UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
DEPARTAMENTO DE AQUICULTURA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AQUICULTURA
Avaliação do uso de Lactobacillus plantarum (CPQBA 007 07
DRM 01) na conservação do alimento fresco (Perna perna) para
reprodutores de Litopenaeus vannamei
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Aquicultura do Centro de
Ciências Agrárias da Universidade Federal
de Santa Catarina, como requisito parcial
para obtenção do título de Mestre em
Aquicultura.
Orientador: Edemar Roberto Andreatta
Co-orientador: Felipe do Nascimento Vieira
GENYESS RIBEIRO ARTHUR DA SILVAVIEIRA
Florianópolis
2013
Avaliação do uso de Lactobacillus plantarum (CPQBA 007 07 DRM
01) na conservação do alimento fresco (Perna perna) para
reprodutores de Litopenaeus vannamei
Por
GENYESS RIBEIRO ARTHUR DA SILVA VIEIRA
Esta dissertação foi julgada adequada para a obtenção do título de
MESTRE EM AQUICULTURA
e aprovada em sua forma final pelo Programa de
Pós-Graduação em Aqüicultura.
_____________________________________
Prof. Alex Pires de Oliveira Nuñer, Dr.
Coordenador do Curso
Banca Examinadora:
__________________________________________
Dr. Edemar Roberto Andreatta – Orientador
__________________________________________
Dra. Cristina Ramirez Toro
__________________________________________
Dr. José Luiz Pedreira Mouriño
__________________________________________
Dr. Walter Quadros Seiffert
Dedicatória:
A minha mãe, Luisa Arthur que é uma mulher
admirável. Tu és o meu exemplo de caráter,
profissionalismo, amizade e amor. Amo-te e
admiro muito;
A minha irmã - melhor amiga, Nykole Vieira,
pela amizade e amor deste que eu nasci;
Ao meu sobrinho Kawane, um pequenino que
mudou a minha vida e me mostrou que amor
incondicional não tem palavras. Teu sorriso e
tua alegria derem-me muita força para
continuar e espero ser para ti alguém com que
podes sempre contar. Amo-te muito - amor da
minha vida.
Ao meu segundo sobrinho Ythyenne, que
ainda não conheço pessoalmente, mas já é a
paixão da tia. Bem vindo pequeno boy.
Ao meu pai de coração Wim, pela amizade,
atenção e carinho todos estes anos.
AGRADECIMENTOS:
Ao projeto SOED (Southern Oceans Education Development) pela
bolsa concedida. A Regina Fumie Tiba e Jack Littlepage pelo apoio em
varias momentos. Ao João Santana pelo apoio com a administração do
projeto aqui no Brasil.
Ao Prof. Dr. Antonio M. Hoguane, da ESCMC – UEM, pelo
apoio e incentivo durante esta trajetória. E pela amizade deste sempre.
Ao meu orientador Prof. Dr. Edemar Roberto Andreatta pela
orientação ao longo do curso, ensinamentos e amizade.
Ao meu coorientador Prof. Dr Felipe Vieira, pela paciência, calma,
orientação e ajuda, por sempre me fazer voltar para o foco do experimento.
Pelas viagens Florianópolis - Araquari serem sempre com um bom papo humor e conhecimento culinário e claro sem falar na amizade. O meu muito
obrigada.
Ao Prof. Dr. José Moriño, pelo apoio, ideais, opinião em muitos
momentos e pela simpatia.
Ao Laboratório de Moluscos Marinhos da UFSC, em especial a
Profa. Dra. Aimê Rachel Magenta Magalhães, pelos mexilhões fornecidos
durante o experimento.
Ao Bruno Correia por sempre me ajudar a melhor colocar em pratica
as metodologias, estatística e pela amizade deste de que nos conhecemos.
Aos professores da IFC – Araquari Delano Dias Schleder, que
sempre com muita simpatia e atenção me ajudou no experimento. Adolfo
Jatobá pela amizade e ajuda.
Ao colega Yan por me apoiar, com boa disposição, energia e claro
pela amizade que ai surgiu. E sem deixar de agradecer a Karina e o Moises.
Ao Carlito, por sempre ter me ajudado com esta minha trajetória, ao
esforço das datas quando ainda estava em Moçambique e muitas vezes que
me apoio com os meus documentos. Que a nossa amizade continue para um
sempre.
As minhas queridas amiga-colegas Mariana Soares e Norha Bolivar,
pela ajuda ao realizar o experimento (meus braços direito e esquerdo). E
também, pelos momentos autoclave, pimenta e sem falar das perolas que
tornaram esses momentos mais divertidos.
Ao grupo do Laboratório de Microbiologia LCM (Amigas)
Gabreilas, Sheila, Karine, Jess pelo apoio e atenção. Sem deixar de fora os
meninos Marcelo e Gabi que sempre rindo e fazendo das nossas TPMs mais
leves.
Um obrigado especial também para os manos Ilson e David do LCM,
pelos ensinamentos dos setores que tive a oportunidade de vós ter como
professores.
Ao grupo da cozinha do LCM que em alguns momentos nos
cozinhamos (quando morava no alojamento), mas no final aprendi que eram
sempre para nos tornar pessoas melhores. Aos vigias que também fizeram
parte dessa minha família um “bom dia” e “boa noite” sempre foram bem
vindo, fora os papos quando a Tv a noite não tinha nada legal.
Aos colegas – amigos do LCM: Tarik, Carlos (Biólogo), Carlos
(técnico), Dimas pelo apoio, conversa e amizade.
Aos manos Moz (Simão, Manecas, Manuel, Helena) e africanos que
sempre me fizeram sentir mais em casa quando nós encontrávamos e
batíamos altos papos dos pontos de vista.
Aos manos Ewdemar e Robson por estarem sempre ao meu lado.
Aos colegas e amigos da ESCMC - UEM, pela amizade e apoio
nestes anos da elaboração do mestrado.
As amigas: Celene, Nicole, Silvia, Lika, Maria Luisa, Marisol pelas
conversas divertidas e de incentivo. A Sthefania que além da amizade e
risadas, foi sempre muito querida ao entregar os mexilhões ao longo do
experimento.
A minha amiga Iva Garrido pelo carinho, risadas gostosas via skype,
recados carinhos no facebook. Resumindo, pela amizade e amor que me
deste mesmo estando deste lado do mundo.
Os últimos, mas não os menos importantes, a minha família pelo
carinho, mimos e comidas gostosas que tornaram a estadia aqui mais
gostosa. Em especial para minha mãe, que sempre me apoiou nas minhas
decisões/ escolhas, fossem essas certas ou erradas.
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi avaliar a conservação do mexilhão Perna
perna (Linnaeus, 1758), utilizados na alimentação de reprodutores de
Litopenaeus vannamei (Bonne, 1931), com o uso de Lactobacillus
plantarum embalado a vácuo e armazenamento a 4° C. Os mexilhões
que receberam a bactéria L. plantarum tiveram maior contagem de
bactérias ácido lácticas (p<0,05) e menor contagem de Vibrio spp
(p<0,05) e bactéria heterotróficas totais (p<0,05), após 60 dias de
conservação ao comparar com os que não receberam L. plantarum. Nas
análises de atratividade e do consumo dos mexilhões pelos camarões,
não houve diferença entre os tratamentos (p≥0,05). A microbiota
bacteriana do trato intestinal dos camarões alimentados com mexilhão
conservados com L. plantarum, apresentou maior contagem de bactérias
ácido lácticas e menor de Vibrio spp ao comparar com os camarões do
grupo controle. Concluí-se, que o uso de L. plantarum no alimento
fresco (mexilhão) inibe o Vibrio spp e conserva o alimento por um
período de pelo menos 60 dias a 4° C, sem alterar a atratividade e o
consumo do alimento para os camarões e melhora a saúde intestinal do
camarão marinho Litopenaeus vannamei.
Palavras-chaves:
conservação
Bactérias
ácido
lácticas,
probiótico,
consumo,
ABSTRACT
The aim of this study was to evaluate the preservation of mussels Perna
perna (Linnaeus, 1758), used to fed Litopenaeus vannamei (Bonne,
1931), in maturation, using Lactobacillus plantarum associated with the
vacuum process and storage at 4 ° C. The mussels that received the
bacteria L. plantarum showed higher counts of lactic acid bacteria (p
<0.05) and lower counts of Vibrio spp (p <0.05) and total heterotrophic
bacteria, after 60 days of storage when compared to the mussels that did
not receive L. plantarum. In the analyses of the attractiveness and
consumption of mussels by the shrimp, there was no difference between
the two treatments of the mussels (p ≥ 0.05). The bacterial flora of the
intestinal tract of shrimp fed with mussels conserved with L. plantarum,
vacuum sealed and stored at 4 °C showed higher counts of lactic acid
bacteria and smaller counts of Vibrio spp in comparison with the shrimp
of the control group. It is concluded, therefore, that the use of L.
plantarum in fresh food (mussels) can inhibit Vibrio spp and preserve
food for a period of 60 days at 4 °C without changing the attractiveness
and consumption of shrimp feed and improve intestinal health of
Litopenaeus vannamei
Keywords: lactic acid bacteria, probiotics, consumption, conservation
A educação é a arma mais poderosa que
você pode usar para mudar o mundo;
Nelson Mandela
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................. 17
1.1 MATURAÇÃO DE L. vannamei EM CATIVEIRO....................... 19
1.2 CONSERVAÇÃO DE ALIMENTO............................................... 21
1.2.1 CONSERVAÇÃO DE ALIMENTO FRESCO............................ 22
1.3 PROBIÓTICOS............................................................................... 23
1.3.1 PROBIÓTICOS NA CARCINICULTURA................................. 25
2 HIPÓTESE ........................................................................................ 26
3 OBJETIVO GERAL .......................................................................... 27
3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .......................................................... 27
4 FORMATAÇÃO DA DISSERTAÇÃO ............................................ 27
5 RESUMO........................................................................................... 29
6 ABSTRACT ...................................................................................... 30
7 INTRODUÇÃO ................................................................................. 31
8 MATERIAL E METODOS ............................................................... 32
8.1 Material biológico ........................................................................... 33
8.1.1 Avaliação da conservação de mexilhão com L. plantarum .......... 33
8.1.2 Análises microbiológicas ............................................................. 33
8.2 Análise de atratividade do alimento ................................................ 34
8.2.1 Análise do consumo do alimento e da microbiota do trato
intestinal ............................................................................................... 35
8.3 Análise estatística............................................................................ 35
9 RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................... 36
9.1 Avaliação da conservação de mexilhão com L. plantarum e
análises microbiológicas ....................................................................... 36
9.2 Análise de atratividade e consumo do alimento .............................. 39
9.3 Análise da microbiota do trato intestinal......................................... 39
10 CONCLUSÕES ................................................................................41
11 AGRADECIMENTOS......................................................................41
12 REFERENCIAS DO ARTIGO.........................................................41
13 REFERENCIA DA INTRODUÇÃO................................................46
ANEXO I: ..............................................................................................55
ANEXO II:.............................................................................................56
ANEXO III: ...........................................................................................57
ANEXO IV: ...........................................................................................58
17
INTRODUÇÃO
A crescente demanda mundial de peixes, crustáceos e outros
organismos aquáticos têm direcionado interesses e investimentos para o
desenvolvimento da aquicultura (MAGALHÃES, 2004). A aquicultura
destaca-se como uma das atividades de produção de alimentos que mais
cresce no mundo, pelo elevado potencial de produção e pela qualidade
nutricional dos produtos gerados. Sua produção teve um crescimento
significativo, passando de 51,4 milhões de toneladas em 2002 gerando
US$ 60 bilhões (FAO, 2004), para 79 milhões de toneladas em 2010,
tendo gerado US$119.4 bilhões (FAO, 2012). Adicionalmente, esta
atividade contribui ativamente para geração de oportunidades
empresariais, gerando postos de trabalho, que atenuam a pobreza da
zona costeira (ARANA, 2004).
A produção de crustáceos (camarão, lagostim e outros crustáceos
menores) representa 9,6% da aquicultura mundial, sendo o camarão
marinho Litopenaeus vannamei o mais produzido mundialmente, sendo
responsável por 71,8% da produção mundial da carcinicultura marinha
em 2010 (FAO, 2012).
