Detecção feno+pica de ERCs em laboratórios de microbiologia clínica e importância médica Jorge Luiz Mello Sampaio Professor de Microbiologia Clínica Faculdade de Ciências FarmacêuFcas -‐ USP Médico Responsável – Microbiologia – Fleury Medicina e Saúde Jorge Sampaio Roteiro •  Que critérios uFlizar •  Por que não deve ser uFlizado o teste de Hodge modiﬁcado •  Racional para triagem feno+pica de mecanismos de resistência •  O que testar adicionalmente, como testar e interpretar •  Cuidados no uso da automação •  Culturas de vigilância •  O que deve ser enviado aos LACENs Jorge Sampaio Que critério uFlizar? Nota técnica 01/2013 ANVISA Concentração Inibitória Mínima
Antimicrobia
Sensível
no
(µg/mL)
I
(µg/mL)
Disco-Difusão
Potência
Resistente
Sensível
do Disco
(µg/mL)
(mm)
(µg)
≥8
30
≥ 24
≥8
30
≥ 24
≥8
10A
≥ 22A
I
(mm)
Resistente
(mm)
21-23
21 - 23
19-21A
≤ 20
≤ 20
≤ 18A
Aztreonam
Cefepima
CeftazidimaA
≤1
≤1
≤1
2-4
2–4
2–4
Ertapenem
Colistina ou
Polimixina B
≤ 0,5
≤2
1
-
≥2
≥4
10
-B
≥ 25
-
22 - 24
-
≤ 21
-
≤1
2
≥4
15
≥ 18C
15 – 17C
≤ 14C
Tigeciclina
Jorge Sampaio Faz senFdo? CLSI -‐2013 EUCAST Jorge Sampaio Por que não deve ser uFlizado o teste de Hodge modiﬁcado? Jorge Sampaio Jorge Sampaio Solução de ácido fenilborônico •  Solução de ácido fenilborônico 40 mg/ml •  Ácido fenilborônico (Fluka 78181 ou Aldrich P20009) -‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐ 240 mg •  DMSO -‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐ 3 ml •  Água grau reagente -‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐ 3 ml •  Esterilizar por ﬁltração 0,22 µm (opcional) •  A solução pode ser estocada por um mínimo de 3 meses a -‐20°C; •  Aplicar 10 µl/ disco de imipenem e meropenem •  Deixar evaporar o excesso de umidade Solução de cloxacilina •  Solução de cloxacilina 75 mg/ml •  Cloxacilina sal sódico monohidratado (Sigma C9333) -‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐ 750 mg •  Água grau reagente -‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐ 10 ml •  Esterilizar por ﬁltração 0,22 µm •  A solução pode ser estocada por um mínimo de 3 meses a -‐20°C; •  Aplicar 10 µl/ disco de imipenem e meropenem •  Deixar evaporar o excesso de umidade Solução de EDTA 0,1M •  EDTA sal dissódico dihidratado (Merck 1.08418.1000 ou Sigma
E6635) - Mol = 372,24 g
•  Preparo da solução
•  EDTA ------------------------------ 1,86 g
•  Água grau reagente ------------ 40 mL
•  Ajustar o pH para 7,5 com NaOH 5M
•  Agitar até completa dissolução do EDTA
•  Ajustar o volume para 50 mL em temperatura ambiente
•  Distribuir em frascos com 1 mL cada
•  Esterilizar em autoclave por 10 min a 121 °C
•  Estocar em temperatura ambiente por até 1 ano.
Cloxacilina 10 µl de solução 75 mg/mL IMI Sem adiFvo MEM ERT MEM IMI IMI MEM MEM IMI Ácido fenilborônico 10 µl de solução 40 mg/mL EDTA 10 µl de solução 0,1M Jorge Sampaio KPC Carbapenemase de Klebsiella pneumoniae 2f A Bush Ambler
Hidrólise de cefalosporinas, carbapenêmicos, penicilinas e cefamicinas. Pobremente inibidas por ácido clavulânico ou tazobactam.
Jorge Sampaio KPCs •  14 descritas até o momento (KPC-‐1 = KPC-‐2) Fonte: hqp://www.lahey.org/Studies/other.asp#table1 • 
• 
• 
• 
São inibidas pelo ácido fenilborônico Não são inibidas pelo EDTA Não há potenciação com cloxacilina Não degradam eﬁcientemente cefoxiFna Jorge Sampaio Detecção de KPC com ácido fenilborônico •  Pode haver falso posiFvo com AmpC plasmidial + perda de porina •  DiagnósFco diferencial: potenciação com cloxacilina –  Pos – AmpC plasmidial + perda de porina –  Neg -‐ KPC Jorge Sampaio Detecção com AFB •  Por enquanto aplicável apenas a enterobactérias NÃO pertencentes ao grupo CESP •  > 99% de correlação com detecção por PCR. •  Falsos posiFvos com Grupo CESP Jorge Sampaio NDM New Delhi Metalobetalactamase 3a B Hidrólise de todos os β-‐lactâmicos, Bush Ambler exceto monobactâmicos. Inibidos por EDTA e quelantes de íons metálicos. Não inibidos por ácido clavulânico ou tazobactam.
