CAMILA VIEIRA DA SILVA
Avaliação do efeito de Metarhizium anisopliae (Metsch) Sorokin
(Deuteromycotina: Hyphomycetes) e do extrato de óleo de Neem,
Azadirachta indica, em ovos de Diatraea saccharalis (Fabricius 1794)
(Lepidoptera: Crambidae) em condições laboratoriais.
Dissertação apresentada ao
Programa de Pós-graduação
em Ciências Biológicas (Área
de concentração - Biologia
Celular e Molecular) da
Universidade Estadual de
Maringá, para obtenção do
grau de Mestre em Ciências
Biológicas.
Maringá
Julho – 2008
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
(Biblioteca Central - UEM, Maringá – PR., Brasil)
S586a
Silva, Camila Vieira da
Avaliação do efeito de Metarhizium anisopliae
(Metsch) Sorokin (Deuteromycotina : hyphomycetes ) e do
extrato de óleo de Neem, Azadirachta indica, em ovos de
Diatraea saccharalis (Fabricius 1794 ) (Lepidoptera :
crambidae) em condições de laboratório / Camila Vieira
da Silva. -- Maringá : [s.n.], 2008.
52 f. : il. color.
Orientador : Prof. Dr. Hélio Conte.
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de
Maringá. Programa de Pós-graduação em Ciências
Biologicas, 2008.
1. Controle biológico - Cana-de-açúcar. 2. Extrato
de óleo de neem. 3. Metarhizium anisopliae - ovos de
Diatraea saccharalis. I. Universidade Estadual de
Maringá. Programa de Pós-graduação em Ciências
Biológicas.
Cdd 21.ed.633
CAMILA VIEIRA DA SILVA
Avaliação do efeito de Metarhizium anisopliae (Metsch) Sorokin
(Deuteromycotina: Hyphomycetes) e do extrato de óleo de Neem,
Azadirachta indica, em ovos de Diatraea saccharalis (Fabricius 1794)
(Lepidóptera: Crambidae) em condições laboratoriais.
Prof. Dr. HÉLIO CONTE
Orientador
BIOGRAFIA
Camila Vieira da Silva, nascida em São Paulo/SP em 26/10/1982. Possui graduação em
Ciências Biológicas pela Universidade Estadual de Maringá (2005). Teve como monografia
de conclusão de curso o trabalho intitulado: “Estudo da Parameiose em Isolados Selvagens
de Aspergillus nidulans”. Foi monitora das disciplinas de Biologia Celular e Genética
(2002-2004). Tem experiência na área de Genética de Microorganismos e Controle
biológico.
Atualmente está em fase de conclusão do mestrado em Ciências Biológicas,
área de concentração em Biologia Celular e Molecular, pela mesma instituição, trabalhando
com controle biológico da broca da cana-de-açúcar.
Expresso à minha mãe, de forma especial,
meu agradecimento por toda dedicação,
amor e apoio incondicional.
A Larissa pelo apoio e carinho em todos os
momentos.
AGRADECIMENTOS
À Deus por ser o Mentor de todos os meus atos e por ter possibilitado mais uma
conquista.
À minha mãe Albany e meu pai Rafael por contibuirem, cada um de sua maneira, para a
concretização de mais uma etapa.
À minha tia madrinha Alba por todo carinho e apoio, principalmente nas horas mais
difíceis.
À minha família como um todo pelo apoio e amor.
À Larissa Schneider pelo auxílio direto na realização de todo o trabalho.
Ao Professor Hermes por toda presteza, amizade e disposição em ajudar.
À Valéria Pereira Mendes pelos ensinamentos primordiais no campo da Biologia.
Aos colegas das disciplinas cursadas durante o Mestrado, pela amizade.
Aos colegas de laboratório, Bruno, Juliana e Elton por toda paciência e auxílio.
Aos professores e coordenadores do Curso de Pós-graduação em Ciências Biológicas pela
colaboração e ensinamentos ministrados.
Ao Prof. Dr. Hélio Conte pela acolhida, incentivo e solicitude com que sempre orientou.
Ao Prof. Dr. João Pamphile, pelo fornecimento das linhagens de fungos, disponibilidade
do uso do laboratório e auxílio na realização do trabalho.
À Coordenação de Aperfeiçoamento do Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo suporte
financeiro.
Às técnicas Maria Euride, Maria dos Anjos e Ana Paula do DCM, pela disponibilidade
de materiais para a realização das técnicas histológicas e o uso do Micrótomo.
Ao Prof. Dr. Kitajima, pelo ensinamento e pela disponibilidade do Microscópio
Eletrônico de Varredura, ESALQ/USP.
Aos colegas, Fábio e Daniela, pelo amparo e auxílio na realização das técnicas de
Microscopia Eletrônica de Varredura.