Esta espécie, nativa da costa Americana do Pacífico, é encontrada
do Peru ao México e sua introdução no Brasil se deu nos anos 90
(MARTINS, 2003; REIS, 2008). Apresenta desempenho favorável para
cultivo, devido a sua adaptabilidade a condições ambientais extremas,
aceitação de dietas com baixo teor proteico (hábito alimentar
detritívoro) e por apresentar alta taxa de rentabilidade comparada com
as espécies nativas (JÚNIOR; NETO, 2002).
O crescimento da carcinicultura marinha está associado ao
desenvolvimento tecnológico de laboratórios comerciais de reprodução,
que levam ao constante e eficaz fornecimento de pós-larvas em elevada
quantidade para as fazendas de engorda de camarões (BROWDY,
1998). Para uma boa produção de camarões marinhos em cativeiro, é
indispensável que o setor de maturação, aonde são acondicionados os
reprodutores e acontecem as cópulas e desovas, funcione de maneira
eficaz. Para garantir uma boa desova (em número e qualidade de ovos),
a nutrição das matrizes em cativeiro deve ser colocada em destaque,
uma vez que interfere diretamente no desempenho reprodutivo dos
organismos, e consequentemente, na qualidade dos náuplios (primeiro
estágio larval dos camarões marinhos) (CARVALHO et al., 2010).
Uma dieta desbalanceada ou incompleta pode causar baixo
desempenho reprodutivo ou até mesmo impedir a reprodução
18
(KAWAHIGASHI, 1998; FLOR, 2009). Neste contexto, alguns estudos
bioquímicos da dieta foram realizados para identificar os nutrientes
ideais para maturação e reprodução (WOUTERS, 2001). Contudo, até
hoje ainda não foi desenvolvida uma ração que supra todas as
necessidades reprodutivas dos camarões, sendo indispensável à
utilização de alimentos frescos como mexilhão, lula, ova de peixe e
biomassa de artêmia (KAWAHIGASHI, 1998).
Para conservação do alimento fresco utilizado no setor de
maturação, estratégia mais utilizada é a estocagem a -18°C. No entanto,
com o congelamento, ocorre o risco de formação de cristais de gelo que
podem causar danos aos tecidos dos alimentos frescos. Este processo
provoca perda de líquidos ocasionando reações indesejáveis e
consequente redução do valor nutricional, além de alterações na textura
e na aparência dos alimentos após o descongelamento (CORDEIRO,
2005). O fornecimento do alimento sem o processo de congelamento
poderia melhorar os índices reprodutivos da maturação de camarões
peneídeos. Uma estratégia que poderia ser utilizada com este propósito é
a conservação do alimento fresco com uso de bactérias ácido lácticas.
Com relação à biosseguridade, Coman et al. (2007) verificou que
o uso de alimentos frescos ou congelados são possíveis vetores de
transmissão de diferentes patógenos. Com isso, a utilização de bactérias
ácido lácticas também poderiam contribuir, pois possuem atividade
antimicrobiana devido a vários fatores, como a acidificação do meio, e
produção de compostos com ação bacteriostática ou bactericida
(FRANCO; MARTINS; TODOROV, 2011). As bactérias ácido lácticas,
entre elas os Lactobacillus, possuem características como: produção de
ácido láctico, peróxido de hidrogênio, ácidos orgânicos e bacteriocinas,
que atuam como bioconservadores, alterando as propriedades intrínsecas
de alimentos e inibindo microrganismos deteriorantes (DEEGAN et al.,
2006).
No caso específico da carcinicultura, a conservação do alimento
com bactérias ácido lácticas pode ser uma importante janela sanitária,
eliminando bactérias patogênicas do gênero Vibrio que são comumente
encontradas em lulas e mexilhões (PRADRO; ROMALDE; BRAJA,
2010). Os Vibrio spp são os microrganismos mais importantes na
aquicultura, pois infectam diversos organismos marinhos, como
crustáceos, peixes e moluscos (VANDENBERGHE et al., 2003). Os
moluscos bivalves são animais filtradores, que se alimentam de
partículas heterogêneas e dispersas na coluna de água, podendo filtrar
até 5L de água por hora (ANANDRAJ et al., 2002). Tais partículas
incluem vírus (MORTENSEN, 1993; NAPPIER; GRACZYK;
19
SCHWAB, 2008; VAZQUEZ-BOUCARD et al., 2010). Por serem
filtradores podem acumular contaminantes nos seus tecidos, em
concentrações de 1.000 a 10.000 vezes superior às encontradas na fonte
de exposição (UNEP, 2004). São animais com alto risco de
contaminação e potentes vetores na transmissão de doenças. Em estudo
com as ostras Crassostrea gigas, demonstrou-se seu potencial como
vetor do vírus da mancha branca (WSSV, do inglês White Spot
Sindrome Virus), patógeno com maior impacto na carcinicultura
marinha (VAZQUEZ-BOUCARD et al., 2010). Adicionalmente, o uso
de bactérias ácido lácticas (Lactobacillus plantarum) que apresentam
um pH ácido em torno de 3,8 pode ser avaliado como inativador do
vírus WSSV. Chang et al. (1998) em um experimento realizado com
camarão tigre (Penaeus monodon) onde ajustou solução de vírus para
pH 3, houve a inativação total do vírus da mancha branca após uma hora
de exposição. Sendo assim, o uso de L. plantarum poderá contribuir
para um melhor controle da enfermidade na produção de camarão
marinho em cativeiro.
1.1
MATURAÇÃO DE L. vannamei EM CATIVEIRO
Em condições naturais, as estações reprodutivas dos camarões
peneídeos são influenciadas pela presença de organismos para sua
alimentação, fotoperíodo e temperatura adequada da água (BRAY;
LAWRENCE, 1992). Já em condições de cativeiro, é necessário o
conhecimento do hábito alimentar, comportamento, biologia
reprodutiva, exigências nutricionais, entre outros conhecimentos para
reprodução destes animais (BROWDY, 1998). Nas espécies de
camarões peneídeos, o macho tem o sistema reprodutivo localizado na
região cardíaca do hepatopâncreas e formado por um par de testículos,
vasos deferentes e ampolas terminais. O petasma é o aparelho copulador
masculino que se forma a partir da união de um par de endopóditos
(PETERSEN, 1996 apud ANDREATTA; BELTRAME, 2004). Já na
fêmea, o sistema reprodutivo está formado por um par de ovários,
ovidutos e apenas um télico. O télico está localizado na parte ventral,
entre o quinto par de pereiópodos, composto por placas receptoras dos
espermatóforos. O ovário é composto por lóbulos e ocupa grande parte
do corpo (MARTIN; HOSE, 2010).
A espécie L. vannamei pertence ao grupo de télico aberto,
apresenta depressões abertas (DALL et al., 1990) e a cópula ocorre
momentos antes da desova. O par de espermatóforos transferido serve
apenas para uma desova, o que difere das espécies de télico fechado. As
várias desovas que ocorrem num mesmo período de intermuda
20
necessitam de uma nova cópula, e para selecionar uma fêmea madura e
copulada em cativeiro tem que se verificar a presença do espermatóforo
aderido na mesma (BROWDY, 1992; ANDREATTA; BELTRAME,
2004).
Em relação ao controle hormonal dos peneídeos, a ablação do
pedúnculo ocular é uma técnica que vem sendo utilizada com sucesso na
indução da maturação gonadal desses animais em cativeiro
(PRIMAVERA, 1978; PEIXOTO; CAVALLI; WASIELESKY, 2005;
COMAN et al., 2007; PEIXOTO; WASIELESKY; CAVALLI, 2011).
Na base do pedúnculo ocular existe um conjunto de células
neurosecretoras, denominada órgão X, que é responsável pela produção
do hormônio inibidor, ou repressor da maturação gonadal
(ANDREATTA; BELTRAME, 2004; MARTIN; HOSE, 2010). A
técnica de ablação ocular consiste na extirpação de um ou ambos os
pedúnculos oculares, podendo ser realizada por dois métodos distintos:
(1) incisão no globo ocular do crustáceo com remoção do complexo
endócrino por pressão superficial (PRIMAVERA, 1978) e (2) remoção
total ou parcial do pedúnculo ocular com cauterização "a quente",
utilizando uma agulha incandescente (PRIMAVERA, 1985 apud
SANTOS, 2012). A ablação unilateral do pedúnculo ocular tem sido a
maneira mais efetiva empregada no cultivo de camarões peneídeos para
induzir a maturação ovariana (PRIMAVERA, 1978; PEIXOTO;
CAVALLI; WASIELESKY, 2005; BROWDY, 1992; COMAN et al.
2007).
Para garantir os índices reprodutivos satisfatórios na maturação, a
qualidade da água utilizada é essencial (JUAREZ; MOSS; FIQUERA,
2010). Os parâmetros físicos – químicos como temperatura (28-29°C),
salinidade (30-35 ‰), oxigênio dissolvido (acima de 5 mg/L) e pH (7,58) devem ser controlados. A renovação da água dos tanques deve ser de
100 à 400% dia, para retirada de restos de alimentos, fezes e compostos
tóxicos.
No setor de maturação alimentos naturais tais como: moluscos,
crustáceos, peixes, poliquetas, microcrustáceos e Artemia spp são
indispensáveis (BROWDY, 1992; COMAN et al., 2007). Esses
alimentos naturais normalmente são congelados e são oferecidos aos
animais três a cinco vezes ao dia (BROWDY, 1992). Estudos
bioquímicos da dieta foram realizados para identificar os nutrientes
ideais para maturação e reprodução (WOUTERS, 2001), com intuito de
desenvolver dietas artificiais. Segundo Harrison (1990) as vantagens que
podem ser esperadas com uso de dieta artificial sobre o alimento fresco
são: a garantia de suprimento confiável, reprodutividade, controle de
21
qualidade, facilidade do uso, melhor estabilidade quando armazenada,
redução do acúmulo de matéria orgânica nos tanques, risco reduzido de
introdução de doenças e facilidade de agregação de quimioterápicos,
imunoestimulantes e hormônios. No entanto, as tentativas de substituir
completamente o alimento fresco por dietas artificiais, resultam em uma
diminuição na maturação ovariana, reduzido número de desovas e
qualidade inferior dos ovos (KAWAHIGASHI, 1998; WOUTERS,
2001). Além das dietas artificiais não tem todos os fatores que
determinam uma maior atratividade e consumo (textura, cheiro, % ideal
de lipídios, proteínas, acido graxos, minerais, vitaminas). Dessa forma,
existe a necessidade de uma combinação de alimento fresco e dietas
artificiais, para a obtenção de resultados superiores na maturação
(GALGANI et al., 1989a; BRAY; LAWRENCE, 1990b; PEIXOTO;
WASIELESKY; CAVALLI, 201).
1.2
CONSERVAÇÃO DE ALIMENTO
A conservação de alimentos vem sendo praticada pelo homem ao
longo da História. Pode ser considerado como um método de tratamento
dos alimentos, que tem como objetivo aumentar sua durabilidade,
mantendo a qualidade. A contaminação é um sério problema na
conservação de alimentos, por isso há necessidade de se desenvolver
alternativas para que seja possível disponibilizar alimentos mais seguros
para a população sob o ponto de vista microbiológico, toxicológico e
qualitativo (SCHULZ, et al., 2003). Esta contaminação ocorre por
diferentes fontes: agentes químicos, metais pesados, infestação
parasitária, pesticidas e microrganismo (ENVAGELISTA, 2001). Os
processos de conservação baseiam-se na destruição total ou parcial dos
microrganismos capazes de alterar o alimento, ou na
modificação/eliminação de um ou mais fatores (intrínsecos ou
extrínsecos) essenciais, de modo que o alimento não se torne favorável
ao desenvolvimento microbiano (EVANGELISTA, 2001). Atualmente,
existem vários métodos de conservação de alimentos como: a cocção,
pasteurização, esterilização, uso do açúcar, uso de sal, uso de aditivos,
irradiação, defumação, uso do frio e fermentação (EVANGELISTA,
2001; GAVA, 2009). A secagem, embalagem a vácuo e a embalagem de
atmosfera modificada são igualmente considerados métodos de
conservação. A maioria destas técnicas estão baseadas na redução do
crescimento microbiano, por tornar as condições ambientais
desfavoráveis, através da redução de temperatura, diminuição de pH e
desnaturação a tratamentos térmicos (FOOD INGREDIENTS BRASIL,
2008).