Outras: IMP e VIM Jorge Sampaio NDM •  Nove variantes descritas até o momento –  hqp://www.lahey.org/Studies/other.asp#table1 •  América LaFna (Publicações) –  Guatemala –  Colombia Jorge Sampaio NDM •  Possuem duas moléculas de zinco no síFo aFvo •  InaFvadas pelo EDTA e outros quelantes de cáFons divalentes (ácido dipicolínico) Jorge Sampaio Importante •  Outras metalo-‐betalactamases, como IMP, VIM e SPM apresentam posiFvidade para esse teste (EDTA+). Jorge Sampaio Puro Cloxacilina EDTA Ácido Fenilborônico Jorge Sampaio Novo Desaﬁo Microbiológico NDM •  Metalo-‐β-‐lactamase •  Testar meropenem e imipenem com e sem EDTA; •  10 μL de solução de EDTA 0,1M •  Deixar evaporar o excesso de umidade •  Nordmann et al., J Clin Microbiol. 2011;49(2):718-‐21. •  Aumento ≥ 5 mm com qualquer um dos substratos = provável MBL •  Conﬁrmar por PCR e sequenciamento de DNA •  Pode haver falsos posiFvos •  Ideal ácido dipicolínico (Sigma P63808) 1000 µg/disco Jorge Sampaio Detecção de Resistência a carbapenêmicos •  E. coli, K. pneumoniae, P. mirabilis e outros não produtores de AmpC cromossômica • Triagem com ertapenem (I ou R) EUCAST • Determinar CIMs para Meropenem e Imipenem •  Discos de IMP e MEM com: –  Ácido fenilborônico 10 µl de solução 40 mg/mL – EDTA 10 μL de solução de EDTA 0,1M – Cloxacilina – 10 µl de solução 75 mg/mL Tsakris A et al J Clin Microbiol. 2011 Aug;49(8):2804-‐9. Giske Jorge et aSampaio l. Clin Microbiol Infect 2011 Apr;17(4):552-‐6. Nordmann et al., J Clin Microbiol. 2011;49(2):718-‐21. Jorge Sampaio Reforçando conceitos •  Grupo CESP –  Triagem com meropenem e imipenem –  Interpretar apenas o teste com EDTA •  Não CESP –  Triagem com ertapenem, imipenem e meropenem –  Interpretar AFB, cloxa e EDTA Jorge Sampaio Grupo CESP • 
• 
• 
• 
• 
• 
Citrobacter freundii Enterobacter spp. Serra9a spp. Providencia spp. Morganella morganii Hafnia alvei Jorge Sampaio Interpretando (não CESP) β-lactamase
AFB
EDTA CLOXA
KPC
+
N
N
NDM/IMP/VIM
N
+
N
AmpC + perda
+
N
+
porina
OXA-48 e
N
N
N
outras
+ = aumento ≥ 5 mm com um ou mais dos substratos Jorge Sampaio Importante •  Em casos de infecção a determinação das CIMs para imipenem e meropenem deve ser realizada por método não automaFzado; •  A triagem de produção de carbapenemases em não CESP deve incluir o ertapenem. Jorge Sampaio Polimixinas •  Não uFlizar disco-‐difusão; •  Paineis de microdiluição congelados a -‐80°C; •  UFlizar Etest de colisFna e não polimixina B –  48,7% de erros menores –  van der Heijden et al. Ann Clin Microbiol AnFmicrob. 2007;6:8. Jorge Sampaio Fosfomicina •  No CLSI só há critérios interpretaFvos para E. coli em infecções urinárias •  Conduta pessoal: –  E. coli em ITU  disco-‐difusão CLSI –  Todas as outras espécies de enterobactérias e síFos anatômicos  determinação da CIM com Etest –  Critérios interpretaFvos do EUCAST –  Sensível ≤ 32 mg/L –  Resistente ≥ 64 mg/L Jorge Sampaio Tigeciclina • 
• 
• 
• 
Não há critérios no CLSI M100-‐S23 Nota Técnica ANVISA 01/2013  EUCAST E. coli disco-‐difusão Demais enterobactérias  determinar a CIM –  Preferencialmente microdiluição com caldo MH preparado no dia do teste um manFdo a -‐80°C –  Etest superesFma intermediários •  Vitek2 – 25 a 27% de falsa resistência Jorge Sampaio Outros •  Cloranfenicol –  Disco-‐difusão •  Rifampicina –  Não há critérios interpretaFvos Jorge Sampaio Testes de sinergismo •  Em modelo murino sinergismo entre doripenem e amicacina mesmo com CIMs na faixa de resistência •  Amicacina + levoﬂoxacino = antagonismo •  Hirsch et. al. J Infect Dis 2013;207:786–93 Jorge Sampaio O que é melhor: PCR direto do swab retal ou cultura de vigilância? – A cultura de vigilância detecta P. aeruginosa e Acinetobacter MDR além de ERC; – Detecta novos alelos que podem não ser detectados pela PCR; – Direcionamento precoce de conduta – O uso de inibidores e potenciadores tem a limitação de detectar OXA-‐48 por exclusão Jorge Sampaio Culturas de Vigilância •  Swab retal ou fezes •  CulFvo inicial em 10 ml de caldo TSB ou BHI com 1 disco de ertapenem (1mg/L) Jorge Sampaio Culturas de Vigilância – Detecção de ERC Semear o swab no caldo BHI ou TSB com ertapenem (1mg/L) NÃO 48h de incubação
? Incubar 12 a 24 horas NÃO Meio turvo? SIM Testar todos os Fpos coloniais disFntos se halo do ertapenem < 27 mm SIM SIM Sem turvação. Liberar negaFvo SIM. Repicar em ágar cromogênico ESBL ou MacConkey com discos de ertapenem e meropenem ; incubar 18 a 24 h 37 °C Interpretar e liberar LOLANS, K. et al. J Clin Microbiol 2010;48(3):836-‐41. O que enviar para o LACEN •  ANVISA •  Qualquer isolado EDTA+ (infecção ou colonização) •  Não há necessidade de enviar não CESP (p. ex. K. pneumoniae)posiFvas para ácido fenilbrorônico. Jorge Sampaio Obrigado! Jorge Sampaio