseolus vulgaris
Araripina-PE
ISOL-6
> 1 mm
2
Alcalino
Opaco
Phaseolus vulgaris
Araripina-PE
ISOL-11
> 1 mm
2
Ácido
Translúcido
Phaseolus vulgaris
Araripina-PE
ISOL-14
< 1 mm
2
Levemente
Opaco
Phaseolus vulgaris
Araripina-PE
Opaco
Phaseolus vulgaris
Araripina-PE
Translúcido
Phaseolus vulgaris
Cali-CO
Isolados/
Estirpe
Ácido
ISOL-16
> 1 mm
2
Levemente
Ácido
CIAT 899*
> 1 mm
2
Ácido
Inóculo
As estirpes descritas na Tabela 1 foram purificadas por repicagem em placas de
petri contendo o meio YMA (Vincent, 1970 - modificado), utilizando o corante vermelho
do congo, como indicador. Após a purificação as bactérias foram repicadas em tubos
inclinados em meio de cultura sem o indicador vermelho de congo, as quais foram
incubados a 28 °C, por 48 horas em estufa e armazenadas a ±4 °C.
A partir dessas culturas os experimentos foram conduzidos em duas etapas.
Primeiro preparou-se um pré-inóculo, partindo de uma alçada de cultura crescida sobre
meio YMA e incubada em estufa por 48 h a 28 ± 1 °C. Transcorrido este período,
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preparou-se o inóculo, através da transferência asséptica em Erlenmeyer de 250 mL,
com 80 mL de meio de produção, contendo 2,5 % (v/v) de uma cultura do pré-inóculo
crescida até a fase logarítma e incubados em agitador rotatório a 200 rpm, a 28 ± 1 °C
em triplicata.
Produção e recuperação de biopolímero
A produção total dos biopolímeros [g.(L.h)-1] obtidos nos diferentes tempos de
cultivo foram avaliados pela massa do produto seco por volume de meio YM
modificado, em Incubadora refrigerada com agitação Modelo TE-421 TECNAL,
A
quantidade produzida de EPS durante a fermentação foi determinada através da
técnica da massa seca. Após centrifugação álcool etílico P.A. foi adicionado ao mosto
fermentado até atingir a concentração de 80 % na solução hidroalcoólica formada .
Após a total precipitação do EPS presente no meio fermentado foi realizado a secagem
do produto em dissecador à temperatura 30 °C, até massa constante. Todas as
determinações foram efetuadas em triplicata.
Viscosidade
A caracterizção reológica do biopolímero produzido foi determinada em um
viscosímetro rotacional Brookfield, modelo RVT, com spindle 1, a 20 °C, acoplados a
um banho-maria termostatizado, modelo TE-184 TECNAL. Foram determinadas as
viscosidades aparentes e a avaliação do comportamento pseudoplástico. As equações
e procedimentos específicos aplicados para os cálculos das taxas de cisalhamento em
função da rotação aplicada no material foram obtidos através dos métodos verificados
por Mitschka (1982) citado por Morais (1999) para reômetros deste modelo (RV).
O modelo reológico adotado foi de Ostwald-de Waele (power-law):
•n
τ (i ) = k γ
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Pelo método utilizado a tensão de cisalhamento é calculada pela multiplicação da
leituras de torque pela constante tabelada kat (função do rotor) e a taxa de cisalhamento
pela constante k γ (função do rotor e índice da potência) (Morais, 1999):
τ (i ) = K at .L(i )
γ (i ) = K γ (n).W (i)
Os valores das constantes das constantes de Mitschka se encontram na tabela 2
seguinte:
Tabela 2. Valores das constantes kat e k γ (Mitshka, 1982)
Rotor
1
kat
kγ
2
3
4
5
6
7
0.035
0.119
0.279
0.539
1.05
2.35
8.4
n=0.1
1.728
1.431
1.457
1.492
1.544
1.366
1.936
0.2
0.967
0.875
0.882
0.892
0.907
0.851
1.007
0.3
0.705
0.656
0.656
0.658
0.663
0.629
0.681
0.4
0.576
0.535
0.530
0.529
0.528
0.503
0.515
0.5
0.499
0.458
0.449
0.445
0.442
0.421
0.413
0.6
0.449
0.404
0.392
0.387
0.382
0.363
0.346
0.7
0.414
0.365
0.350
0.343
0.338
0.320
0.297
0.8
0.387
0.334
0.317
0.310
0.304
0.286
0.261
0.9
0.367
0.310
0.291
0.283
0.276
0.260
0.232
1.0
0.351
0.291
0.270
0.262
0.254
0.238
0.209
Análise Estatística
Para as análises individuais do experimento foi utilizado um delineamento
inteiramente casualizado, com nove (n = 9) bactérias e três repetições (r =3). O modelo
matemático utilizado foi o aditivo linear:
Yij = µ + bi + lij, onde:
Yij é a variável resposta (produção de biopolímero) da i-ésima bactéria, na j-ésima
repetição;
µ é a média geral do experimento;
bi é o efeito da i-ésima bactéria;
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lij é o componente aleatório (erro experimental ou resíduo) para a i-ésima bactéria e jésima repetição. Considerando eij independente e normalmente distribuído com média
zero e variância σe2.
O esquema teórico da análise de variância utilizado para os experimentos de 96
e 168 horas pode ser visto na Tabela abaixo.
Tabela 3 – Esquema teórico da análise de variância, para
experimentos em 96 e 168 horas.
Fonte de
variação
GL
SQ
QM
F
Bactérias
n −1
1 n 2
∑ bi −C
r i =1
Q1
Q1
Q2
Resíduos
n(r − 1)
Diferença
Q2
Total
nr − 1
n
r
∑ ∑Y
i =1
j =1
2
ij
−C
Para a análise de Grupo de experimentos foi utilizado o modelo matemático:
Yijk = µ + bi + ti + (b.t)ik + lijk, onde:
Yijk é a variável resposta (produção de biopolímero) da i-ésima bactéria, no k-ésimo
tempo, da j-ésima repetição;
µ é a média geral dos experimentos;
bi é o efeito da i-ésima bactéria;
tk é o efeito do k-ésimo tempo;
(b.t)ik é o efeito da interação hierarquica da i-ésima bactéria com o k-ésimo tempo;
lijk é o componente aleatório (erro experimental ou resíduo), para a i-ésima bactéria, do
k-ésimo tempo, na j-ésima repetição. Considerando lijk independente e normalmente
distribuído com média zero e variância σe2.
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O esquema teórico da decomposição da variância utilizado pode ser visto na Tabela 3.
Tabela 4 – Esquema teórico da análise de variância, para
grupo de experimentos.
Fonte de
variação
GL
SQ
QM
F
Bactérias (B)
n −1
_
Q1
Q1 Q 4
Tempo (T)
t −1
_
Q2
Q2 Q4
Interação
(BxT)
(n − 1)(t − 1)
_
Resíduo
nt (r − 1)
_
Q3
Q3
Q4
Q4
nrt − 1
5.3 Resultados e Discussão
Produção de biopolímero
As Tabelas 5 e 6 apresentam os resultados da análise de variância e dos dados
médios das análises individuais e do grupo de experimento da produção de biopolímero
(g.L-1) para os tempos de cultivo (96 e 168 horas), respectivamente.
A Tabela 6 apresenta a produção média (g.L-1) das fermentações realizadas em
triplicata, para a produção do biopolímero, durante 96 e 168 horas de cultivo dos 8
isolados e da estirpe padrão CIAT 899, e a média do grupo de experimento das
mesmas. Nesta observa-se que a produção máxima no período de 168 horas de
processo ocorreu para todas as estirpes, porém a bactéria CIAT 899 (padrão)
apresentou a maior produção em relação aos demais tratamentos ( ISOL 14, ISOL 16 e
ISOL. 3 ) pelo teste de Tukey a nível de 1% de probabilidade. Isto sugere que com o
aumento do tempo (168 horas) ocorre um aumento da produção, o que mostra que a
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condição de 30 g de sacarose, 200 rpm, 168 horas e 28 °C é a condição maximizada
para a produção do biopolímero realizada neste estudo. No entanto, em relação a
média das produções de 96 e 168 horas a estirpe CIAT 899 não apresentou diferença
significativa pelo teste de Tukey (p<0,01) em relação ao ISOL 14. A menor produção
de biopolímero ocorreu com o ISOL 1.
Tabela 5. Resultados da análise de variância da produção de biopolímeros
sintetizados por Rhizobium cultivados por 96 e 168 horas de cultivo.
FV
GL
Bactéria
8
Resíduo
18
Quadrado Médio
96 horas
0,4366
168 horas
0,0099
0,8720
0,0213
Significância ao nível (p<0,01), para o teste de F.
C.V. (%) 15,25 (96 horas)
C.V.(%) 14,20 (168 horas)
Tabela 6. Dados médios das análises individuais e do grupo de experimento da
produção de biopolímeros por Rhizobium sp.