22
1.2.1
CONSERVAÇÃO DE ALIMENTO FRESCO
Para conservação do alimento fresco, o mais comum é a
estocagem a -18°C. Contudo, com o congelamento, ocorre a formação
de cristais de gelo, que podem causar danos aos tecidos do alimento.
Este processo provoca exsudação e perda de líquidos ocasionando
reações indesejáveis e consequente redução do valor nutricional e
alterações na textura após o descongelamento (CORDEIRO, 2005).
Também, durante o descongelamento há perda de minerais e vitaminas,
resultando na queda da qualidade sensorial do produto e do valor
nutritivo, tornando-o mais ressecado e com textura rígida
(GONÇALVES, 2005). A velocidade de congelamento é importante,
pois quanto menor a velocidade, maior é a formação de cristais a nível
extracelular, causando danos aos tecidos do alimento (BEVILACQUA;
M.D`AMORE; POLONARA, 2004). Para que não ocorram esses
processos, uma alternativa seria o fornecimento do alimento sem o
processo de congelamento. Para isso, poderia ser utilizada a conservação
do alimento com uso de bactérias. Muitos trabalhos já foram realizados
mostrando a importância do uso desses microrganismos para a
preservação de alimentos e para o controle de bactérias patogênicas
(FADDA; LÓPEZ; VIGNOLO, 2010).
Os microrganismos podem desempenhar um papel muito
importante nos alimentos e podem ser classificados dependendo do tipo
de interação existente entre microrganismo e alimento: (1) os que
alteram os alimentos, (2) os causadores de doenças e (3) os que causam
alterações benéficas ao alimento. (GAVA, 2009). A utilização de
microrganismos para conservação de alimento ocorre desde os
primórdios da nossa civilização (PAZ, 2001) e nas últimas décadas essa
utilização é cada vez maior. O uso de microrganismos para conservação
de alimentos está baseado na sua capacidade de produzir substâncias
que podem influenciar no desenvolvimento de outros microrganismos e
de produzir substâncias com atividade antimicrobiana utilizados na
conservação e melhoramento nutricional dos alimentos (SCHULZ, et
al., 2003; FOOD INGREDIENTS BRASIL, 2010). As bactérias ácido
lácticas são um exemplo disso.
As bactérias ácido lácticas habitam naturalmente o trato
digestivo, respiratório superior e urogenital inferior dos animais (HOVE
et al., 1999). Constituem um grupo de bactérias Gram-positivas, em
forma de cocos ou bacilos não esporulados. São anaeróbicas, mas
podem ser aeróbicas e ácido tolerantes (CARR; CHILL; MAIDA,
2002). Apresentam atividade antimicrobiana que pode ser atribuída a
23
vários fatores, como pH baixo, competição por substrato e produção de
compostos com ação bacteriostática ou bactericida (FRANCO;
MARTINS; TODOROV, 2011). Os principais gêneros são:
Lactobacillus,
Lactococcus,
Enterocococcus,
Streptococcus,
Pediococcus, Leuconostoc e Bifidobacterium (VASILJEVIC; SHAH,
2008). Algumas utilizam a lactose como fonte de carbono, tendo como
produtos do seu metabolismo substâncias antimicrobianas, que atuam
favoravelmente no produto alimentício ao qual foram adicionados
(LIMA et al., 2009). Estas bactérias ácido lácticas são usadas
comumente na fabricação de produtos lácteos (leite, queijos, iogurtes e
manteiga) no processamento de carnes (presuntos); bebidas alcoólicas
(vinho e cerveja) e vegetais (CARR; CHILL; MAIDA, 2002).
Igualmente podem ser usadas na fermentação do pescado, onde as
bactérias ácido lácticas desempenham um papel essencial alterando de
forma favorável o sabor e a textura, evitando a deterioração precoce dos
produtos e inibindo o desenvolvimento de organismos prejudiciais a
saúde (FADDA; LÓPEZ; VIGNOLO, 2010 POFFO; SILVA, 2011).
Ainda, as bactérias ácido lácticas podem ter ação probiótica, atuando
beneficamente no hospedeiro (RINGO; GATESOUPE, 1998).
1.3
PROBIÓTICOS
O termo probiótico deriva do grego e significa “pró-vida”.
Guarner e Schaafsma (1998) definem que os probióticos “são
microrganismos vivos que consumidos em doses adequadas promovem
benefícios ao hospedeiro”.
Segundo Saad, Bedani e Mamizuka (2011) existem três possíveis
mecanismos de ação dos probióticos: (1) a supressão do número de
células viáveis, através da produção de compostos com atividade
antimicrobiana, da competição por nutrientes e da competição por sítios de
adesão; (2) alteração do metabolismo microbiano, através do aumento
ou diminuição da atividade enzimática; (3) o estímulo da imunidade do
hospedeiro. Assim, ao ingerir culturas probióticas destaca-se na saúde do
hospedeiro: controle da microbiota intestinal, promoção da resistência
gastrointestinal à colonização por patógenos, estimulação do sistema
imune e redução da população de patógenos pela produção de ácido
acético e láctico, bacteriocinas e outros compostos antimicrobianos
(SAAD; BEDANI; MAMIZUKA, 2011; CRUZ et al., 2012).
O uso de probióticos na aquicultura vem sendo uma alternativa à
prevenção das enfermidades existentes nos cultivos. O uso dos
antibióticos no setor produtivo tem sido controlado/limitado, pelo fato
que os antibióticos podem inibir outras bactérias benéficas, ganhando
24
resistência e transferindo esses genes para futuras gerações, que nunca
foram expostas aos antibióticos (VERSCHUERE et al., 2000,
NOMOTO, 2005). Os microrganismos probióticos tem a capacidade de
liberar substâncias químicas com efeito bactericida ou bacteriostático no
intestino do hospedeiro, formando uma barreira contra a proliferação de
patógenos oportunos (CRUZ et al., 2012), minimizando os impactos
ambientais negativos e não deixando resíduos na carne do camarão
(BOYD; MASSAUNT, 1999).
Gatesoupe (1999) define probiótico para aquicultura como
“células microbianas que são adicionadas de uma maneira que entrem
no trato digestivo dos animais, mantendo-se vivas, com o objetivo de
melhorar a saúde do hospedeiro”. Ao contrário dos animais terrestres, na
aquicultura existe uma constante interação entre os organismos
cultivados e os microrganismos presentes no ambiente. A microbiota
gastrointestinal de espécies aquáticas é dependente do meio exterior,
devido à passagem do fluxo de água através do trato. Assim, a maioria
das bactérias são transitórias no intestino, devido à ingestão constante de
água, comida e conjunto de microrganismos presentes no mesmo
(GATESOUPE, 1999; CRUZ et al. 2012). Os potenciais patógenos
encontrados no trato gastrointestinal dos animais aquáticos são:
Salmonella, Listeria e Escherichia coli (CRUZ et al., 2012).
Estudos realizados encontraram bactérias probióticas no trato
digestivo dos animais aquáticos incluindo bactérias Gram positivas,
como Bacillus, Carnobacterium, Enterococcus e algumas da espécie
Lactobacillus (VIEIRA et al., 2007); também algumas Gram negativas,
aeróbias facultativas, como Vibrio e Pseudomonas (GOMEZ-Gil;
ROQUE; TURNBULL, 2000; CRUZ et al. 2012). Portanto, os
probióticos tem um grande potencial para serem controladores de
doenças na aquicultura (MORIARTY, 1998).
Diversos trabalhos já foram realizados com o uso de probióticos
na aquicultura, relatando que há melhora na qualidade da água (WANG;
LI; LIN, 2008); na tolerância ao estresse (CARNEVALI et al., 2006), na
promoção do crescimento (DOUILLET P; LANGDON, 1994;
QUEIROZ;
BOYD,
1998;
RENGPIPAT
et
al.,
1998;
GATESOUP,1999; CARNEVALI et al., 2006; VIEIRA, et al., 2007), na
inibição de patógenos (MORIARTY, 1998; SCHOLZ et al., 1999;
BALCAZÁR; ROJAS–LUNA; CUNNINGHAM, 2007; VIEIRA, et al.,
2007; JATOBA et al.,2008; AL-DOHAIL; HASHIM; ALIYU-PAIKO,
2011) na digestão de nutrientes (GHOSH; SINHA; SAHU, 2007;
BUGLIONE, 2009) e no aumento reprodutivo (SCHREZENMEIR;
VRESE, 2001).
25
1.3.1
PROBIÓTICOS NA CARCINICULTURA
Na carcinicultura o uso de probióticos pode ser uma importante
barreira sanitária eliminando bactérias patogênicas. Diversos trabalhos
foram feitos com o uso de Bacillus spp como probiótico no cultivo de
camarão. Moriarty (1998), em trabalho com Bacillus spp., obteve
aumento na sobrevivência de camarões cultivados e diminuição de
Vibrio spp. na água dos tanques, no sedimento. A bactéria Bacillus P64
obtida a partir do hepatopâncreas do camarão selvagem saudável, teve
efeito inibitório contra o Vibrio harveyi S2 no cultivo do camarão L.
vannamei (GULLIAN; THOMPSONB; RODRIGUEZ, 2004).
Adicionalmente, Rengpipat et al.(1998) ao avaliou o uso da dieta
suplementada com bactéria Bacillus S11 do camarão P. monodon
contra o patógeno Vibrio harveyi, durante 10 dias, teve uma
sobrevivência de 100% ao comparar com o controle que foi d 26%.
Outro estudo com quatro cepas isoladas do camarão adulto L. vannamei
(Vibrio alginolyticus UTM 102, Bacillus subtilis UTM 126,
Roseobacter gallaeciensis SLV03 e Pseudomonas aestumarina SLV22),
onde demonstraram que após 28 dias de alimentação, o camarão teve
uma redução da doença causada pelo Vibrio parahaemolyticus PS-017 e
uma melhor conversão alimentar (BALCAZÁR; ROJAS-LUNA;
CUNNINGHAM, 2007).
As bactérias do gênero Vibrio são Gram negativas, móveis não
esporuladas, aeróbicas facultativas e com alta taxa de multiplicação
(MADIGAN et al., 2004 apud VIEIRA, 2010). A enfermidade
bacteriana mais comumente encontrada no cultivo de camarão é a
vibriose, causada por bactérias do gênero Vibrio. Sendo, algumas
espécies caracterizadas tanto como benéficas quanto patogênicas para o
cultivo de camarões peneídeos (SILVA, 2010). Essas bactérias podem
agir de forma oportunista, quando os camarões estão imunologicamente
comprometidos devido a causas primárias como a presença de outros
agentes infecciosos, práticas inadequadas de manejo, deficiência
nutricional e estresse ambiental em decorrência de bruscas alterações
nos parâmetros físico-químicos da água de cultivo (CARVALHO,
2011). Causando nos camarões anorexia, inatividade, baixa taxa de
crescimento e necroso muscular (CHUI et al., 2007). A espécie Vibrio
alginolyticus é tanto utilizada como probiótico (GULLIAN;
THOMPSONB; RODRIGUEZ, 2004) quanto importante patógeno
(BUGLIONE et al., 2010). A diferença entre as cepas patogênicas ou
não patogênicas reside em apenas uma variação genética (GEORGE et
al., 2005 apud VIEIRA, 2010).