À Universidade Estadual de Maringá e o Programa de Pós-graduação em Ciências
Biológicas.
A todos que tenham contribuído de forma direta ou indireta para a realização deste
trabalho.
APRESENTAÇÃO
Esta dissertação é composta de dois artigos científicos:
1. “Mecanismo de infecção de Metarhizium anisopliae (Metsch) Sorokin
(Deuteromycotina; Hyphomycetes) e mortalidade em ovos, de diferentes idades, de
Diatraea saccharalis (Fabricius 1794) (Lepidoptera: Crambidae)” que descreve a ação de
duas linhagens de M. anisopliae, testada em laboratório, em ovos de D. saccharalis em
diferentes fases de seu desenvolvimento embrionário.
2. “Efeito inseticida do óleo de Neem, Azadirachta indica A. Juss., em ovos de
Diatraea saccharalis (Fabricius, 1794) (Lepidoptera: Crambidae)”, que analisou os efeitos
de soluções aquosas do produto a base de óleo de neem, NATUNEEM®, sobre ovos de D.
saccharalis em diferentes fases de seu desenvolvimento embrionário.
Em consonância com as regras do Programa de Pós-graduação em Ciências
Biológicas, os trabalhos foram redigidos em forma de artigo de acordo com as normas das
revistas a que serão submetidas.
1. Camila Vieira da Silva, Larissa Carla Lauer Schneider, João de Alencar Pamphile e
Hélio Conte. “Mecanismo de infecção de Metarhizium anisopliae (Metsch) Sorokin
(Deuteromycotina; Hyphomycetes) e mortalidade em ovos, de diferentes idades, de
Diatraea saccharalis (Fabricius 1794) (Lepidoptera: Crambidae)”. Será encaminhado ao
Canadian Journal of Microbiology. ISNN – 0008-4166; Fator Impacto = 1,286.
2. Camila Vieira da Silva, Larissa Carla Lauer Schneider e Hélio Conte. “Efeito inseticida
do óleo de Neem, Azadirachta indica A. Juss., em ovos de de Diatraea saccharalis
(Fabricius 1794) (Lepidoptera: Crambidae).” Será encaminhado a revista Agricultural and
Forest Entomology. ISNN-1461-9555; Fator Impacto = 1,222.
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RESUMO GERAL
Dentre os países produtores de cana-de-açúcar, Saccharum officinarum, o Brasil desponta
com cerca de 30% do total da produção. A cana é uma das gramíneas de maior
importância devido a sua múltipla utilidade. Atualmente, a maioria das usinas a utiliza
apenas para retirar o caldo e fazer açúcar e álcool. A fim de sustentar seu crescimento
econômico, o país tem o desafio de aumentar o fornecimento de energia em 5% ao ano.
Para tanto, o objetivo é tornar a utilização de biomassa intensiva, principalmente a
advinda da cana-de-açúcar. Estima-se que até 2021 o potencial de energia obtida com o
bagaço da cana será equivalente ao da hidrelétrica de Itaipu, que corresponde a 20% do
abastecimento do país. Com isso, a qualidade de produção tem sido muito considerada,
para que a cana possa ser aproveitada por completo. A produtividade da cana-de-açúcar é
regulada por uma série de fatores, dentre os quais se destacam: variedade, solo, clima e o
controle de pragas. Uma das pragas mais significativas nesta cultura é a broca da cana-deaçúcar, Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae). Uma vez no interior do colmo, o
controle deste inseto se torna difícil e métodos alternativos devem ser viabilizados. Com a
crescente preocupação em conservar e proteger os recursos naturais, práticas lesivas ao
ambiente têm sido evitadas. As políticas públicas, mediante acordos internacionais, têm
incluído em seus planos e ações o fomento às atividades agrícolas sustentáveis que levam
em conta a diminuição do uso de agrotóxicos, pela redução das taxas para a produção de
biocontroladores, bem como incentivo ao Manejo Integrado de Pragas (MIP). No intuito
de reduzir o uso indiscriminado de agrotóxicos, porém conservando a qualidade da
produção, várias formas de controle biológico com entomopatogênicos e plantas
inseticidas estão sendo estudadas. O fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae
(Metsch.) Sorok. é mundialmente conhecido e utilizado como agente de controle
biológico para diversas pragas agrícolas de expressão econômica. Os extratos das folhas e
sementes de neem, Azadirachta indica, também apresentam princípios ativos com
comprovada eficácia na atividade inseticida. Considerando a ação satisfatória de M.