Produção
Produção
-1
Média Produção
(g.L )
(g.L )
-1
(g.L )
96 horas
168 horas
96 e 168 horas
CIAT 899
1,2520 a
1,8542 a
1,5531 a
ISOL 14
1,0575 ab
1,6608 ab
1,3592 a
ISOL 16
0,8237 bc
1,3225 bc
1,0731 ab
ISOL 3
0,8825 bc
1,1746 cd
1,0285 ab
ISOL 11
0,6241 cd
0,8463 d
0,7352 bc
ISOL 4
0,4958 de
0,9429 cd
0,7194 bc
ISOL 6
0,4029 def
0,8479 d
0,6254 bc
ISOL 2
0,2162 ef
0,3217 e
0,2690 c
ISOL 1
0,1229 f
0,2779 e
0,2004 c
Bactérias
-1
As médias (3 repetições) seguidas de mesma letra não diferem estatisticamente entre si,
pelo teste de Tukey (p<0,01)
C.V. (%) 15,25 (96 horas)
C.V. (%) 14,20 (168 horas)
C.V. (%) 14,87 (96 e 168 horas)
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Entretanto, sabe-se que a produção é influenciada pela linhagem do
microrganismo, tempo e meio de fermentação (Antunes et al. 2000; Souza &
Vendruscolo 2000; Torres et al. 1993). Neste estudo, a fonte de carbono utilizada como
substrato foi à sacarose que é bastante utilizada em experimentos de fermentação. As
fermentações foram realizadas com o meio de produção elaborado a partir do meio YM
(Vincent 1970) suplementado com uma dosagem maior de sacarose (30 g/L), no intuito
de incrementar a produção das linhagens testadas.
As bactérias do gênero Rhizobium são capazes de utilizar uma ampla gama de
produtos como fontes de carbono. A literatura cita cultivos com glicose, galactose,
frutose, arabinose, xilose, ramnose, maltose, sacarose, lactose, trealose, rafinose,
manitol, furamato, malato, succinato, citrato e piruvato (Jordan, 1984). De todos estes
produtos, a sacarose é o de mais fácil obtenção e mais vantajoso economicamente.
Segundo Sutherland (2002) a glicose e sacarose são usadas como fontes de carbono
preferenciais para a produção de biopolímeros. O rendimento da conversão de
sacarose em células pelo R. leguminosarum bv. phaseoli oscila entre 0,4 e 0,5 g de
células por grama de sacarose (Boiardi, 1983; Balatti, 1992; IPT, 1993a)
Padilha (2003) também verificou que os resultados de fermentação obtidos em
duas linhagens de Xanthomonas demonstraram a influência do tempo de incubação na
produção do biopolímero, onde a linhagem X. axonopodis pv. manihotis 289 apresentou
maior concentração em ambas as condições testadas, 72 e 96 horas, 6,9 g.L-1 e 7,9
g.L-1, respectivamente, em relação à linhagem de X. campestris pv campestris CA110
que produziu 6,3 g.L-1 e 6,8 g.L-1, respectivamente.
Após
a
fermentação,
os
biopolímeros
foram
purificados
(por
centrifugação), recuperados e avaliados visualmente, para verificar as diferenças
quanto à coloração e estrutura das duas estirpes, maiores produtoras de goma (CIAT
899 e ISOL 14) após a precipitação com etanol. A Figura 3 apresenta o aspecto dos
EPS precipitados, a partir da produção onde pode-se observar diferenças quanto ao
aspecto da goma precipitada. Observa-se que os polímeros sintetizado pelo ISOL 14
apresenta um aspecto translúcido, enquanto que o CIAT 899 um aspecto mais opaco e
denso. Quanto à coloração, não foi detectada pigmentação nas gomas obtidas.
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(b)
(a)
Figura 3 – Aspecto do EPS precipitado, sintetizado a partir do ISOL 14 (a)
e do CIAT 899 (b) com 168 horas de cultivo.
Segundo, Sandford (1979) os métodos usados para a recuperação de um
biopolímero dependem, sobretudo das características do microrganismo utilizado, do
tipo de polissacarídeo e do grau de pureza desejado.
Smith & Pace (1982) revisaram esquemas de recuperação para polissacarídeos
microbianos. A precipitação (baseada no caráter polieletrilítico do polissacarídeo) tem
sido realizada pela adição de cátions (como eletrólito) mono e polivalentes bem como
pela utilização de diversos tipos de solventes (acetona, metanol, etanol, isopropanol, 1butanol ou 1,1,1-tricloroetano) como agentes precipitantes.
Os sólidos obtidos neste estágio de separação são lavados com solução
(etanol/água), para remoção de grande parte das impurezas (Sais inorgânicos e
pigmentos), sendo, então secos à vácuo ou pela passagem forçada de ar quente ou
gás inerte (Pace & Righelato, 1981). As condições de secagem devem ser tais que
evitem a degradação química, coloração excessiva ou mudanças na solubilidade do
produto (Margaritis & Pace, 1985).
O biopolímero seco é então moído a uma
granulometria pré-determinada, dependendo da aplicação do produto.
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Viscosidade aparente
As propriedades reológicas foram avaliadas através da análise de viscosidade
aparente, para verificar o comportamento reológico dos EPS produzidas, a temperatura
de 20 °C, comparando-se nos tempos de fermentação de 96 e 168 horas.
Os resultados obtidos podem ser visualizados nas figuras 4 e 5, onde as soluções
das gomas apresentaram comportamento pseudoplástico, isto é, a viscosidade
aparente decresceu com o aumento da taxa de cisalhamento. De acordo com a
literatura, esse comportamento tem sido encontrado em soluções poliméricas de
Viscosidade aparente (Pa.s)
polissacarídeos microbianos (Amanullah et al. 1996; Cacik et al. 2001; Padilha 2003).
0,35
ISOL 1
0,3
ISOL 2
ISOL 3
0,25
ISOL 4
0,2
ISOL 6
0,15
ISOL 11
ISOL 14
0,1
ISOL 16
0,05
CIAT
899
0
0
10
20
30
40
50
60
70
Taxa Cisalham ento (s-1)
80
90
100
110
Figura 4. Variação da viscosidade aparente em função da taxa de
cisalhamento de soluções aquosas de EPS 2,5 % (v/v) de 8 isolados de
Rhizobium e uma estirpe padrão CIAT 899 a 20 °C com tempo de
fermentação de 96 h, determinada com viscosímetro rotacional Brookfield
(modelo RVT).
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Viscosidade aparente (Pa.s)
0,35
ISOL 1
0,3
ISOL 2
0,25
ISOL 3
ISOL 4
0,2
ISOL 6
0,15
ISOL 11
ISOL 14
0,1
ISOL 16
0,05
CIAT 899
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90 100 110 120 130 140 150 160
Taxa cisalham ento (s-1)
Figura 5. Variação da viscosidade aparente em função da taxa de
cisalhamento de soluções aquosas de EPS 2,5 % (v/v) de 8 isolados de
Rhizobium e uma estirpe padrão CIAT 899 a 20 °C com tempo de
fermentação de 168 h, determinada com viscosímetro rotacional Brookfield
(modelo RVT).
Através dos gráficos comparativos entre as leituras de viscosidade aparente das
soluções aquosas das diferentes gomas produzidas, pode-se visualizar que o CIAT
899, ISOL 3 e ISOL 16 apresentaram os valores de viscosidade mais elevados em
ambos os tempos de processo, porém, em 168 horas as viscosidades tiveram um
aumento comparando-se a 96 horas (Figura 4 e 5).
A diminuição da viscosidade com o aumento da taxa de cisalhamento é uma
característica comum aos biopolímeros bacterianos. Beyer et al (1987) observaram que
em soluções a 1% do polissacarídeo produzido por Rhizobium CB744 medidas a 25 °C
e 65 °C, também houve um decréscimo da viscosidade com taxa de cisalhamento e
temperatura. Vendruscolo (1995) estudou o comportamento reológico das soluções
aquosas a 6 % do biopolímero Beijerinckia 7070, produzido por fermentação com meio
VIII contendo 5 % de sacarose, medido nas temperaturas de 25, 45 e 65 ° C. Verificou
que a viscosidade é dependente da temperatura e que decresce com o aumento desta,
porém, o biopolímero recupera as suas características reológicas quando a viscosidade
é medida novamente na temperatura inicial, no caso 25 °C.
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Barreto, M. C. S.
Em estudo realizado por Bueno & Garcia-Cruz (2000) com a bactéria do gênero
Pseudomonas, foi verificada a influência do tempo de cultivo em 24, 48 e 72 horas,
utilizando-se dois caldos de fermentação diferentes. Em um caldo, a fonte de carbono
utilizada foi a glicose e no outro, a sacarose na concentração de 2,0 %. Os
biopolímeros apresentaram comportamento pseudoplástico e a maior viscosidade
aparente obtida foi em 72 horas de cultivo. O meio contendo sacarose produziu fluidos
mais viscosos em 24 e 48 horas e o contendo de glicose produziu fluidos mais viscosos
somente após 72 horas de cultivo.
As propriedades reológicas do biopolímero devem ser estáveis durante mudanças
na temperatura, pH e força iônica. O conhecimento sobre as propriedades dos
biopolímeros, principalmente a viscosidade e o comportamento reológico são
importantes para futuras aplicações industriais, refletem sua estrutura química primária
e servem para predizer em quais produtos podem ser utilizados (Scamparini et al.
1997).
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Barreto, M. C. S.