26
As bactérias ácido láticas constituem um grupo de bactérias
Gram-positivas, em forma de cocos ou bacilos, não esporuladas,
anaeróbicas, mas podem ser aeróbicas e ácido tolerantes (CARR;
CHILL; MAIDA, 2002). As mesmas produzem compostos
antimicrobianos, tem a facilidade de multiplicação e estimulam a
resposta imune não específica nos hospedeiros (RINGO; GATESOUPE,
1998). Os principais gêneros são: Lactobacillus, Lactococcus,
Enterocococcus, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc e
Bifidobacterium (VASILJEVIC; SHAH, 2008). Igualmente, estudos
demonstram os benefícios do uso de bactérias ácido lácticas do gênero
Lactobacillus como probiótico na carcinicultura marinha (VIEIRA et
al., 2007, 2008; BUGLIONE, 2009; VIEIRA, 2010). O gênero
Lactobacillus, constituem um grupo de bactérias em formato de
bastonetes, Gram-positivos, caracterizado por sua habilidade de produzir
metabólicos secundários como antibióticos, bioinseticidas, biocinas,
ácidos orgânicos e enzimas (OLMOS, et al., 1997 apud BUGLIONE,
2009).
Na engorda de P. monodon o uso de Lactobacillus spp aumentou
a sobrevivência e o crescimento dos camarões (PHIANPHAK et al.,
1999). Para o camarão Macrobrachium rosenbergii, em 60 dias de
experimento, o uso de L. acidophilus e L. sporogenes aumentou a taxa
de crescimento e melhorou a conversão alimentar dos animais
(VENKAT et al., 2004). No experimento com L. vannamei a adição de
L. plantarum na dieta induziu a resposta imune e a resistência a infecção
bacteriana com V. alginolyticus (CHIU et al., 2007). Observou-se que a
adição da bactéria L. plantarum na dieta do L. vannamei aumentou o
coeficiente de digestibilidade aparente da proteína bruta da dieta
(BUGLIONE, 2009). Vieira et al. (2007, 2008) relatam que o uso de L.
plantarum em larvas e adultos do camarão L. vannamei modifica
beneficamente a microbiota intestinal, melhora a sobrevivência na
larvicultura e na engorda comercial e aumenta a resistência à bactéria
Vibrio harveyi. Assim, se justifica a escolha do L. plantarum para a
conservação do mexilhão fresco, pois apresenta características benéficas
para conservação de alimentos e ação benéfica na saúde do hospedeiro.
2
HIPÓTESE
É possível a conservação de mexilhão fresco, utilizado no setor
de maturação de laboratórios de camarões marinhos, a 4°C com uso de
L. plantarum e embalagem a vácuo, sem alterar a atratividade e
consumo do alimento pelos reprodutores?
27
3
OBJETIVO GERAL
Contribuir para a melhoria do desempenho sanitário de reprodutores
de camarões marinhos (Litopenaeus vannamei) em cativeiro, através do
desenvolvimento de metodologias alternativas de conservação do alimento
fresco (mexilhão).
3.1
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
•
•
•
4
Avaliar a conservação de alimentos frescos (mexilhão)
utilizados na alimentação de reprodutores de camarões
marinhos com o uso de Lactobacillus plantarum associado
ao processo de vácuo e armazenamento a 4°C.
Avaliar a atratividade e o consumo do alimento conservado
com L. plantarum em sistema de vácuo em relação ao
alimento congelado.
Avaliar as condições da saúde intestinal dos camarões
marinhos Litopenaeus vannamei alimentados com
mexilhão conservados com Lactobacillus plantarum.
FORMATAÇÃO DA DISSERTAÇÃO
Esta dissertação está dividida em dois capítulos, o primeiro
referente à revisão literária e a segunda parte é o artigo nas normas da
revista Brazilian Archives of Biology and Technology (BABT).
28
CAPITULO 2
Avaliação do uso do Lactobacillus plantarum (CPQBA 007 07
DRM01) na conservação do alimento fresco mexilhão Perna
perna e seu efeito na saúde intestinal do camarão marinho
Litopenaeus vannamei
Genyess Ribeiro Arthur da Silva Vieira, Felipe do Nascimento Vieira*,
Mariana Soares, Norha Bolivar, Delano Dias Schleder , Bruno Corrêa da
Silva, José Luiz Pedreira Mouriño e Edemar Roberto Andreatta
Artigo formatado nas normas da revista Brazilian Archives of Biology
and Technology (BABT).
29
5
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi avaliar a conservação do mexilhão Perna
perna (Linnaeus, 1758), utilizados na alimentação de reprodutores de
Litopenaeus vannamei (Bonne, 1931), com o uso de Lactobacillus
plantarum embalado a vácuo e armazenamento a 4° C. Os mexilhões
que receberam a bactéria L. plantarum tiveram maior contagem de
bactérias ácido lácticas (p<0,05) e menor contagem de Vibrio spp
(p<0,05) e bactéria heterotróficas totais (p<0,05), após 60 dias de
conservação ao comparar com os que não receberam L. plantarum. Nas
análises de atratividade e do consumo dos mexilhões pelos camarões,
não houve diferença entre os tratamentos (p≥0,05). A microbiota
bacteriana do trato intestinal dos camarões alimentados com mexilhão
conservados com L. plantarum, apresentou maior contagem de bactérias
ácido lácticas e menor de Vibrio spp ao comparar com os camarões do
grupo controle. Concluí-se, que o uso de L. plantarum no alimento
fresco (mexilhão) inibe o Vibrio spp e conserva o alimento por um
período de pelo menos 60 dias a 4° C, sem alterar a atratividade e o
consumo do alimento para os camarões e melhora a saúde intestinal do
camarão marinho Litopenaeus vannamei.
Palavras-chaves:
conservação
Bactérias
ácido
lácticas,
probiótico,
consumo,
30
6
ABSTRACT
The aim of this study was to evaluate the preservation of mussels Perna
perna (Linnaeus, 1758), used to fed Litopenaeus vannamei (Bonne,
1931), in maturation, using Lactobacillus plantarum associated with the
vacuum process and storage at 4 ° C. The mussels that received the
bacteria L. plantarum showed higher counts of lactic acid bacteria (p
<0.05) and lower counts of Vibrio spp (p <0.05) and total heterotrophic
bacteria, after 60 days of storage when compared to the mussels that did
not receive L. plantarum. In the analyses of the attractiveness and
consumption of mussels by the shrimp, there was no difference between
the two treatments of the mussels (p ≥ 0.05). The bacterial flora of the
intestinal tract of shrimp fed with mussels conserved with L. plantarum,
vacuum sealed and stored at 4 °C showed higher counts of lactic acid
bacteria and smaller counts of Vibrio spp in comparison with the shrimp
of the control group. It is concluded, therefore, that the use of L.
plantarum in fresh food (mussels) can inhibit Vibrio spp and preserve
food for a period of 60 days at 4 °C without changing the attractiveness
and consumption of shrimp feed and improve intestinal health of
Litopenaeus vannamei
Keywords: lactic acid bacteria, probiótics, consumption, conservation
31
7
INTRODUÇÃO
A aquicultura destaca-se como uma das atividades de produção
de alimentos que mais cresce no mundo, devido a sua elevada produção
e pela qualidade nutricional dos produtos gerados. Sua produção passou
de 51,4 milhões de toneladas em 2002 gerando US$ 60 bilhões (Fao
2004), para 79 milhões de toneladas em 2010, com faturamento de
US$119.4 bilhões (Fao 2012). Dentro da aquicultura, destaca-se a
carcinicultura marinha como um dos setores mais importantes, sendo o
camarão marinho Litopenaeus vannamei o mais produzido
mundialmente, responsável por 71,8% da produção mundial em 2010
(Fao 2012). O crescimento da carcinicultura marinha está atrelado ao
intenso desenvolvimento tecnológico de laboratórios comerciais de
reprodução, o que permite o fornecimento constante e eficaz de póslarvas em quantidade e qualidade para as fazendas de cultivo (Andreatta
e Beltrame 2004). Apesar da reprodução dos camarões em cativeiro já
estar bem estabelecida, a melhoria contínua do processo é importante.
Uma dieta desbalanceada ou incompleta pode causar baixo desempenho
reprodutivo ou até mesmo impedir a reprodução (Kawahigashi 1998 e
Flor 2009). Contudo, ainda não foi desenvolvida uma ração que supra
todas as necessidades reprodutivas dos camarões, sendo indispensável à
utilização de alimentos frescos como mexilhão, lula, ova de peixe e
biomassa de artêmia (Kawahigashi 1998).
Para conservação do alimento fresco no setor de maturação, o
mais comum é a estocagem a -18 °C. Com o congelamento ocorre a
formação de cristais de gelo, que podem causar danos aos tecidos dos
alimentos. Este processo provoca exsudação e perda de líquidos
ocasionando reações indesejáveis e consequente redução do valor
nutricional, alterações na textura e aparência dos alimentos após o
descongelamento (Cordeiro 2005).
Também, pode afetar as
propriedades estruturais e químicas das carnes, como as fibras
musculares, lipídios e proteínas (Pietrasik e Janz 2009). Uma alternativa
que poderia ser utilizada com o propósito de conservação do alimento
seria a utilização de bactérias ácido lácticas.
Em relação à biosseguridade, Coman et al. (2007) verificaram
que os alimentos frescos ou congelados são possíveis vetores de
transmissão de diferentes patógenos, como vírus e bactérias que podem
acarretar em enfermidade e consequente mortalidades. Contudo, muitos
trabalhos já realizados mostraram a importância do uso de bactérias
acido láticas para a preservação de alimentos e para o controle de
bactérias patogênicas (Fadda et al. 2010). Estas bactérias apresentam
32
potencial como bioconservadores, porque são cepas consideradas
seguras ou reconhecidamente seguras GRAS– do inglês Generally
Recognized as Safe), principalmente as do gênero Lactobacillus
(Oliveira 2002). Estas cepas têm como produto final ácido láctico,
ácidos orgânicos, bacteriocinas e peróxido de hidrogênio que atuam
como bioconservadores, alterando as propriedades intrínsecas de
alimentos e inibindo microrganismos deteriorantes (Deegan et al. 2006).
As bacteriocinas são produzidas por varias bactérias Gram-negativas e
Gram-positivas, mas as produzidas pelas bactérias ácido lácticas são as
mais utilizadas pela indústria de alimentos, por serem consideradas mais
seguras (Parada et al. 2007). Os Lactobacillos dominam a microbiota de
muitos alimentos fermentados durante o armazenamento, bem como a
microbiota intestinal humana e animais (Rodríguez 2010), sendo aptos
para consumo humano (De Vuyst et al. 2008).
No caso específico da carcinicultura, a conservação do alimento
com bactérias ácido lácticas pode ser uma importante janela sanitária,
eliminando bactérias patogênicas do gênero Vibrio, que são comumente
encontradas em lulas e mexilhões (Prado et al. 2010). Poderiam ainda
eliminar uma possível contaminação viral, como a do vírus da mancha
branca (WSSV, do inglês White Spot Sindrome Virus), que é sensível a
baixos valores de pH (Chang et al. 1998).
Adicionalmente, o uso das bactérias ácido lácticas na conservação
do alimento pode ter efeito probiótico. Diversos estudos demonstram os
benefícios do uso de probióticos na carcinicultura marinha, melhorando
o balanço da microbiota intestinal (Vieira et al. 2008; Ling et al. 2009),
a sobrevivência (Vieira et al. 2007; Vieira2010), resistência a infecção
por patógenos ( Chiu et al., 2007; Vieira et al. 2007, 2008, 2010),
imunoestimulação (Gullian et al. 2004; Chiu et al. 2007; Tseng et al.
2009) e digestibilidade da dieta (Buglione 2009).
O objetivo deste trabalho foi avaliar a conservação do mexilhão
fresco, utilizado na alimentação de reprodutores de camarões marinhos,
com o uso de lactobacillus plantarum embalado a vácuo e
armazenamento a 4°c, sob a atratividade, consumo e as condições da
microbiota intestinal de camarões marinhos litopenaeus vannamei.
8
MATERIAL E METODOS
Os estudos foram realizados no Laboratório de Camarões
Marinhos (LCM) da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC),
nos setores de maturação e microbiologia.
33
8.1
Material biológico
Foram utilizados camarões da espécie Litopenaeus vannamei
(Bonne, 1931) do banco de reprodutores do LCM, proveniente de
linhagem livres de patógenos específicos (SPF, Specific Pathogen Free)
da empresa Genearch e mantidos em sistemas de cultivos superintesivos
de bioflocos do LCM.