anisopliae e do extrato de neem no controle de pragas, realizamos, no presente trabalho,
um estudo para analisar os efeitos resultantes do tratamento com estes compostos em ovos
de diferentes idades de D. saccharalis. Para isso, ovos de D. saccharalis com 0, 24, 48,
72, 96 e 120 horas da oviposição, foram fornecidos pelo laboratório de Morfologia e
Citogenética de Insetos DBC/UEM, sendo separados em grupos de cinqüenta para
posterior tratamento. As linhagens MT e E9, de M. anisopliae foram obtidas de estoques
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do laboratório de Biotecnologia Microbiana DBC/UEM. As suspensões de conídios foram
preparadas com água destilada e Tween 80, ambos estéreis, em placas contendo as
linhagens e a concentração 107 conídios/ml aferida em câmara de Newbauer. O produto
comercial NATUNEEM® (com teor de azadiractina de 1.500 ppm) foi diluído em água
destilada, segundo a indicação do rótulo, nas seguintes concentrações: 0,1; 0,3; 0,5; 1,0 e
2,0%. Os grupos controle foram tratados com água destilada estéril. Ovos em diferentes
tempos de desenvolvimento, separados em grupos, foram tratados com 100µ l das
suspensões fúngicas e concentrações do extrato de óleo de neem. A porcentagem de
viabilidade dos ovos e a mortalidade de larvas emergidas foi determinada através de
programa estatístico PRISMA 2.1. Os resultados foram submetidos à ANOVA, sendo a
comparação das médias realizadas por teste de Tukey (P<0,05). Em ovos tratados com o
extrato de óleo de neem as alterações foram observadas apenas ao estereomicroscópio e
documentadas fotograficamente. Já para ovos tratados com M. anisopliae as observações
das alterações morfológicas foram realizadas em estereomicroscópio, microscópio de luz
(montagem total utilizando-se azul de toluidina e técnicas histoquímicas com PAS) e
microscópio eletrônico de varredura (MEV) onde o material fixado com Bouin foi
desidratado em ponto crítico e metalizado com pó de ouro. Nos resultados do primeiro
experimento, com as linhagens de M. anisopliae, observamos que a MT foi mais eficiente
resultando em viabilidade de 0 a 56%, enquanto que em E9 variou entre 6,3 e 81,5%,
sendo diferentes significativamente (P< 0,001). A maioria das larvas, que eclodiram após
tratamento com o fungo morreu com o corpo recoberto por hifas fúngicas. As análises de
microscopia de luz revelaram o crescimento do fungo e a formação de sítios de
penetração, bem como o seu desenvolvimento no interior dos ovos, ocasionando um
possível atraso ou bloqueio no processo embriogênico do ovo e a extrusão do fungo junto
com a conidiogênese no exterior dos ovos. As análises ao MEV revelaram com mais
detalhes a formação da estrutura de penetração denominada apressório e a reprodução do
patógeno. No segundo experimento, onde foi analisada a eficiência do extrato de óleo de
neem- NATUNEEM®- os resultados mostraram efeito tóxico em todas as concentrações,
sendo o grau dependente da dose usada e do estágio dos ovos, causando redução de 38,1 a
98,9% na viabilidade dos ovos. Em ovos tratados nos primeiros dias de desenvolvimento
(0, 24 e 48h após oviposição) a redução foi superior, provavelmente devido à ação do
principal componente do extrato, a azadirachtina, o qual tem efeito seletivo para insetos
comprovado, podendo afetar os processos de muda. Um aspecto fundamental é o tempo
de ação ou permanência dos inseticidas, ou seja, seu efeito residual pós-aplicação. As
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larvas que não foram afetadas pela ação ovicida apresentaram, após 24h e 48h da eclosão,
alta taxa de mortalidade para as concentrações 0,3-2%, variando entre 89,14±4,9 e
97,52±2,56. Verificamos que estes resultados ocorreram principalmente em ovos tratados
em fases de desenvolvimento adiantado. Estas larvas apresentaram coloração clara,
abdômen amolecido e em alguns casos, ausência de cápsula cefálica, o que leva a
conclusão de que houve alterações na via relacionada às mudas, uma vez que estas
também ocorrem na fase embrionária. Através dos resultados obtidos nas condições
experimentais podemos concluir que o uso de M. anisopliae, linhagem MT na
concentração de 107 conídios/ml e do extrato de óleo de neem (0,3-2,0%) são efetivos
para o controle de ovos de D. saccharalis em diferentes estágios embrionários,
apresentando ambos, efeito residual estendido às larvas de primeiro instar.
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GENERAL ABSTRACT
Among the countries producers of sugar cane, Saccharum officinarum, Brazil arising
with about 30%. The cane is a grass of utmost importance because of its multiple uses.
Currently, most of the power plants used only to utilized the broth and make sugar and
alcohol. In order to sustain its economic growth, the country has the challenge of
increasing the supply of energy at 5% a year. To that end, the objective is to make
intensive use of biomass, mainly arising from sugar cane. It is estimated that by 2021
the potential of energy obtained with the cane pomace is equivalent to that of the Itaipu
Hydroelectric, which corresponds to 20% of supply. With this, the quality of production
has been considered, so that the cane can be used entirely. The productivity of sugar
cane is governed by a number of factors, among which stand out: variety, soil, climate
and pest control. One of the most significant pest granddaughter cultures is the drill of
sugar cane, Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae). Once inside the stem, the
control of this insect becomes difficult and with that, alternative methods must be
possible. With the growing concern to conserve and protect natural resources, practices
detrimental to the environment have been avoided. Public policies through international
agreements have included in their plans and actions, the promotion of sustainable
agricultural activities that take into account the reduction in the use of pesticides, the
reduction of rates for the production of biocontrol and encourage the Integrated
Management Pests (IMP). To reduce the indiscriminate use of pesticides, but retaining
the quality of production, various forms of biological control and of insecticides plants
are being studied. The entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae (Metsch.)
Sorok. is widely known and used for biological control of agricultural pests for various
economic expressions. The extracts of the leaves and seeds of neem, Azadirachta
indica, also have active ingredients with proven effectiveness in insecticidal activity.
Considering the satisfactory action of M. anisopliae and the extract of neem in control
of pests, we conducted, in this work, a study to examine the effects of treatment with
these compounds in eggs of different ages of D. saccharalis. For this, eggs of D.
saccharalis with 0, 24, 48, 72, 96 and 120 hours of oviposition, were provided by the
Laboratory of Morphology and Cytogenetics of Insect DCB / State University of
Maringá and are separated into groups than fifty for further treatment. The isolates MT
and E9, Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin was obtained from the laboratory
stocks of Microbial Biotechnology CBD / SUM. The suspensions of conidia were
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prepared with distilled water and Tween 80, both sterile, plates containing the lines and
concentration measured at 107 conidia/ml in chamber of Newbauer. The commercial
product NATUNEEM ® (with the content of azadiractina of 1,500 ppm) was diluted
with distilled water, according to the label indication, in the following concentrations:
0.1, 0.3, 0.5, 1.0 and 2.0%. Control groups were treated with sterile distilled water. Eggs
at different times of development, separated into groups, were treated with 100 µl of
fungal suspensions and concentrations of extract neem oil. The percentage of viable
eggs and mortality of larvae emerged were determined through statistical program
PRISM 2.1. The results were submitted to ANOVA, and the comparison of means test
conducted by Tukey (P <0.05). In eggs treated with the extract of neem oil changes
were observed only in stereomicroscope and documented photographically. For eggs
treated with M. anisopliae the analyses were realized in stereomicroscope, in a light
microscope (assembly using a total of toluidine blue and technical routine with
histological PAS) and scanning electron microscopy (SEM) where the material fixed
was dehydrated in critical point and metallic powder with gold. In the results of the first
experiment, the isolates MT and E9 of M. anisopliae were tested, we found that it was
more efficient than this, resulting in viability of 0 to 56%. In contrast, in eggs treated
with E9 it ranged between 6.3 and 81.5%, which was significantly different (P <0.001).
We also saw that most of the larvae, which hatch from eggs successfully treated, died
with the body covered by fungal hyphae. Analyses of light microscopy, showed the
growth of fungus and the formation of sites of penetration as well as the development
inside the egg, showing the organization, the development, which may result in a
possible delay or block the process of egg also embryogenesis and the extrusion of the
fungus along with conidiogenesis abroad eggs. The analyses also revealed SEM in the
formation of the structure of penetration (apressoria) and reproduction. In the second
experiment, where he examined the efficiency of neem oil extract-NATUNEEM ® - the
results showed toxic effect at all concentrations, and the degree dependent on the dose
used and the stage of eggs. The treatment caused reduction from 38.1 to 98.9% in the
viability of eggs. In eggs treated in the early days of development (0, 24 and 48 hours of
oviposition) the reduction was higher, which may be linked to action of the main
component of the extract, the azadirachtin, which takes effect for selective insects
proven, by affecting the processes of ecdyse. A key aspect is the time for action or
residence of insecticides, or its residual effect post-application. The larvae that were not
affected by the action ovicide showed, after one or two days of the outbreak, high
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mortality rate for concentrations 0.3-2%, ranging between 89.14± 4.9 and 97.52 ± 2.56.
We note that these results occurred mainly in eggs treated in early stages. These larvae
showed clear color, abdomen loose and in some cases, lack of cephalic capsule, which
leads to the conclusion that ecdyse in the way related to the seedlings may have
occurred, since they also occur in the embryonic stage. In conclusion, by the results
obtained in experimental conditions of our study, we finished that the use of M.
anisopliae, in strain MT concentration of 107 conidia/ml and the extract of neem oil
(0.3-2.0%) are effective for the control of eggs, D. saccharalis in different stages,
giving both residual effects extended the larvae of the first instar.
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