5.4 Conclusões
ª É possível produzir biopolímeros a partir de Rhizobium sp, utilizando-se meio
suplementado (sacarose 30 g/L);
ª A condição maximizada para a produção de biopolímeros sintetizados por
Rhizobium sp, a partir do meio suplementado, dentro das faixas estudadas foi 28
°C, 200 rpm, 168 horas de fermentação, em meio contendo 2,5 %(v/v) inoculo;
ª A produção obtida nessa condição foi 1,85 g.L-1 para a estirpe CIAT 899; 1,66
g.L-1 para o ISOL 14 e 1,32 g.L-1 para o ISOL 16;
ª Os biopolímeros sintetizados por Rhizobium sp apresentaram comportamento
reológico característico de soluções poliméricas de polissacarídeos microbianos,
apresentando os valores mais elevados de viscosidade aparente para CIAT 899,
ISOL 3 e ISOL 16 respectivamente, para soluções aquosas de goma sintetizadas
a partir de sacarose 30 g/L, medidos a 20 °C em 168 horas de processo;
ª Estudos
viscosímetricos
de
soluções
do
polissacarídeo
revelaram
comportamento pseudoplástico, mesmo em baixas concentrações.
seu
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
Barreto, M. C. S.
5.5 Referências
Amanullah A, Serrano LC, Galindo E, Nienow AW (1996) Reproducibility of pilot scale
xanthan fermentations. Biotechnology Progress, New York 12: 466-473
Antunes AEC, Moreira AS, Vendruscolo JLS, Vendruscolo, CT (2000) Viscosidade
aparente de biopolímeros produzidos por diversas cepas de Xanthomonas campestris
pv Pruni. Ciência e Engenharia 9 (1): 83-87
Balatti AP (1992) Producción de inoculantes para leguminosas. La Pampa: Facultad de
Ciências Exactas Y Naturales de la Universidad Nacional de La Pampa 152p
Beyer R, Melton DL., Kennedy DL (1987) Viscosity studies on the polysaccharide gum
from Rhizobium strain CB 744. Journal of the Science of Food and Agricultura 39: 151161
Boiardi JL, Balatti AP, Mazza LA (1983) Cultivos de Rhizobium phaseoli en sistema
sumergido. Rev. Fac. Agron. 4: 19-27
Boza
YEAG
(2002)
Encapsulamento
Beijerinckia
sp
utilizando
Spray-drier.
Departamento de Ciência de alimentos (FEA), Universidade Estadual de Campinas
(UNICAMP), Campinas
Bueno SM, GARCIA-CRUZ CH (2000) Influência do tempo de fermentação e presença
de sais na reologia do caldo de fermentação de uma bactéria do gênero Pseudomonas
isolada do solo. In: Congresso Brasileiro de Ciência e Tecnologia de Alimentos, 17.,
2000, Fortaleza. Livro de resumos...Fortaleza 9-47
Bradshaw IJ, Nisbet BA, Kerr MH, Sutherland IW (1983) Modifield xanthan: its
preparation and viscosity. Carbohyfrate Polymers, Barking 3:23-38
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
Barreto, M. C. S.
Cacik F, Dondo RG, Marques D (2001) Optimal control of a batch bioreactor for the
production of xanthan gum. Computers and Chemical Engineering, [S. l.] 25:409-418
Costerton IW (1987) Bactrial biofilms in nature and disease. Annual Review of
Microbiology 41:435-464
Faria LHB (2002) Caracterização taxonômica e produção de polissacarídeos
utilizando bactérias isoladas de amostras do solo. Tese (Mestrado em Engenharia e
Ciência de Alimentos) – Instituto de Biociências, Letras e Ciências exatas, Universidade
Estadual Paulista, São José do Rio Preto.
Jordan DC (1984) Rhizobiaceae Conn 1938. In: KRIEG, N. R.; HOLT, J.G. (Ed.)
Bergey’s manual of systematic bacteriology. Baltimore/London: Williams & Wilkins 235244.
Madi NB, Mcneil B, Harvey M (1997) Effect of exogenous calcium on morphological
development and biopolymer synthesis in the fungus Aureobasidium pullulans. Enzyme
and Microbial Technology, New York, 21:102-107.
Margaritis A, Pace GW (1985) Microbial Polysaccharides. In: Comprehensive
Biotechnology, v. 49, n. 3, p. 1005-1004.
Martins LO, Brito LC, SÁ-CORREIA I (1990) Roles of Mn2+, Mg2+ and Ca2+ on alginate
biosynthesis by Pseudomonas aeruginosa. Enzyme and Microbial Technology, New
York 12:794 -799.
Mitschka, P. (1982) “Simple conversion of Brookfield RVT readings into viscosity
functions”. Rheologica Acta, v. 21, n. 2, p. 207-209.
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
Barreto, M. C. S.
Morais, RLC (1999) Caracterização reológica de licor negro e efeito do aditivo peróxido
de hidrogênio. Dissertação (Mestrado Engenharia Química) – Centro de Tecnologia e
Geociências, Universidade Federal de Pernambuco, Recife. 131p.
Otoboni AMMB (2001) Determinação da composição dos exopolissacarídeos em
diferentes isolados de Xylella fastidiosa por cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE), 82f. Dissertação (Mestrado em Genética e Melhoramento de plantas) –
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista,
Jaboticabal.
Pace, GW, Righelato, RC (1981) Production of extracellular microbial polysaccharides.
Advances in Biochemical Engineering, v. 15, p. 41-70.
Padilha FF (2003) Produção de biopolímeros sintetizados por microrganismos. 2003.
99 p. Tese (Doutorado em Ciência dos alimentos) – Universidade
Estadual de
Campinas, Campinas.
Sandford PA (1979) Exocellular microbial polysaccharides. Advances in Carbohydrate
Chemistry and Biochemistry, v. 36, p. 265-313.
Scamparini ARP (1991) Modification of xanthangum. In: Wold Congress of Food
Science and Techonology Toronto. Abstracts…Toronto 8 : 177.
Scamparini A, Mariuzzo D, Fujihara H, Jacobusi R, Vendruscolo C (1997) Structural
Studies of CV-70 Polysaccharide. International journal of Biological Macromolecules 21 :
115-121
Souza AS, Vendruscolo CT (2000) Produção e caracterização dos biopolímeros
sintetizados por Xanthomonas campestris pv. Pruni cepas 24 e 58. Ciência e
Engenharia. 8(2):115-123
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
Barreto, M. C. S.
Smith IH, Pace W (1982) Recovery of microbial polysaccharides. Journal of Chemistry
Technology & Biotechnology, v. 32, p. 119-129.
Sutherland IW (1988) Bacterial surface polysaccaharides structure and function.
International Review of Cytology 113 : 187-231
Sutherland IW (2001) Microbial polysaccharides from gram-negative. International Dairy
Journal, Barking 11: 663-674
Sutherland I (2002) A sticky business: microbial polysaccharides: current products and
future trends. Microbiology Today, [S.l] 29:70-71
Torres LG, Brito E, Galindo E, Chopin L (1993) Viscous behaviour of Xanthan aqueous
solutions from a variant of Xanthomonas campestris. Journal of Fermentation and
Bioengineering 75 : 58-64
Vincent JM (1970) A manual for the practical study of the root nodule bacteria. Lodon:
JBP, 1970. 164 p.
Vendruscolo CT (1995) Produção e caracterização do biopolímero produzido por
Beijerinckia sp. isolado do solo da região de Ribeirão Preto – SP, Brasil. Campinas,.
143p. Tese – Universidade Estadual de Campinas.(UNICAMP)
Vermani MV, Kelkar SM, Kamat
MY (1995) Production and optimization of certain
growth parameters for an exopolysaccharide from Azotobacter vinelandii MTCC 2460
isolated from a plant rhizosphere. Journal of Fermentation and Bioengineering, Osaka
80(6): 599-602
Wong TY (1993) Effects of calcium on sugar transport in Azotobacter vinelandii. Applied
and Environmental Microbiology, Washington 59(1): 89-92
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
Barreto, M. C. S.
Whitfield C (1988) Bacterial extracellular polysaccaharides. Canadian Journal
Microbiology 34: 415-420
Younes A, Achouak W, Marol C, Heulin T (2000) Rhizosphere soil agreegation and plant
growth promotion of sunflowers by an exopolysaccharide producing Rhizobium sp. strain
isolated from sunflower roots. Applied and Environmental Microbiology, August 66(8):
3393-3398
Zevenhuizen LPTM (1997) Succionoglycan and galactoglucan. Carbohydrate Polymers
33 : 139-144.
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Barreto, M. C. S.
6. CAPÍTULO 2
CINÉTICA MICROBIANA E COMPOSIÇÃO QUÍMICA
DOS EPSs PRODUZIDOS POR Rhizobium sp.
Barreto M. C. S. 1,2, Figueiredo M. V. B. 2,Oliveira, J. P.2, Lima-Filho J. L. 1.
1
Universidade Federal de Pernambuco, Rua Nelson Chaves s/n, Cidade Universitária,
Recife – PE, Brasil.
2
Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária – IPA, Laboratório Biologia do
Solo, Av. Gal. San Martin, 1371, Bongi, Recife – PE , Brasil
O manuscrito a seguir será
submetido à revista Scientia Agrária.