Foram utilizados mexilhões frescos da espécie Perna perna
(Linnaeus, 1978), obtidos no cultivo experimental do Laboratório de
Moluscos Marinhos da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC),
situado na praia da Ponta do Sambaqui, Baía Norte da Ilha de Santa
Catarina (27 graus 29' 18"S e 48 graus 32' 12"W).
A cepa da bactéria ácido láctica Lactobacillus plantarum
(CPQBA 007 07 DRM01) foi utilizada como probiótico. Esta bactéria
foi isolada de camarões adultos de L. vannamei (Vieira et al. 2007) e
mantida no cepário do setor de microbiologia do LCM da UFSC, a 20°C em meio de cultura Man, Rogosa e Sharpe (MRS) suplementada
com 25% de glicerol.
8.1.1
Avaliação da conservação de mexilhão com L. plantarum
Inicialmente foi preparado o inóculo de L. plantarum. Para isto, a
bactéria foi repicada em meio de cultura líquido MRS suplementado
com 3% de NaCl por 24 h a 35 °C, atingindo a concentração de 109
unidades formadoras de colônia (UFC) por mL.
Para conservação do alimento fresco (mexilhão), foram utilizados
frascos de vidro de 500 mL, onde 500 g do alimento fresco foram
imersas com o inóculo de L. plantarum, permanecendo 6h a temperatura
ambiente (28 °C). Após esse procedimento, foi retirado o excesso de
inóculo de bactéria e o alimento foi acondicionado em 72 sacos plásticos
com 10 g cada, selados a vácuo. Metade dos sacos foram estocados a
4°C e a outra metade congelados a -18°C. Para controle, mexilhões
foram acondicionados em 36 sacos plásticos com 10 g cada (sem adição
da bactéria), embalados a vácuo e armazenados em duas condições
diferentes, a 4 °C e a -18 °C
As análises microbiológicas dos alimentos foram realizadas nos
dias 1, 7, 15, 30, 45 e 60 após o processamento. Para cada dia de
avaliação as diferentes amostras foram processadas em triplicata.
8.1.2
Análises microbiológicas
Foi retirada 1g de cada amostra, macerada em almofariz e diluída
serialmente (1/10) em solução salina estéril (SSE) 3% de NaCl até a
34
diluição 10-8. As diluições foram semeadas em meio de cultura para
bactérias heterotróficas totais (Agar Marine), Vibrio spp (Agar
Tiossulfato Citrato Bile Sacarose - TCBS) e bactérias ácido lácticas
(Agar MRS, De Man, Rogosa e Sharpe). A contagem de unidades
formadoras de colônia (UFC) foi realizada 24h após incubação a 30°C
para os meios Agar Marine e Agar TCBS e 35 °C após 48h para MRS.
8.2
Análise de atratividade do alimento
Para o teste da atratividade foram comparadas duas dietas:
mexilhão armazenado a -18°C e mexilhão conservado com L.
plantarum, a vácuo e conservado a 4°C (preparado da mesma forma
descrita no item 8.1.1).
A atratividade das duas amostras de dietas foram avaliadas
segundo a metodologia descrita por Nunes et al. (2006), através do
labirinto em Y, utilizando um aquário de vidro com formato em Y com
as seguintes medidas: 1,3 m x 0,3 m x 0,4 m (comprimento x largura x
altura). Os camarões (24±1,47 g) utilizados para análise da atratividade
foram mantidos em um tanque de seis toneladas, com temperatura (2829°C), salinidade (30-35 ‰), oxigênio dissolvido (acima de 5 mg/L) e
pH (7,5-8). Para estimular à resposta mais rápida a alimentação, os
camarões foram deixados 24 h em jejum antes da análise.
O comportamento dos camarões foi avaliado de três formas,
descritas por Nunes et al. (2006): tempo de detecção, tempo de
orientação/locomoção e atividade de alimentação. Quando a dieta
escolhida era consumida, era classificada como escolha positiva, e
quando havia recusa da dieta era contabilizada como rejeição. Os
números de escolhas positivas foram calculados em porcentagem para
realizar uma comparação final para cada dieta.
A cada análise, toda água do aquário era trocada para evitar
influência de algum nutriente ou resto da dieta que possivelmente
pudesse estar presente. Posteriormente, as duas dietas testadas foram
oferecidas separadamente em quantidades idênticas (2 g), colocadas
individualmente no perímetro dos braços do labirinto em Y. Antes das
avaliações comportamentais, o camarão foi estocado por 10 min em uma
câmara de aclimatação para permitir a adaptação ao sistema. No total foi
realizados de 33 testes (um camarão por teste). No caso da não detecção
do camarão no tempo limite (sete minutos), o espécime de camarão era
trocado.
35
8.2.1 Análise do consumo do alimento e da microbiota do trato
intestinal
O teste do consumo do alimento foi realizado em seis aquários de
50 L estocados com quatro camarões (24±1,47g). Foram avaliadas as
duas dietas descritas no item 8.2.1, em triplicata.
A alimentação foi realizada duas vezes ao dia (9 h e 15 h), na
proporção de 6% da biomassa de camarões. Passada 1 h do
fornecimento do alimento foram coletadas as sobras e congeladas a -18
°C. As coletas foram realizadas durante sete dias. Para determinação do
peso seco, as amostras foram colocadas em estufa a 105 °C até
atingirem peso constante, aproximadamente 27 h. O consumo do
alimento foi calculado pela fórmula “Ingestão de alimento por hora”,
descrita por Cortes et al. (1999).
Onde:
L = Ingestão de alimento por hora
Mi = Peso do alimento seco inicial
Mf = Peso do alimento seco final
Mp = peso do alimento seco dissolvido em água
T = Tempo do alimento decorrido na água
Após o período de consumo os camarões ainda foram mantidos
com seus respectivos tratamentos até o 18º dia de alimentação.
Posteriormente o trato digestivo de 24 camarões (12 para cada
tratamento) foram extirpados, pesados e homogeneizados em um gral e
diluídos serialmente em SSE 3% de NaCl (1/10). Foram semeados em
meio de cultura da mesma forma descrito no item 8.1.2.
8.3
Análise estatística
Os valores das contagens bacterianas foram transformados para
log10 (x+1) antes de serem analisadas. Os dados foram submetidos à
análise de Bartlett, para verificar a homocedasticidade dos dados.
Posteriormente, os dados de conservação dos alimentados foram
submetidos à ANOVA unifatorial com parcelas subdivididas no tempo
suplementada pelo teste Tukey de separação de médias. Já os dados do
consumo do alimento e da microbiota do trato intestinal foram
analisados pelo teste t-Student. Para porcentagens de escolha e rejeição
do alimento foi usado os teste do Qui-quadrado, enquanto que os tempos
36
de detecção, locomoção e alimentação foram analisados pelo teste tStudent. Todos os testes foram realizados com nível de significância de
5%.
9
RESULTADOS E DISCUSSÃO
9.1
Avaliação da conservação de mexilhão com L. plantarum e
análises microbiológicas
Nesta análise foi observado que a partir do dia sete, os mexilhões
conservados com L. plantarum (independente da temperatura de
conservação) apresentaram contagem superiores de bactérias ácidolácticas em relação aos controles (Tabela 1).
Para contagem de bactérias heterotróficas totais, até o dia 30 não
foi observada diferença nos mexilhões dos diferentes tratamentos
(p≥0,05). Nos dias 45 e 60, os mexilhões conservados com L. plantarum
a -18°C apresentaram menor contagem de bactérias totais heterotróficas
(p<0,05) em relação aos mexilhões sem L. plantarum.
Para contagem de Vibrio spp. no dia sete foi possível observar
diferença (p<0,05) do mexilhão conservado com L. plantarum a -18 °C
em relação aos demais tratamentos. Porém, a partir do dia 15 os
mexilhões conservados com L. plantarum independente da temperatura
de conservação, apresentaram menor contagem de Vibrio spp. em
relação aos mexilhões sem a bactérias acido lática.
A maior contagem de bactérias ácido lácticas nos mexilhões
conservados com L. plantarum indicam que estas bactérias se
mantiveram viváveis no mexilhão. Este grupo de bactérias são utilizadas
como bioconservadoras, por melhorarem a qualidade sensorial, cor e
textura do alimento, através da diminuição do pH do alimento e
produção de bacteriocinas, ácidos orgânicos e peróxido de hidrogênio,
que possuem ação bacteriostática ou bactericida (Gatesoupe 1999 e
Fadda et al. 2010).
Estas substâncias devem estar relacionadas à redução da
contagem de bactérias heterotróficas totais nos mexilhões conservados
com L. plantarum a -18°C e da menor contagem de Vibrio spp. nos
mexilhões conservados com L. plantarum, independente da temperatura
de conservação.
Rodríguez (2010) no estudo com a conservação de carne de
hambúrguer com cepas de bactérias ácido lácticas, conclui que as cepas
das bactérias foram eficiente, responsável pela diminuição de pH na
carne
tento um efeito inibitório contra patógenos e são
37
bioconservadoras. Adicionalmente, Souza et al. (2006) em estudo da
atividade antimicrobiana do Lactobacillus sakei na fermentação do
bonito-de-barriga-listrada (Euthynnus pelamis). Os autores concluíram
que, com 21 dias de incubação, quando a contagem das bactérias
lácticas atingiu valores entre 108 a 109 UFC g-1, as bactérias
deterioradoras apresentaram uma redução (de quatro ciclos logaritmos),
o que mostrou o efeito antagônico da cepa L. sakei. que, durante a
fermentação, com auxílio da glicose, a cepa demonstrou eficiência na
redução do pH e aumento da acidez com a produção de ácido láctico.
Estes resultados sustentam a hipótese que o pH baixo (3,8) e a produção
de compostos antimicrobianos da bactéria L. plantarum conservaram o
mexilhão fresco, o que não ocorreu com os mexilhões que não levaram
bactéria.
Neste estudo, observou-se que o mexilhão pode ser conservado
com L. plantarum, a vácuo e armazenado a 4°C, por um período de 60
dias. Este método de conservação pode ser vantajoso para laboratórios
comerciais de reprodução de camarões, em relação a conservação a 18°C. Isto porque uma vez que o alimento não sofre o processo de
congelamento, evita-se a formação de cristais de gelo, que durante o
descongelamento, podem causar danos aos tecidos dos alimentos. Estes
danos provocam a exsudação e perda de líquidos, redução no valor
nutricional, alteração na textura e aparência dos alimentos
(CORDEIRO, 2005). Adicionalmente, a conservação do alimento a 4°C
reduz o custo energético em relação a conservação a -18°C.
Tabela 1: Resultado da contagem de bactérias ácido lácticas, bactérias heterotróficas totais e Vibrio spp em mexilhões
conservados com Lactobacillus plantarum, selado a vácuo e conservado a 4°C (L plantarum + 4°C), mexilhões selados a vácuo e
conservado a 4°C (Controle + 4°C), mexilhão selado a vácuo e congelado a - 18°C (Controle -18°C) e mexilhão com
Lactobacillus plantarum, selado a vácuo e conservado a -18°C (L. plantarum -18°C), durante 60 dias.
