DNA especifico com marca fluorescente
Produto:
1. DNA marcado com moléculas fluorescentes (sonda).
2. Buffer(tampão) de Hibridação
3. Reagentes para solução de montagem (DAPI + antifade)
Eliminado: <#>¶
Eliminado: ¶
Estas sondas estão desenhadas para serem utilizadas nas células interfásicas
ou metafasicas, obtidas através de procedimentos padrões citogenéticos,
veja:O Manual ACT CytogeneticsLaboratory . 2nd ed. New Cork: Raven Press;
1991.
Materiais necessários que não estão incluídos
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Solução ultra pura de Formamida
2XSSC*
Etanol em solução 70, 90. 100%
Pepsina*
Detergente não iônico
pH-medidor ou papel para medir pH
Coverslip/lamínula
Soluções de lavado (1 y 2)*
Adesivo de contato
0,2 ou 0,5ml PCR tubos
Frascos coplin
Câmera úmida
Termômetro calibrado
* Ver abaixo as instruções de preparação.
Equipamento necessário:
Microscópio fluorescente: nem sempre o microscópio usado nas reações
imunoistoquímica ou em outras analises fluorescentes são apropriado. Os
requisitos para observar corretamente as reações FISH são os seguintes:
o
o
o
Fonte de excitação: Recomenda-se uma lâmpada de 1oo watts de
mercúrio com uma vida útil de 200hs. É necessário que uma vez
posicionada, a lâmpada esteja corretamente alinhada.
Objetivos: para localizar o alvo (interfases ou metafases) são
recomendadas objetivas de 10, 20 e/ou 40x. A análise da reação requer
de uma objetiva fluorescente de imersão com uma abertura numérica ≥
0.75.
Filtros de emissão- excitação: Cada flourocromo requer um filtro
diferente. Os requisitos para nossa sonda estão na tabela abaixo:
1
Fluorocromo
Verde
VERMELHO
DAPI
•
•
•
•
•
•
Excitação(nm)
495
550
350
Emissão (nm)
519
570
470
Microcentrifuga
Micropipetas para 1 a 10 µL volumes
Vórtex
Timer/ cronômetro
Banho- maria
Incubadora
Preparação de Reagentes:
2XSSC:
Cloreto de sódio(NaCl)
300mM
Citrato de sódio desidratado(Na3C6H5O7)
30mM
Ajustar o pH a 7.0 com gotas de ácido clorídrico (HCl) 1N
Solução de Desnaturação:
Formamida Ultrapura
70%
2XSSC
30%
AjustarpH:7-8.
Armazenar a 4ºC. descartar depois de 7 dias.
Solução Pepsina:
Diluir 0.5 mg de pepsina em 1ml de ácido clorídrico(HCl) 0,1N.
Solução de lavado 1:
Em um coplin adequado para 80ml, adicione 16ml de 2XSSC, 64ml de agua
destilada e 0.240ml de detergente não iônico.
Solução de lavado 2:
Em um coplin adequado para 80ml, adicione 80ml de 2XSSC e 0.80ml de
detergente nãoiônico
2
Precauções e advertências (leia com atenção):
•
Reagente analítico. Somente para investigação. Este produto
aprovado para diagnóstico ou uso terapêutico
•
As reações e interpretações dos mesmos devem ser
profissionais qualificados e corretamente treinados.
•
Toda amostra biológica
agentes infecciosos.
•
Evitar expor as amostras a acido ou alcalinos em concentrações elevadas
e altas temperaturas. Estes fatores podem danificar o DNA e causar
falhas na reação FISH.
•
A falha ou omissão de qualquer passo do protocolo detalhado
continuação pode levar a resultados errôneos ou inaceitáveis.
a
•
O buffer(tampão)hibridizador contém formamida, um teratogênico
portanto deve-se evitar o contato com a pele ou membranas mucosas.
e
•
Recomenda-se o uso de aventalde trabalho durante o procedimento
•
Todo material perigoso deve ser jogado fora de acordo com as normas da
sua instituição.
deve
ser
3
tratada
como
Não está
realizadas
possível
portadora
por
de
Protocolo de utilização
Considerações preliminares:
•
Durante a aplicação deste protocolo não é necessário agir em condições
de luz tênue. As sondas LIVE foram desenvolvidas para não perderem sua
fluorescência durante curtos períodos (horas) de exposição à luz
artificial.
•
Embora seja altamente recomendável mantê-las a -20 ºC, as sondas LIVE
não perdem sua ação depois de 48hs a temperatura ambiente.
•
O buffer(tampão)hibridizador mostrará resultados em 30 minutos
hibridização. Uma hibridização maior a 30 minutos não interfere
qualidade da reação.
•
Recomenda-se usar 45ºC para 30 minutos até aproximadamente 8hs de
hibridização. Se a reação for mostrada no dia seguinte, a temperatura
deverá ser de 37ºC.
de
na
Esfregaço/smear celular
Para o esfregaço celular é muito importante não usar temperaturas extremas
(chamas, chama- secagem)
Tratamento prévio
Em geral as sondas LIVE funcionam bem sem qualquer tratamento prévio, contudo
a presença de fragmentos celulares ou hibridização em algumas amostras como
mucosa bucal, amniocitos, etc. requerem que se limpe o DNA especifico para
melhorar a hibridização.