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Barreto, M. C. S.
RESUMO
Os exopolissacarídeos (EPSs) são definidos como polissacarídeos extracelulares,
produzidos por alguns fungos e bactérias. Alguns EPSs são sintetizados durante todo o
crescimento bacteriano enquanto que outros são produzidos somente durante a fase
logarítmica ou na fase estacionária. O objetivo deste trabalho foi avaliar o crescimento
microbiano e dosagem de sacarose, assim como determinar a composição química das
melhores estirpes obtidos de 8 isolados de Rhizobium sp. em diferentes tempos de
cultivo. O biopolímero foi obtido através de agitação, em incubador rotatório. As
condições foram: 28 °C, 200 rpm por 96 e 168 horas em meio YM modificado. Foram
avaliados: a cinética microbiana, pela contagem do número de unidades formadoras de
colônias (UFC) e por densidade ótica, assim como consumo de substrato (sacarose)
pelo método glicose-oxidase e determinação da composição química por cromatografia
gás líquido (GLC). Os resultados mostraram que a cinética de crescimento microbiano
apresentou na fase logarítmica valores correspondentes a uma concentração celular
média de 109 UFC/mL para todos os isolados e estirpe padrão CIAT 899 após 72 horas
de incubação. O consumo de substrato em 168 horas de fermentação foi de de 4,55
g/L e 4,78 g/L,
para o ISOL 14 e CIAT 899, respectivamente. A composição dos
açucares dos exopolissacarídeos
do ISOL 14 apresentou valores superiores
de
ramnose, manose, galactose, glicose e ácidos urônicos na molécula, em relação a
estirpe padrão CIAT 899.
Palavras Chave: Exopolissacarídeos, glicose, rizóbio, sacarose, unidades formadoras
de colônias (UFC).
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Barreto, M. C. S.
6.1 Introdução
Os
exopolissacarídeos
(EPSs),
chamados
de
biopolímeros
ou
gomas
hidrossolúveis, são produzidos por uma grande variedade de microrganismos e
possuem propriedades físicas, estruturais e químicas bastante homogêneas, em
relação aos derivados de algas e plantas (Margaritis; Pace, 1985).
A produção de EPS pode ser limitada por certas condições como: quantidade de
carboidratos, nitrogênio, cofatores no meio, temperatura, pH e condições de aeração.
Entretanto, os efeitos destas condições não podem ser generalizados para todas as
estirpes bacterianas, deve-se levar em consideração as particularidades de cada uma.
Os EPSs formam uma camada protetora para as células, protegendo-as da
desidratação e de substâncias tóxicas e servem como fonte de carbono e energia, além
de manterem os microrganismos perto das fontes alimentares.
Os primeiros estudos nutricionais sobre a composição do meio de produção foram
realizados por Davidson (1978) em cultivo contínuo, e por Souw & Demain (1979), em
batelada. Souw & Demain (1979) estudaram diferentes fontes de carbono e nitrogênio e
concluíram que as melhores fontes de carbono são açúcares, especialmente glicose e
sacarose. Além, do tipo de substrato utilizado, a concentração inicial deste no meio de
cultivo parece ser um fator decisivo para o sucesso do processo fermentativo.
Thomart et al (1985) concluíram que a produção de polímero é altamente
dependente da concentração inicial de açúcar, enquanto o crescimento do
microrganismo independe desta concentração inicial de açúcar. Foi relatada uma
produção decrescente de polímero à medida em que a concentração inicial de glicose
foi aumentada, caindo rapidamente a razão polímero/biomassa para concentrações
iniciais maiores que 3%.
Diversas pesquisas têm tentado elucidar a rota biossintética, as condições de
crescimento, e a fisiologia bacteriana que leva à produção de polissacarídeos. Alguns
EPSs são sintetizados durante todo o crescimento bacteriano enquanto que outros são
produzidos somente durante a fase logarítmica ou na fase estacionária. A síntese de
todos esses EPSs é um processo intracelular utilizando açucares difosfato nucleotídios
(De Souza; Sutherland, 1994).
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Barreto, M. C. S.
Tem sido observado que as limitações da fonte de nitrogênio, fosfato ou enxofre em
presença de excesso de carboidrato podem conduzir a um aumento na síntese de
polissacarídeo, embora a quantidade seja também afetada pelo teor de oxigênio, pH e
temperatura. Cada cepa bacteriana difere em sua resposta ao efeito destas mudanças
ambientais e à fonte de carbono utilizada. (Faria, 2002). Portanto, a utilização do meio
de fermentação mais adequado para a produção de EPS irá refletir nas propriedades
funcionais de cada polissacarídeo obtido.
Para a produção de EPS podem ser usados os mais diversos substratos: glicose,
frutose, sacarose, lactose, amido hidrolisado, metanol, diferentes hidrocarbonetos. O
custo de produção é dependente destes substratos (Margaritis; Pace, 1985). De todos
estes produtos a sacarose é o de mais fácil obtenção e mais vantajoso
economicamente. O rendimento da conversão de sacarose com células pelo R.
leguminosarum bv. phaseoli oscila entre 0,4 e 0,5 g de células por grama de sacarose
(Boiardi, 1983; Balatti, 1992; IPT, 1993 a). A sacarose (C12H22O11) é um dissacarídeo
não redutor o qual por hidrólise com ácidos muito diluídos, resinas de troca catiônica ou
a enzima invertase, fornece proporções equimolares de D-Glicose e D-Frutose.
Geralmente, concentrações limitantes de alguns nutrientes e excesso de
carboidrato favorecem a produção de polissacarídeos (Sutherland, 1979). Obtém-se um
alto rendimento quando ocorre a conversão de 70-80% da fonte de carbono utilizada
em biopolímero (Margaritis, Pace, 1985).
Um aspecto de extrema importância em relação aos EPSs é a necessidade de
um rígido controle das condições de fermentações, uma vez que diferentes parâmetros
de produção levam à obtenção de produtos com características heterogêneas.
Assim, é fundamental que qualquer estudo para a produção de EPS seja
acompanhado pela caracterização do material produzido, principalmente a composição
química, uma vez que pequenas variações químicas na molécula terão grande efeito
para determinadas aplicações.
Dentro deste contexto, este trabalho teve como objetivo geral avaliar a cinética
microbiana, obtidos de 8 isolados de Rhizobium sp. e uma estirpe padrão Rhizobium
tropici (CIAT 899) em diferentes tempos de cultivo, determinar a dosagem da sacarose
do ISOL 14 e a estirpe padrão CIAT 899 e a composição química do ISOL 14,
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Barreto, M. C. S.
selecionadas como as estirpes maiores produtoras de EPS, em estudos realizados
anteriormente por Barreto et al. (2008) (submetido à publicação).
6.2 Material e Métodos
Microrganismos
Foram utilizadas as bactérias pertencentes ao gênero Rhizobium, 8 isolados (nativos
da região do sertão de Pernambuco – Araripina) do banco de germoplasma da
Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária - IPA, resistentes a alta
temperatura e formadoras de goma e uma estirpes padrão Rhizobium tropici (CIAT 899)
obtidas do Centro Nacional de Pesquisa em Agrobiologia - CNPAB/ EMBRAPA.
As estirpes descritas na Tabela 1 foram mantidas em meio YMA (Vincent 1970)
modificado contendo (g.L-1): sacarose (30 g); Extrato de Levedura (0,4 g); 1 mL de
K2HPO4 a 10 %; 4 mL de KH2PO4 a 10 %; 2 mL de MgSO4.7H2O a 10 %; 1 mL de NaCl
a 10 %; 5 mL de azul de bromotimol 0,25 % em KOH a 0,2N; ou 10 mL de vermelho do
congo a 0,25 %.
Para as determinações da sacarose foram analisados apenas o ISOL 14 e a estirpe
padrão CIAT 899 e a composição química apenas o ISOL 14, selecionadas como as
estirpes maiores produtoras de EPS, em estudos realizados por Barreto et al (2008)
(submetido à publicação).
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Tabela 7. Isolados de rizóbios e estirpe padrão CIAT 899 Rhizobium tropici.
ISOLADOS
HOSPEDEIRO
ESTIRPE
ISOL-1
Phaseolus vulgaris
ORIGEM
Araripina-PE
ISOL-2
Phaseolus vulgaris
Araripina-PE
ISOL-3
Phaseolus vulgaris
Araripina-PE
ISOL-4
Phaseolus vulgaris
Araripina-PE
ISOL-6
Phaseolus vulgaris
Araripina-PE
ISOL-11
Phaseolus vulgaris
Araripina-PE
ISOL-14
Phaseolus vulgaris
Araripina-PE
ISOL-16
Phaseolus vulgaris
Araripina-PE
CIAT 899*
Phaseolus vulgaris
Cali-CO
Inóculo
As estirpes descritas na tabela 7 foram purificadas por repicagem em placas de
Petri contendo o meio de cultura Agar, sacarose, extrato de levedura (Vincent, 1970 modificado), utilizando o corante vermelho do congo, como indicador. Após a
purificação as bactérias foram repicadas em tubos inclinados em meio de cultura sem o
indicador vermelho do congo, as quais foram incubados a 28 °C, por 48 horas em
estufa e armazenadas a ±4 °C.
A partir dessas culturas os experimentos foram conduzidos em duas etapas.
Primeiro preparou-se um pré-inóculo, partindo de uma alçada de cultura crescida sobre
meio YMA e incubada em estufa por 48 h a 28 ± 1 °C. Transcorrido este período,
preparou-se o inóculo, através da transferência asséptica em Erlenmeyer de 250 mL,
com 80 mL de meio de produção, contendo 2,5 % (v/v) de uma cultura do pré-inóculo
crescida até a fase logarítma e incubados em agitador rotatório a 200 rpm, a 28 ± 1 °C
em triplicata.
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Barreto, M. C. S.
Curva de crescimento microbiano
O crescimento celular foi avaliado através da leitura de absorbância, em
comprimento de onda de 560 nm, em espectrofotômetro, contra um branco constituído
de meio YM. O plaqueamento das bactérias foi efetuado em meio YMA contendo o
indicador vermelho do congo através do método da gota (“Drop-plate”). As curvas de
crescimento microbiano foram construídas a partir dos dados de absorbância e
contagem de células viáveis (UFC/mL). A Figura 5 mostra o procedimento efetuado
para a contagem de UFC e totais (densidade ótica).
Figura 6. Procedimento para contagem de células viáveis (UFC) e totais
(densidade ótica)
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Barreto, M. C. S.
Determinação quantitativa da sacarose
A sacarose presente no mosto foi hidrolisada para obter glicose e frutose. Para
isso, foram preparados tubos de ensaio contendo 1 mL de meio fermentado, 1 mL de
água destilada e 1 mL de HCl 2 N, deixando-se reagir por 10 minutos a 60 °C. Em
seguida resfriou-se rapidamente e neutralizou com 3 mL de NaOH 1 N. O cálculo da
concentração de sacarose em g/L foi efetuado de acordo com a Equação 1 (Araújo et
al., 2005).
Csac. = fator de calibração* média da leitura (absorbância)*D* (1/100)*1,9.
(1)
Em seguida procedeu de acordo com o descrito para dosagem de glicose, cujas
determinações foram realizadas por método enzimático utilizando o Kit glicose-oxidase
PAP da LABTEST.
Após a reação enzimática, a intensidade da cor da solução foi medida a 505 nm
em espectrofotômetro, usando cubetas de vidro de 1 cm de percurso óptico,
considerando como branco, a solução da glicose-oxidase. Esse método é específico
para a glicose e se baseia na oxidação da mesma, de acordo com a seguinte reação,
catalizada pela glicose-oxidase (GOD):
GOD
Glicose + O2 + H2O → Ácido Glucônico + H2O2
O peróxido de hidrogênio formado reage com 4-aminoantipirina e fenol, sob ação
catalizadora da peroxidase (POD), através de uma reação oxidativa de acoplamento
formando uma antipirilquinona vermelha cuja intensidade de cor é proporcional à
concentração da glicose na amostra. Esse composto de tonalidade vermelha apresenta
a sua máxima absorção de luz na faixa de 505 nm.
POD
2 H2O2 + 4-Aminoantipirina + fenol → Antipirilquinonimina + 4 H2O.
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Barreto, M. C. S.
Determinação da Composição Química
ª Àcido urônico
A dosagem de ácido urônico foi efetuada pelo método descrito por Blumenkrantz
& Asbol-Hansen (1973), usando alíquotas de 0,4 mL de uma solução a 100 mg/mL do
polissacarídeo e ácido D-glucurônico como padrão. O método utiliza m-fenilfenol , (o
qual promove a formação de composto corado que absorvem em 520 nm).
As leituras das medidas de absorbância foram realizadas a 520 nm, em
espectrofotômetro
Spectronic
20
Genesys,
Spectronic
Instruments.
Todas
as
determinações foram realizadas em triplicata.
ª Determinação quantitativa de monossacarídeos
Os monossacarídeos presentes nas amostras de biopolímeros de Rhizobium
sp foram determinados sob a forma de acetato de alditóis (Sawardeker et al., 1965) por
cromatografia gás líquido (GLC). Os acetatos derivados foram analisados por
cromatografia gasosa (cromatógrafo a gás modelo 5890S11 (Hewllet-Packard)), a 220
°C, com uma coluna capilar DB-210 (0,25 mm d.i. x 30 m) e filme de espessura igual a
0,25 µm. A temperatura de injeção da amostra e a do FID foi 250 °C e foi utilizado como
gás carreador N2. Para a realização desta análise, aproximadamente 10 mg das
amostras foram hidrolisadas, reduzidas e acetiladas. A hidrólise foi efetuada com ácido
sulfúrico.
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Barreto, M. C. S.
6.3 Resultados e Discussão
Curva de crescimento microbiano
Com base nos resultados obtidos neste estudo, que podem ser visualizados nas
Figuras 6 a 14 (a), pode-se observar que houve diferenças quanto ao crescimento
populacional entre os isolados. A curva de crescimento dos isolados e da estirpe
padrão CIAT 899 de Rhizobium sp em meio utilizando sacarose como fonte de carbono,
mostrou que após 72 horas de incubação o crescimento foi máximo. Pode-se observar
que o ótimo da fase log ocorre entre 72 a 120 horas de incubação à temperatura de 28
°C, com agitação de 200 rpm, variando conforme a linhagem estudada. Esta faixa de
tempo de incubação corresponde a uma concentração celular média de 109 UFC/mL.
As relações cinéticas entre o crescimento e a formação de produtos são
importantes para determinar o modo de operação mais econômico. Segundo Hiss
(2001) sem o conhecimento da cinética torna-se inviável a transposição de um
experimento de laboratório para a escala industrial.
Desta forma, inicialmente, as curvas nos propiciam informações tais como, a
faixa de absorbância (560 nm) correspondente ao ótimo da fase log e a concentração
celular que esta faixa corresponde.
Pereira (2002), analisando o crescimento das estirpes de Rhizobium em meio
YMA com manitol, observou um acentuado crescimento exponencial entre 24 e 48
horas de cultivo de 7 estirpes.
Barberi et al (2004) avaliaram as curvas de crescimento de Bradyrhizobium
elkanii (BR 29) de acordo com o pH e com a composição do meio de cultura. Com base
no número máximo de UFC. mL-1 para o meio (Lorda & Balatti 1996) modificado, o
melhor crescimento ocorreu após 72 horas, para o tratamento com pH inicial de 6,0 e,
no meio Lopreto (1972), citado por Urenha et al. (1994) o tratamento com pH inicial 5,5
foi o que apresentou os valores de número máximo de células, ocorrendo em 161 horas
de cultivo. As médias de log dos números de UFC. mL-1 apresentadas por Barberi et al
(2004) foram superiores aos encontrados por Miguel e Moreira (2001), que foram
aproximadamente 109. Isso é explicado pela melhor utilização da fonte de carbono do
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
Barreto, M. C. S.
meio Lorda e Balatti (1996), em que em sua composição possui glicerol, em
comparação com o manitol utilizado no meio YM (Vincent, 1970) utilizado por esses
autores.
Nas figuras 6 a 14 (b) mostram os resultados da Densidade Ótica (D.O.), onde a
curva de crescimento construída a partir da contagem de células totais demonstrou que
após 72 horas de cultivo, o crescimento permaneceu crescente, para a maioria das
estirpes estudadas. Provavelmente, o aumento da curva deve-se a presença dos EPSs.
Segundo Cunningham e Munns (1984), a produção de EPS é uma resposta de
várias espécies da bactéria a uma gama de fatores limitantes, que em geral sugerem
estarem implicados em suprimir a reação da defesa da planta e parecem ser requeridos
para formação do cordão de infecção. Os EPSs pode ter um papel integral por permitir
que um organismo sobreviva sob uma variedade de circunstâncias estressantes.
Miguel e Moreira (2001), utilizando meio YM, obtiveram maior densidade ótica para
o tratamento com pH igual a 6,0 do que no pH 6,8, utilizando o mesmo número-base
(108,8 UFC. mL-1), o que provavelmente está relacionado com a diferente composição
dos meios, principalmente com relação à fonte de carbono. Cunningham e Munns
(1984), em meio YMA (modificado por Keyser e Munns, 1979), obtiveram maior
quantidade de EPS em estirpes de Rhizobium tolerantes à acidez do meio, quando
expostas a meio ácido.
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
a)
UFC.mL-1
ISOL 1
3,00E+09
2,50E+09
2,00E+09
1,50E+09
1,00E+09
5,00E+08
0,00E+00
0
12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168 180
Tem po (h)
b)
ISOL 1
Absorbância
(560nm)
2
1,5
1
0,5
0
0
12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168 180
Tem po (h)
Figura 7- Curvas de crescimento microbiano referentes a UFC.mL-1 (a) e
absorbância (560 nm) (b) do inóculo do Isolado 1 com 2,5 % (v/v) em meio
YM incubados a 28 °C e 200 rpm .
Barreto, M. C. S.
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
a)
Barreto, M. C. S.
UFC.mL-1
ISOL 2
3,00E+09
2,50E+09
2,00E+09
1,50E+09
1,00E+09
5,00E+08
0,00E+00
0
12
24
36
48
60
72
84
96 108 120 132 144 156 168 180
Tem po (h)
b)
Absorbância (560nm)
ISOL 2
2
1,5
1
0,5
0
0
12
24
36
48
60 72
84
96 108 120 132 144 156 168 180
Tem po (h)
Figura 8- Curvas de crescimento microbiano referentes a UFC.mL-1 (a) e
absorbância (560 nm) (b) do inóculo do Isolado 2 com 2,5 % (v/v) em meio YM
incubados a 28 °C e 200 rpm.
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
a)
Barreto, M. C. S.
ISOL 3
3,00E+09
UFC.mL-1
2,50E+09
2,00E+09
1,50E+09
1,00E+09
5,00E+08
0,00E+00
0
12
24
36
48
60
72
84
96
108
120
132
144
156
168 180
Tem po (h)
b)
Absorbância (560nm)
ISOL 3
2
1,5
1
0,5
0
0
12
24
36
48
60
72
84
96
108 120 132 144 156 168 180
Tem po (h)
Figura 9- Curvas de crescimento microbiano referentes a UFC.mL-1 (a) e
absorbância (560 nm) (b) do inóculo do Isolado 3 com 2,5 % (v/v) em meio YM
incubados a 28 °C e 200 rpm.
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
a)
Barreto, M. C. S.
ISOL 4
3,00E+09
UFC.mL-1
2,50E+09
2,00E+09
1,50E+09
1,00E+09
5,00E+08
0,00E+00
0
12
24
36
48
60
72
84
96
108 120 132 144 156 168 180
Tem po (h)
b)
Absorbância (560nm)
ISOL 4
2
1,5
1
0,5
0
0
12
24
36
48
60
72
84
96
108
120
132
144
156
168
180
Tem po (h)
Figura 10- Curvas de crescimento microbiano referentes a UFC.mL-1 (a) e
absorbância (560 nm) (b) do inóculo do Isolado 4 com 2,5 % (v/v) em meio YM
incubados a 28 °C e 200 rpm.
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
Barreto, M. C. S.
ISOL 6
a)
3,00E+09
UFC.mL-1
2,50E+09
2,00E+09
1,50E+09
1,00E+09
5,00E+08
0,00E+00
0
12
24
36
48
60
72
84
96
108 120 132 144
156 168 180
Tem po (h)
b)
Absorbância (560nm)
ISOL 6
2
1,5
1
0,5
0
0
12
24
36
48
60
72
84
96
108
120
132
144
156
168
180
Tem po (h)
Figura 11- Curvas de crescimento microbiano referentes a UFC.mL-1 (a) e
absorbância (560 nm) (b) do inóculo do Isolado 6 com 2,5 % (v/v) em meio YM
incubados a 28 °C e 200 rpm.
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
a)
Barreto, M. C. S.
ISOL 11
3,00E+09
UFC.mL-1
2,50E+09
2,00E+09
1,50E+09
1,00E+09
5,00E+08
0,00E+00
0
12
24
36
48
60
72
84
96
108 120 132 144 156 168 180
Tem po (h)
b)
Absorbância (560nm)
ISOL 11
2
1,5
1
0,5
0
0
12
24
36
48
60
72
84
96 108 120 132 144 156 168 180
Tem po (h)
Figura 12- Curvas de crescimento microbiano referentes a UFC.mL-1 (a) e
absorbância (560 nm) (b) do inóculo do Isolado 11 com 2,5 % (v/v) em meio YM
incubados a 28 °C e 200 rpm.
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
a)
Barreto, M. C. S.
ISOL 14
3,00E+09
UFC.mL-1
2,50E+09
2,00E+09
1,50E+09
1,00E+09
5,00E+08
0,00E+00
0
12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168 180
Tem po (h)
b)
Absorbância (560nm)
ISOL 14
2
1,5
1
0,5
0
0
12
24
36
48
60
72
84
96
108
120
132
144
156
168
180
Tem po (h)
Figura 13- Curvas de crescimento microbiano referentes a UFC.mL-1 (a) e
absorbância (560 nm) (b) do inóculo do Isolado 14 com 2,5 % (v/v) em meio YM
incubados a 28 °C e 200 rpm.
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
a)
Barreto, M. C. S.
ISOL 16
3,00E+09
UFC.mL-1
2,50E+09
2,00E+09
1,50E+09
1,00E+09
5,00E+08
0,00E+00
0
12
24
36
48
60
72
84
96
108 120 132 144 156 168 180
Tem po (h)
b)
Absorbância(560nm)
ISOL 16
2
1,5
1
0,5
0
0
12
24
36
48
60
72
84
96
108
120
132
144
156
168
180
Tem po (h)
Figura 14- Curvas de crescimento microbiano referentes a UFC.mL-1 (a) e
absorbância (560 nm) (b) do inóculo do Isolado 16 com 2,5 % (v/v) em meio YM
incubados a 28 °C e 200 rpm.
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
a)
Barreto, M. C. S.
CIAT 899
3,00E+09
UFC.mL-1
2,50E+09
2,00E+09
1,50E+09
1,00E+09
5,00E+08
0,00E+00
0
12
24
36
48
60
72
84
96
108
120 132 144 156
168 180
Tem po (h)
b)
Absorbância (560nm)
CIAT 899
2
1,5
1
0,5
0
0
12
24
36
48
60
72
84
96
108
120
132
144
156
168
180
Tem po (h)
Figura 15- Curvas de crescimento microbiano referentes a UFC.mL-1 (a) e
absorbância (560 nm) (b) do inóculo do CIAT 899 com 2,5 % (v/v) em meio YM
incubados a 28 °C e 200 rpm.
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
Barreto, M. C. S.
Determinação quantitativa da sacarose
Analisando os resultados obtidos para a dosagem da sacarose verificou-se que a
estirpe CIAT 899 (padrão) apresentou maior consumo de substrato para o meio de
produção empregado durante 168 horas de fermentação, apresentando um consumo
final de 4,55 g/L. Neste ponto a massa celular corresponde a 0,76 g/L (Figura 15).
Entretanto, o ISOL 14 apresentou resultados próximos da estirpe padrão, com consumo
de 4,78 g/L e massa celular de 0,86 g/L, no mesmo tempo (Figura 16).
Deu-se preferência à utilização de um método específico para glicose, ao invés de
um para determinação de açúcares redutores, o que garante a detecção da liberação
especificamente de glicose a partir da hidrólise por sacarose do EPS.
ISOL 14
Glicose g/L
10
8
6
4
2
0
0
12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168 180
Tem po (h)
Figura 16. Concentração de glicose durante a produção de EPS
por Rhizobium sp. (ISOL 14).
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
Barreto, M. C. S.
CIAT 899
Glicose g/L
10
8
6
4
2
0
0
12
24
36
48
60
72
84
96 108 120 132 144 156 168 180
Tem po (h)
Figura 17. Concentração de glicose durante a produção de EPS
por Rhizobium sp. (CIAT 899).
Determinação da Composição Química dos EPS
Na tabela 8 observa-se os açúcares determinados das gomas produzidas pelas
estirpes ISOL 14 e CIAT 899 onde revelaram maiores concentrações dos
monossacarídeos galactose e glicose para a estirpe ISOL 14 em relação a estirpe
padrão CIAT 899. Também foram observados traços de manose e ramnose na
composição das gomas das estirpes estudadas.
Tabela 8. Constituintes químicos da goma produzida pela estirpe de Rhizobium
sp (ISOL 14)
Açúcares
Amostras
Ac. urônico
(%)
Manose
Ramnose
(mg/100g)
Galactose
Glicose
ISOL 14
4,10
0,98
0,16
12,60
36,95
CIAT 899*
-
0,20
0,10
8,95
16,80
* Castellane & Lemos (2007)
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Barreto, M. C. S.
Lima (1999), analisando a composição química da goma xantana produzida por
linhagens de Xanthomonas campestris pv. campestris verificou a presença de glicose e
manose nas concentrações 33,22 %, 57,78 % respectivamente, para a linhagem NRRL
B-1459, apresentando componentes típicos da goma xantana.
Whitfield et al. (1981), caracterizando cinco amostras de goma xantana
produzidas por diferentes linhagens de Xanthomonas campestris pv. campestris,
encontraram valores de glicose variando entre 22-42 %, manose de 12-38 % e ácido
urônico de 9-20 %. Com relação à ramnose, apenas três amostras de xantana
apresentaram este açúcar, com valores que oscilam entre 12-22 %. Outro açúcar
identificado pelos pesquisadores foi a galactose com valores entre 24-28 %. Em todas
as amostras estudadas por estes autores foram observados os grupamentos piruvato e
acetila. Lowson e Symes (1977) relataram a presença de ramnose na xantana
produzida por X. juglandis. Sugere-se que a presença desse açúcar seja uma
característica desejável, pois, em geral, os polímeros dos quais faz parte possuem
capacidade de formar géis verdadeiros (Mcnelly e Kang, 1977). A goma xantana
comercial não apresenta ramnose na sua composição (Casas et al.,2000).
De acordo com Casas et al. (2000) a composição do meio de cultura utilizado na
fermentação exerce um profundo efeito na síntese do produto oligomérico e polimérico.
Portanto, a quantidade de manose, glicose e ácido glucurônico sintetizados e inseridos
no EPS pelas enzimas durante fermentação, podem sofrer variações dependendo da
composição do substrato e das condições utilizadas na fermentação.
No presente trabalho, o percentual de ácido urônico produzido pela estirpe ISOL
14 foi de 4,1 enquanto o apresentado na goma xantana por Lima (1999) foi de 8,47.
Os
métodos
de
análises
de
polissacarídeos
complexos
baseiam-se,
principalmente, na determinação dos constituintes dos resíduos obtidos após hidrólise
química dos polímeros nativos (Wei & Fang, 1990; Ruitter et al., 1992; Scamparini et al.,
2000). Esses são compostos de inúmeros resíduos de açúcares interligados por
ligações glicosídicas (α e β), que podem diferir consideravelmente na sua
suscetibilidade à hidrólise ácida. Ácidos urônicos são frequentemente envolvidos por
fortes ligações glicosídicas, particularmente nos tipos de ligações dos ácidos
aldobiurônicos (Druzian, 2000).
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Barreto, M. C. S.
Moreira et al (1998) analisando a composição de dois biopolímeros comerciais,
gelana® e xantana® e um biopolímero produzido a clairana, identificou o ácido
glicurônico (em todas as amostras) e os monossacarídeos esperados para a clairana
(glicose, galactose e fucose), gelana (glicose e ramnose) e xantana (glicose e manose).
A ramnose está presente na acetana, gelana, welana e ransana, que possuem
estrutura química similar à da xantana e possui propriedades de espessante e agente
de suspensão semelhantes àquelas atribuídas para xantana (Kennedy & Sutherland,
1994). A goma welana apresenta como cadeia lateral unidades de manose e ramnose,
distribuídas de modo aleatório. Aproximadamente dois terços das unidades químicas
repetidas do polímero contém ramnose como cadeia lateral, enquanto que o restante
das ramificações é composto por unidades de manose (Jansson et al., 1985).
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Barreto, M. C. S.
6.4 Conclusões
ª A curva do crescimento microbiano apresentou na fase logarítmica valores
correspondentes a uma concentração celular viáveis média de 109 UFC/mL para
todos os isolados e estirpe padrão CIAT 899 após 72 horas de incubação a uma
temperatura de 28 °C, com agitação de 200 rpm, variando conforme a linhagem
estudada;
ª As estirpes apresentaram valores do consumo de substrato para o meio de
produção empregado, de 4,55 g/L para a CIAT 899 e 4,78 g/L para o ISOL 14,
em 168 horas de fermentação;
ª A composição dos açucares da goma do ISOL 14 apresentou valores superiores
de ramnose, manose, galactose, glicose e ácidos urônicos na molécula, em
relação a estirpe padrão CIAT 899.
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Barreto, M. C. S.
6.5 Referências Bibliográficas
ARAÚJO, T. A. A; FRANÇA, F. P. E CARDOSO, V. L. Avaliação do comportamento
reológico dos diferentes meios de produção de goma xantana a partir do caldo de cana.
VI Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica, Campinas,
24-27 julho, 2005.
BARBERI, A; MOREIRA, F. M. S; FLORENTINO, L. A; RODRIGUES, M. I. D.
Crescimento de Bradyrhizobium elkanii estirpe BR 29 em meios de cultivo com
diferentes valores de pH inicial. Ciênc. Agrote., Lavras, v. 28, n. 2, p. 399-408, 2004.
CASAS, J. A; SANTOS, V. E; GARCIA-OCHOA, f. Xanthan gum production under
several operational condictions: molecular structure and rheological properties. Enzyme
and Microbial Technology, v. 26, p. 282-291, 2000.
CASTELLANE, T. C. l. & LEMOS, E. G. M. Composição de exopolissacarídeos
produzidos por estirpes de rizóbios cultivados em diferentes fontes de carbono. Pesq.
Agropec. Bras., Brasília, v. 42, n. 10, p. 1503-1506, 2007.
COUSO, R. O., IELPI, L., DANKERT, M. A xanthan gum like polysaccharide from
Acetobacter xylinum. Journal of General Microbiology, v. 133, p. 2123-2135, 1987.
CUNNINNGHAM, S.D.; MUNNS, D.N. Effects of rhizobial extracellular polysaccharide
on pH and aluminium activity. Soil Science Society American Journal, Madison, v.48,
n. 6, p. 1276-1280, 1984.
DANTAS, Elizabeth Sonocia Keiko; Introdução à Absorção Atômica. Curso IPEN, São
Paulo, 1995.
DAVIDSON, I. H. Production of polysaccharide by Xanthomonas campestris in
contínuos culture. FEMS Microbiology Letters, v.3, p. 347-349, 1978.
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
Barreto, M. C. S.
DE SOUZA, A. M.; SUTHERLAND, I. W. Exopolysaccharide and storage polymer
production in Enterobacter aerogenes type 8 strains. Journal of Applied Bacteriology,
Oxford, v. 76, p. 463-468, 1994.
DRUZIAN, J. I. Estudo da estrutura de exopolissacarídeos produzidos por duas
espécies de Rhizobium e uma de Bradyrhizobium isolados de solo de cultivar de feijão
de corda (Vigna unguiculata L.), Tese de doutorado, Faculdade de Engenharia de
Alimentos, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Camppinas, SP, 2000.
FARIA, L. H. G. B. Caracterização taxonômica e produção de polissacarídeos utilizando
bactérias isoladas de amostras de solo. Tese (Mestrado em Engenharia e Ciência de
Alimentos) – Instituto de Biociências, Letras e Ciências exatas, Universidade Estadual
Paulista, São José do Rio Preto, 2002.
HISS, H. Cinética de processos fermentativos. In: BORZANI, W; SCHMIDELL, W; LIMA,
U. A; AQUARONE, E. Biotecnologia Industrial – Engenharia Bioquímica, v. 2, São
Paulo: Editora Edgard Blücher Ltda., 2001.
JANSSON, P. E., LINDBERG, B., WIDMAL M. G. et al. Structural studies of an
extracellular
polysaccharide
(S-130)
elaborated
by
Alcalignes
ATCC31555.
Carbohydrate Research, v. 139, p. 217-223, 1985.
KAWAHARA, H., OBATA, H. Production of xanthan gum and ice-nucleating material
from whey by Xanthomonas campestris pv. Translucens. Applied Microbiology
Biotechnology, v. 49, p. 353-358, 1998.
KEYSER, H. H; MUNNS, D. N. Tolerence of Rhizobia to acidity, aluminum and
phosphate. Soil Science Society American Journal, Madison, v. 43, n. 3, p. 519-523,
1979.
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
Barreto, M. C. S.
KENNEDY, L., SUTHERLAND, I. W. Gellan lyases – novel polysaccharide lyases.
Microbiology, v. 140, p. 3007-3013, 1994.
LIMA, M. A. G. A. Obtenção e caracterização de xantanas produzidas por diferentes
linhagens de Xanthomonas campestris pv. campestris. Rio de Janeiro, 1999. 165 p.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, 1999.
LOWSON, C. J;SYMES, K.C. Oligosaccharides produced by partial acetolysis of
xanthan gum. Carbohydrates Research, v. 58, p. 433-438, 1977.
LORDA, G. S; BALATTI, A. P. Desining média I. In: BALLATI, A. P; FREIRE, J. R. J.
Legume inoculants: selection and characterization of strains: production, use and
management. New York: [s. n.], 1996.
McNELLY, W; KAN, K. OS-7 a new bacterial heteropolysaccharide. In: SANFORD, P. A;
LASKIN, A. ed Extracellular Microbial Polysaccharides, Washington, D. C: American
Chemical Society, p. 220-230, 1977.
MARGARITIS,
A.;
PACE,
G.
W.
Microbial
polysaccharides.
Comprehensive
Biotechnology. Canadá : University of Waterloo, 1985. Cap. 49, p. 1005-1044.
MIGUEL, D. L; MOREIRA, F. M. S. Influencia do pH do meio de cultivo e da turfa no
comportamento de estirpes de Bradyrhizobium. Revista Brasileira de Ciência do solo,
Viçosa, v. 25, n. 4, p. 873-883, 2001.
MOREIRA, A. S.; SOUZA, A. S; VENDRUSCOLO, C. T. Determinação da composição
de biopolímero por cromatografia em camada delgada: Metodologia. Rev. Bras. de
Agrociência, Pelotas, v. 4, n. 3, p. 222-224, 1998.
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
Barreto, M. C. S.
PEREIRA, K. C. Caracterização morfológica, bioquímica e molecular de rizóbios
recomendados para inoculação de leguminosas arbóreas. Jaboticabal - SP, 2002, 63 p.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências
Agrárias e Veterinárias, 2002.
RUITER, G. A; SCHOLS, H. A; VORAGEN, G. J. ROMBOUTS, F. M. Carbohydrate
analysis of water-soluble uronic acid containing polysaccharides with high performance
anion exchange chromatography using methanolysis combined with TFA hydrolysis is
superior to four ather methods. Analytical Biochemistry, v. 207, p. 176-185, 1992.
SCAMPARINI, A. R. P; DRUZIAN, J. I; MALDONADE, I; MARIUZZO, D. New
biopolymers produced by nitrogen fixing microrganisms for use in foods. In:
Hydrocolloids.
Part1:
Physical
Chemistry
and
industrial
Appliation
of
Gels,
polysaccharides and proteins. Osaka: ed. K. Nishinari, Elsevier Science B.V., p. 169178, 2000.
SHU, C. H. E YANG, S. T. “Effects of temperature on cell growth and xanthan
production in batch cultures of Xanthomonas campestris.” Biotechnology and
Bioengineering. V. 35, p. 454-468, 1990.
SOUW, P., DEMAIN, A. L. Nutritional studies on xanthan production by Xanthomonas
campestris NRRL B-1459. Applied and Environmental Microbiology, v. 37, n. 6, p.
1186-1192, 1979.
THONART, M., PAQUOD, M., HERMANS, L. et al.
Xanthan production by
Xanthomonas campestris NRRL B-1459 and interfacial approach by zeta potencial
measurement. Enzyme Microbiology Technology, v.7, p.235-238, 1985.
Inovação tecnológica baseada na produção de biopolímeros .....
Barreto, M. C. S.
URENHA, L. C; PRADELLA, J. G. C; OLIVEIRA, M. S; BONOMI, A. Produção de
biomassa celular de rizóbio. In: HUNGRIA, M; ARAUJO, R. S. Manual de métodos
empregados em estudos de microbiologia agrícola. Brasília: EMBRAPA-SPI, 1994.
542p.
VINCENT J.M. (1970) A manual for the practical study of the root nodule bacteria.
Lodon: JBP, 1970. 164 p.
WEI, Y. & FANG, J. Studies on the chromatography behavior of some uronic acids and
neutral sugars on an amino-boned phase column. Journal of Chromatography, v. 513,
p. 227-235, 1990.
WHITFIELD, C., SUTHERLAND, I. W., CRIPPS, R. G. Surface polysaccharides in
mutants of Xanthomonas campestris. Journal of General Microbiology, v. 124, p. 385392, 1981.
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7. ANEXOS
Normas da Revista World Journal of Microbiology and
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Citation
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Negotiation research spans many disciplines (Thompson 1990).
This result was later contradicted (Becker and Seligman 1996).
This effect has been widely studied (Abbott 1991; Barakat et al. 1995; Kelso and Smith 1998; Medvec et al. 1993).
Reference list
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publication. Personal communications and unpublished works should only be mentioned in the text. Do not use
footnotes or endnotes as a substitute for a reference list.
Reference list entries should be alphabetized by the last names of the first author of each work.
Journal article
Smith J, Jones M Jr, Houghton L et al (1999) Future of health insurance. N Engl J Med 965:325–329
Article by DOI
Slifka MK, Whitton JL (2000) Clinical implications of dysregulated cytokine production. J Mol Med.
Doi:10.1007/s001090000086
Book
South J, Blass B (2001) The future of modern genomics. Blackwell, London
Book chapter
Brown B, Aaron M (2001) The politics of nature. In: Smith J (ed) The rise of modern genomics, 3rd edn. Wiley, New
York, pp 230-257
Online document
Doe J (1999) Title of subordinate document. In: The dictionary of substances and their effects. Royal Society of
Chemistry. Available via DIALOG. http://www.rsc.org/dose/title of subordinate document.
Accessed 15 Jan 1999
Always use the standard abbreviation of a journal’s name according to the ISSN List of Title Word Abbreviations, see
www.issn.org/en/node/344
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Figure Numbering
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Figure Placement and Size
Electronic Figure Submission
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Vector graphics containing fonts must have the fonts embedded in the files.
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Line Art
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All lines should be at least 0.1 mm (0.3 pt) wide.
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Vector graphics containing fonts must have the fonts embedded in the files.
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Halftone Art
Definition: Photographs, drawings, or paintings with fine shading, etc.
If any magnification is used in the photographs, indicate this by using scale bars within
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Combination Art
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extensive lettering, color diagrams, etc.
Combination artwork should have a minimum resolution of 600 dpi.
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If the figures will be printed in black and white, do not refer to color in the captions.
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Keep lettering consistently sized throughout your final-sized artwork, usually about 2–3
mm (8–12 pt).
Variance of type size within an illustration should be minimal, e.g., do not use 8-pt type
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Figure Placement and Size
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For most journals the figures should be 39 mm, 84 mm, 129 mm, or 174 mm wide and
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higher than 198 mm.
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Submissão do Artigo
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Normas da Revista Scientia Agrária
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Trabalhos apresentados no 24º Congresso Brasileiro
de Microbiologia - 3 a 6 de Outubro de 2007 em
Brasília - Centro de Convenções Ulysses Guimarães –
Brasília / DF
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MICROBIOLOGIA GERAL / K03 METABOLISMO MICROBIANO E SEUS
PRODUTOS
609
Biopolímero sintetizados por Rhizobium sp. em diferentes tempos de cultivo:
comportamento reológico
BARRETO, M. D. C. S.1 ; FIGUEIREDO, M. D. V. B.2 ; BURITY, H. A.2 ; OLIVEIRA, J.
P.2 ; COELHO, A. C. D.1 ; LIMA-FILHO, J. L. L.1
UFPE
Resumo:
Os polissacarídeos extracelulares sintetizados por bactérias do gênero Rhizobium tem sido estudados na
tentativa de melhor compreender sua participação na simbiose leguminosa x Rhizobium, uma vez que
estes biopolímeros parecem ser determinantes da especificidade simbiótica. A viscosidade, que pode ser
tomada como parâmetro de qualidade, é influenciada em função das estirpes, da colônia bacteriana, do
meio de fermentação utilizado e das condições operacionais na produção. Com base no exposto, o
objetivo deste trabalho foi verificar o comportamento reológico em diferentes tempos de cultivo de 8
isolados de Rhizobium sp. e da estirpe padrão de Rhizobium tropici (CIAT 899). As bactérias foram
incubadas em agitador rotatório (200rpm à 28ºC) em Erlenmeyers de 250mL contendo 1/5 de meio YM
modificado, por um período de 96 e 168 horas. Foram avaliados: a determinação da viscosidade da
solução aquosa dos biopolímeros a 2,5% (v/v) obtidas em diferentes tempos de cultivo e medidas a 20ºC
em viscosímetro rotacional Brookfield, modelo RVT, com spindle 2, nas seguintes velocidades de
deformação: 10, 20, 50 e 100rpm; a viscosidade aparente, a várias taxas de cisalhamento, dos mostos
fermentados. Os resultados mostraram que os estudos viscosimétricos de soluções de polissacarídeo
dos isolados e da CIAT 899 revelam seu comportamento, não tixotrópico, pseudoplástico, mesmo em
baixas concentrações, e caráter polieletrolítico, e que as medidas de viscosidade do mosto em função do
tempo de agitação mostra que a viscosidade aparente do meio de cultivo alcança um valor patamar com
168 horas de processo para todos os microrganismos, porém os isolados 3 e 16 e CIAT 899
apresentaram maiores valores no aumento da viscosidade.
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MICROBIOLOGIA GERAL / K03 METABOLISMO MICROBIANO E SEUS
PRODUTOS
1751
Biopolímero sintetizados por Rhizobium sp. em diferentes tempos de cultivo: produção
BARRETO, M. D. C. S.1 ; FIGUEIREDO, M. D. V. B.2 ; BURITY, H. A.2 ; SILVA, M. L. R.
B.1 ; CALAZANS, G. M. T.1 ; LIMA-FILHO, J. L. L.1
UFPE
Resumo:
A produção de exopolissacarídeos (EPS) microbianos tem sido objeto de intensa pesquisa, tendo em
vista seu elevado potencial de aplicação em diferentes setores, pois não se encontra exposta às
alterações climáticas ou à problemas nas colheitas, que prejudicam a oferta e alteram o custo de
produção das gomas tradicionais. No processo de produção de polissacarídeos deve-se considerar
desde o microrganismo em estudo até a determinação dos parâmetros de agitação, onde se destaca o
meio de produção e sua influência na síntese, no rendimento e na composição dos EPS. O objetivo
deste trabalho foi avaliar a produção de biopolímeros (g/L.h) obtidos de 8 isolados de Rhizobium sp. e da
estirpe padrão Rhizobium tropici (CIAT 899) em diferentes tempos de cultivo pela massa do produto seco
por volume de meio. As bactérias foram purificadas em meio YMA e após foram incubadas em agitador
rotatório (200rpm à 28º C) em Erlenmeyers de 250mL contendo 1/5 de meio YM modificado, por um
período de 96 e 168 horas. Foram avaliados: o peso seco da solução aquosa dos biopolímeros a 2,5%
(v/v) obtidos em diferentes tempos de cultivo, através da técnica do peso seco, onde o álcool etílico foi
adicionado ao mosto até atingir a concentração de 80% na solução hidroalcoólica formada e posterior
precipitação do EPS. Após a filtração, a secagem do produto foi realizada em dissecador (30ºC), até peso
constante, comparando-se os diferentes tempos de cultivo. Os resultados mostraram que a produção
total do biopolímero dos isolados e da estirpe padrão CIAT 899 apresentaram máxima produção no
período de 168 horas de processo para todos os microrganismos, porém os isolados 3 e 14, e a CIAT
899 foram as que resultaram em maior produtividade (1,3; 1,7 e 2gL-1h-1) respectivamente.