Contagem de bactérias ácido lácticas em meio agar MRS (log UFC/g)
Tratamento
Dias da análise
1
7
15
30
45
60
L. plantarum + 4°C
8,08±0,21a
8,09±0,15a
7,94±0,03a
7,43±0,38a
7,29±0,49a
6,62±0,33b
Controle + 4°C
3,72±0,12b
2,39±0,09b
2,74±0,26b
3,19±0,59b
2,39±0,09c
3,15±1,93a
b
a
a
a
a
L. plantarum -18°C
4,66±0,26
7,76±0,28
7,76±0,28
7,80±0,76
7,40±0,17
6,87±0,15b
c
b
c
b
b
Controle -18°C
2,15±0,15
2,15±0,15
0,00±0,00
3,40±0,35
4,35±0,17
3,08±0,46a
Contagem de bactérias heterotróficas totais em meio agar Marine (log UFC/g)
Tratamento
Dias da análise
1
7
15
30
45
60
L. plantarum + 4°C
4,97±2,57a
5,15±1,20a
2,95±2,59a
2,90±2,59ab
4,43±1,50bc
3,51±3,04a
Controle + 4°C
6,79±3,08a
7,05±2,42a
5,76±0,11a
5,68±3,38a
5,70±3,39a
9,05±2,95a
a
a
a
a
b
L. plantarum -18°C
4,33±1,84
4,14±1,25
4,36±0,14
4,12±1,05
0,00±0,00
0,00±0,00c
a
a
a
a
a
Controle -18°C
2,86±0,42
5,95±2,88
5,32±0,17
4,81±3,44
4,38±0,74
8,46±1,89ab
Contagem de Vibrio spp meio agar tiossulfato citrato bile sacarose (log UFC/g)
Tratamento
Dias da análise
1
7
15
30
45
60
L. plantarum + 4°C
4,45±1,55ab
2,38±0,43a
0,77±1,33b
0,00±0,00c
0,00±0,00b
0,00±0,00b
Controle + 4°C
4,33±1,25a
3,65±2,31a
2,65±1,33b
2,30±1,91a
2,30±1,91a
5,14±1,52a
ab
b
b
c
b
L. plantarum -18°C
4,30±1,15
0,00±0,00
1,00±0,30
0,00±0,00
0,00±0,00
0,00±0,00b
b
a
a
a
a
Controle -18°C
2,87±0,97
3,56±1,45
4,63±2,17
5,34±1,57
3,83±2,00
3,09±2,00a
Letras diferentes indicam diferença significativa pelo teste tukey de separação de médias (p<0,05).
38
39
9.2
Análise de atratividade e consumo do alimento
Das 33 observações feitas no teste de atratividade, as três formas
de comportamento do camarão (tempo de detecção, tempo de
orientação/locomoção e atividade de alimentação) não apresentaram
diferença (p≥0,05) em relação às duas dietas oferecidas (mexilhão
conservado com L. plantarum, embalado a vácuo e conservado a 4°C e
mexilhão armazenado a -18°C). Contudo os tempos para os mexilhões com
L. plantarum foram de 83; 384 e 552 segundos, respectivamente para
detecção, locomoção e alimentação. Enquanto que para os mexilhões
não suplementados os tempos foram de 144; 338 e 577 segundos.
As porcentagens de escolha também não apresentaram diferenças
significativas (p≥0,05), com porcentagem para o mexilhão com L.
plantarum de 37% de escolha e 63% de escolha para mexilhão sem L.
plantarum. Já o consumo dos mexilhões acondicionados de diferentes
formas, com ou sem adição de bactéria acido lática, também não
mostrou diferenças significativas (p≥0,05). Os camarões apresentaram
um consumo de mexilhões de (0,53 ± 0,21g) a (0,69 ± 0,19g) da
biomassa de camarão ao dia.
Os testes da atratividade e do consumo demonstraram que o
camarão L. vannamei não teve preferência por nenhuma das duas dietas
oferecidas, o que é um resultado bom. Alguns trabalhos relatam que a
presença de alguns ácidos orgânicos ou seus sais, que são comumente
produzidos pelas bactérias ácido láticas, quando suplementados nas
dietas de camarões marinhos podem alterar a atratividade desta (Silva et
al. 2013), como por exemplo o butirato pode causar efeito atrativo e o
acetato pode causar efeito repulsivo em relação a uma dieta sem adição
de ácidos orgânicos. Contudo, esta alteração não foi observada neste
trabalho, sendo um resultado positivo para este trabalho.
9.3
Análise da microbiota do trato intestinal
A contagem de bactérias ácido lácticas do trato intestinal dos
camarões alimentados com mexilhão, conservado com L. plantarum a
4°C foi superior (p<0,05) ao comparar com o grupo alimentado com
mexilhão armazenado a -18°C (Figura 1). Já para contagem de Vibrio
spp foi inferior (p<0,05) nos camarões alimentados com mexilhão
conservado com L. plantarum a 4°C (Figura 1). Para a contagem de
bactérias heterotróficas totais no trato intestinal dos camarões, não
houve diferença (p≥0,05) entre os grupos experimentais (Figura 1).
O maior número de bactérias ácido lácticas encontradas no trato
intestinal dos camarões alimentados com mexilhão, conservado com L.
40
plantarum a 4°C, indica que bactéria L. plantarum tem a capacidade de
se manter viável no trato intestinal do camarão. A redução na contagem
de Vibrio spp. no trato intestinal dos camarões alimentados com
mexilhões conservados com L. plantarum pode ser devido à
característica do L. plantarum em produzir substâncias antimicrobianas
(Deegan et al., 2006). Resultados semelhantes de modificação da
microbiota intestinal de camarões (L. vannmei) com uso de ração
suplementada com L. plantarum já foram relatados (Vieira et al. 2007,
2008; Jatobá et al. 2008; Vieira 2010; Ramirez 2011). Prado et al.
(2010), relata dos poucos experimentos feitos com probióticos na
larvicultura de bivalves diminui a concentração de alguns Vibrio spp.
Nestes trabalhos, foi demonstrado que o L. plantarum possui ação
probiótica no camarão, melhorando os parâmetros imunes e a resistência
a infecção por patógenos (Vibrio spp). Assim, sugere-se o oferecimento
do alimento fresco (mexilhão) conservado com L. plantarum, é eficiente
na conservação do mexilhão, possui ação probiótico no hospedeiro pelo
aumento a resistência frente a V. alginolyticus, V. harveyi e diminuí a
concentração dos Vibrio spp (Chiu et al. 2007; Vieira et al. 2007, 2008;
Jatobá et al. 2008; Buglione 2009; Vieira, 2010; Ramírez 2011).
Figura 1. Contagem de bactérias ácido lácticas, bactérias heterotróficas totais e
contagem de Vibrio spp. no trato intestinal dos camarões alimentados com
mexilhão conservado com L. plantarum, embalado a vácuo e estocado a 4°C (L.
plantarum + 4°C) e com mexilhão armazenado a -18°C (Sem L. plantarum 18°C). Letras diferentes indicam diferenças entre os tratamentos na coluna pelo
teste de Tukey de separação de média (p<0,05).
41
10
CONCLUSÕES
1.
O mexilhão fresco pode ser conservado com o uso de
Lactobacillus plantarum, selado a vácuo e armazena a 4ºC por um
período até 60 dias, sem alterar a atratividade e o consumo do alimento
para reprodutores de camarões da espécie Litopenaeus vannamei.
2.
O uso da bactéria L. plantarum na conservação do mexilhão
utilizado para alimentação, modifica a microbiota intestinal do camarão
L. vannamei, aumentando o número de bactérias ácido lácticas e
diminuindo o de Vibrio spp., melhorando assim a saúde intestinal do
camarão.
11
AGRADECIMENTOS
Ao projeto SOED, pela bolsa concebida. Ao Laboratório de
Moluscos Marinhos, em especial a Profa. Dra. Aimê Rachel Magenta
Magalhães, pelo fornecimento dos mexilhões utilizados no experimento.
Ao Ministério da Pesca e Aquicultura pelo apoio financeiro.
12
REFERENCIAS DO ARTIGO
Andreatta ER, Beltrame E. Cultivo de camarões marinhos. In. Poli, C.R.
et al. Aqüicultura: experiências brasileiras. Multitarefa Editora Ltda;
2004. 456p.
Balcazár JL, Rojas – luna T, Cunningham DP. Effect of the addition of
four potential probiotic strains on the survival of pacific white shrimp
(Litopenaeus vannamei) following immersion challenge with Vibrio
parahaemolyticus. J. Invertebr. Pathol. 2007; 96: 147–150.
Boyd CE, Massaut L. Risks associated with the use of chemicals in
pond aquaculture, Aquaculture. 1999; 20: 13-132.
Buglione, CC. Avaliação do coeficiente de digestibilidade aparente da
proteína, energia e matéria seca em ração comercial suplementada com
probiótico para Litopennaeus vannamei (Mestrado em Aquicultura).
Florianópolis: Universidade Federal de Santa Catarina; 2009.
Chang P, Chen L, Wang Y. The effect of ultraviolet irradiation, heat,
pH, ozone, salinity and chemical disinfectants on the infectivity of white
spot syndrome baculovirus. Aquaculture. 1998; 166: 1-17.
42
Chiu, CH, Guu YK, Liu CH, Pan TM, Cheng W. Immune responses and
gene expression in white shrimp, Litopenaeus vannamei, induced by
Lactobacillus plantarum. Fish Shellfish Immunol.2007; 23: 364-377.
Coman GJ. Effect of two maturation diet combinations on reproductive
performance of domesticated Penaeus monodon. Aquaculture. 2007;
263: 75-83.
Cordeiro D. Qualidade do mexilhão Perna perna submetido ao processo
combinado de cocção, congelemento e armazenamento. Dissertação
(Mestrado em Ciências e Tecnologia de Alimento). Piracicaba, Escola
Superior de Agricultura Luiz de Queiroz: Universidade de São Paulo;
2005.
Cortes PH, Seiffert WQ, Toro MAN, Portillo G, Colado G, Carreño
FLG. Rate of ingestion and proteolytic activity in digestive system of
juvenile white shrimp, Penaeus vannamei, during continual feeding. J.
Appl. Aquac. 1999; 9: 35-45.
De Vuyst L. Technology Aspects Related to the Application of
Functional Starter Cultures. Food Technol. Biotechnol. 2000; 38: 105–
112.
Deegan, LH, Paul D. Cotter PD, Hilla C, Ross P. Bacteriocins:
Biological tools for bio-preservation and shelf-life extension.
International Dairy Journal. 2006; 16: 1058-1071.
Fadda, S, López C, Vignolo G. Role of lactic acid bacteria during meat
conditioning and fermentation: Peptides generated as sensorial and
hygienic biomarkers. Meat Science. 2010; 86: 66-79.
FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations). Status
of World Fisheries and Aquaculture , Roma SOFIA. 2004; 3-7.
FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations). Status
of World Fisheries and Aquaculture , Roma SOFIA. 2012; 25 -37.
Flor HR. Desempenho reprodutivo do camarão-rosa Farfantepenaeus
brasiliensis (Latreille, 1817) (Crustacea, Decapoda, Penaeidae) em
cativeiro: Efeito da alimentação e proporção sexual. (Mestrado em
Zootecnia). Seropédica, Instituto de Zootecnia: Universidade Federal
Rural do Rio de Janeiro; 2009.
43
Franco BDGM, Martins ECP, Todorov SD. Bioconservação de produtos
lácticos probióticos e não probióticos empregando bacteriocinas de
bactérias láticas e bifidobácterias. In: Saad SMI, Cruz AG, Faria JAF.
Probióticos e prebióticos em alimentos. São Paulo: Varela; 2011. p.
121-140.
Gonçalves A. Hematologia e macrófagos policariontes em Colossoma
macropomum, mantidos em duas densidades de estocagem, alimentados
com dieta contendo probiótico e espirulina. (doutorado em Aquicultura).
Jaboticabal, Centro de Aquicultura, Universidade Estadual Paulista;
2009.
Gullian M, Thompson F, Rodriguez J. Selection of probiotic bacteria
and study of their immunostimulatory effect in Penaeus vannamei
Aquaculture. 2004: 233; 1 –14.
Jatobá A, Vieira FN, Neto CB, Silva BC, Mouriño JLP, Jerônimo GT,
Dotta G, et al. Utilização de bactérias ácido-lácticas isoladas do trato
intestinal de tilapia‑do‑nilo como probiótico. Pesq. agropec. bras.
2008: 43; 1201-1207.
Ling Z, Mai K, Tan B, Ai Q, Qi C, Xu W, et al. Effects of Dietary
Administration of Probiotic Halomonas sp. B12 on the Intestinal
Microflora, Immunological Parameters, and Midgut Histological
Structure of Shrimp, Fenneropenaeus chinensis, J. World Aquac. Soc.
2009: 40; 58-66.
Nunes AJP, Sá MVC, Andriola-Neto FF, Lemos D. Behavioral response
to selected feed attractants and stimulants in Pacific white shrimp,
Litopenaeus vannamei. Aquaculture. 2006: 260; 244-254.
Oliveira MN, Sivieri K, Alegro JHA, Saad SMI. Aspectos tecnológicos
dos alimentos funcionais contendo probióticos. Rev. Bras. Cienc. Farm.