•
Sobre a amostra do esfregaço aplique uma gota de solução de Pepsina.
Adicione um Coverslip/lamínula.
•
Incube em uma câmara úmida a 37ºC (o tempo varia com a severidade do
tratamento, com 5 minutos como mínimo).
•
Descarte o
corrente.
•
Desidrate em series de etanol: 70,90 y 100% 1 minuto em cada um.
•
Espere que se seque completamente.
Coerslip/lamínula
e
enxague
4
rapidamente
embaixo
de
agua
Reação de hibridização flourescente in situ
Protocolo 1: Desnaturação usando Fornamida
Preparação da sonda:
• Descongele o tubo da sonda, misture no vortex
• Centrifugue rapidamente
• Descongele o buffer(tampão) hibridização
•
Em um tubo PCR adicione:
7µl de buffer(tampão)hibridização
1µl de sonda
• Misture no vortex
• Centrifugue rapidamente
Desnaturação:
NOTA: Pelo menos 30 minutos antes da desnaturação, aqueça a solução a
temperatura desejada. Com um termômetro calibrado certifique a temperatura no
interior do COPLIN.
•
Na parte de tras da lâmina marque a região parahibridizar(os 8µl hibridram
aproximadamente uma região de 22x22mm).
•
Mergulhe a lâmina na solução desnaturação a 60-75º por 1-5min (dependendo
da idade do esfregaço/smear)
•
Usando pinças retire a lâmina e imediatamente mergulhe em 70%
agitando por alguns segundos para eliminar a formamida restante.
•
Desidrate em etanol 70, 90 e 100% 2 minutos cada um.
•
Espere que se seque completamente.
•
Desnature a solução desonda a uma temperatura mínima de 70ºC por 5
minutos. Isto pode ser feito com um dispositivo controlador de temperatura
ou simplesmente deixando o tubo em água fervendo em um suporte de
poliestireno
•
Coloque a solução de sonda em gelo por algunos
rapidamente para recolher a parte evaporada.
•
Adicione a solução de sonda na região para hibridizar.
•
Coloque um COVERSLIP/LAMINULA/ do tamanho apropriado.
•
Sele as bordas com adesivo de contato removível ou coloque uma folha de
Parafilm® que ultrapasse o tamanho do coverslip/lamínula.
segundos.
Hibridação: O buffer hibridizador LIVE outorga excelente
qualquer sonda em somente 30 minutos de incubação a 45ºC
•
etanol
Centrifugue
resultados
com
Coloque a lâmina montada em uma câmara úmida. Incubar pelo menos por 30
minutos a 45ºC ou de um dia para o outro a 37ºC
5
Protocolo 2: Desnaturação com Hidróxido de Sódio
Este protocolo preserva de maneira ideal a morfologia dos cromossomas,
permite a reação FISH no mesmo dia da preparação do esfregaço-smear
celular e dá resultados de alta qualidade. Além disso, de acordo com a
qualidade da suspenção celular é possível observar um padrão de bandas
similar ao da banda G.
NaOH as vezes pode gerar autofluorescência em um núcleo e /ou
cromossomas.
Neste
caso
se
recomenda
envelhecer
levemente
os
esfregaços/smear a 37-45ºC 2 horas.
Preparação da sonda:
• Descongele o tudo da sonda, misture no vortex
• Centrifugar rapidamente
• Descongele o buffer(tampão) hibridização
• Em um tubo PCR adicionar:
7µl de buffer(tampão) hibridização
1µl de sonda
• Misturar no vortex
• Centrifugar rapidamente
Desnaturação:
•
Na parte de trás da lâmina marcar a região para hibridizar (os 8µl
preparados hibridam uma região aproximada de 22x22mm).
•
Mergulhe a lâmina em uma solução de NaOH 0.1M em etanol 70% a temperatura
ambiente por 6 minutos.
•
Utilizando pinças retire a lâmina e imediatamente mergulhe em etanol 70%
agitando por unos segundos para eliminar o NaOH restante.
•
Desidratar em etanol 70, 90 e 100% 2 minutos cada um.
•
Esperar que seque completamente.
•
Desnaturar a solução de sonda a uma temperatura mínima de 70ºC por 5
minutos. Isto pode ser feito em dispositivo controlador de temperatura ou
simplesmente deixando o tubo em agua fervendo em um suporte de
poliestireno.
•
Coloque a solução sonda em gelo por unos segundos. Centrifugue rapidamente
para recolher a parte evaporada.
•
Adicione a solução de sonda na região para hibridizar
•
Coloque um coverslip/lamínula de tamanho apropriado.
•
Sele as bordas com adesivo de contato ou coloque uma folha de Parafilm® que
exceda o tamanho do coverslip/lamínula.
NOTA: uma vez terminado o processo anterior, é uma boa alternativa colocar a
lâmina em uma superfície quente a 71ºC por 4 minutos. Em geral neste passo
extra acontece melhores resultados, contudo se pode diminuir levemente a
qualidade da morfologia dos cromossomas
Hibridização: O Buffer(tampão)hibridizador LIVE oferece excelentes resultados
com qualquer sonda em somente 30 minutos de incubação a 45ºC.
• Coloque a lâmina montada em uma câmara úmida a 45ºC. incubar pelo menos
por 30 minutos a 45ºC ou de um dia para o outro a 37ºC.
6
Protocolo3: Co-desnaturação
Este protocolo foi desenhado para unificar o tempo da co-desnaturação
com a temperatura. Aqui, os parâmetros são os mesmo para células
esfregaços/smear preparadas no dia ou as guardadas a -20ºC
Preparação da sonda:
• Descongele o tubo da sonda, misture no Vortex
• Centrifugue rapidamente
• Descongele o buffer(tampão) hibridização
• Em um tubo PCR adicione:
7µl de buffer(tampão) hibridização
1µl de sonda
• Misture no vortex
• Centrifugue rapidamente
Co-Desnaturação:
• Na parte de trás da lâmina marcar a região para hibridizar (os 8µl
preparados hibridam uma região aproximada de 22x22mm).
•
Adicione a sonda na região para hibridizar.
•
•
Coloque um coverslip/lamínula de tamanho apropriado.
Sele as bordas com adesivo de contato removível ou coloque uma folha
deParafilm® que exceda o tamanho do coverslip/lamínula.
Coloque a lâmina montada em uma superfície quente (hibridizador,placa
termostática, etc.). Em ocasiões é conveniente colocar uma gota de água
sobre a chapa aquecedora e depois colocar sobre esta a lâmina montada,
desta forma se consegue uma película de água entre a lâmina e a superfície
quente melhorando a transferência de temperatura.
•
Um tratamentode 15 minutos a 71°C tem funcionado bem independente da idade
doesfregaço/smears.
Hibridização: O Buffer(tampão)hibridizador LIVE oferece excelentes resultados
com qualquer sonda em somente 30 minutos de incubação a 45ºC.
• Coloque a lâmina montada em uma câmara úmida a 45ºC. incubar pelo menos
por 30 minutos a 45ºC ou de um dia para o outro a 37ºC.
7
Reação de hibridização flourescente in situ
Revelado: (O mesmo procedimento para os protocolos 1, 2 e 3)
Nota: Pelo menos 30 minutos antes da lavagem, aqueça a solução de lavado 1 para 71°C
(+/-1ºC).Com um termômetro calibrado confira a temperatura dentro do coplin.
Descongele a solução de lavado 2 a temperatura ambiente.
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Retirea lâmina da câmera úmida.
Com cuidado retire o adesivo ou a folha deParafilm®
Mergulhe a lâmina em uma solução 2XSSC a temperatura ambiente até o
coverslip/lamínula cair.
Mergulhe a lâmina na solução de lavado 1 por exatamente 2 minutos
Mergulhe a lâmina na solução de lavado 2 pelo menos 1 minuto.
Retire a lâmina e drene o excesso de liquido ligeiramente.
Coloque uma gota na solução de montagem na região hibridizada.
Coloque o coverslip/lamínula do tamanho apropriado.
Drene o excesso da solução de montagem pressionando com cuidado e
secando com toalhas de papel.
Remova alguma bolha de ar pressionando com cuidado.
A reação está pronta para ser lida
8
Protocolo para uso
(Protocolo #1)
esfregaço/smear
Celular
Preparação da Sonda
DNA sonda + Buffer Hibridização
Desnaturação
Desnaturação
Formamida 70%
Desidratar em etanol
70ºC ou mais
, 5 minutos
Hibridização
45ºC (30 minutos a pelo menos 8 horas)
37ºC (Overnight)
Lavados
Montagem
DAPI + Antifade
Análise
9
Protocolo para uso
(Protocolo #2)
Esfregaço/smear
celular
Feito no dia
Envelhecido a 37-45ºC
Preparação sonda
DNA Sonda + Buffer Hibridização
Desnaturação
Desnaturação
Hidroxido de sodio0.1M
6minutos Tºambiente.
Desidratar em etanol
70ºC oumais, 5 minutos
Alternativa
71ºC, 4 minutos
Hibridização
45ºC (30 minutos a pelo menos 8 horas)
37ºC (Overnight)
Lavagens
Montagem
DAPI + Antifade
Analise
10
Protocolo para uso
(Protocolo #3)
Esfregaço/smear
celular
Feito no dia
Envelhecido a 37-45ºC
Preparação sonda
DNA Sonda + Buffer Hibridização
Co-desnaturaçao
71ºC 15 minutos
Hibridização
45ºC (30 minutos pelo menos 8 horas)
37ºC (Overnight)
Lavados
Montagem
DAPI + Antifade
Analise
11