2002; 38:1-21.
Parada JL, Caron CR, Medeiros ABP, Rucardo C. Bacteriocins from
Lactic Acid Bacteria: Purification, Properties and use as
Biopreservatives. Braz Arch Biol Technol. 2007; 50: 521-542.
Pietrasik Z, Janz JAM. Influence of freezing and thawing on the
hydration characterisitics, quality, and consumer acceptance of whole
44
muscle beef injected with solutions of salt and phosphate. Meat Science.
2008; 81: 523-532.
Prado S, Romalde JL, Braja JL. Review of probiotics for use in bivalves
hatcheries. Vet. Microbiol. 2010; 145: 187-197.
Ramírez NC. Avaliação de uso de probióticos, prebióticos e simbióticos
na microbiota intestinal de Litopnaeus vannamei. (mestrado em
Aquicultura). Florianópolis, Centro de Ciências Agrárias: Universidade
Federal de Santa Catarina; 2011.
Rengpipat S, Phianphak W, Piyatiratitivorakul S, Menasveta P.
Immunity enhancement in black tiger shrimp (Penaeus monodon) by a
probiont bacterium (Bacillus S11), Aquaculture. 2000: 191;271-288.
Rodríguez CM. Bioconcervación cárnico de cerdo com bacterias ácidos
lácticas. (mestrado em engenharia de alimentos). Cali, Facultad
Ingenieria: Universidad Del ValleFaculdade; 2010.
Santo MLPE. Avaliação da atividade bacteriocinogênica do
Lactobacillus sakei na fermentação da sardinha-verdadeira (Sardinella
brasiliensis) utilizando glicose como carboidrato fermentecível. Boletim
do CEPPA, Curitiba. 2003: 21; 83-98.
Schulz U, Pereira MA, Bonelli RR, Nunes MM, Batista CRV.
Enhancement of vibriosis resistance in juvenile Penaeus Íannamei by
supplementation of diets with different yeast products. Aquaculture.
1999: 176; 271-283.
Silva BC, Vieira FN, Mouriño JLP, Ferreira GS, Seiffert WQ. Salts of
organic acids selection by multiple characteristics for marine shrimp
nutrition. Aquaculture. 2013: 384; 104–110.
Souza J. Atividade antimicrobiana do Lactobacillus sakei na
fermentação do bonito-de -barriga - listrada (Euthynnus pelamis). Vetor,
Rio Grande. 2006: 16; 25-36, 2006.
Ringo E, Gatesoupe FOJ. Lactic acid bacteria in fish: a review,
Aquaculture. 1998: 160; 177–203.
Tseng DY, Ho PL, Huang SY, Cheng SC, Shiu YL, Chiu CS, et al.
Enhancement of immunity and disease resistance in the white shrimp,
45
Litopenaeus vannamei, by the probiotic, Bacillus subtilis E20. Fish &
Shellfish Immunology. 2009: 26; 339–344.
Kawahigashi DK. Overview of commercial maturation technology in
the western hemisphere. In: Recife In: Recife Brasil LAC WAS
Conference proceedings. Anais de aquicultura, Brasil: 1998; 381-392.
Vieira FN, Pedrotti FS, Neto CCB, Mouriño JLP, Beltrame E, Martins
ML, et al. Lactic-acid bactéria increase the survival of marine shrimp,
Litopenaeus vannamei, after infection with Vibrio harveyi. Braz. j.
oceanogr. 2007: 55; 251-255.
Vieira FN, Neto CCB, Mouriño JLP, Jatobá A, Ramirez C, Martins ML,
Barracco MAAM, et al. Time-related action of Lactobacillus plantarum
in the bacterial microbiota of shrimp digestive tract and its action as
inmunostimulation. Pesq. agropec. Bras. 2008: 43; 763-769.
Vieira FN. Seleção e utilização de bactérias probióticas na carcinicultura
marinha.(doutorado em Aquicultura). Florianópolis, Centro de Ciências
Agrárias: Universidade Federal de Santa Catarina; 2010.
46
13
REFERENCIA DA INTRODUÇÃO
AL-DOHAIL, M.A., , R., ALIYU-PAIKO, M. Evaluating the use of
Lactobacillus acidophilus as a biocontrol agent against common
pathogenic bacteria and the effects on the haematology parameters and
histopathology in African catfish Clarias gariepinus juveniles.
Aquaculture Research. v. 42, p. 196-209, 2011.
ANDREATTA, E.R.; BELTRAME, E. Cultivo de camarões marinhos.
In. Poli, C.R. et al. Aqüicultura: experiências brasileiras.
Florianópolis: Multitarefa Editora Ltda, 2004. 456 p.
ARANA, L.V.Fundamentos de Aqüicultura. Florianópolis: Editora da
UFSC, 2004. 348 p.
ANANDRAJ, A. et al. Metal accumulation, filtration and O2 uptake rates
in the mussel Perna perna (Mollusca: Bivalvia) exposed to Hg2+, Cu2+
and Zn2+. Comp Biochem Physiol Part C. v 132 p. 355-363, 2002.
BALCÁZAR, J.L. et al. The role of probiotics
aquaculture.Veterinary Microbiology. v. 114, p. 173–186, 2006.
in
BALCAZÁR, J.L.; ROJAS – LUNA, T.; CUNNINGHAM, D.P. Effect
of the addition of four potential probiotic strains on the survival of
pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) following immersion
challenge with Vibrio parahaemolyticus. Journal of Invertebrate
Pathology. v. 96, p.147–150, 2007.
BEVILACQUA, M.D`AMORE, A.; POLONARA, F. A multi-criteria
decision approach to choosing the optimal blanching-freezing system,
Journal of Food Engeneering. v. 63, p. 253-263, 2004.
BOYD, C.E.; MASSAUT, L. Risks associated with the use of chemicals
in pond aquaculture, Aquaculture. v. 20 p. 13-132, 1999.
BRAY, W.A., LAWRENCE, A.L., LESTER, L.J., Reproduction of
eyestalk-ablated Penaeus stylirostris fed various levels of total dietary
lipid. J. World Aquacult. Soc. v. 21, p. 41–52, 1990b.
BROWDY, C.L. A review of the reproductive biology of Penaeus
species: perspectives on controlled shrimp maturation systems for high
quality nauplii production.Proceeding of the Special Session on Shrimp
Farming. World Aquaculture Society. 1992.
47
BRONDY, C.L. Recent developments in penaeid broodstock and seed
production technologies: improving the outlook for superior captive
stocks. Aquaculture, v 164, p. 3-21, 1998.
BUGLIONE, C.C. Avaliação do coeficiente de digestibilidade
aparente da proteína, energia e matéria seca em ração comercial
suplementada com probiótico para Litopennaeus vannamei. 2009.
Dissertação (Mestrado em Aquicultura), Universidade Federal de Santa
Catarina, Florianópolis, 2009.
CARNEVALI, O. et al. Growth improvement by probiotic in European
sea bass juveniles (Dicentrarchus labrax, L.), with particular attention to
IGF-1, myostatin and cortisol gene expression. Aquaculture. v. 258, p.
430–438, 2006.
CARR, F. L.; CHILL, D.; MAIDA, N. The latic acid bacteria: A
literature survey. Critical Reviews in Micribiology, v,28, n.4, p.281370,2002.
CARVALHO, F.G. ; ANDREATTA, E.R.; FRACALOSSI, D.M.
Avaliação de gônadas de peixe marinho e da biomassa de Artemia sp.
como itens alimentares sobre o desempenho reprodutivo de Litopenaeus
vannamei. Bol.Inst.Pesca, São Paulo, v. 36. p.111-121,2010.
CARVALHO, J. A. L. V. Efeito do uso de bactérias probióticas na
sobrevivência de larvas de litopenaeus vannamei expostas à infecção
experimental por vibrio spp. 2011.51p. Dissertação (Mestrado em
Recursos Pesqueiros e Aquicultura). Departamento de Pesca,
Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, PE, 2011.
CHANG, P.;CHEN,L.; WANG,Y. The effect of ultraviolet irradiation,
heat, pH, ozone, salinity and chemical disinfectants on the infectivity of
white spot syndrome baculovirus. Aquaculture. v 166, p. 1-17.1998.
CHIU, C.H.et al. Immune responses and gene expression in white
shrimp, Litopenaeus vannamei, induced by Lactobacillus plantarum.
Fish Shellfish Immunol. v.23, p.364-377, 2007.
COMAN, G.J. Effect of two maturation diet combinations on
reproductive performance of domesticated Penaeus monodon.
Aquaculture. v 263, p. 75-83, 2007.
48
CORDEIRO, D. Qualidade do mexilhão Perna perna submetido ao
processo combinado de cocção, congelemento e armazenamento.
2005. 68p. Dissertação (Mestrado em Ciências e Tecnologia de
Alimento). Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz,
Universidade de São Paulo, Piracicaba, SP, 2005.
CORTES, P. H. et al. Rate of ingestion and proteolytic activity in digestive
system of juvenile white shrimp, Penaeus vannamei, during continual
feeding. Journal of Applied Aquaculture. v. 9, p. 35-45, 1999.
CRUZ, P. et al. Uso os probiotics in Aquaculture. ISRN Microbiolgy.
V. 2012, p.13, 2012.
DEEGAN, L.H. et al. Bacteriocins: Biological tools for bio-preservation
and shelf-life extension. International Dairy Journal, v16, p.10581071, 2006.
DOUILLET, P. A., LANGON, C.J. Use of a probiotic for the culture of
larvae of the Pacific oyster (Crassostrea gigas Thunberg).
Aquaculture. v.119, p. 25-40, 1994.
EVANGELICO, J. Tecnologia de alimentos. 2º edição. São Paulo:
Atheneu, 2001.652 p.
FADDA, S.; LÓPEZ, C.; VIGNOLO, G. Role of lactic acid bacteria
during meat conditioning and fermentation: Peptides generated as
sensorial and hygienic biomarkers. Meat Science. v.86, p.66-79, 2010.
FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations). Status
of World Fisheries and Aquaculture , Roma SOFIA, 2004 , 3-7 p.
FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations). Status
of World Fisheries and Aquaculture , Roma SOFIA, 2012 , 25 -37 p.
FARIAS, T. H. V. Probiótico na alimentação do pacu (Piaractus
mesopotamicus): avaliação hematológica, bioquímica, imunológica e
desempenho produtivo. Dissertação (Mestrado em Aquicultura).
Centro de Aquicultura da UNESP, Universidade Estadual Paulista,
Jaboticabal, SP, 2012.
FRANCO, B. D. G. M.; MARTINS, E. C. P; TODOROV, S. D.
Bioconservação de produtos lácticos probióticos e não probióticos
49
empregando bacteriocinas de bactérias láticas e bifidobácterias. In:
SAAD, S. M. I.; CRUZ, A. G.; FARIA, J. A. F. Probióticos e
prebióticos em alimentos. São Paulo: Varela, 2011, p. 121-140.
FRANCO, I. Isolamento, identificação e caracterização molecular de
bactérias candidatas a probióticos em organismos aquáticos. 2009.
67p. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos). Escola de
Medicina Veterinária, Universidade Federal da Bahia, Salvador, BA, 2009.
FLOR, H. R. Desempenho reprodutivo do camarão-rosa
Farfantepenaeus brasiliensis (Latreille, 1817) (Crustacea, Decapoda,
Penaeidae) em cativeiro: Efeito da alimentação e proporção sexual.
2009. 57p. Dissertação (Mestrado em Zootecnia). Instituto de
Zootecnia,Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica,
RJ, 2009.
FOOD INGREDIENTS BRASIL. Segurança alimentar, Nº 4, 2008.
Disponível em www.revista-fi.com acesso em 10-Out-2012.
FOOD INGREDIENTS BRASIL. Agentes antimicrobianos, Nº 15,
2010. Disponível em www.revista-fi.com acesso em 29-Out-2012.
FRANCO, I. Isolamento, identificação e caracterização molecular de
bactérias candidatas a probióticos em organismos aquáticos. 2009. 67p.
Dissertação (Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos). Escola de
Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia, Salvador, BA, 2009.
FULLER R.,Probiotics in man and animals, a review, J. Appl.
Bacteriol, v.66, p.365-378, 1989.
GALGANI, M.L.; AQUACOP. Influence du régime alimentaire sur la
reproduction em captivité de Penaeus vannamei and Penaeus
stylirostris. Aquaculture, v. 80, p. 97–109,1989a.
GASTESOUPE, F.J. The use of probiotics in aquaculture. Aquaculture,
v.180, p.147-165, 1999.
GAVA, ALTANIR JAIME. Princípios de Tecnologia de Alimentos. 1º
edição. São Paulo: Nobel , 2009. 512 p.
GHOSH, S. SINHA1 A. SAHU, C. Effect of probiotic on reproductive
performance in female livebearing ornamental fish. Aquaculture. v.38,
p. 518-526,2007.
50
GOMEZ-GIL, B. ROQUE, A.TURNBULL, J.F. The use and selection
of probiotic bacteria for use in the culture of larval aquatic organisms.
Aquaculture. v. 191, p. 259-270, 2000.
GONÇALVES, A. A. Estudos do processo de congelamento de
camarão associado ao uso de aditivo fosfato.2005. 170p. Tese
(doutorado em Engenharia de Produção). Escola de Engenharia,
Universidade Federal de Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, 2005.
GONÇALVES, A. Hematologia e macrófagos policariontes em
Colossoma macropomum, mantidos em duas densidades de
estocagem, alimentados com dieta contendo probiótico e espirulina.
2009. 79p. Tese (doutorado em Aquicultura). Centro de Aquicultura,
Universidade Estadual Paulista, Jaboticabal, SP, 2009.
GUARNER, F., SCHAAFSMA, G.J. Probiotics. International Journal
of Food Microbiology. v. 39, p.237–238, 1998.
GULLIAN, M. THOMPSON, F. RODRIGUEZ, J. Selection of
probiotic bacteria and study of their immunostimulatory effect in
Penaeus vannamei Aquaculture. v. 233, p.1 –14, 2004
HARRISON, K.E., The role of nutrition in maturation, reproduction and
embryonic development of decapod crustaceans: a review. Journal
Shellfish Research. v. 9, p. 1–28, 1990.
HOVE, H.; NORGAARD, H.; MORTENSEN, P. B. Lactic acid bacteria
and the humangastrointestinal tract. Europ. J. Clin. Nutr. v. 53, p.339350, 1999.
JATOBÁ, A. et al. Utilização de bactérias ácido-lácticas isoladas do trato
intestinal de tilápia-do-nilo como probiótico. Pesquisa Agropecuária
Brasileira. Brasília, v. 43, p.1201-1207, 2008.
JÚNIOR, R.C.B.; NETO, A.O. Camarões Marinhos- Engorda.
Viçosa: Aprenda Fácil Editora, 2002. 370 p.
LIMA, C.D.L.C.et al. Bactérias do acido láctico e leveduras associadas
com o queijo-de-minas artesanal produzido na região da Serra do
Salitre, Minas Gerais. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.61, n.1, p.266272, 2009.
51
LING, Z. et al. Effects of Dietary Administration of Probiotic
Halomonas sp. B12 on the Intestinal Microflora, Immunological
Parameters, and Midgut Histological Structure of Shrimp,
Fenneropenaeus chinensis, Journal of the World Aquaculture
Society, v.40, p. 58-66, 2009.
MAGALHÃES, M. E. S. Cultivo do camarão marinho Litopenaeus
vannamei (boone, 1931) em sistema multifásico.
2004. 60p.
Dissertação (Mestrado em Recursos Pesqueiros e Aqüicultura).
Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE, 2004.
MARTINS, P.C.C. Influencia das condições ambientais e das
técnicas do manejo de produção sobre a ocorrência de enfermidade
no cultivo de camarão marinho Litopenaeus vannamei, no Estado do
Ceará. 2003. Tese (Doutorado em Ciências) Centro de Ciências
Biológicas e da Saúde, Universidade Federal de São Carlos, São Paulo,
2003.
MORIARTY D.J.W. Control of luminous Vibrio species in penaeid
aquaculture ponds. Aquaculture. v. 164, p. 351–358, 1998.
MORTENSEN, S.H. Passage of infectious pancreatic necrosis virus
(IPNV) through invertebrates in an aquatic food chain. Dis. Aquat.Org.
v. 16, p. 41-45, 1993.
NAPPIER, S. P., GRACZYK, P.T., SCHWAB, K.J. Bioaccumulation,
Retention, and Depuration of Enteric Viruses by Crassostrea virginica
and Crassostrea ariakensis Oysters. Appl. Environ. Microbiol. v. 74,
p. 6825–6831, 2008.
NOMOTO, k. Review Prevention of Infections by Probiotics. J.
Biosci. Bioeng. v. 100, p. 583-592, 2005.
NUNES, A.J.P. et al. Behavioral response to selected feed attractants
and stimulants in Pacific white shrimp, Litopenaeus vannamei.
Aquaculture, v.260, p.244-254, 2006.
PAZ, M. F. Conservação de alimentos por microrganismos antagônicos.
NAPMA, v. 13, p. 24, 2001.
PEIXOTO, S., CAVALLI, R. O., WASIELESKY, W. Recent
developments on broodstock maturation and reproduction of
52
Farfantepenaeus paulensis. Brazilian Archives of Biology and
Technology. v. 48, p.997-1006, 2005.
PEIXOTO, S., WASIELESKY, W., CAVALLI, R. O. Broodstock
maturation and reproduction of the indigenous pink shrimp
Farfantepenaeus paulensis in Brazil: An updated review on research and
development. Aquaculture. v 315, p. 9-15, 2011.
PHIANPHAK, W. et al., Probiotic Use of Lactobacillus spp. For Black
Tiger Shrimp, Penaeus monodon. J. Sci. Res. Chula. Univ.v. 24, p. 4152, 1999.
POFFO, F., SILVA, M.A.C. Caracterização taxonômica e fisiológica de
bactérias ácido-láticas isoladas de pescado marinho. Cienc. Tecnol.
Aliment.v.31, p.303-307, 2011.
QUEIROZ, J., BOYD, C. Effects of a Bacterial Inoculum in Channel
Catfish Ponds. Journal of the World Aquaculture Society. v. 29, p.
67-73, 1998.
PRIMA VERA, 1. H. Indiced maturation and spawning in five-1l10nthold Penaeus monodon Fabricius by eyestalk ablation. Aquaculture. v.
13, p. 355-359, 1978.
RAMÍREZ, N.C. Avaliação de uso de probióticos, prebióticos e
simbióticos na microbiota intestinal de Litopnaeus vannamei.2011.56
p.Dissertação (mestrado em Aquicultura). Centro de Ciências Agrárias,
Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, SC, 2011.
REIS, L.G. Efeito da salinidade, densidade de estocagem e da
infecção hipodermal e necrose hematopoiética (IHHN) na
imunidade do camarão Litopenaeus vannamei cultivados em
fazendas do Rio Grande do Norte. 2004. 72p. Dissertação (Mestrado
em Ciências). Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN,
2008.
RENGPIPAT, S.et al. Immunity enhancement in black tiger shrimp
(Penaeus monodon) by a probiont bacterium (Bacillus S11),
Aquaculture, v.191, p.271-288, 2000.
RINGO, E.; GATESOUPE, F.O.J., Lactic acid bacteria in fish: a review,
Aquaculture, v.160, p.177–203, 1998.
53
SAAD, S. M. I.; BEDANI, R.; MAMIZUKA, E. M. Beneficios à saúde
dos probióticos e prebióticos. In: SAAD, S. M. I.; CRUZ, A. G.;
FARIA, J. A. F. Probióticos e prebióticos em alimentos. São Paulo:
Varela, 2011, p. 51- 84.
SANTOS, A. A. Sustentabilidade ambiental da criação de camarões
de água doce e uso de aguapé no tratamento dos efluentes. 2012.116
p. Tese (doutorado em Aquicultura). Centro de Aquicultura,
Universidade Estadual Paulista, Jaboticabal, SP, 2012.
SCHOLZ, U. et al. Enhancement of vibriosis resistance in juvenile
Penaeus Íannamei by supplementation of diets with different yeast
products. Aquaculture. v.176, p. 271-283,1999.
SCHREZENMEIR, J., VRESE, M. Probiotics, prebiotics, and synbiotics
- approaching a definition. Am J Clin Nutr. v. 73, -361-364, 2001.
SCHULZ, D. et al., Bacteriocinas: mecanismos de ação e uso na
conservação de alimento. Alim. Nutr., Araraquara, v.14, p.229-235,
2003.
SILVA, E. F. B. Utilização de probiótico (Bacillus spp.) na
larvicultura do camarão marinho Litopenaeus vannamei. 2010. 81p.
Dissertação (Mestrado em Recursos Pesqueiros e Aqüicultura).
Departamento de Pesca e Aqüicultura, Universidade Federal Rural de
Pernambuco, Recife, PE, 2010.
TSENG, D.Y.et al. Enhancement of immunity and disease resistance in
the white shrimp, Litopenaeus vannamei, by the probiotic, Bacillus
subtilis E20, Fish & Shellfish Immunology, v.26, p. 339–344, 2009
KAWAHIGASHI, D.K. Overview of commercial maturation
technology in the western hemisphere. In: Recife In: Recife Brasil LAC
WAS Conference proceedings. Anais de aquicultura, Brasil, 1998,
p.381-392.
UNEP (UNITED NATIONS ENVIRONMENT PROGRAMME).
Guidance for a Global Monitoring Programme for Persistent
Organic Pollutants, Inter-Organization Programme for the Sound
Management of Chemicals. Geneva, Switzerland, 2004, 45 p.
54
VASILJEVIC ,T. SHAH, N.P. Probiotics—From Metchnikoff to
bioactives. International Dairy Journal. v. 18, p. 714– 728, 2008.
VAZQUEZ-BOUCARD, C. et al.Detection of white spot syndrome
virus (WSSV) in the Pacific oyster Crassostrea gigas. Journal of
Invertebrate Pathology. v. 104, p. 245–247, 2010.
VENKAT, H. K.; SAHU, N. P.; JAIN, K. K. Effect of feeding
Lactobacillus-based probiotics on the gut microflora, growth and
survival of postlarvae of Macrobrachium rosenbergii (de Man).
Aquaculture Research. v. 35, p. 501-507, 2004.
VERSCHUERE, L. et al. Probiotic bacteria as biological control agents
in aquaculture. Microbiology and Molecular Biology Reviews, v. 64,
p. 655-671, 2000.
VIEIRA, F.N.et al. Lactic-acid bactéria increase the survival of marine
shrimp, Litopenaeus vannamei, after infection with Vibrio harveyi.
Brazilian Journal of Oceanography, v.55, p.251-255, 2007.
VIEIRIA, F.N. et al. Time-related action of Lactobacillus plantarum in
the bacterial microbiota of shrimp digestive tract and its action as
inmunostimulation. Pesquisa Agropecuária Brasileira. Brasília, v.43,
p.763-769, 2008.
VIEIRA, F. N. Seleção e utilização de bactérias probióticas na
carcinicultura marinha. 2010. 113p. Tese (doutorado em Aquicultura).
Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal de Santa Catarina,
Florianópolis, SC, 2010.
WANG, Y.; LI, J.; LIN, J. Probiotics in aquaculture: Challenges and
outlook. Aquaculture. v. 281, p. 1-4, 2008.
WOUTERS, R.et al. Penaeid shrimp broodstock nutrition: an updated
review on research and development. Aquaculture, v.202, p. 1-21,
2001.
55
ANEXO I:
Preparação do alimento fresco (mexilhão) com L. plantarum
56
ANEXO II:
Placas dos meios de cultura: a) MRS (Agar De Man, Rogosa e Sharpe); b)
Marine (Agar Marine); e c) TCBS (Agar Tiossulfato Citrato Bile Sacarose) no
60° dia de análise do mexilhão.
57
ANEXO III:
Aquário no formato de labirinto em Y, ilustração retirada por
NUNES et al, (2006). Modelo usada para realizar o teste de atratividade.
58
ANEXO IV: