FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA - UNIR
NÚCLEO DE SAÚDE – DEPARTAMENTO DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA EXPERIMENTAL
FERNANDA BAY HURTADO
CONTRIBUIÇÃO AO ESTUDO FITOQUÍMICO E ATIVIDADE BIOLÓGICA DA
ENTRECASCA DE Maytenus guianensis KLOTZSCH EX REISSEK
(CELASTRACEAE)
PORTO VELHO
2013
FERNANDA BAY HURTADO
CONTRIBUIÇÃO AO ESTUDO FITOQUÍMICO E ATIVIDADE BIOLÓGICA DA
ENTRECASCA DE Maytenus guianensis KLOTZSCH EX REISSEK
(CELASTRACEAE)
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Biologia Experimental da Universidade Federal de
Rondônia, como requisito para a obtenção do título de
Doutora em Biologia Experimental.
Orientador: Prof. Dr. Valdir Alves Facundo
Coorientadoras: Profª Dra. Juliana Zuliani
Profª Dra. Pratrícia Soares Maria de
Medeiros
PORTO VELHO
2013
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Biblioteca Setorial 07/UNIR
H967c
Hurtado, Fernanda Bay.
Contribuição ao estudo fitoquímico e biológico da entrecasca da
espécie Maytenus guianensis klotzsh ex Reissek / Fernanda Bay
hurtado. Porto Velho – RO: UNIR, 2013.
175 f. : il. color. ; + 1 CD-ROM
Orientador: Prof. Dr. Valdir Alves Facundo.
Co-orientadoras: Profª Dra. Juliana Pavan Zuliani; Profª Dra. Patrícia
Soares de Maria Medeiros.
Tese (Doutorado em Biologia Experimental) – Fundação Universidade
Federal de Rondônia. Porto Velho, 2013.
1. Maytenus. 2. Maytenus guianensis. 3. Friedelanos. 4. Atividade antiPlasmodial. 5. Atividade anti-inflamatóriaI. Fundação Universidade Federal
de Rondônia. II. Facundo, Valdir Alves. III. Título.
CDU: 615.322 (811)
Bibliotecário-Documentalista: Jonatan Cândido, CRB15/732
FERNANDA BAY HURTADO
CONTRIBUIÇÃO AO ESTUDO FITOQUÍMICO E ATIVIDADE BIOLÓGICA DA
ENTRECASCA DE Maytenus guianensis KLOTZSCH EX REISSEK
(CELASTRACEAE)
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia
Experimental da Universidade Federal de Rondônia, como requisito
para a obtenção do título de Doutor em Biologia Experimental, banca
examinadora:
Data da aprovação: 29 de maio de 2013.
BANCA EXAMINADORA
__________________________________________________
Dr. Valdir Alves Facundo
(Presidente: Universidade Federal de Rondônia – UNIR)
__________________________________________________
Dr. Gil Valdo José da Silva
(Faculdade de Filosofia Ciência e Letras de Ribeirão Preto - FFCLRP, Universidade de São
Paulo -USP)
__________________________________________________
Dra. Patrícia Soares de Maria Medeiros
(Universidade Federal de Rondônia – UNIR e Fundação Oswaldo Cruz – Fiocruz Rondônia)
__________________________________________________
Dr. Roberto Nicolete
(Fundação Oswaldo Cruz – Fiocruz Rondônia)
__________________________________________________
Dra. Rubiani Cássia Pagotto
(Universidade Federal de Rondônia – UNIR)
Dedico este trabalho aos meus pais, Josefina e Teodózio, minha irmã, Márcia, e ao
meu esposo, Luiz Antônio, pessoas fundamentais em minha vida.
Sem vocês nada disso seria possível!
AGRADECIMENTOS
A Deus, por tornar esse momento possível, por me dar forças para seguir adiante e por
sempre me iluminar.
Aos meus pais, Josefina e Teodózio, e irmã, Márcia, por todo amor, apoio e exemplo de
vida, por acreditarem em mim em todo momento, por toda confiança e por estarem juntos a mim em
todos os momentos.
Ao meu muito amado esposo Luiz Antônio, por deixar-me acompanhar a obra prima que é a
sua vida, testemunhar a prática de nobres virtudes e ser digna de seu amor e companheirismo.
Ao meu orientador profº Valdir Alves Facundo pela orientação e a oportunidade de
crescimento pessoal e profissional. Agradeço pela confiança, paciência e respeito.
A Leda e Isadora por gentilmente me cederem os extratos para a realização deste projeto.
As Profªs Francisca da Luz Dias e Mariangela Soares de Azevedo, pela oportunidade,
confiança e pela minha formação.
As profªs Juliana Pavan Zuliani e Patrícia Medeiros, que por serem dedicadas e terem amor
à ciência me transmitram ensinamentos valiosos e sábios, que às vezes ultrapassaram as paredes dos
laboratórios e me serviram para a vida, duas pessoas de coração enorme que me acolheram com
carinho, quero deixar um agradecimento especial a essas grandes orientadoras que são grandes seres
humanos, OBRIGADO POR TUDO.
A Fernanda Bijella, mais que uma amiga, uma irmã que esteve comigo desde o início desta
jornada, obrigada por tudo, desde as conversas felizes até as tristes.
Aos amigos Cristiane, Daniel Sol Sol, Daniele Simone, Elci, Joana d´Arc, Jorge, Reginaldo e
Rubi, com certeza, sem vocês, eu não conseguiria chegar ao fim.
Aos meus amigos do Departamento de Engenharia de Pesca que contribuíram direta e
indiretamente para a realização deste trabalho, Clodoaldo, Eliane, Igor, Jair, Jucilene, Julia, Mário,
Marlos, Paulo de Tarso, Rute e Santina.
A todos os meus amigos do Laboratório de Pesquisa em Química de Produtos Naturais LPQPN, que contribuíram para realização deste projeto, Andrina, Consuelo, Daniela Lobato, Frank,
Ivana, João Jr, Leandro Flores, Leandro Soares, Ludmila, Poli e Renato.
Aos estagiários e funcionários e Amigos do Laboratório de Quimioterapia de Malária –
LQM, pela atenção, colaboração, palavras de incentivo e afeto, e momentos de descontração, Daniel,
Elci, Esquerdo e Francisco.
Aos estagiários e funcionários do Laboratório de Cultivo Celular e Anticorpos
Monoclonais e Laboratório De Bioquímica e Biotecnologia, pela atenção e colaboração,
especialmente Leda, Letícia, Nery e Sulamita.
A equipe do Laboratório de Fitoquímica e Produtos Naturais - Labfito, pela atenção,
colaboração e ensinamentos, especialmente, “Xico”, “Rafa” e Valéria.
A equipe do Laboratório de Citogenética e Mutagênese das Faculdades Integradas Aparício
Carvalho – FIMCA, Ana Letíca, Carli, Márcia e Valcira, por sempre estarem dispostas e de bom
humor, mesmo tendo de trabalhar com muitas cebolas.
Ao profº Wilson Petenele do Departamento de Química – UNIR, pelo auxílio na obtenção
dos espectros no infravermelho.
Ao profº Gil Valdo José da Silva do Departamento de Química da Faculdade de Filosofia
Ciências e Letras de Ribeirão Preto – USP, pelo axílio na obtenção dos espectros de RMN de
1
He
13
C.
Ao profº Valdemar Lacerda Júnior do Departamento de Química da Universidade Federal do
Espírito Santo – UFES, pelo auxílio na obtenção dos espectros de RMN de 1 H e 13C.
Aos funcionários da Fiocruz – RO, em especial ao Felipe, Giovani, Rose e Tatiane, muito
obrigada pela cordialidade, ajuda indispensável e principalmente pela boa vontade que sempre
demonstraram todas as vezes que busquei auxílio.
A Caroline, secretária deste Programa de Pós-Graduação, muito obrigada pela cordialidade,
ajuda indispensável e boa vontade que sempre demonstrou todas as vezes que busquei auxílio.
Aos profºs Andreimar Martins Soares, Rubiani Cássia Pagotto e Deusilene Souza Viera, por
terem feito parte da banca de exame de qualificação desta tese e contribuírem de maneira fundamental
a finalização deste trabalho.
Aos profºs Gil Valdo José da Silva, Patrícia Soares de Maria Medeiros, Roberto Nicolete e
Rubiani Cássia Pagotto por tere feito parte da banca de exame de defesa final desta tese e contribuírem
de maneira fundamental na finalização deste trabalho.
À Fiocruz/Rondônia que gentilmente cedeu às instalações fundamentais para realização
deste trabalho.
À CAPES e CNPq pelo apoio financeiro.
E por fim, as demais pessoas que não foram aqui mencionadas, mas que contribuíram direta
ou indiretamente em mais uma etapa do caminho da minha realização profissional.
"Foi o melhor dos tempos e o pior dos tempos,
a idade da sabedoria e da insensatez,
a era da fé e da incredulidade,
a primavera da esperança e o inverno do desespero.
Tínhamos tudo e nada tínhamos."
(Charles Dickens, séc. XIX)
RESUMO
Espécies pertencentes ao gênero Maytenus (Celastraceae) são utilizadas na medicina
tradicional na região Amazônica contra câncer, reumatismo, como anti-inflamatório.
Maytenus guianensis, popularmente conhecida como “chichuá e xixuá” é uma árvore muito
difundida na floresta Amazônica. O estudo fitoquímico de sua entrecasca resultou no
isolamento de seis triterpenos pentaciclicos: 3-oxofriedelano, 3β-hidroxfriedelano, 3-oxo-16βhidroxifriedelano, 3-oxo-29-hidroxifriedelano, tingenona e tingenina B. Os resultados obtidos
para a avaliação da atividade antioxidante, foram expressos em termos de CE50 (µg.mL-1),
respectivamente: extrato acetônico da entrecasca (EAMG) com 50,44, eluato hexânico
(EHMG) com 61,39, eluato clorofórmico (EClMG) com 53,28 e eluato acetônico (EAcMG)
com 49,52, sendo o EAcMG o que apresentou a melhor atividade antioxidante quando
comparado com o padrão comercial Ginkgo biloba (CE50 = 46,42 µg.mL-1). Para os testes de
atividade genotóxica verificou-se que em um tempo de exposição prolongado (48 h) há efeito
inibidor da proliferação em células de Allium cepa em todas as concentrações testadas, porém
a ação clastogênica foi baixa, sem significativo efeito aneugênico. No teste de inflamação
pelo edema de pata induzido pela carragenina 1%, os melhores resultados foram para extrato
acetônico da entrecasca (EAMG) que apresentou Imax de 48,8 % no tempo de180 minutos na
dose de 100 mg/kg via intraperitoneal e 16 β-hidroxifrielan-3-ona (CQH-3) que apresentou
Imax de 65% no tempo de 120 minutos na dose de 50 mg/kg via intraperitoneal. Para o teste de
atividade citotóxica frente as células HepG2 nenhuma amostra testada apresentou
citotoxicidade de acordo com o National Institute of Cancer. No teste anti-Plasmodium
falciparum os resultados foram promissores e expressos em termos de IC50 (g.mL-1),
respectivamente: extrato acetônico da entrecasca (EAMG) com 250,02 ± 0,02, eluato
hexânico (EHMG) com 305,23 ± 0,03, eluato clorofórmico (EClMG) com 294,76 ± 0,01 e
eluato acetônico (EAcMG) com 190,37. Os resultados obtidos contribuíram para o estudo
quimiotaxonômico da família Celastraceae e mostram que M. guianensis pode vir a ser uma
fonte alternativa de compostos que sejam possíveis protótipos de fármacos que atuem em
diferentes enfermidades.
Palavras-chave: Triterpenos friedelanos. Atividade antiplasmodial. Atividade antiinflamatória. Atividade genotóxica. Atividade antioxidante
ABSTRACT
Species of the genus Maytenus (Celastraceae) are used in traditional medicine in the Amazon
region against cancer, rheumatism, as anti-inflammatory. Maytenus guianensis, popularly
known as "chichuá and xixuá" is a widespread tree in the Amazon rainforest. The
phytochemical study of their bark resulted in the isolation of six pentacyclic triterpenes: 3oxofriedelane,
3β-hydroxyfriedelane,
3-oxo-16β-hydroxyfriedelane,
3-oxo-29hydroxyfriedelane, tingenone and tingenin B. The results for the evaluation of antioxidant
activity, were expressed in terms of EC50 (μg.mL-1), respectively: acetone extract of bark
(EAMG) with 50.44, hexane eluate (EHMG) with 61.39, chloroform eluate (EClMG) with
53.28 and acetone eluate (EAcMG) with 49.52 being the EAcMG presented the best
antioxidant activity when compared with the standard commercial Ginkgo biloba (EC50 =
46.42 µg. mL-1). For testing genotoxic activity was found that at a long exposure time (48
hours) no inhibitory effect on the proliferation of cells in Allium cepa all concentrations
tested, but was low clastogenic action without significant effect aneugenic. Inflammation test
in the rat paw edema induced by carrageenin 1%, the best results were to acetone extract of
the bark (EAMG) which presented 48.8% of Imax time de180 minutes at a dose of 100 mg/kg
intraperitoneally, and 3-oxo-16β-hydroxyfriedelane (CQH-3) showed that 65% of Imax time
120 minutes at a dose of 50 mg/kg intraperitoneally. To test the cytotoxic activity front
HepG2 cells showed no cytotoxicity of the tested sample according to the National Institute of
Cancer. In the test anti-Plasmodium falciparum and promising results were expressed in
terms of IC50 (g.mL-1), respectively: acetone extract of the bark (EAMG) of 250.02 ± 0.02,
hexane eluate (EHMG) with 305.23 ± 0.03, chloroform eluate (EClMG) to 294.76 ± 0.01 and
acetone eluate (EAcMG) with 190.37. The results obtained have contributed to the Study of
the family Celastraceae chemotaxo/nomic and showed that M. guianensis may prove to be an
alternate source of compounds that are possible prototypes of drugs that act in different
diseases.
Key-Words: Triterpenes friedelanos. Antiplasmodial activity. Anti-inflammatory. Genotoxic
activity. Antioxidant activity.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Principais vias do metabolismo secundário e suas interligações. ..................................... - 27 Figura 2 - Substâncias envolvidas na biossíntese de terpenos. ........................................................ - 30 Figura 3 - Biossíntese geral de formação de terpenóides. ................................................................ - 31 Figura 4 - Conversão de 3-oxidosqualeno para friedelanol e 3-oxo-friedelano e o seu envolvimento
como o precursor biossintético do quinonametídeo. .................................................... - 32 Figura 5 - Ciclo biológico do Plasmodium no mosquito e no homem. ............................................ - 58 Figura 6 - Casca do caule Maytenus guianensis. ............................................................................. - 61 Figura 7 - Esquema geral do procedimento experimental efetuado com a entrecasca de Maytenus
guianensis. .................................................................................................................... - 64 Figura 8 - Espectro de RMN de 1H de CQH-1 (3-oxo-friedelano) (CDCl3; 400 MHz). ................. - 76 Figura 9 - Espectro de RMN de 13C de CQH-1 (3-oxo-friedelano) (CDCl3; 100 MHz). ................ - 77 Figura 10 - Espectro de RMN de 13C (DEPT-135) de CQH-1 (3-oxo-friedelano) (CDCl3; 100 MHz). 78 Figura 11 - Espectro de CQH-2 (3-hidroxifriedelano) obtido no infravermelho (IV) (KBr, cm-1).- 81
Figura 12 - Espectro de RMN 1H de CQH-2 (3-hidroxifriedelano), mostrando uma expansão entre
1,2-0,70 (400 MHz, CDCl3).......................................................................................... - 82 Figura 13 - Espectro de RMN 13C - Desacoplado - (CDCl3, 100 MHz) de CQH-2 (3hidroxifriedelano). ........................................................................................................ - 83 Figura 14 - Espectro de RMN de 13C (DEPT-100) de CQH-2 (3-hidroxifriedelano) (CDCl3;
100MHz). ...................................................................................................................... - 84 Figura 15 - Espectro de CQH-3 (3-oxo-16β-hidroxifriedelano) obtido no infravermelho (IV) (KBr,
cm-1). ............................................................................................................................. - 87 Figura 16 - Espectro de RMN 13C (PND) de CQH-3 (3-oxo-16 β-hidroxifriedelano) (150 mhz, cdcl3).
...................................................................................................................................... - 88 Figura 17 - Espectro de RMN 13C (DEPT-135) de CQH-3 (3-oxo-16β-hidroxifriedelano) (150 MHz,
CDCl3). ......................................................................................................................... - 89 Figura 18 - Algumas correlações observadas no espectro NOESY de CQH-3 (3-oxo-16 βhidroxifriedelano). ........................................................................................................ - 90 Figura 19 - Espectro de RMN 1H de CQH-3 (3-oxo-16 β-hidroxifriedelano) (400 MHz, CDCl3). - 91 Figura 20 - Espectro bidimensional COESY de CQH-3 (3-oxo-16β-hidroxifriedelano) (400 MHz,
CDCl3). ......................................................................................................................... - 92 -
Figura 21 - Espectro bidimensional COESY de CQH-3 (3-oxo-16β-hidroxifriedelano) (400 MHz,
CDCl3). ......................................................................................................................... - 93 Figura 22 - Espectro bidimensional HMBC de CQH-3 (3-oxo-16β-hidroxifriedelano) (400 MHz,
CDCl3). ......................................................................................................................... - 94 Figura 23 - Espectro bidimensional NOESY de CQH-3 (3-oxo-16 β-hidroxifriedelano) (400 MHz,
CDCl3). ......................................................................................................................... - 95 Figura 24 - Espectro de CQH-4 (tingenona + tingenina b) obtido no infravermelho (IV) (KBr, cm-1). 98 Figura 25 - Estrutura parcial de triterpeno quinonametídeo. ........................................................... - 99 Figura 26 - Espectro de RMN 1H de CQH-4 (tingenona + tingenina b) (400 MHz, CDCl3). ......... - 99 Figura 27 - Expansão do espectro de RMN 1H da região de 2,35 - 2,00 de CQH-4 (tingenona +
tingenina b) (400 MHz, CDCl3).................................................................................. - 100 Figura 28 - Expansão do espectro de RMN 1H da região de 7,70 - 6,20 de CQH-4 (tingenona +
tingenina b) (400 MHz, CDCl3).................................................................................. - 101 Figura 29 - Espectro de RMN 13C (DEPT-135) de CQH-4 (tingenona + tingenina b) (150 MHz,
CDCl3) . ...................................................................................................................... - 102 Figura 30 - Espectro de RMN 13C (PND) de CQH-4 (tingenona + tingenina b) (150 MHz, CDCl3)
mostrando expansões entre 214 – 209 e 77-71. .......................................................... - 103 Figura 31 - Espectro bidimensional COESY de CQH-4 (tingenona + tingenina b). ..................... - 105 Figura 32 - Espectro bidimensional HMBC de CQH-4 (tingenona + tingenina b). ...................... - 106 Figura 33 - Espectro de CQCl-1 (3-oxo-29-hidroxifriedelano) obtido no infravermelho (IV) (KBr,
cm-1). ........................................................................................................................... - 109 Figura 34 - Espectro de RMN 13 C (PND) de CQCl-1 (3-oxo-29-hidroxifriedelano) (CDCl3; 100
MHz). .......................................................................................................................... - 110 Figura 35 - Espectro de RMN de 13C (DEPT-135) de CQCl-1 (3-oxo-29-hidroxifriedelano) (CDCl3;
100MHz). .................................................................................................................... - 111 Figura 36 - Espectro de RMN de 1H de CQCl-1 (3-oxo-29-hidroxifriedelano) (CDCl3; 400 MHz),
mostrando também as expansões entre 3,30-2,20 e 1,22-0,70.................................... - 112 Figura 37 - Espectro bidimensional HMBC de CQCl-1 (3-oxo-29-hidroxifriedelano) (400 MHz,
CDCl3). ....................................................................................................................... - 113 Figura 38 - Espectro bidimensional COESY de CQCl-1 (3-oxo-29-hidroxifriedelano) (400 MHz,
CDCl3). ....................................................................................................................... - 114 Figura 39: Avaliação da atividade antioxidante (%) de Maytenus guianensis pelo método do DPPH. . 118 Figura 40: Avaliação da atividade antioxidante (%) de Ginkgo biloba (Egb 761) pelo método do
DPPH. ......................................................................................................................... - 119 -
Figura 41 - Efeito da administração do EAMG sobre o edema de pata induzido por carragenina a 1%.
.................................................................................................................................... - 125 Figura 42 - Efeito da administração do EHMG sobre o edema de pata induzido por carragenina a 1%.
.................................................................................................................................... - 127 Figura 43 - Efeito da administração do EClMG sobre o edema de pata induzido por carragenina a
1%. .............................................................................................................................. - 129 Figura 44 - Efeito da administração de CQH-2 sobre edema de pata induzido por carragenina a 1%... 131 Figura 45 - Efeito da administração de CQH-3 sobre edema de pata induzido por carragenina a 1%... 133 Figura 46 - Determinação citotoxicidade do extrato acetônico da entrecasca e eluatos frente a
linhagem celular HepG2. ............................................................................................ - 140 Figura 47 - Determinação citotoxicidade de CQH-2 e CQH-3 frente a linhagem celular HepG2.- 141
Figura 48 - Atividade anti-P. falciparum (cepa 3D7) do extrato acetônico da entrecasca e eluatos,
utilizando o ensaio imunoenzimático anti-HRPII. ...................................................... - 144 Figura 49 - Atividade anti-P. falciparum (cepa 3D7) de Cloroquina (CQ), utilizando o ensaio
imunoenzimático anti-HRPII. ..................................................................................... - 145 -
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Deslocamentos químicos dos carbonos não-, mono-, di- e tri-hidrogenados de CQH-1 (3oxo-friedelano), a partir dos espectros de RMN 13C (PND) e RMN 13C (DEPT-135). - 78 Tabela 2 - Dados de RMN de 13C (100 MHz, CDCl3) de CQH-1 (3-oxo-friedelano) e dados da 3-oxofriedelano descritos na literatura (SOUSA et al., 2012). .............................................. - 79 Tabela 3 - Deslocamentos químicos dos carbonos não-, mono-, di- e tri-hidrogenados de CQH-2 (3hidroxifriedelano), a partir dos espectros de RMN 13C (PND) e RMN 13C (DEPT-135). ... 83 Tabela 4 - Dados de RMN de 13C (100 MHz, CDCl3) de CQH-2 (3-hidroxifriedelano) e dados da
3-hidroxifriedelano descritos na literatura. ................................................................. - 85 Tabela 5 - Deslocamentos químicos dos carbonos não-, mono-, di- e tri-hidrogenados de CQH-3 (3oxo-16β-hidroxifriedelano), a partir dos espectros de RMN 13C (PND) e RMN 13C
(DEPT-135). ................................................................................................................. - 88 Tabela 6 - Dados de RMN 13C e RMN 1H de CQH-3 (3-oxo-16 β-hidroxifriedelano) e comparação
com os dados do triterpeno 3-oxo-16 β-hidroxifriedelano (3), descritos na literatura
(NOZAKI et al., 1986).................................................................................................. - 96 Tabela 7 - Deslocamentos químicos dos carbonos não-, mono-, di- e tri-hidrogenados de CQH-4
(tingenona + tingenina b), obtidos a partir dos espectros de RMN 13C (PND) e RMN 13C
(DEPT-135). ............................................................................................................... - 104 Tabela 8 - Comparação entre os dados de RMN 13C de CQH-4 (tingenona + tingenina b) com dados
destes triterpenos da literatura. ................................................................................... - 107 Tabela 9 - Correlação entre os deslocamentos químicos dos hidrogênios com os carbonos para CQH4 (tingenona + tingenina b). ........................................................................................ - 108 Tabela 10 - Deslocamentos químicos dos carbonos não-, mono-, di- e tri-hidrogenados de CQCl-1 (3oxo-29-hidroxifriedelano), a partir dos espectros de RMN 13C (PND) e RMN 13C (DEPT135). ............................................................................................................................ - 111 Tabela 11 - Dados de RMN 13C e RMN 1H de CQCl-1 (3-oxo-29-hidroxifriedelano) e comparação
com os dados do triterpeno 3-oxo-29-hidroxifriedelano (3), descritos na literatura. . - 115 Tabela 12 - Atividade antioxiante (% AA) do extrato acetônico da entrecasca e eluatos de Maytenus
guianensis. .................................................................................................................. - 116 Tabela 13 - Tratamentos, número total de células analisadas no ciclo celular (interfase, prófase,
metáfase, anáfase, telófase) em células meristemáticas de raízes de Allium cepa tratadas
com o extrato acetônico da entrecasca de Maytenus guianensis. .............................. - 120 Tabela 14 - Tratamentos, número total de células analisadas, número de aberrações celulares e de
células aberrantes de pontas de raízes de Allium cepa tratadas com extrato acetônico de
Maytenus guianensis................................................................................................... - 121 -
Tabela 15 - Efeito da administração do EAMG sobre edema de pata induzido por carragenina a 1%. . 124 Tabela 16 - Efeito da administração do EHMG sobre edema de pata induzido por carragenina a 1%. . 126 Tabela 17 - Efeito da administração de EClMG sobre edema de pata induzido por carragenina a 1%. . 128 Tabela 18 - Efeito da administração de CQH-2 sobre edema de pata induzido por carragenina a 1%. . 130 Tabela 19 - Efeito da administração de CQH-3 sobre edema de pata induzido por carragenina a 1%. . 132 Tabela 20 - Atividade anti-P. falciparum (cepa 3D7) do extrato acetônico da entrecasca e eluatos,
utilizando o ensaio imunoenzimático anti-HRPII. ...................................................... - 143 -
LISTA DE QUADROS
Quadro 1- Metabólitos secundários isolados de algumas espécies do gênero Maytenus................. - 36 Quadro 2 - Espécies reativas do oxigênio. ....................................................................................... - 44 Quadro 3 - Principais agentes antioxidantes de defesa orgânica. .................................................... - 47 Quadro 4 - Exemplos de plantas com atividades biológicas. ........................................................... - 54 Quadro 5 - Dados epidemiológicos da malária por estados da Amazônia Legal, janeiro a dezembro de
2012. ............................................................................................................................. - 56 -
LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS
%AA – Porcentagem de Atividade Antioxidante
5-LOX – 5-lipoxigenase
AA – Ácido araquidônico
ACM – Anomalias celulares e cromossômicas
AINE – Anti-inflamatório não esteroidal
AMPc - Adenosina 3',5'-monofosfato cíclico
ATP – Trifosfato de adenosina
BK – Bradicinina
Carr – Carragenina
CAT – Catalase
CC – Cromatografia em coluna
CCD – Cromatografia em camada delgada
CDL3 – Clorofórmio deuterado
CE50 – Concentração efetiva 50%
CM – Células em mitose
CoQ – Coenzima Q10
CoQH2 – Ubiquinol
COX – Ciclo-oxigenase
COX-2 – Ciclo-oxigenase-2
CQH-1 – 3-oxo-friedelino
CQH-2 – 3 - hidroxifriedelano
CQH-3 – 3-oxo-16 β-hidroxifrielano
CQH-4 – tingenona + tingenina b
CQCl-1 – 3-oxo-29-hidroxifriedelano
DI50 - Dose de inibição de 50 %
Diclo – Diclofenaco de sódio
DMAPP – Dimetilalil pirofosfato
DMSO – Dimetilsulfóxido
DNA – Ácido desoxirribonucleico
DO – Densidade óptica
DPPH – 2,2-difenil-1-picril-hidrazila
E.P.M. – Erro padrão da média
EAcMG – Eluato acetônico
EAMG – Extrato acetônico da entrecasca
EClMG – Eluato clorofórmico
EDTA - Ácido etilenodiamino tetra-acético
EHMG – Eluato hexânico
ERO – Espécie reativa de oxigênico
FDA – Food and Drug Administration
FPP – Farnesil pirofosfato
GGPP – Geranilferanil pirofosfato
GMPc - Monofosfato cíclico de guanosina
GPP – Geranil pirofosfato
GPx – Glutationa peroxidase
HEPES – Ácido 4 –(2-hidroxietil)-1-piperazinoetanossulfônico
HepG-2 - Célula de hepatoma humano
HIS – Histidina
HRPII - Histidine rich protein II
IM – Índice mitótico
ip – Intraperitoneal
IgE – Imunoglobulina E
IL-1 - Interleucina 1
iNOS – Indutor óxido nítrico sintetase
INPA – Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia
IP – Isopreno
IPP – Isopentenil pirofosfato
LOX – Lisil oxidase
MDL50 – Mínima Dose Letal 50%
MTT – 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio
NADH – nicotinamida adenina dinucleótido hidreto
NADP – Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
NF-kB - Fator nuclear kappa B
O21- - Ânion superóxido
OH1- - Radical hidroxila
OMS – Organização Mundial da Saúde
PBS - Tampão de Fosfato e salina
PBS-T - Tampão de Fosfato e salina com Tween 20 à 0,05%
PG – Prostaglandina
PGE2 - Prostaglandina E2
ppm – Parte por milhão
psi – unidade de medida de pressão (libra força por polegada quadrada)
RMN – Ressonância magnética
RMN 13C – Ressonância magnética de carbono 13
RMN 1H - Ressonância magnética de hidrogênio 1
RNA – Ácido ribonucleico
rpm - Rotação por minuto
RPMI - Roswell Park Memorial Institute medium
SBF – Soro fetal bovino
SOD – Superóxido dismutase
SOD2 – Superóxido dismutase 2
TA – Total de anomalias
TMB – 3,3´,5,5´-Tetrametilbenzidina
TNF- - Fator de necrose tumoral - 
UV – Ultra violeta
UV-Vis – Ultravioleta-Visível
LISTA DE FÓRMULAS
H2O2 – Peróxido de Hidrogênio
KBr – Brometo de potássio
NaCl – Cloreto de sódio
NaHCO3 – Bicarbonato de Sódio
LISTA DE UNIDADES
m – nanômetro
M - namoMolar
g.mL-1 – nanograma por mililitro
µg.kg-1 – micrograma por quilograma
µg.mL-1 – micrograma por mililitro
µM – microMolar
mg/kg – Miligrama por quilograma
mg/mL – Miligrama por mililitro
mL – Mililitro
mM - miliMolar
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................................ - 23 1.1 Aspectos Gerais sobre o uso de plantas medicinais ................................................................ - 23 1.2 Metabolismo Secundário ......................................................................................................... - 25 1.3 Terpenos .................................................................................................................................. - 28 1.3.1 Biossíntese de Terpenos ................................................................................................... - 30 1.4 Família Celastraceae ............................................................................................................... - 33 1.5 Gênero Maytenus .................................................................................................................... - 34 1.6 Características da espécie Maytenys guianensis ..................................................................... - 42 1.7 Considerações sobre a atividade antioxidante ......................................................................... - 43 1.8 Considerações sobre genotoxicidade....................................................................................... - 47 1.8.1 Bioensaios na detecção da mutagenicidade...................................................................... - 49 1.9 Considerações sobre inflamação ............................................................................................. - 52 1.9.1 Plantas com atividade anti-inflamatória ........................................................................... - 53 1.10 Considerações sobre a malária .............................................................................................. - 55 1.10.1 Ciclo de vida do parasito e aspectos clínicos da doença ................................................ - 57 1.10.2 Busca por novos fármacos .............................................................................................. - 58 2. OBJETIVOS ................................................................................................................................. - 60 2.1 Geral ........................................................................................................................................ - 60 2.2 Específicos .............................................................................................................................. - 60 3 MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................................................... - 61 3.1 Estudo fitoquímico de Maytenus guianensis ........................................................................... - 61 3.1.1 Coleta do material vegetal ................................................................................................ - 61 3.1.2 Preparação do extrato acetônico e eluatos ........................................................................ - 62 3.1.3 Materiais e métodos cromatográficos............................................................................... - 62 3.1.4 Isolamento e purificação dos metabólitos secundários .................................................... - 63 3.1.5 Materiais e métodos para a elucidação das estruturas químicas das substâncias isoladas - 65 3.2 Avaliação da atividade antioxidante........................................................................................ - 66 3.3 Avaliação da atividade genotóxica .......................................................................................... - 67 3.4 Avaliação da atividade anti-inflamatória ................................................................................ - 68 -
3.4.1 Animais ............................................................................................................................ - 68 3.4.2 Edema de pata induzido por carragenina ......................................................................... - 68 3.4.3 Análise estatística ............................................................................................................. - 69 3.5 Solubilização do extrato acetônico da entrecasca, eluatos e substâncias isoladas .................. - 69 3.6 Avaliação da atividade citotóxica............................................................................................ - 70 3.6.1 Cultivo das células HepG2 ............................................................................................... - 70 3.6.2 Preparo das placas teste .................................................................................................... - 70 3.6.3 Teste de citotoxicidade ..................................................................................................... - 71 3.7 Avaliação da atividade anti-Plasmodium falciparum.............................................................. - 72 3.7.1 Cultivo do P. falciparum cepa 3D7 (sensível a cloroquina) ............................................ - 72 3.7.2 Sincronização dos parasitos para utilização nos testes in vitro ........................................ - 72 3.7.3 Preparo das placas para os ensaios de quimioterapia ....................................................... - 73 3.7.4 Teste imunoenzimático anti-HRPII .................................................................................. - 73 3.7.5 Análise Estatística ............................................................................................................ - 74 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................................. - 75 4.1. Determinação estrutural dos constituintes isolados da entrecasca de Maytenus guianensis .. - 75 4.1.1 Determinação estrutural de 3-oxo-friedelano (CQH-1) ................................................... - 75 4.1.2 Determinação estrutural de 3 - hidroxifriedelano (CQH-2) ........................................... - 80 4.1.3 Determinação estrutural de 3-oxo-16-hidroxifriedelano (CQH-3). ............................... - 86 4.1.4 Determinação estrutural de tingenona + tingenina B (CQH-4) ........................................ - 97 4.1.5. Determinação estrutural de 3-oxo-29-hidroxifriedelano (CQCl-1) ............................... - 108 4.2 Avaliação da atividade antioxidante...................................................................................... - 115 4.1 Avaliação da atividade genotóxica ........................................................................................ - 119 4.3 Atividade anti-inflamatória ................................................................................................... - 123 4.4 Atividade citotóxica .............................................................................................................. - 139 4.5 Atividade anti-P. falciparum ................................................................................................. - 142 5 CONCLUSÃO ............................................................................................................................. - 147 6 REFERÊNCIAS ........................................................................................................................... - 148 7. ANEXOS..................................................................................................................................... - 168 -
- 23 -
1. INTRODUÇÃO
1.1 ASPECTOS GERAIS SOBRE O USO DE PLANTAS MEDICINAIS
A definição da OMS para plantas medicinais diz que “são aquelas que têm uma
história de uso tradicional como agente terapêutico” As planta s podem ser classificadas de
acordo com sua ordem de importância, iniciando-se pelas empregadas diretamente na
terapêutica, seguidas daquelas que constituem matéria-prima para manipulação e, por último,
as empregadas na indústria para obtenção de princípios. As plantas medicinais têm sido
utilizadas tradicionalmente para o tratamento de várias enfermidades. Sua aplicação é vasta e
abrange desde o combate ao câncer até à microrganismos patogênicos (SILVA;
CARVALHO, 2004). As plantas, além de seu uso na medicina popular com finalidades
terapêuticas, têm contribuído, ao longo dos anos, para a obtenção de vários fármacos, até hoje
amplamente utilizados na clínica, como a emetina, a vincristina, a colchicina, a rutina. A cada
momento são relacionadas na literatura novas moléculas, algumas de relevante ação
farmacológica como o taxol e a artemisinina (CECHINEL FILHO, 1998).
As plantas medicinais são frequentemente utilizadas com o intuito de substituir ou
auxiliar as terapias convencionais no tratamento de várias doenças. Entre outros fatores, a
preferência na utilização das plantas medicinais decorre da facilidade de obtenção e do baixo
custo de produção. Porém, sabe-se que as plantas medicinais apresentam ampla diversidade
de metabólitos secundários com diferentes atividades biológicas (SIMÕES, 2007).
Como emprego medicinal poder-se-ia citar centenas de exemplos, porém alguns são
clássicos como é o caso da Papaver somniferum L. (Papaveraceae), vulgarmente conhecida
por papoula, planta usada para a extração do ópio, cujo componente majoritário é a morfina isolada por Setürner, princípio ativo empregado para combater a dor, desde 1803-04. Passado
mais de um século isolou-se desta mesma planta a codeína (Robiquet) e mais tarde a
papaverina (Merck). Indícios arqueológicos indicam seu uso há 4000 anos a.C. Outro
exemplo marcante é o da Digitalis purpurea L. e a Digitalis lanata Ehr., plantas que foram a
- 24 -
origem da descoberta de medicamentos para o coração. Delas extraíram-se glicosídeos
cardiotônicos chamados cardenolídeos, sendo os mais utilizados a digitoxina e a digoxina.
Estas plantas também têm uma longa história, pois egípcios e romanos faziam uso delas pelas
propriedades diuréticas e tóxicas. Foi durante a antiguidade Egípcia, Grega e Romana que se
acumularam conhecimentos empíricos transmitidos, principalmente pelos árabes, aos
herdeiros destas civilizações. Isto prova que, desde as mais antigas civilizações, as plantas são
utilizadas como fitoterápicos (HOSTETTMANN; QUEIROZ; VIEIRA, 2003; YUNES;
CECHINEL FILHO, 2001).
Nota-se nos últimos anos que o trabalho com plantas medicinais tem aumentado, pois
na década de 1990, registrou-se um aumento expressivo no interesse em substâncias derivadas
de espécies vegetais, evidenciado pelo crescimento de publicações dessa linha de pesquisa nas
principais revistas científicas das áreas de química e farmacologia (CALIXTO, 2000). Alguns
fatores têm contribuído para este aumento de interesse, e entre eles está a grande eficácia de
algumas substâncias antitumorais obtidas de plantas, como os alcalóides extraídos da espécie
vegetal Catharanthus roseus G. Don (Apocynaceae), originária de Madagascar, descobertos
no final dos anos 60, ainda considerados indispensáveis para o tratamento de leucemia assim
como os taxoides extraídos das espécies Taxus brevifolia Nutt. (Taxaceae) e T. baccata L.
para cânceres ginecológicos (HOSTETTMANN; QUEIROZ; VIEIRA, 2003). Outro fator que
incentiva o estudo com plantas é a complexidade na descoberta de novas drogas; atualmente
são necessários de sete a dez anos para o desenvolvimento do estudo completo. Embora seja o
quinto maior consumidor mundial de remédios, possua grande riqueza natural e amplo
patrimônio étnico-cultural, o mercado farmacêutico brasileiro ainda é dominado por
multinacionais (LOPES, 2004).
Em grande parte, os efeitos gerados pelos constituintes de uma planta no organismo
vivo são verificados baseando-se nos conhecimentos populares de uso repetitivo e tradicional.
Sabe-se que os vegetais e frutas possuem classes de agentes fitoquímicos com diversas ações
terapêuticas, como efeitos antioxidantes, antimutagênicos e até anticarcinogênicos
(KUSAMRAN; TEPSWAN; KUPRADINUN, 1998). Também existem diversos estudos
relacionados com a ação benéfica de plantas na modulação da resposta imunológica (LOPES,
2004). Pae et al. (2003), por exemplo, estudaram extratos de Catalpa ovata G. Don.,
tradicional planta ornamental da Coréia e verificaram importante ação inibitória da liberação
de óxido nítrico e TNF-α por macrófagos, o que caracteriza sua ação anti-inflamatória. Enfim,
os extratos de muitas plantas podem ser usados no tratamento de várias doenças humanas.
- 25 -
Estudos mostraram que 50% dos medicamentos aprovados entre 1981 e 2006, pelo
Food and Drug Administration (FDA), são direta ou indiretamente derivados de produtos
naturais. E que mais de 60% de medicamentos anticancerígenos têm sua origem em uma fonte
natural (FERREIRA; PINTO, 2010).
A indústria farmacêutica, motivada pela descoberta de quimioterápicos eficazes,
aumentou o interesse pelos medicamentos de origem vegetal, como a vimblastina e a
vincristina, alcaloides antitumorais isolados da vinca (ANDRADE et al., 2007). As atividades
terapêuticas no organismo são causadas por componentes químicos chamados de princípios
ativos (metabólitos secundários). Há uma grande busca por processos que os identifiquem e
caracterizem, comprovando sua eficácia (OLIVEIRA et al., 2006a).
1.2 METABOLISMO SECUNDÁR IO
Dá-se o nome de metabolismo ao conjunto de reações químicas que continuamente
estão ocorrendo em cada célula. A presença de enzimas específicas garante uma certa direção
a essas reações, estabelecendo o que se denomina rotas metabólicas. Os compostos químicos
formados, degradados (ou simplesmente transformados) são chamados de metabólitos e as
reações enzimáticas envolvidas, são designadas como anabólicas, catabólicas ou de
biotransformação (SANTOS, 2007).
A atividade metabólica é uma característica intrínseca dos seres vivos. O metabolismo
nada mais é do que o conjunto de reações químicas que ocorrem no interior das células, no
caso das células vegetais, o metabolismo costuma ser dividido em primário e secundário
(SIMOES et al., 2007).
Entende-se por metabolismo primário o conjunto de processos metabólicos que
desempenham uma função essencial no vegetal, tais como a fotossíntese, a respiração e o
transporte de solutos. Os compostos envolvidos no metabolismo primário possuem uma
distribuição universal nas plantas. Esse é o caso dos aminoácidos, dos nucleotídeos, dos
lipídios, carboidratos e da clorofila (SANTOS, 2007).
Em contrapartida, o metabolismo secundário origina compostos que não possuem uma
distribuição universal, pois não são necessários para todas as plantas. Como consequência
prática, esses compostos podem ser utilizados em estudos taxonômicos na elucidação da
- 26 -
quimiossistemática de plantas medicinais e no desenvolvimento de novos agentes terapêuticos
no combate a patógenos e com efeitos curativos como cicatrizantes e anestésicos e outros
(YUNES; CALIXTO, 2001).
A produção destes componentes pode ter várias funções, dentre estas, proteger a planta
da herbivoria, do ataque de patógenos, bem como beneficiá-la na competição com outros
vegetais. Além disso, favorecem a atração de polinizadores, de dispersores de sementes, bem
como microorganismos simbiontes. Acrescidos a estes fatores bióticos, a produção de
metabólitos secundários também protege o vegetal de influências externas, como temperatura,
umidade, exposição a luz ultravioleta (UV) e deficiência de nutrientes minerais (PERES,
2004).
A síntese de metabólitos secundários pode ser afetada por condições ambientais
(fatores edafoclimáticos), por representarem uma interface química entre as plantas e o meio
ambiente circundante. Os vegetais respondem a estímulos ambientais bastante variáveis, de
natureza física, química ou biológica, fatores tais como fertilidade e tipo do solo, umidade,
radiação solar, vento, temperatura e poluição atmosférica, dentre outros, podem influenciar e
alterar a composição química dos vegetais (GOBBO-NETO; LOPES, 2007).
Ainda não se conhece com exatidão, como esses produtos são formados pelas células
vegetais, e uma das questões que se busca responder é “como as plantas regulam a produção
destas substâncias”, e o resultado deste questionamento levaram a elucidação das principais
vias metabólicas conhecidas, a via do piruvato, a via do mevalonato e a via do ácido
chiquímico. Atualmente estima-se que existam cerca de 10.000 metabólitos secundários
conhecidos e supõe-se que este número ultrapasse 100.000 na natureza, oriundos em sua
maioria destas três vias metabólicas (CARVALHO, 2004a; SANTOS, 2007; YUNES;
CALIXTO, 2001). Existem três grandes grupos de metabólitos secundários: terpenos,
compostos fenólicos e alcalóides conforme exemplifica a Figura 1 (BARBOSA, 2008).
O metabolismo primário em sua essência é geral a todos os vegetais, contudo o
metabolismo secundário apresenta rotas não tão gerais e talvez só sejam ativadas durante
alguns estágios particulares de crescimento e desenvolvimento, ou em períodos de estresse
causados por fatores bióticos ou abióticos (CARVALHO, 2004a; SANTOS, 2007).
- 27 -
FIGURA 1 - Principais vias do metabolismo secundário e suas interligações.
CO2
fotossíntese
Metabolismo Primário do Carbono
Eritrose-4fosfato
piruvato
fosfoenolpiruvato
Ciclo do
Ácido
Tricarboxílico
3-fosfoglicerato
Acetil-Co A
Aminoácidos
alifáticos
Via do
Ácido
Chiquímico
Aminoácidos
Aromáticos
Via do Ácido
Malônico
Via do Ácido
Mevalônico
Via do
metileritritol
fosfato
Alcalóides
Terpenos
Compostos
Fenólicos
Metabolismo Secundário do Carbono
Fonte: adaptado de BARBOSA (2008).
Na Figura 1 pode-se observar as várias vias deste processo e suas especificidades. Os
terpenos formam o maior grupo de metabólitos secundários, com cerca de 29.000 compostos
conhecidos, incluindo os esteroides. São estruturas que contém esqueleto carbônico derivados
da condensação de unidades de isoprenos, e que apresentam uma classificação de acordo com
- 28 -
a quantidade de átomos na cadeia carbônica, onde: monoterpenos (C10), sesquiterpenos
(C15), diterpenos (C20), triterpenos (C30) e tetraterpenos (C40) (BIESKI, 2004).
Os fenóis são substâncias que tem pelo menos um grupo hidroxila ou derivado
funcional ligado a um sistema aromático. O número e variedades dos fenóis fazem deles um
importante grupo de substâncias das plantas, como por exemplo as cumarinas, ligninas,
flavononas, flavonas, antocianidinas entre outras. As lignanas são dímeros encontradas na
natureza, obtidas a partir do acoplamento fenólico oxidativo de monômeros derivados do
acido chiquímico que é o precursor de muitos metabolitos com unidades básica C6-C3
(SIMOES et al., 2007).
Os alcalóides são compostos azotados complexos, de natureza básica, capazes de
geralmente produzir efeitos fisiológicos. São, na maior parte dos casos, venenos vegetais
muito ativos, dotados de uma ação específica. A medicina emprega-os normalmente em
estado puro e o seu verdadeiro valor apenas se releva quando usados adequadamente pelo
médico (CARVALHO, 2004a).
1.3 TERPENOS
Os terpenos são conhecidos pelas suas importantes funções biológicas e fisiológicas
e, por isso, muitos são utilizados na área farmacêutica. Inicialmente eram conhecidos como
sendo originados nas plantas superiores através da via biossintética do acetato-mevalonato a
partir de unidades do isopreno que vão se ligando entre si, orientados em sentido inverso
(cabeça-cauda). No entanto, a partir da descoberta da via do não-mevalonato, o conceito da
biossíntese dos terpenóides passou por algumas mudanças. Nas plantas superiores, a via
convencional opera, principalmente, no citoplasma e mitocôndrias e sintetiza esteróides e
sesquiterpenos preferencialmente, porém a via não-mevalonato opera no plastídio sintetizando
todas as outras classes de terpenos incluindo carotenoides e clorofila (NIERO; MALHEIROS,
2009).
São conhecidos cerca de 30.000 terpenos, classificados de acordo com o número de
unidades de isopreno em: hemiterpenóides, C5; monoterpenóides C10; sesquiterpenóides C15;
diterpenóides, C20; triterpenoide, C30 e tetraterpenóides, C40 (DUBEY et al., 2003). Eles
- 29 -
apresentam funções variadas nos vegetais. Os monoterpenos são os principais constituintes
dos óleos voláteis, atuando na atração de polinizadores. Os sesquiterpenos, em geral,
apresentam funções protetoras contra fungos e bactérias, enquanto muitos diterpenóides dão
origem aos hormônios de crescimento vegetal. Os triterpenoides e seus derivados esteroidais
apresentam uma gama de funções como proteção contra herbívoros, antimitóticos, atuantes na
germinação das sementes e na inibição do crescimento da raiz (DUBEY et al., 2003; NIERO;
MALHEIROS, 2009).
Os monoterpenos podem ocorrer em pêlos glandulares, células parenquimáticas
diferenciadas e em canais oleíferos. Eles podem estar estocados em flores, como as de
laranjeira, folhas, como no capim-limão, nas cascas dos caules, como na canela, na madeira,
como no sândalo ou no pau-rosa, e em frutos como nos de erva-doce (PERES, 2004).
Os sesquiterpenoides são encontrados nos óleos essenciais e em hormônios vegetais,
constituindo a maior classe de terpenóides (OLIVEIRA et al., 2006a).
Os diterpenoides compreendem um grande grupo de compostos não voláteis,
possuindo uma vasta gama de atividades diferentes que incluem os hormônios, ácidos
resínicos e agentes anticancerígenos (OLIVEIRA; GODOY; COSTA, 2003). Peres (2004)
descreveu que provavelmente o principal papel desempenhado por um diterpeno seja o das
giberelinas, as quais são importantes hormônios vegetais responsáveis pela germinação de
sementes, alongamento caulinar e expansão dos frutos de muitas espécies vegetais.
Os triterpenoides formam os componentes das resinas, látex, ceras e cutícula das
plantas. Entre os triterpenos está uma importante classe de substâncias, os esteróides, os quais
são componentes dos lipídios de membrana e precursores de hormônios esteróides em
mamíferos, plantas e insetos. Outra classe importante de triterpenos são as saponinas. Como o
próprio nome indica, as saponinas são prontamente reconhecidas pela formação de espuma
em certos extratos vegetais. Essas substâncias são semelhantes ao sabão porque possuem uma
parte solúvel (glicose) e outra lipossolúvel (triterpeno). Nas plantas, as saponinas
desempenham um importante papel na defesa contra insetos e microorganismos (PERES,
2004).
Os tetraterpenoides são carotenoides, pigmentos responsáveis pela coloração
amarela, laranja, vermelha e púrpura dos vegetais, apresentando função essencial na
fotossíntese e, especialmente, na pigmentação de flores e frutos. Os politerpenoides são
- 30 -
aqueles com mais de oito unidades de isopreno, ou seja, com mais de 40 carbonos na sua
estrutura, como os longos polímeros encontrados na borracha (OLIVEIRA; GODOY;
COSTA, 2003).
1.3.1 BIOSSÍNTESE DE TERPENOS
O isopreno (IP) é produzido naturalmente, mas não está envolvido diretamente na
formação dos produtos pertencentes a estas classes. As unidades bioquimicamente ativas de
isopreno são na realidade o dimetilalill pirofosfato (DMAPP) e o isopentenil pirofosfato
(IPP), Figura 2 (YUNES; CECHINEL FILHO, 2009).
FIGURA 2 - Substâncias envolvidas na biossíntese de terpenos .
OPP
OPP
IP
DMAPP
IPP
Fonte: YUNES; CECHINEL FILHO, (2009).
A adição de uma unidade do DMAPP ao carbono ativo C5 do IPP, gera o isômero
geranil pirofosfato (GPP, C10). Subsequentemente a cada adição de uma unidade de isoprenil
pirofosfato forma sucessivamente os prenilados pirofosfatos superiores como o farnesil
pirofosfato (FPP, C15) e o geranilferanil pirofosfato (GGPP, C20). Uma condensação de duas
unidades de IPP ou GPP gera os triterpenos e tetraterpenos, respectivamente (DUBEY et al.,
2003). Na natureza a maioria dos terpenóides não ocorre na sua forma linear, existindo sob a
forma de estruturas cíclicas, obtidas através de reações de oxidação, redução, hidratação e
isomerização, levando a uma grande variedade estrutural (MAHMOUD; CROTEAU, 2002).
A Figura 3 representa a síntese geral de formação de alguns terpenóides encontrados em
plantas superiores.
Os friedelanos são os triterpenos mais frequentemente isolados da família
Celastraceae. A co-ocorrência de friedelanos e quinonemetídeos em várias espécies, tanto em
plantas inteiras como em culturas de células, levou CORSINO et al. (2000) a propor uma rota
biogenética sobre a relação destes dois tipos de triterpenoides. A Figura 4 mostra a conversão
- 31 -
de 3-oxidosqualeno para friedelanol e 3-oxo-friedelano e o seu envolvimento como o
precursor biossintético da quinona metide.
FIGURA 3 - Biossíntese geral de formação de terpenóides.
OPP
OPP
DMAPP
Hemiterpenos
IPP
Fitoesteróides
GPP Sintase
Geranilpirofosfato
Triterpenos
C30
Monoterpenos
(GPP, C10)
Óleos
Essenciais
FPP sintase + IPP
Esqualeno
dimerização
Farnesilpirofosfato
(FPP, C15)
Sesquiterpenos
GGPP sintase + IPP
Saponinas
Geranilgeranilpirofosfato
(GGPP, C20)
(+ IPP)n
Politerpenos
Fonte: YUNES; CECHINEL FILHO, (2009).
Diterpenos
Carotenóides
Clorofila
- 32 -
FIGURA 4 - Conversão de 3-oxidosqualeno para friedelanol e 3-oxo-friedelano e o
seu envolvimento como o precursor biossintético do quinonametídeo.
O
Oxidosqualeno
Ciclase
H
H
H
Friedelanol
HO
Oxidoredutase
H
H
H
Friedelina
O
O
HO
Fonte: CORSINO et al., (2000).
H
Quinonametídeo
- 33 -
1.4 FAMÍLIA CELASTRACEAE
A família Celastraceae distribui-se nas regiões tropical e subtropical, incluindo o
norte da África, América do Sul e Ásia, particularmente na China contendo 98 gêneros e
aproximadamente
1.264
espécies
(DUARTE
et
al.,
2010;
SPIVEY;
WESTON;
WOODHEAD, 2002). No Brasil, essa família é representada por quatro gêneros: Maytenus
Juss., Austroplenckia Lund., Franhofera Mart. E Salacia Mart. (OLIVEIRA et al., 2006b).
De acordo com Joly (1998) apud Dias et al. (2005), a família Celastraceae
“apresenta plantas lenhosas, arbustivas ou arbóreas. As folhas são inteiras, sem estípulas com
disposição oposta ou alterna. As flores são hermafroditas ou unissexuais, pequenas de
simetria radial”.
Segundo Fonseca et al.(2007), a família Celastraceae possui espécies com grande
importância terapêutica, pois apresentam uma grande variedade de atividades farmacológicas,
como ação antiulcerogênica, inseticida, imunossupressora, ação curativa de feridas na pele,
antirreumática, antibacteriana e tratamento de câncer de pele.
Espécies da Família Celastraceae, ressaltando o gênero Maytenus, tem sido objeto de
inúmeras investigações fitoquímicas e muitos metabólitos secundários apresentam atividades
biológicas. As principais classes de metabólitos descritos incluem os triterpenos pentacíclicos
friedelânicos e quinonametídeos, os sesquiterpenos, os secofriedelanos, os esteróides, os
derivados agarofurânicos, os glicosídeos, as proantocianidinas, os flavonóides glicosilados, os
alcaloides piridínicos sesquiterpênicos e as catequinas.
As principais classes de compostos isolados são triterpenos, sesquiterpenos,
alcaloides, flavonoides e esteroides glicosilados (BAZZOCCHI et al., 2008; CHAVES et al.,
1999; CORSINO et al., 1998; CORSINO et al., 2003; DUARTE, et al., 2012; PINHEIRO,
1980; SILVA et al., 2008; SOUSA et al., 2012). Dessas classes, os triterpenos pentacíclicos
são os mais abundantes, dentre os quais destacam-se: friedelanos, quinonametídeos,
oleananos, ursanos e lupanos. Vários triterpenos pentacíclicos e seus derivados foram
reportados na literatura por apresentarem atividade biológica (ALLISON et al., 2001;
ALMEIDA
et
al.,
2010;
ALVARENGA;
FERRO,
2006;
ANTONISAMY;
DURAIPANDIYAN; IGNACIMUTHU, 2011; CORSINO et al., 2003; DING et al., 2010;
FONSECA et al., 2007; FORMIGONI et al., 1991; JORGE et al., 2004; KENNEDY et al.,
2011; KVIST et al., 2006; LIMA et al., 2010; SANTOS et al., 2013).
- 34 -
1.5 GÊNERO MAYTENUS
O gênero Maytenus é o maior e mais diversificado da família Celastraceae e está
inserido na subfamília Celastroideae, seção Oxphylla, que é restrita a América do Sul
(CARVALHO-OKANO; LEITÃO FILHO, 2005).
Este gênero foi estabelecido por Molina (1782) (LOURTEIG; O´DONELL 1955,
apud OKANO, 1992) baseado na espécie Maytenus boaria Molina, do Chile. Segundo o autor
o gênero se caracterizava por apresentar cálice monossépalo, corola monopétala, androceu
com 2 estames e fruto monospérmico. Estas características não correspondem ao gênero, e
foram reconhecidas pelo autor em 1810, atribuindo as falhas em sua descrição ao tamanho
pequeno das flores, associado e inexistência de melhores equipamentos (PESSUTO, 2006).
Este gênero possui cerca de 200 espécies tropicais; dentre estas, 76 espécies e 14
variedades são encontradas no Brasil, principalmente na Região Sul (NEGRI; POSSAMAI;
NAKASHIMA, 2009). Espécimes deste gênero são encontradas na floresta amazônica,
floresta atlântica, cerrado, restinga, caatinga e no campo rupestre. Muitas espécies deste
gênero são utilizadas na medicina popular, morfologicamente, esse gênero é formado por
árvores, arbustos ou subarbustos. As folhas têm forma variada, que pode ser crenada, serrada
ou aculeada nas margens. Possuem flores inconspícuas, esverdeadas e fruto cápsula
(CARVALHO-OKANO; LEITÃO-FILHO, 2005).
De acordo com Carvalho-Okano e Leitão-Filho (2004), o gênero Maytenus é
considerado pantropical; cerca de 40% das espécies ocorrem no Brasil, incluem
representantes arbóreos, arbustivos e subarbustivos, com porte variando entre 1,5-8,0 m e
árvores de até 20 m. Seus ramos são geralmente eretos, simples ou bastante ramificados na
porção apical com entrenós expostos na maioria das espécies, seus ramos podem ser
cilíndricos, achatados, retangulares ou carenados com suas superfícies variando entre de
galbra a pilosa e sem espinhos (PESSUTO, 2006).
Pessuto (2006) relata que as folhas são extremamente variáveis no gênero e entre
indivíduos de uma mesma espécie, e, segundo Loesener (1942) apud Okano (1992) a filotaxia
do gênero Maytenus pode ser alterna ou oposta, sendo mais frequentemente a disposição
alterna.
Pessuto (2006) ressalta que a forma e as dimensões da lâmina foliar nas espécies
deste gênero são muito variáveis incluindo desde formas suborbiculares até cordadas, ovais e
- 35 -
obovais, elípticas e estreitamente elípticas e oblongas, a lâmina é basicamente plana na
maioria das espécies. As inflorescências são axilares e cimosas, as flores são pequenas e
inconspícuas variando entre 3 – 5 mm de comprimento com coloração branco-esverdeada.
Em relação aos frutos são coriáceos ou subcarnosos, deiscentes, capsulares,
loculicidas, bivalvares, suas sementes são eretas, suborbiculares, elipsoides ou obovais e as
vezes angulares em número variável de 1 a 4 por fruto envoltas inteiramente pelo aríolo
(PESSUTO, 2006).
As espécies Maytenus ilicifolia Martius ex Reiss e M. aquifolium Mart. são exemplos
de plantas da família Celastraceae que são amplamente utilizadas na medicina popular
brasileira. São ingeridas na forma de infusão aquosa para o tratamento de úlcera gástrica e
outras afecções intestinais (OLIVEIRA et al., 2006b). As cascas de Maytenus rigida são
utilizadas para o tratamento de inflamação, úlcera e diarréia (ROCHA et al., 2004). A
atividade antiulcera também foi reportada para as espécies Maytenus truncata (SILVA et al.,
2005) e Austroplenckia populnea (ANDRADE et al., 2006).
Muitos metabólitos bioativos foram isolados de espécies de Maytenus (Quadro 1), e
estes vêm apresentando várias propriedades biológicas, tais como ação antiulcerogênica
(QUEIROGA et al., 2000; SOUZA-FORMIGONI et al., 1991), atividade antitumoral
(SHIROTA et al., 1994), inseticidas (MADRIGAL et al., 1985), ação anti-inflamatória
(SOSA et al., 2007), potencial herbicida (SILVA, 2007), atividade antioxidante
(NOGUEIRA, 2009; PESSUTO, 2006; SILVA et al., 2009a), atividade antiplasmodial
(MALEBO et al., 2009; MUTHAURA et al., 2011), efeito antinociceptivo (MARTINS et al.,
2012), ação antimicrobiana (GONZALEZ et al., 1995; LINDSEY et al., 2006; RODRIGUES
et al., 2012), atividade antiprotozoária (MALEBO et al., 2009; SANTOS et al., 2012;
SANTOS et al., 2013).
- 36 -
QUADRO 1 - Metabólitos secundários isolados de algumas espécies do gênero
Maytenus.
Maytenus acanthophylla
OLIVEIRA et al., (2006b)
H
O
H
O
H
HO
H
H
HO
HO
-Sitosterol
O
Tingenona
11 -hidroxi-Lup-20(29)-en-3-ona
COOCH3
HO
O
HO
O
O
HO
HO
Pristimerina
20-hidroxi-20-epi-Tingenona
HO
Lup-20(29)-en-311-diol
Maytenus amazônica
CHAVES, et al., (1999)
H
H
O
H
O
O
O
OH
HO
HO
HO
HO
OH
HO
O
OH
23-nor-6-oxo-Tingenol
O
(7S,8S)-7- hidroxi-7,8-dihidroTingenona
7,8-dihidro-6-oxo-Tingenol
H
O
H
HO
HO
H
O
23-oxo-isotingenona III
Maytenus aquifolium
CORSINO et al., (2003)
OH
OH
OMe
HO
O
HO
O
OH
OH
OH
OH
OH
OH
(+) ouratea-Catequina
- 37 -
Epigalocatequina
Maytenus blepharodes
LEON; LOPEZ; MOJUIR, (2010)
COOMe
COOH
HO
HO
HO
HO
HOOC
O
HOOC
Zeilasterona
O
Dimetilzeilasterona
Maytenus chuchuhuasca
MORITA et al., (2008)
COOH
O
O
H
HO
H
O
MeO
O
3-metil-6-oxo-Tingenol
OH
H
O
HO
HO
22 - hidroxi-Tingenona
Celastrol
COOMe
H
HO
HO
O
6 – oxo-Pristimerol
Maytenus distichophylla
DUARTE, et al., (2012)
OH
O
OH
OH
O
O
O
O
OH
6,12-dihidroxi-3,16,21-trioxoFriedelano
12-Hidroxi-3-oxo-Friedelano
9-hidroxi-3-oxo-Friedelano
Maytenus guianensis
MACARI, et al., (2004); PINHEIRO, (1980); SOUSA et al., (1986)
CH2OH
OH
OMe
HO
O
OH
H
HO
H
HO
H
H
OH
OH
O
OH
OH
CH2OH
dulcitol
HO
H 3C
OH
N
CH3
N,N-dimetilserina
- 38 -
4-metil-Epigalocatequina
HO
O
-Sitosterol
O
O
-Sitostenona
3,7-dioxo-Friedelano
OCH3
OCH3
HO
HO
O
AcO
OH
OH
O
AcO
OH
OH
OAc
O
OAc
OH
OH
OH
OH
Me
HO
4´-O-metil-(-)-epigalocatequina
O
OCH3
OH
O
AcO
OH
O
Me
O
OH
O
OH
CH3
C
C
Me
OH
N
Proantocianidia A
Evonina
AcO
AcO
OAc
AcO
OCOPh
O
Me
AcO
O
OH
O
Me
O
CH3
C
O
OH
C
N
Wilfordina
Maytenus gonoclada
SILVA et al., (2009b)
O
O
3-oxo-Friedelano
OH
3-Hidroxifriedelano (Friedelinol)
O
3,11-Dioxo-Friedelano
O
- 39 -
OH
OH
O
O
O
3,16-dioxo-Friedelano
12-hidroxi-3-oxo -Friedelano
O
29-Hidroxi-3-oxo-Friedelano
HO
HO
3-Taraxerol
-Amirina
HO
Lupeol
Maytenus ilicifolia
COSTA et al., 2008; MARIOT; BARBIERI, (2007); QUEIROGA et al., (2000).
COOCH3
O
HO
Pristimerina
HO
O
3-Hidroxifriedelano
3-oxo-Friedelano (Friedelina)
OH
OH
HO
HO
O
O
OH
OH
OH
OH
OH
O
O
Quercetina
Canferol
Maytenus imbricata
RODRIGUES et al., (2012); SILVA, (2007); SILVA et al., (2007)
HO
HO
O
HO
11-hidroxi-Lup-20(29)-en-3-ona
3, 11  - di – hidroxi-Lup-20(29)en-3-ona
O
O
3,7-dioxo-Friedelano
- 40 -
HOCH2
O
O
HO
O
HO
HO
O
H
O
6-oxo-Tingenol
Tingenona
29-hidroxi-3-oxo-Friedelano
HOOC
Ácido 3,4-seco-Friedelan-3-óico
Maytenus obtusifolia
SILVA et al., (2008)
OH
HOOC
O
O
O
29-hidroxi-3-oxo-Friedelano
3,7-dioxo-Friedelano
Ácido 3,4-seco-Friedelan-3-óico
OH
OMe
HO
O
OH
H
OH
HO
HO
H
H
3-hidroxi-9,12-en-Oleanane
OH
3-hidroxi-11,13-en-Oleanano
OH
HO
OH
OH
OH
O
OH
OH
OMe
HO
O
HO
OH
HO
HO
4´-O-methyl-(_)-Epigalocatecina
O
OH
O
OH
HO
OH
OH
OH
HO
Catequina
Epicatequina (12)
ouratea-Proantocianidina
Maytenus robusta
SOUSA et al., (2012)
OH
O
OH
O
O
- 41 -
3-oxo-Friedelano
3-Hidroxifriedelano
21-hidri-3,15-dioxo-Friedelano
HO
HO
HO
HO
3,11-dihidroxifriedelano
O
O
29-hidri- 3-oxo-Friedelano
11-hidri-3-oxo-Friedelano
Maytenus salicifolia
MAGALHÃES et al., (2011)
HOH2C
HOH2C
O
O
HO
O
30-hidroxi-3-oxo-Friedelano
Lup-20(29)-en,30-diol
3,16-dioxo-Friedelano
CH2OH
HO
Betulina
Maytenus senegalensis
LINDSEY et al., (2006); SOSA et al., (2007)
COOH
COOH
H
H
H
H
H
O
O
Ácido 3-oxo-Friedelan-20-óico
H
Ácido Maitenóico
O
Lupenona
H
H
H
H
H
HO
-Sitosterol
H
HO
-Amirina
H
H
- 42 -
1.6 CARACTERÍSTICAS DA ESPÉCIE Maytenys guianensis
Maytenus guyanensis é uma árvore endêmica de terra firme, encontrada em algumas
áreas da floresta Amazônica, principalmente no Peru, Equador e Colômbia, é conhecida como
chichuá, xixuá, chuchahuasi, chucchu huashu, chuchuasi, chuchasha e tonipulmon (BORRÁS,
2003; DUCKE; VASQUEZ, 1994; REVILLA, 2002b).
Suas folhas são oblongas lanceoladas ou elípticas, inteiras, acuminadas, coriáceas e
lustrosas na face superior, de 10 - 20 cm de comprimento e 3 - 4 cm de largura, cartácea, veia
central proeminente em ambas as faces, secundárias inconspícuas; ápice acuminado a
cuspiado com pecíolo de 4 mm de largura, inflorescência axilar, flores numerosas, pentâmeras
diminutas, cálice colorido com dentes decíduos e pétalas obovadas de cor branca, o fruto em
forma de cápsula ovóide, sementes oblongas com arilo branco (REVILLA, 2001; 2002a;
2002b). O tronco é cilíndrico com base acanalada. Riditoma sulcado marrom-amarelado;
desprendimento em placas papiráceas (RIBEIRO et al., 1999).
O pó vermelho da casca da raiz dessa planta é usado pelos indígenas na forma de
infusão alcoólica como um tônico geral, para o tratamento de reumatismo, como
contraceptivo e como afrodisíaco. Para o uso tópico, é empregada como agente antitumoral
em câncer de pele e, também, para o tratamento de feridas (DA SILVA, 1990). Suas raízes e
caule também são utilizados como analgésico, anti-inflamatório, afrodisíaco, relaxante
muscular, antireutmático e antidiarréico. A espécie também é indicada no tratamento de
artrite, impotência, resfriado, bronquite, hemorróidas, verminoses, lumbago, úlceras externas
e usos ginecológicos (BORRAS, 2003). Como cosmético é utilizado nas erupções cutâneas e
prevenção do câncer de pele (REVILLA, 2002a).
Na forma de tintura é utilizada como relaxante muscular, para artrire e reumatismo;
em decocção usa-se uma parte da casca (cerca de 2 a 5 centímetros em 2 litros de água); para
artrite e reumatismo foi relatado o uso de uma xícara (café) 3 vezes ao dia, por uma semana
(BORRAS, 2003). A decocção dos galhos é considerada segundo Ducke e Vasquez (1994)
como estimulante e tônico.
Desta espécie, até o momento, foram estudados o cerne (PINHEIRO, 1980) e a casca
(LIMA; VARGAS; POHLIT, 2010; MACARI et al., 2004 e 2006; SOUSA et al., 1986). Em
sua dissertação de mestrado Pinheiro (1980) realizou o estudo do extrato etanólico do cerne,
que resultou no isolamento dos metabólitos secundários: dulcitol, N,N-dimetilserina, sitosterol,
-sitostenona,
3,7-dioxo-friedelano,
proantocianidia
A
e
4´-O-metil-(-)-
- 43 -
epigalocatequina (Quadro1); Sousa et al.(1986) realizaram o estudo do extrato etanólico da
raíz e isolaram os alcaloides sesquiterpênicos wilfordina e evonina (Quadro 1) e por fim
Macari et al.(2004) realizaram o estudo químico do extrato etanólico da casca da espécie,
resultando no isolamento do flavonóide 4-metilepigalocatequina (Quadro 1).
Para avaliar o potencial farmacológico de M. guianensis, Lima, Vargas e Pohlit
(2010), realizaram testes de atividade antiedematogênica e antiplaquetária do extrato etanólico
da casca, os resultados obtidos foram significativos quando o extrato foi administrado
oralmente (400 mg de extrato/kg de peso corporal de camundongo) com redução do edema
em 40% quando comparado com carragenina, também obtiveram resultados significativos
para a atividade antiplaquetária, com IC50 142 ± 14,3, 133 ± 2,3 e 166 ± 0,3 µg/mL, para
agregação plaquetária induzida por adrenalina, difosfato de adenosina ou ácido araquidônico,
respectivamente.
1.7 CONSIDERAÇÕES SOBRE A ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
A presença de radicais livres em materiais biológicos foi descoberta em meados de
1950, sendo que, em 1956, Denham Harman elaborou a hipótese de que radicais de oxigênio
poderiam ser formados como subprodutos de reações enzimáticas in vivo. Assim, ele
descreveu os radicais livres como a “caixa de pandora” responsável por danos celulares para
algumas enfermidades, como o processo de mutagênse, o câncer, o processo degenerativo do
envelhecimento biológico, dentre outros (DROGE, 2002).
A oxidação é inerente à vida aeróbica e, dessa forma, os radicais livres são
produzidos naturalmente. Essas moléculas geradas in vivo estão envolvidas na produção de
energia, fagocitose, regulação do crescimento celular, sinalização intercelular e síntese de
substancias biológicas importantes (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006).
Muitos compostos oxidantes ou pró-oxidantes, possuem atividade carcinogênica e
mutagênica e atuam através da formação de radicais de oxigênio também chamados de
espécies reativas de oxigênio (ERO). A maioria das reações dos radicais livres envolve a
redução do oxigênio molecular levando à formação de ERO como ânion superóxido (O21-) e
radical hidroxila (OH1-). Em geral, as espécies ativas de oxigênio (Quadro 2) são essenciais
para muitas funções celulares, entretanto, podem causar danos oxidativos aos componentes
celulares, contribuindo para o envelhecimento e doenças degenerativas. Assim, a proteção dos
- 44 -
componentes celulares contra as modificações oxidativas pode ser estabelecida com o uso de
antioxidantes (GOUVEA, 2004).
QUADRO 2 - Espécies reativas do oxigênio.
O2●1-
Ânion superóxido ou radical superóxido
HO2●
Radical perhidroxil
H2O2
Peróxido de hidrogênio
HO●1-
Radical hidroxila
RO●1-
Radical alquila
ROO●1- Radical peróxido
ROOH
Hidroperóxido orgânico
1
Oxigênio singlet
O2
RO●1-
Carbonila excitada
Fonte: SILVA (2010).
A formação endógena de ERO ocorre pela mitocôndria, tratando-se de um processo
fisiológico contínuo que ocorre em condições anaeróbicas e por enzimas envolvidas em
reações de óxido-redução em outros compartimentos celulares. Tem sido estabelecido que
cerca de 1-2% do oxigênio consumido pela mitocôndria sofre redução univalente, produzindo
o ânion superóxido (O21-) ao nível da coenzima Q e do complexo NADH-CoQ redutase e em
solução aquosa o ânion superóxido sofre dismutação espontânea, Reação 01 (GOUVEA,
2004) :
2O21- + 2H1+
H2O2
+ O2
Reação 01
Devido a sua configuração eletrônica, o oxigênio molecular (O2), principal oxidante
em virtude do metabolismo aeróbico, tende a receber um elétron de cada vez, o que acarreta
na formação de compostos intermediários altamente reativos - EROs (Reação 02). O primeiro
composto obtido é o ânion superóxido, que é gerado pela reação entre moléculas de
substâncias que participam da cadeia de transporte de elétrons na mitocôndria e no retículo
endoplasmático. As células fagocitárias também produzem o ânion superóxido como parte do
mecanismo de defesa imunológica para eliminar microorganismos patogênicos; porém nas
- 45 -
doenças inflamatórias crônicas esta produção torna-se excessiva, provocando lesões nos
tecidos (LEITE; SARNI, 2003).
O2
e-
O21-
1+
e- + 2 H
H2O2
1+
e- + H
1+
OH1- e + H
H2O
Reação 02
H2O
Uma vez formados, os radicais livres buscam estabilizar-se, cedendo ou capturando
um elétron de espécies vizinhas. Estas, por sua vez, viram radicais livres e se estabilizam,
tomando ou cedendo elétrons de outras substâncias. Criando-se dessa forma uma reação em
cadeia que termina por alterar a conformação, a estrutura ou as funções das proteínas,
fosfolipídios de membrana, ácidos nucléicos e outros componentes celulares (RIEGEL, 2002).
Grande parte das moléculas biológicas podem ser oxidadas pelos radicais livres, no
entanto, Cheeseman e Slater (1993) citam que os lipídeos são os mais afetados pelo estresse
oxidativo. As consequências oriundas da lesão de lipídeos pelos radicais livres são
evidenciadas quando estas moléculas alteram a função metabólica, a permeabilidade e, como
consequência, a fluidez de substâncias entre o meio intra e extracelular e até danos ao DNA
intracelular, o que em última instância altera e prejudica o metabolismo intracelular, podendo
inclusive ocasionar morte celular (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007).
A mitocôndria possui um sistema antioxidante de defesa, que consiste em uma série
de enzimas como a peroxidase, superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase,
glutationa redutase e nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP) transidrogenase, bem
como compostos como NADPH e vitaminas E e C. Em condições, nas quais um excesso de
ERO são geradas na mitocôndria e seu sistema antioxidante de defesa está em exaustão, é
criado um estado de estresse oxidativo, levando a danos da mitocôndria (GOUVEA, 2004).
O excesso de radicais livres no organismo é combatido por antioxidantes produzidos
pelo corpo ou absorvidos através da alimentação. Quando há um desbalanço entre a produção
de radicais livres e os mecanismos de defesa antioxidante, ocorre o chamado “estresse
oxidativo”. Os radicais livres em excesso podem ser originados por defeitos na respiração
mitocondrial, metabolismo do ácido araquidônico, ativação-inibição de sistemas enzimáticos
ou por fatores exógenos, como poluição, habito de fumar ou ingerir álcool, ou ainda, por uma
nutrição inadequada (NUNEZ-SELLES, 2005).
Antioxidantes podem ser definidos como agentes que retardam ou previnem as lesões
causadas pelos radicais livres nas células e atualmente são de interesse pelas indústrias
- 46 -
alimentícia, cosmética e farmacêutica. Segundo Halliwell (2000) “Antioxidante é qualquer
substância que, quando presente em baixa concentração comparada à do substrato oxidável,
regenera o substrato ou previne significativamente a oxidação do mesmo”.
Os antioxidantes produzidos pelo organismo podem agir enzimaticamente, a
exemplo da GPx, CAT e SOD2 ou, não-enzimaticamente a exemplo de GSH, peptídeos de
histidina, proteínas ligadas ao ferro (transferrina e ferritina), ácido diidrolipóico e CoQH2.
Alguns dos antioxidantes provenientes da dieta são o a-tocoferol (vitamina-E), β-caroteno
(pro-vitamina-A), ácido ascórbico (vitamina-C), e compostos fenólicos onde se destacam os
flavonóides epoliflavonóides (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006).
Os antioxidantes agem interagindo com os radicais livres antes que estes possam
reagir com as moléculas biológicas, evitando que ocorram as reações em cadeia ou
prevenindo a ativação do oxigênio a produtos altamente reativos (BERNARDES;
PESSANHA; OLIVEIRA, 2010; RATNAM et al., 2006).
Os antioxidantes podem ser divididos em duas classes: os que apresentam atividade
enzimática e os não enzimáticos (Quadro 3). No primeiro grupo estão os antioxidantes
produzidos pelo organismo, CoQH2. compostos capazes de inibir a iniciação da oxidação, ou
seja, as enzimas que removem as espécies reativas ao oxigênio. No segundo grupo estão as
moléculas que interagem com as espécies radicalares e são consumidas durante a reação
(MARIOD et al.; 2009).
Compostos típicos que possuem atividade antioxidante incluem a classe de fenóis,
ácidos fenólicos e seus derivados, flavonoides, tocoferóis, fosfolipídios, aminoácidos, acido
fitico, acido ascórbico, pigmentos e esteróis (OLIVEIRA et al., 2009a).
Os radicais formados a partir de antioxidantes não são reativos para propagar a
reação em cadeia que seria prejudicial à célula; eles são neutralizados por reação com outro
radical, formando produtos estáveis ou podem ser reciclados por outro antioxidante (SOUZA
et al., 2007).
O uso de antioxidantes naturais tem aumentado com as descobertas das propriedades
dos componentes que são produzidos pelas plantas através do metabolismo secundário. Esses
componentes podem atuar como agentes redutores, sequestradores de radicais livres,
quelantes de metais ou desativadores do oxigênio singleto e/ou exibir simultaneamente, mais
de uma dessas funções (CANTERLE, 2005).
- 47 -
QUADRO 3 - Principais agentes antioxidantes de defesa orgânica.
Não enzimático
Enzimático
L-cisteína
Superóxido dismutase
α-tocoferol (vitamina E)
Catalase
β-caroteno
NADPH-quinona oxidoredutase
Glutationa
Glutationa peroxidase
Ácido ascórbico (vitamina C) Enzimas de reparo
Flavonóides
Proteínas do plasma
Selênio
Clorofilina
Curcumina
Fonte: SILVA (2010).
Experimentos simples podem ser realizados para examinar diretamente a habilidade
antioxidante in vitro e para testar possível efeito pró-oxidante em diferentes alvos
moleculares. Um dos métodos mais utilizados consiste em avaliar a atividade sequestradora
do radical livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH). Este teste permite determinar a
porcentagem de atividade antioxidante ou a atividade sequestradora de radicais livres e/ou a
porcentagem de DPPH remanescente no meio reacional (SOUZA et al., 2007).
1.8 CONSIDERAÇÕES SOBRE GENOTOXICIDADE
Em âmbito mundial, tem-se encontrado forte relação entre a exposição a agentes
genotóxicos e o desenvolvimento de diversos efeitos nocivos à saúde, principalmente com a
incidência de cânceres e problemas reprodutivos em pessoas ocupacionalmente expostas em
laboratórios químicos, clínicos, toxicológicos e indústrias em geral (MARQUES et al., 2005).
Estes agentes podem induzir modificações químicas tanto ao nível celular quanto molecular.
Essas lesões podem ser induzidas por agentes químicos, físicos ou biológicos que são
prejudiciais às células, uma vez que podem afetar processos vitais como a duplicação e a
transcrição gênica. As alterações podem também causar mutações e aberrações
- 48 -
cromossômicas, fenômeno esse que podem levar a processos cancerosos e morte celular
(COSTA; MENK, 2000).
Segundo a FDA (2008): “compostos que têm potencial para induzir mutações
genéticas, quebras cromossômicas, e/ou rearranjos cromossômicos são considerados
genotóxicos e têm potencial para causar câncer em humanos”. A utilização de ensaios
biológicos para o monitoramento da bioatividade de extratos, frações e compostos químicos
isolados tem sido frequentemente incorporada à identificação e monitoramento de substâncias
potencialmente tóxicas (NOLDIN; MONACHE; YUNES, 2003).
As fontes de exposição a compostos mutagênicos podem ser de vários tipos: (1)
endógenos – óxido nitroso e radicais livres de oxigênio; (2) provenientes da dieta –
mutagênicos gerados durante o cozimento de alimentos, ou presentes na dieta; (3) radiação –
exposição aos raios-X e ultra violeta (UV); (4) poluição – efluentes industriais, pesticidas,
incineração de lixo (RIBEIRO; MARQUES, 2003).
Toda a informação sobre a função e a estrutura de uma célula encontra-se
armazenada no seu DNA. Este é alvo constante de grandes mutações por uma variedade de
mecanismos que incluem a mutação de ponto, devido a modificação de moléculas reativas
como, por exemplo, o radical hidroxila, quebras cromossômicas, rearranjo, perda ou ganho de
cromossomos, silenciamento de genes, bem como encurtamento acelerado dos telômeros. A
célula pode sofrer mutação em três diferentes locais: (1) no gene; (2) nos cromossomos e (3)
na maquinaria necessária para a segregação de cromossomos (KRISHNA; HAYAHSHI,
2000). Todos esses mecanismos de danos ao genoma ocorrem espontaneamente devido a
efeitos de agentes mutagênicos gerados endogenamente e/ou por causa de deficiência de
cofatores necessários para o metabolismo e reparo do DNA, além da exposição de agentes
mutagênicos, podendo causar grandes alterações ao material genético das células eucarióticas.
Se houver alguma alteração que interrompa a sequencia essencial de DNA pode haver morte
celular (FENECH, 2005).
Na maioria das vezes os danos conseguem ser reparados, porém, quando o reparo é
ineficiente ou incorreto, ocorre aumento da sensibilidade das células do indivíduo a tensões
genotóxicas normais, culminando em mutação. Este tipo de lesão é permanente na sequência
de DNA, sendo transmitida às futuras gerações de células. As mutações podem ser benéficas,
quando elas conferem vantagem seletiva para a evolução da população, ou ainda, maléficas ou
deletérias, com quebras de cromátides ou cromossomos, que podem causar doenças como o
câncer (FENECH, 2005; GORBUNOVA ; SELUANOV, 2005; KAZIMIROVA et al., 2009).
- 49 -
Estas lesões no DNA podem ser quantificadas, tendo por base células-controle não
tratadas como parte de um ensaio de genotoxicidade bem conduzido. A frequência de fundo
quantificável mutante representa uma parte crítica de qualquer caracterização dose-resposta
de mutagenicidade, que pode ser medida tanto em modelos animais, vegetais e em
microorganismos in vitro ou in vivo, e assim, ser extrapolada para humanos (POTTENGER;
GOLLAPUDI, 2009).
1.8.1 BIOENSAIOS NA DETECÇÃO DA MUTAGENICIDADE
Uma variedade de ensaios de genotoxicidade está sendo desenvolvida para a
identificação de compostos que reagem com o DNA. A principal razão para o
desenvolvimento destes sistemas de teste tem o intuito de proteger o homem contra os danos
ao DNA e suas consequências. Algumas características importantes das espécies utilizadas
incluem a disponibilidade de informações sobre sua estrutura genômica, um baixo número de
cromossomos que é ideal para análises de aberração e um crescimento rápido (período de
geração curto) (KRISHNA; HAYASHI, 2000).
Muitos sistemas biológicos podem se caracterizar em importantes sistemas-teste para
ensaios de atividades mutagênicas de agentes químicos. Muitas espécies de vegetais, como
Allium cepa, Arabidopsis thaliana e Hordeum vulgare, têm se mostrado materiais biológicos
altamente adequados para este fim. Por meio desses sistemas vegetais podem ser realizados
ensaios de aberrações cromossômicas e testes citogenéticos (RANK; NIELSEN, 1993).
Bioensaios vegetais são, em geral, altamente sensíveis na detecção de efeitos
genotóxicos de várias substâncias. A maioria destes testes são de baixo custo e tempo
relativamente rápido e não requerem equipamentos específicos e manipulação excessiva da
amostra ou procedimentos de concentração. Um dos modelos mais promissores para a
monitorização in situ é o bioensaio de micronúcleos em Tradescantia utilizado com sucesso
em estudos de biomonitorização ambiental desde 1980 (MISIK et al., 2006). Allium cepa é
outra dessas plantas bastante utilizada em diversos estudos para detectar aberrações
cromossômicas induzidas por substâncias químicas, sendo este teste um dos melhores
sistemas de ensaio estabelecidos, utilizado rotineiramente devido à sua sensibilidade e boa
correlação com sistemas teste em animais (TKALEC et al., 2009).
- 50 -
O teste com a cebola ou Teste Allium cepa é o mais antigo relatado na literatura. Em
1938, Levan publicou um trabalho sobre o efeito da colchicina na mitose de células das raízes
de Allium cepa. Desde então este teste vem sendo muito utilizado para a detecção de
mutágenos, seja de produtos isolados (SETH et al., 2008), seja de misturas complexas
presentes em amostras ambientais (tanto de águas, ar, solo ou sedimento), ou para avaliação
de citotoxicidade (análise do índice mitótico) ou de genotoxicidade (análise de aberrações
cromossômicas ou formação de micronúcleos). O teste Allium cepa é considerado favorável
devido a algumas condições, como a presença de cromossomos grandes e em número
reduzido (2n = 16) (LEME; MARIN-MORALES, 2009).
Testes com A. cepa são adequados por oferecer parâmetros microscópios como
aderências cromossômicas, pontes, fragmentação e perdas cromossômicas, C-mitoses e
micronúcleos, que podem se caracterizar em evidências ou até indicadores de eventuais
mutações no conteúdo genético celular (TKALEC et al., 2009).
Apesar de ser um ensaio muito usado, desde os anos 30, somente em 1985 um
protocolo foi estabelecido (FISKESJO, 1985). Este protocolo preconiza o uso de bulbos com
1,5 a 2 cm de diâmetro, tubos de vidro para cultivo com 1,5 cm de diâmetro e 10 cm de
comprimento, água de torneira de boa qualidade (sem íons tóxicos) como controle negativo e
que o experimento deva ser feito à temperatura de 20°C no escuro. Segundo este protocolo, o
Teste Allium cepa pode ser feito da forma original ou da forma modificada. Na forma
original, os bulbos são colocados para germinar antes do tratamento por 4 ou 24 h, enquanto
que na forma modificada, os bulbos são colocados diretamente no tratamento sem germinação
prévia. A amostra de água de tratamento deve ser trocada a cada dia ou, se disponível em
pouca quantidade, apenas completada. Para análise da conformação cromossômica, o
protocolo sugere o uso da colchicina a 0,1%. A coloração por Reação de Feulgen pode ser
usada, mas a orceína acética a 1% fornece melhores resultados, além de ser mais rápida. Tal
ensaio estabelece como parâmetros microscópicos o índice mitótico (IM), com análise de 400
células/lâmina e aberrações em metáfases e anáfases (100/lâmina) tais como: stickness, pontes
e fragmentos, cromossomos vagantes e mitose colchicínica. Como parâmetros macroscópicos
sugere tamanho e forma das raízes, turgescência e alterações na cor (FISKESJO, 1985). O
teste A. cepa também permite a avaliação de diferentes parâmetros: as frequências de
aberrações cromossômicas e de micronúcleos têm sido as mais utilizadas para detecção de
mutagenicidade, enquanto que o índice mitótico e algumas anomalias nucleares são utilizadas
para avaliar a citotoxicidade (TURKOGLU et al., 2008).
- 51 -
De acordo com Leme e Marin-Morales (2009), a análise do Índice Mitótico (IM) foi
utilizada em diferentes estudos e a maioria deles mostrou resultados satisfatórios para as
análises propostas. O IM constitui um parâmetro importante para a avaliação da toxicidade
celular de diversas substâncias, onde a citotoxicidade de determinado agente químico pode ser
determinada pelo aumento ou pela diminuição do IM. Índices mitóticos maiores que o
controle negativo são resultados de um aumento na divisão celular, que pode ser prejudicial
para as células, levando a uma proliferação celular desordenada e até mesmo para a formação
de tecidos tumorais. A redução significativa do IM em relação ao controle negativo pode
indicar alterações, derivadas da ação química do agente sobre o crescimento e
desenvolvimento do organismo exposto (LEME; MARIN-MORALES, 2009).
Em 2003, Rank propôs o método para análise de aberrações em anáfase e telófase.
Esse método seria uma versão modificada do protocolo de Fiskesjo (1985), em que os bulbos
seriam colocados para germinar por 24 horas e, em seguida, suas raízes seriam expostas
durante um período de tratamento de 48 horas. Após a preparação das lâminas, duas
categorias de aberrações cromossômicas mais frequentes poderiam ser analisadas: as
indicativas de atividade clastogênica (fragmentos cromossômicos e pontes) e as promovidas
por interação com o fuso mitótico (cromossomos atrasados -laggards e vagantes). Outras
categorias de aberrações menos frequentes como anáfase c-mitótica, multipolaridades,
poliploidia e cromossomos pulverizados também poderiam ser analisados (RANK, 2003).
A análise da frequência de aberrações mitóticas tem se destacado como marcador de
danos ao material genético mais utilizado em A. cepa. Entre essas alterações citológicas, as
aberrações em metáfase e anáfase são as mais empregadas nas análises de genotoxicidade,
seguidas das aberrações em telófase. Para os estudos de genotoxicidade, as aberrações
cromossômicas podem ser reunidas em um único grupo, de acordo com a fase do ciclo, ou
ainda serem classificadas com base na sua origem, em aberrações de origem clastogênica ou
aneugênica (RIBEIRO; MARQUES, 2003). A classificação diferencial de cada tipo de
aberração também pode ser realizada, e é particularmente interessante em estudos que buscam
compreender o mecanismo de ação do agente de interesse. Nesse tipo de análise, as alterações
mais frequentemente encontradas são: c-mitose, cromossomos stickness, cromossomos
atrasados, cromossomos vagantes, multipolaridades, pontes anafásicas, anáfases precoces,
poliploidia e fragmentos cromossômicos (LEME; MARIN-MORALES, 2009).
- 52 -
Diante desta revisão relatada, verifica-se que, dentre os diversos bioensaios de
genotoxicidade e mutagenicidade a substâncias o Teste Allium cepa vêm sendo bastante
utilizado, sendo importante para o diagnóstico de possíveis efeitos mutagênicos e
genotóxicos, reparo celular e na prevenção de riscos a curto ou em longo prazo de exposição e
que correlações entre esse bioensaio pode contribuir para o entendimento da complexidade
molecular da exposição a substâncias em estudos de genética toxicológica.
1.9 CONSIDERAÇÕES SOBRE INFLAMAÇÃO
A palavra inflamação, do grego phlogosis e do latim flamma, significa fogo, área em
chamas. Descrições das características clínicas da inflamação foram encontradas em papiros
egípcios, datados de aproximadamente 3000 a.C., mas o primeiro autor a listar os quatro
sinais cardinais da inflamação foi Celsius, um escritor romano do século I d.C., que relatou o
aumento no fluxo sanguíneo e a dilatação dos pequenos vasos, rubor, a permeabilidade
vascular aumentada, tumor, que levaria a um aumento na temperatura local, calor, à passagem
de células do sangue circulante e dor local, dolor (ROCHA e SILVA; GARCIA LEME,
2006). A perda de função (functio laesa), quinto sinal clínico, foi adicionado posteriormente
por Virchow. Em 1793 John Hunter, um cirurgião escocês, observou o que é óbvio para os
tempos atuais: que a inflamação não é uma doença, mas uma resposta sem especificidade,
com objetivos salutares ao hospedeiro (KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
O processo inflamatório é uma resposta de defesa do organismo frente a um
estímulo lesivo, que visa preservar e restabelecer a homeostase do tecido agredido. Para
enfrentar a injúria ou invasão por microrganismos causadores de doenças, o corpo humano
possui um arsenal de respostas de defesa, e a reposta inflamatória/imunológica forma um
componente significativo de muitas doenças encontradas na clínica (RANG; DALE, RITTER,
2007). É uma resposta de proteção, cujo objetivo é livrar o organismo tanto da causa inicial da
agressão celular quanto das consequências desta agressão (HUME; FAIRLIE, 2005).
As respostas inflamatórias ocorrem em 3 fases distintas, sendo cada uma
aparentemente mediada por diferentes mecanismos: (1) Uma fase transitória aguda, reação
inata, não imunológica que engloba os eventos que ocorrem localmente no interior dos
tecidos, caracterizada por vasodilatação e permeabilidade capilar; (2) Uma fase subaguda
tardia, caracterizada proeminentemente pela infiltração dos leucócitos e células fagocíticas; a
- 53 -
resposta imune é adquirida e específica, tornando a resposta de defesa a um microorganismo
invasor mais eficaz; (3) Uma fase proliferativa crônica em que ocorre degeneração tecidual e
fibrose (TLASKALOVA-HOGENOVA et al., 2005).
Todas estas etapas do processo de migração leucocitária são dependentes da
expressão pelos leucócitos e pelas células endoteliais, de moléculas denominadas moléculas
de adesão e mediadores quimiotáticos. O principal objetivo dessas interações é facilitar a
migração dos leucócitos do compartimento intravascular para dentro do interstício e do
espaço intersticial para os locais de infecção ou lesão (SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY,
2004).
Após o estímulo desencadeador do processo inflamatório, ocorre a liberação de
diversos mediadores que podem originar-se no plasma das células ou dos tecidos lesionados
podendo ser divididos em: aminas vasoativas (histamina e serotonina), proteases plasmáticas
(sistema de cinina – bradicina, sistema do complemento, sistema de coagulação fibrinolítico);
eicosanoides; proteases lisossômicas; fatores ativadores de plaquetas (PAF); quimiocinas,
citocinas, óxido nítrico, dentre outros. Cada mediador com o seu papel específico atua em
estágios definidos da reação inflamatória (KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
1.9.1 PLANTAS COM ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA
Produtos naturais, incluindo os derivados de plantas superiores têm dado, nos últimos
anos, grande contribuição para o desenvolvimento de terapias farmacológicas modernas. A
maioria dos metabólitos secundários derivados de plantas são conhecidos por interferir, direta
ou indiretamente, com moléculas ou mecanismos como mediadores inflamatórios, exemplos
são os metabólitos do ácido araquidônico (AA) e as citocinas; produção e/ou ação de
segundos mensageiros, como AMPc, GMPc, proteínas quinases e cálcio; expressão de fatores
de transcrição como o NF-kB, e de proto-oncogenes, c-jun e c-fos; e intervenção na expressão
de moléculas pró-inflamatórias como a iNOS, COX-2, IL-1, TNF-, neuropeptídeos e
proteases (CALIXTO; OTUKI; SANTOS, 2003).
Muitas plantas cuja indicação popular aborda a resposta inflamatória são alvos para o
estudo de novas alternativas terapêuticas para esta área. Este uso popular é muitas vezes
confirmado pelos resultados das pesquisas científicas, como pode ser observado com os
exemplos citados a seguir e resumidos no Quadro 4.
- 54 -
QUADRO 4 - Exemplos de plantas com atividades biológicas.
Planta
Nome
Popular
Andiroba
Calêndula
Atividades
Confirmadas
Mecanismo de
Ação
Referência
Anti-inflamatória,
analgésica
Inibe
prostaglandinas e
cininas
Estimula a
fagocitose e inibe a
LOX.
PEREIRA ; CARVALHO,
2004
Antioxidante, inibe
5-LOX.
CARVALHO,
2004d;
KOBAYASHI et al.,
2003;
KOBAYASHI;
TAKAHASHI; OGINO,
2005;
MCKAY
;
BLUNBERG,
2006;
YAMAMOTO et al.,
2002;
CASCON, 2004; HECK,
VIANA,
VICENTIN,
2012; PARENTE et al.,
2006; VEIGA JUNIOR ;
PINTO, 2002;
Nome Científico
Carapa
guianensis
Aublet
Calendula
officinalis L.
Anti-inflamatória,
antitumoral,
cicatrizante,
sedativa,
estrogênica.
Anti-inflamatório,
espasmolítico.
Camomila
Matricaria
chamomila L.,
M. recutita L.
Copaíba
Copaifera ssp
Anti-inflamatória,
anti-séptica,
antitumoral,
analgésica
Garra-dodiabo
Harpagophytum
procumbens
Anti-inflamatória
e analgésico
Gengibre
Zingiber
officinale,
Roscoe
Picão
Bidens pilosa L.
Anti-inflamatória,
antiemético,
analgésico,
antitumoral,
antioxidante.
Imunossupressor
e anti-inflamatória
Salgueiro
(gênero)
Salix ssp
Analgésico e
antipirético
Unha-degato
Uncaria
tomentosa
Atividade antiinflamatória na
asma e artrite.
Inibe
prostaglandinas,
cininas, citocinas,
histaminas e
sistema
complemento.
Inibe a produção de
eicosanóides,
principalmente dos
cisteinil-LT
Inibe as isoformas 1
e 2 da COX, a
síntese de LT e de
TNF-.
Inibe a liberação de
HIS pelos
mastócitos, a
produção de IgE, e
permite a
permeabilidade
vascular.
Inibe as isoformas 1
e 2 da COX.
Impede a ativação
do NF-kB, e a
produção de TNF-
e PGE2. Possui
ação antioxidante e
captadora de
radicais livres.
AKIHISA et al., 2006;
CARVALHO,
2004c;
NEUKIRCH et al., 2005;
UKIYA et al., 2006;
LIMA;
CARVALHO,
2004; SETTY ; SIGAL,
2005
SETTY; SIGAL, 2005;
SILVA et al., 2011
CARVALHO,
2004b;
HORIUCHI ; SEYAMA,
2006; PEREIRA et al.,
1999
ROBERTS
II;
MORROW,
2003;
SETTY; SIGAL, 2005
CISNEROS et al., 2005;
PERAZZO,
2004;
SETTY; SIGAL, 2005
Assim, as plantas medicinais têm apresentado importante participação na saúde
mundial, contrariando os grandes avanços observados em décadas recentes na medicina
- 55 -
moderna, as plantas ainda contribuem muito para os cuidados com a saúde. As plantas
medicinais possuem distribuição mundial, mas são mais diversificadas nos países tropicais. O
interesse em medicamentos derivados de plantas superiores, especialmente os fitoterápicos,
aumentou expressivamente nas duas últimas décadas. Estima-se que em torno de 25% de
todos os medicamentos modernos sejam derivados, direta ou indiretamente de plantas
superiores (CALIXTO, 2000).
1.10 CONSIDERAÇÕES SOBRE A MALÁRIA
A malária é uma infecção parasitária que permanece associada à elevada morbidade,
à considerável mortalidade e ao impacto econômico significativo nos países afetados. De
acordo com a OMS, a malária ocorre em mais de 100 países e territórios (OMS, 2012).
Estima-se que cerca de 3,2 bilhões de pessoas (40% da população mundial) vivem em área de
risco para a doença onde de 250 a 500 milhões de pessoas são infectadas anualmente e,
destas, de 1 a 3 milhões morrem principalmente crianças menores com menos de 5 anos de
idade e mulheres grávidas (CUMBANE, 2011).
A distribuição entre as espécies de Plasmodium que oferecem risco ao ser humano é
bastante heterogênea. Cinco espécies de Plasmodium são importantes na transmissão da
malária humana: Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae,
Plasmodium ovale e Plasmodium knowlesi, todas pertencentes ao filo Apicomplexa a família
Plasmodiidae e ao gênero Plasmodium (CUMBANE, 2011).
A maior prevalência de casos ocorre na África, no Brasil, na China e no Sri Lanka
(GOOD et al., 2005). Em 2009, o número de casos de malária estimados pela OMS foi de
cerca de 225 milhões. A região Africana contribui com 85%, 10% pelo sudoeste da Ásia e 4%
as regiões do Mediterrâneo Oriental, destes casos, estima-se que ocorram 781 mil mortes, das
quais 89% na África, 6% no Mediterrâneo Oriental e 5% no sudoeste da Ásia (OMS, 2012).
Nas Américas a doença ocorre em 21 países e territórios, sendo que 20% da
população total vive em locais de risco. Os relatos de casos na região diminuíram de 1,18
milhões em 2000 a 526.000 em 2009, sendo que 4 países representam 90% dos casos
reportados em 2009 (Brasil, Colômbia, Haiti e Peru) (OMS, 2012).
- 56 -
Segundo o Ministério da Saúde, mais de 60% do Território Brasileiro possui
condições propícias à transmissão da doença. A transmissão natural da malária no Brasil
ocorre por meio da picada de fêmeas de mosquitos do gênero Anopheles, sendo mais
importante a espécie Anopheles darlingi, cujos criadouros preferenciais são coleções de água
limpa, quente, sombreada e de baixo fluxo (BRASIL, 2009). Aproximadamente 99,9% dos
casos ocorrem da região da Amazônia Legal, que compreende os estados do Acre, Amapá,
Amazonas, Pará, Rondônia, Roraima, Tocantins e parte dos estados do Mato Grosso e
Maranhão. A Amazônia apresenta características climáticas, ambientais, ecológicas e
socioeconômicas extremamente favoráveis à transmissão da malária (OLIVEIRA FILHO;
MARTINELLI, 2009). O risco de se contrair a doença não se mostra uniforme como
demonstrado no Quadro 5.
QUADRO 5 - Dados epidemiológicos da malária por estados da Amazônia Legal,
janeiro a dezembro de 2012.
Unidade da Federação
População Casos Confirmados
Amazonas
3.483.985
82.692
Pará
7.581.051
80.033
Acre
733.559
26.729
Rondônia
1.562.409
23.123
Amapá
669.526
12.882
Roraima
450.479
5.843
Mato Grosso
3.035.122
1.055
Maranhão
6.574.789
968
Tocantins
1.383.445
3
Total de casos confirmados
Fonte: <http://portal.saude.gov>. Acesso fev. 2013
233.328
- 57 -
1.10.1 CICLO DE VIDA DO PARASITO E ASPECTOS CLÍNICOS DA DOENÇA
O ciclo do parasito (Figura 5) inicia-se pela picada da fêmea do mosquito Anopheles
infectado, o qual inocula o parasito nas formas de esporozoítos na derme durante o repasto
sanguíneo. Aproximadamente 70% dos parasitos inoculados deixam a derme no intervalo de
uma hora e atingem a corrente sanguínea, pela qual alcançam o fígado. Os 30% restantes
entram nos vasos linfáticos, com movimentos de deslizamento lateral, nos quais poderão ser
reconhecidos pelas células do sistema imune, nos gânglios linfáticos, e uma pequena porção
pode desenvolver-se para a forma extraeritrocítica (DOOLAN; DOBAÑO; BAIRD, 2009).
Ao penetrarem as células do fígado (hepatócitos) os esporozoítos iniciam o cicloexoeritrocítico ou esquizogonia tecidual, que dura cerca de seis dias para a espécie P.
falciparum, oito dias para a P. vivax e 12 a 15 dias para a P. malariae. Após a invasão, os
esporozoítos se diferenciam em trofozoítos hepáticos que amadurecem e formam os
merozoítos, os quais são liberados na circulação sanguínea (BRASIL, 2009; REY, 2008).
Os merozoítos liberados na corrente sanguínea possuem vida curta e são altamente
suscetíveis à fagocitose, portanto evitam o contato com macrófagos e rapidamente invadem os
glóbulos vermelhos, iniciando o ciclo assexuado eritrocitário (BAER et al, 2007). O estágio
eritrocitário é o responsável pelas manifestações clínicas. Os merozoítos, após invadirem os
eritrócitos, transformam-se em trofozoítos jovens e, posteriormente, em trofozoítos maduros e
esquizontes que, por esquizogonia, originarão outros merozoítos capazes de infectar novos
eritrócitos (CUMBANE, 2011).
A fase eritrocítica do parasita coincide com a patogenia e as manifestações clínicas
da malária, caracterizadas por síndromes febris cíclicas (paroxismo malárico), que variam de
48 a 72 horas, de acordo com a espécie, acompanhadas de mal-estar, cefaleia, cansaço,
mialgia, entre outros. O início dos sinais clínicos pode variar, dependendo da espécie, de 7 a
15 dias (BAER et al., 2007). No hospedeiro invertebrado, o ciclo inicia-se quando
macrogametóticos são ingeridos pela fêmea durante a hematofagia no ser humano. No
estômago do mosquito ocorre uma fase sexuada, resultando na formação de um zigoto
(oocineto), que posteriormente migra para se posicionar nas microvilosidades do intestino.
Assim, por esporogonia, resultam em oocistos com formas infectantes (esporozoítos). Os
- 58 -
esporozoítos liberados migram para as glândulas salivares do mosquito e poderão ser
inoculados em um novo hospedeiro vertebrado (REY, 2008).
FIGURA 5 - Ciclo biológico do Plasmodium no mosquito e no homem.
Fonte: Adaptado de <http://www.cdc.gov/malaria/about/biology/>. Acesso Jan. 2013
1.10.2 BUSCA POR NOVOS FÁRMACOS
Atualmente os fármacos antimaláricos são baseados em produtos naturais ou
compostos sintéticos produzidos a partir da década de 40. Esses fármacos são específicos para
cada etapa do ciclo de vida do Plasmodium. Existem fármacos chamados eritrocíticos, que
atuam nas formas presentes nos eritrócitos do homem, fármacos gametocíticos que matam as
formas sexuadas do parasita (gametócitos) de um indivíduo infectado, de forma que quando
esse é picado por outro mosquito se evita a transmissão da doença para o inseto e assim a
- 59 -
disseminação da doença para outras pessoas, e por último, os fármacos esporonticidas (ou
esporoitocidas), que atuam contra esporozoítos e são capazes de matar os parasitas assim que
eles entram na corrente sanguínea, após a picada do mosquito, ou ainda destruí-los quando
são liberados pelos esquizontes hepáticos ou sanguíneos. Os fármacos antimaláricos podem
atuar contra mais de uma forma de protozoário e serem efetivos contra uma espécie, mas
totalmente ineficazes contra outras (FRANÇA et al., 2008).
Entretanto, houve o surgimento da resistência à quase todos os medicamentos
utilizados para o tratamento das infecções provocadas pelo P. falciparum e P. vivax, com
exceção apenas à droga Artemisina e seus derivados. A dinâmica da resistência está
intimamente ligada à mutações espontâneas no genoma e pode ocorrer mais rapidamente
devido à pressão de seleção criada pela droga, uma vez que parasitas sensíveis não resistem à
exposição, sobrevivendo apenas os resistentes (BAIRD; RIECKMANN, 2003).
Em função da resistência aos antimaláricos já conhecidos, muitos são os estudos
envolvendo novos alvos para a quimioterapia da malária. Nesse sentido uma abordagem
promissora é a utilização de plantas medicinais como fonte na busca por novas drogas para o
tratamento de doenças como a malária. Sabe-se que os principais antimaláricos existentes no
mercado são de origem natural, como a artemisinina e a quinina, outros sinteticamente
elaborados, mas derivados do anel quinoleínico, como a quinacrina e a cloroquina.
Como um dos países de maior biodiversidade do mundo o Brasil tem um promissor
caminho utilizando a abordagem etnofarmacológica e o estudo químico das plantas utilizadas
na medicina popular. É o país com a maior parte da floresta Amazônica em seu território
nacional e essa região conta com uma diversidade de plantas utilizadas no combate à malária
pelas populações locais e de regiões vizinhas.
Muitas espécies vegetais, a maioria na forma de extratos brutos e pertencendo a
várias família, foram testadas in vitro contra o P. falciparum (MESQUITA et al., 2007;
MUTHAURA et al., 2011; RUIZ et al., 2011), ou in vivo usando o modelo experimental
murino baseado em P. berghei (MOTTA, 2009; WAAKO et al., 2005). Mais recentemente
esta busca vem sendo voltada para plantas usadas na medicina popular como antitérmicos
e/ou antimaláricas ou com atividade anti-inflamatória, o que confirma essa abordagem como
alternativa promissora.
- 60 -
2. OBJETIVOS
2.1 GERAL
O objetivo deste trabalho é contribuir para o conhecimento da composição química e
atividade biológica do extrato acetônico da entrecasca, eluatos e substâncias isoladas da
espécie Maytenus guianensis Klotzsch ex Reissek.
2.2 ESPECÍFICOS

Identificar e determinar a estrutura das substâncias isoladas;

Avaliar a atividade antioxidante do extrato acetônico e eluatos pelo método
fotocolorimétrico in vitro do radical livre estável DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazil);

Avaliar in vivo a atividade mutagênica do extrato acetônico da entrecasca através do
Teste Allium cepa;

Avaliar in vitro a citotoxicidade do extrato acetônico da entrecasca e eluatos frente a
células de hepatoma humano - HepG2;

Avaliar in vivo a atividade anti-inflamatória do extrato acetônico da entrecasca, eluatos e
substâncias isoladas pelo teste de edema de pata em camundongos.

Avaliar in vitro a atividade plasmodial do extrato acetônico da entrecasca e eluatos frente
ao Plasmodium falciparum cepa 3D7;
- 61 -
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 ESTUDO FITOQUÍMICO DE Maytenus guianensis
3.1.1 COLETA DO MATERIAL VEGETAL
As cascas do caule (Figura 6) de Maytenus guianensis Klotzsch foram coletadas em
fevereiro/2008 na Reserva Florestal Adolpho Ducke Localizada no Km 26 da Estrada
Manaus-Itacoatiara (AM-010) (2º53´ S, 59º58´W), a identificação da espécie foi realizada no
Herbário do Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia (INPA), exsicata nº 188.485.
FIGURA 6 - Casca do caule Maytenus guianensis.
Foto: Arquivo pessoal, (2013).
- 62 -
3.1.2 PREPARAÇÃO DO EXTRATO ACETÔNICO E ELUATOS
As cascas do caule foram secas em estufa (TE-394/2, Tecnal) com ventilação forçada
a 50° C por 48 horas, em seguida raspadas para retirada da entrecasca, fornecendo 210 g,
sendo esta a parte submetida à maceração com acetona P.A., em temperatura ambiente, até a
exaustão. Após rotaevaporação (rotaevaporador TE-211, Tecnal) obteve-se 98 g de extrato
acetônico (EAMG).
Os eluatos foram preparados a partir de 50 g do EAMG, que foi adsorvido em 100 g
de silica gel 60 (Vetec ( µm 63-230) e submetido a coluna filtrante, sendo eluído com
hexano (Chemycalis), clorofórmio (Synth) e acetona (Nuclear). Após a rotaevaporação
obteve-se: 12, 84 g de eluato hexânico (EHMG), 11,25 g de eluato clororfórmico (EClMG) e
18,75 g de eluato acetônico (EAcMG).
3.1.3 MATERIAIS E MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
Nas cromatografias de adsorções em colunas foram utilizadas gel de sílica 60 da
Merck e da Vetec ( µm 63-230). O comprimento e diâmetro das colunas variaram de acordo
com as quantidades de amostras a serem cromatografadas. Para cromatografia em camada
delgada (CCD) utilizou-se cromatoplacas de gel de sílica 60 ( µm 2-25 sobre poliéster T –
6145 da Merck e da Sigma Chemical com indicador de fluorescência na faixa de 24 m). Os
solventes utilizados nas eluições cromatográficas foram: éter de petróleo, éter etílico, hexano,
clorofórmico, acetato de etila, acetona e metanol, puros ou combinados em gradiente
crescente de polaridade, Figura 7.
A revelação das cromatoplacas se deu por exposição destas à luz ultravioleta (UV),
em comprimento de onda 254 m e por pulverização com revelador universal (mistura de
etanol/anidrido acético/ácido sulfúrico – 8:1:1 - v/v/v), seguido de aquecimento em chapa de
aquecimento a 100 °C por aproximadamente cinco minutos.
- 63 -
3.1.4 ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO DOS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS
O eluato hexânico (9,0 g) foi submetido ao processo de cromatografia em coluna
(CC), utilizando-se sílica Gel ( µm 63-230) como fase estacionária e os solventes hexano,
acetato de etila, clorofórmio, metanol e acetona, puros ou em misturas, como fase móvel.
Todos os solventes foram eluídos de forma ininterrupta, as frações coletadas foram de 50 mL.
Cada fração foi concentrada em evaporador rotatório sob pressão reduzida até total
eliminação do solvente orgânico e armazenada em frascos de vidro individuais. O
monitoramento de tais frações foi realizado através de cromatografia em camada delgada
(CCD), em seguida foram reunidas utilizando-se como parâmetro comparativo seu perfil
cromatográfico através de revelador universal e aquecimento em chapa quente. Tal
procedimento permitiu a obtenção de um total de setenta e nove frações, que foram
reagrupadas de acordo com seu perfil cromatográfico em CCD, resultando assim em 23
subfrações. Das quais, as frações 10-14 foram reunidas, e a subfração resultante submetida à
nova CC resultando em quinze frações, das quais as frações 7-12 apresentaram um sólido
branco denominado CQH-1. As frações 19-30 foram reunidas após comparação em CCD, e a
subfração resultante apresentou um precipitado branco que foi recristalizado em éter etílico e
resultou em um sólido branco denominado CQH-2. As frações 37-48 após comparação em
CCD foram reunidas e submetidas a nova CC resultando em vinte subfrações, das quais as
frações 5-14 apresentaram um sólido branco denominado CQH-3. As frações 59-66 após
análise em CCD foram reagrupadas e apresentaram um sólido alaranjado que foi
recristalizado em éter etílico e denominado CQH-4.
O eluato clorofórmico (9 g) também foi submetido ao processo descrito acima. Neste
procedimento foi possível obter 139 frações, que foram reagrupadas de acordo com seu perfil
cromatográfico em CCD, resultando assim em 25 subfrações. Destas, as frações 8-13
apresentaram um preciptado e após serem analisadas por CCD foram reunidas e dissolvidas
em acetona e recristalizadas em éter etílico e foi possível obter-se um sólido branco
denominado CQCl-1.
- 64 -
FIGURA 7 - Esquema geral do procedimento experimental efetuado com a
entrecasca de Maytenus guianensis.
Maytenus guianensis
casca
Secagem e raspagem da entrecasca
Entrecasca raspada
210 g
Extração por maceração em acetona e
secagem em rotaevaporador
- Atividade Antioxidante
- Atividade genotóxica
- Atividade citotóxica
- Atividade anti-inflamatória
- Atividade Anti-P. falciparum
Extrato acetônico da Entrecasca de
Maytenus guianensis
(EAMG)
50 g
Adsorção em sílica gel e eluição com
Hexâno, clorofórmio e Acetona
Eluato Clorofórmico
(EClMG)
11,25g
Eluato Hexânico
(EHMG)
12,84 g
Testes Biológicos
Eluato Acetônico
(EAcMG)
18,75 g
Testes Biológicos
Testes Biológicos
- Atividade citotóxica
- Atividade anti-P. falciparum
- Atividade anti-inflamatória
Estudo fitoquímico
CQH-1
23 mg
- Atividade citotóxica
- Atividade anti-P. falciparum
- Atividade anti-inflamatória
Estudo fitoquímico
CQH-2
104 mg
CQH-3
53 mg
Testes Biológicos
CQH-4
16 mg
- Atividade citotóxica
- Atividade anti-inflamatória
CQCl-1
18 mg
- Atividade citotóxica
- Atividade anti-P. falciparum
- 65 -
3.1.5 MATERIAIS E MÉTODOS PARA A ELUCIDAÇÃO DAS ESTRUTURAS
QUÍMICAS DAS SUBSTÂNCIAS ISOLADAS
3.1.5.1 ESPECTROMETRIA NO INFRAVERMELHO
Para realização dos espectros as amostras (0,5-1,0 mg) foram secas em estufa a 100
ºC por 2 horas, acondicionadas em dessecador e posteriormente fez-se a moagem da amostra
com o KBr em gral de ágata liso, esta mistura foi prensada em molde sob pressão entre 10.000
a 15.000 psi, até formar um disco transparente (pastilha). Esta pastilha então foi submetida à
leitura ótica em comprimento de onda entre 4000 – 400 cm-1 para obtenção dos espectros em
espectrômetro (IR-Prestige-21 Fourrier Transform Infrared Spectrophotometer – Shimadzu),
as análises foram realizadas na Central Analítica do Departamento de Química da
Universidade Federal de Rondônia.
3.1.5.2 RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DE HIDROGÊNIO-1 (RMN 1 H)
E DE CARBONO –
13
C (RMN
13
C)
Os espectros de RMN unidimensionais e bidimensionais foram registrados em
espectrômetros Bruker AC – 200 e 500, operando a 200 e 500 MHz para hidrogênio – 1
(RMN 1H) e 50 e 125 MHz para carbono – 13C (RMN 13C). As sequências de pulsos utilizadas
nas experiências bidimensionais estão contidas nos programas Bruker XHCORREAU, para
correlação heteronuclear de hidrogênio – 1 e carbono – 13C a uma ligação e a longa distância
(1 H x 13C – COSY, ‘JCH, n = 1, 2 e 3) e COSY – UA para correlação homonuclear (1 H x 1 H
– COSY). Os espectros de
1
H e
13
C foram referenciados de acordo com o deslocamento
químico do TMS e do CDCl3 respectivamente. Nos experimentos unidimensionais de DEPT
UA (ângulo de mutação 135°). Os deslocamentos químicos () foram expressos em partes por
milhão (ppm) e as multiplicidades dos deslocamentos indicados segundo a convenção: s
(singleto), Sl (singleto largo), d (dubleto), dd (dubleto dubleto), t (tripleto), q (quarteto) e m
(multipleto). As análises foram realizadas no Departamento de Química da Universidade
Federal do Espírito Santo - UFES e no Departamento de Química da Faculdade de Filosofia
Ciências e Letras de Ribeirão Preto / USP.
- 66 -
3.1.5.3 PONTO DE FUSÃO
As medidas de ponto de fusão das substâncias isoladas foram obtidas em Aparelho
Metler Toledo FP 62, com taxa de aquecimento de 5 ºC/minuto. As análises foram realizadas
no Laboratório de Pesquisa em Química de Produtos Naturais no Departamento de Química
na Universidade Federal de Rondônia - UNIR.
3.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
A avaliação da atividade antioxidante do extrato acetônico da entrecasca (EAMG) e
eluatos (EHMG, EClMG e EAcMG) de Maytenus guianensis foi realizada pelo método do
radical livre estável DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazil). Nesta avaliação foi preparada uma
solução de 100 μM de DPPH em metanol. A partir do extrato acetônico da entrecasca e
eluatos foram preparadas soluções estoques na concentração de 1 mg extrato/mL metanol. A
partir desta solução foram obtidas as concentrações de 10, 50, 100, 150 e 250 μg extrato/mL
metanol, em seguida em 2,5 mL destas amostras foram adicionados 1 mL da solução de
DPPH. Como branco foi utilizado 1 mL da solução de DPPH e 2,5 mL de metanol, como
controle positivo foi utilizado extrato padronizado de Ginkgo biloga (Egb 761).
Vinte minutos após a adição de DPPH às amostras, foram realizadas as leituras em
um espectrofotômetro de Ultravioleta UV-Vis (Shimadzu UV 1601) em 517 m. Todas as
leituras foram realizadas em triplicata e, com a média dos dados obtidos calculou-se a
diferença de absorbância entre a amostra e o branco, as atividades antioxidantes percentuais
(%AA) foram obtidas por regressão linear logarítmica para cada fase, chegando-se assim à
concentração necessária para se obter 50 % do efeito antioxidante máximo estimado de 100 %
(CE50) (MENSOR et al., 2001).
As atividades sequestrantes de DPPH do extrato acetônico e dos eluatos foram
expressas em porcentagem, segundo a Equação 1:
 Absbranco - Absamostra 

  100
(% AA)  100 - 
Absbranco



Equação 1
Onde: Absamostra= absorbância da solução em análise (extrato acetônico e eluatos) , Absbranco =
absorbância da solução de metanol + DPPH.
- 67 -
Para as análises estatísticas foi elaborado um banco de dados no programa Origin
(Micronal Software, Inc., Northampton, MA, USA), versão 8.0 “for Windows” e analisado
pelo teste de Tukey, com um nível de significância de p ≤ 0,05.
As análises foram realizadas no Laboratório de Fitoquímica e Produtos Naturais –
Labfito, do Departamento de Química na Universidade Federal de Rondônia - UNIR.
3.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GENOTÓXICA
Para o teste de Allium cepa, foram utilizados bulbos de tamanho médio, uniforme, de
mesma origem, não germinados e saudáveis. Os bulbos de A. cepa foram lavados, limpos,
desenraizados e posteriormente colocados em frascos plásticos com água destilada a
temperatura ambiente para enraizamento. Quando as raízes atingiram 0,5 cm foi realizada a
primeira triagem para o descarte dos bulbos que apresentassem anomalias genéticas. Os
bulbos restantes foram colocados nas soluções de tratamento com o EAMG, foram retiradas
amostras das pontas das raízes para análise com 24 e 48 horas, consistindo em três
concentrações (50, 100 e 200 µg.mL-1) com cinco repetições cada.
Destas raízes foram retiradas a região das células meristemáticas, coradas e fixadas
com orseína acética à 1% e posterior leitura microscópica óptica (Microscópio CX21,
Olympus), utilizando objetivas de 10X e 40X. Foram avaliadas 1000 células por repetição,
totalizando 5.000 células por tratamento. Foram avaliados o índice mitótico (IM), anomalias
celulares e cromossômicas (ACM) e o total de anomalias (TA).
O índice mitótico (IM) foi calculado pela Equação 2:
 CM 
IM  
 x 100
 TC 
Equação 2
onde CM representa o número de células em mitose e TC o número total de células
analisadas, respectivamente (PIRES et al. 2001).
Para as análises estatísticas foi elaborado um banco de dados no programa Origin
(Micronal Software, Inc., Northampton, MA, USA), versão 8.0 “for Windows” e analisado
pelo teste de Tukey, com um nível de significância de p ≤ 0,05.
As análises foram realizadas no Laboratório de Citogenética e Mutagênese das
Faculdades Integradas Aparício Carvalho – FIMCA.
- 68 -
3.4 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA
3.4.1 ANIMAIS
Foram utilizados camundongos Swiss adultos machos provenientes da Fundação
Oswaldo Cruz - Rondônia. Os animais foram mantidos em condições padronizadas de
biotério com temperatura e luz controladas, água e alimentação ad libitum até o momento dos
experimentos. Os animais permaneceram no laboratório para sua adaptação por um período de
pelo menos 4 horas antes da realização dos experimentos. Os experimentos foram conduzidos
de acordo com as orientações para os cuidados com animais de laboratório e considerações
éticas com os protocolos experimentais aprovados pela Comissão de Ética no uso de Animais
do Fundação Oswaldo Cruz - Rondônia, com número de registro 2012/10.
3.4.2 EDEMA DE PATA INDUZIDO POR CARRAGENINA
Esta é uma metodologia que permitiu a observação do efeito sistêmico da substância
e/ou extrato teste através da indução de um estímulo inflamatório local. O teste foi realizado
com dois grupos controles e os grupos experimentais, para cada qual foram distribuídos 5
(cinco) camundongos Swiss machos pesando entre 25-30 g. A mensuração do volume das
patas traseiras direita e esquerda de todos os animais foi realizada antes de qualquer
tratamento, antes da inoculação das amostras (tempo 0 hora) em de Pletismômetro (modelo
EFF 304 - Insight ). Em seguida foi administrado salina 100 μL (i.p.) ao primeiro grupo
controle (negativo); 10 mg/Kg de diclofenado de sódio (i.p.) (Voltaren® - Novartis) no
segundo grupo controle (positivo), em um dos grupos experimentais os EAMG, EHMG,
EClMG nas concentrações de 12,5, 25, 50 e 100 mg/Kg (via i.p.) e as substâncias isoladas
CQH-3 e CQH-2 aos grupos experimentais nas concentrações 12,5, 25 e 50 mg/Kg (via i.p.)
solubilizados em 0,01 mL de DMSO:Tween 80 (1:1)/mL de NaCl 0,9 %. Após uma hora, foi
administrado 50 μL de solução aquosa de carragenina (Sigma-Aldrich) a 1% (p/v) na pata
direita subplantar de cada camundongo, de acordo com o método descrito por Winter et al.
(1962). Um volume igual de salina (NaCl 0,9%) foi injetado na pata contralateral. O edema
- 69 -
foi registrado em pletismômetro 30 min, 1 h, 2h e 3h após a aplicação da carragenina. O
volume do edema (mL) foi registrado em pletismômetro (modelo EFF 304 - Insight), sendo
que para a realização das medidas as patas posteriores de cada animal foram submergidas
(uma de cada vez) até a junção tíbio-tarsal, na câmara de leitura do aparelho. O volume do
líquido deslocado foi registrado digitalmente e correspondeu ao volume das patas. Os
resultados foram expressos como a diferença de volume (mL) entre a pata que recebeu a
carragenina e a pata contralateral que recebeu a salina.
Os experimentos foram realizados no Biotério da Fundação Oswaldo Cruz Rondônia e no Laboratório de Cultivo Celular e Anticorpos Monoclonais e Laboratório
De Bioquímica e Biotecnologia da Fundação Oswaldo Cruz - Rondônia.
3.4.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para a análise estatística dos dados e elaboração dos gráficos foi utilizado o software
GraphPad Prism 5 (GraphPad Inc, EUA). Os resultados foram apresentados como média ±
erro padrão da média (E.P.M.), exceto as doses de inibição de 50 % do edema (DI50) (dose ou
concentração dos extratos que reduziram a resposta em 50% em relação ao grupo controle),
que foram representadas como médias geométricas, acompanhadas de seus respectivos limites
de confiança, em nível de 95%. Os dados obtidos foram avaliados por teste Tukey, ou análise
de variância com um critério (ANOVA – one way).
3.5 SOLUBILIZAÇÃO DO EXTRATO ACETÔNICO DA ENTRECASCA,
ELUATOS E SUBSTÂNCIAS ISOLADAS
Para a realização dos testes de atividade citotóxica e antiplasmodial, o extrato
acetônico da entrecasca e eluatos foram solubilizadas em dimetilsulfóxido (DMSO) ou
clorofórmio (CHCl3) (Sigma-Aldrich) na concentração final de até 0,005% e todas as soluções
foram preparadas no dia da realização dos experimentos.
- 70 -
3.6 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CITOTÓXICA
3.6.1 CULTIVO DAS CÉLULAS HEPG2
As linhagens celulares de HepG2 (derivada de um hepatoma humano) foram
cultivadas como recomendado (CALVO-CALLE et al., 1994). As mesmas foram mantidas
em garrafas de cultura de 75 cm2 (Corning) suplementadas em RPMI contendo 5% de soro
bovino fetal (SBF) (Gibco/Invitrogen) e 40 mg/L de gentamicina (Schering-Plough). As
células foram mantidas em estufa com 5% de CO2 e 37 °C. O meio das garrafas foi
substituído a cada dois dias. Após confluência de cerca de 80%, a cultura de células foi
repicada, ou utilizada na realização de ensaios de citotoxicidade. Quando necessário, o
congelamento das células foi realizado em ampolas de criopreservação com uma solução
contendo 95% de SBF e 5% de DMSO (Sigma-Aldrich).
3.6.2 PREPARO DAS PLACAS TESTE
Para o preparo das placas testes, as células foram lavadas com meio RPMI
incompleto (sem SBF e gentamicina), tratadas com 1 mL de tripsina-EDTA a 0,25%
(Gibco/Invitrogen) e incubadas em estufa com 5% de CO2 a 37°C por 5-10 minutos, para que
as células se descolassem da garrafa. O conteúdo resultante da tripsinização foi transferido
para tubo de centrífuga de fundo cônico de 15 mL (tipo Falcon) e adicionados meio RPMI
completo (contendo 5% SBF e 40 mg/L de gentamicina) até completar 10 mL, seguido de
centrifugação por 5 minutos a 1.500 rpm à temperatura ambiente. O sobrenadante foi
descartado e o sedimento (pellet) ressuspendido em meio RPMI completo. Após a contagem,
em câmara de Neubauer, a suspensão foi ajustada para 1 x106 células/mL e 180μL
acrescentados a cada poço da placa de cultura com 96 poços (KASVI K12-96). As células
foram incubadas por 24 h em estufa com 5% de CO2 e 37 °C para adesão aos poços da
microplaca. Em seguida, 20 μL de meio completo contendo diferentes concentrações dos
extratos EAMG, EHMG, EClMG e EAcMG (9,37; 18,75; 37,7; 75; 150; 300 e 600 g.mL-
- 71 -
1
) e CQH-2 e CQH-3 (2,34; 4,68; 9;37; 18;75; 37,5, 75 e 150 µg.mL-1) foram adicionados aos
poços da placa de cultura. As placas foram incubadas por 24h em estufa com 5% de CO2 e 37
°C. Para os EAMG, EHMG, EClMG e EAcMG foi preparada uma placa denominada
“Branco” (submetida as mesmas condições, porém sem a cultura de células HepG2).
3.6.3 TESTE DE CITOTOXICIDADE
A citotoxidade foi determinada através do método colorimétrico do MTT (3-(4,5dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio]) (MADUREIRA et al., 2002). Após 24 horas foi
adicionado em cada poço, 20 μL de MTT a uma concentração de 5 mg.mL-1 em PBS 1X (p/v)
e as placas foram deixadas por três horas em estufa com 5% de CO2 e 37 °C. Ao final desse
período, o meio de cultura, juntamente com o excesso de MTT, foi desprezado e em seguida,
100 μL de DMSO (Sigma-Aldrich) foi adicionado a cada poço. A leitura óptica foi realizada
em espectofotômetro (BIO-RAD Modelo 3550) em  de 570 m, e a densidade óptica (DO)
média dos poços, foi comparada com a DO média, dos poços controles. A DO da placa com
os EAMG, EHMG, EClMG e EAcMG foi subtraída da DO da placa “Branco” antes da
realização dos cálculos para determinação da MDL50, devido ao fato de o extrato e eluatos
terem coloração alaranjada. Todos os testes foram realizados em triplicata e repetidos por
quatro vezes para confirmação dos resultados obtidos, a citotoxicidade foi calculada através
da Equação 3, e as concentrações que mataram 50% das células (MDL50), foram determinadas
a partir de regressão linear das concentrações testadas e admitindo-se um intervalo de
confiança de 99% (p < 0,01) para a reta obtida, utilizando-se o programa Microcal Origin
versão 8.0.
 AbsHepG-2 Teste 

  100
(%) C  100 - 
 AbsHepG-2 

Equação 3
Onde: AbsHepG2+Teste = absorbância dos poços com extrato acetônico ou eluatos ou substâncias
isoladas, AbsHepG2 = absorbância dos poços sem extrato acetônico ou eluatos ou substâncias
isoladas.
Os testes foram realizados no Laboratório de Quimioterapia de Malária – LQM no
Instituto de Pesquisa em Patologias Tropicais – IPEPATRO/FIOCRUZ-RO.
- 72 -
3.7 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-Plasmodium falciparum
3.7.1 CULTIVO DO P. falciparum CEPA 3D7 (SENSÍVEL A CLOROQUINA)
As cepas de P. falciparum 3D7 foram descongeladas e mantidas em cultura de
suspensão de hemácias humanas com fator A+ ou O+ com hematócrito de 5%, seguindo
fundamentalmente a técnica de Trager e Jansen (1976), adaptado com alguns passos que não
afetaram as condições para manter os eritrócitos viáveis. O cultivo foi realizado em meio
completo composto por RPMI 1640 (Sigma) suplementado com 5% de plasma humano
desfibinado A+ ou O+ ou com albumas (Gibco) na concentração final de 1%; Hepes 22,8 mM
(Promega); glicose 11,1 mM (Sigma); HPX 0,36 mM (50 µg.mL-1) (Sigma); NaHCO3 23,8
mM (Merck); gentamicina 40 µg.mL-1 (Sigma). Os parasitos foram mantidos em estufa com
5% de CO2, 95 % de umidade e 37 °C, em garrafas plásticas de cultura de 25 cm2 (Sarstedt)
sob uma tensão de gases (5% de O2 + 5% de CO2 + N2 balanceado). O acompanhamento do
desenvolvimento do parasito foi realizado através da preparação estendida em lâminas
(esfregaço) para análise em microscópio óptico. Os esfregaços foram corados pelo método
panótico rápido (Laborclin), e observado em aumento de 1000X (Microscópio CX21,
Olympus).
3.7.2 SINCRONIZAÇÃO DOS PARASITOS PARA UTILIZAÇÃO NOS TESTES in vitro
Os cultivos com predomínio de anéis utilizados nos ensaios de quimioterapia foram
obtidos através de sincronização com sorbitol, conforme descrito na literatura (LAMBROS;
VANDERBERG, 1979). Resumidamente, o meio de cultura foi retirado da garrafa de cultura
e 10 mL de uma solução de sorbitol 5% e glicose 0,5% foram adicionadas ao sedimento
contendo o sangue parasitado. O conteúdo foi transferido para um tubo de centrífuga de fundo
cônico de 15 mL (tipo Falcon) e incubado à 37 ºC por 10 minutos. Após esse período o
material foi centrifugado por 5 minutos a 1000 rpm à temperatura ambiente. O sobrenadante
- 73 -
foi retirado e o sedimento ressuspendido com meio RPMI suplementado com soro humano
A+ ou O+ inativado, ajustando-se o hematócrito para 5%. Essa suspensão foi novamente
transferida para uma placa de Petri, e deixada em repouso a 37ºC por aproximadamente 10
minutos para que as hemácias sedimentassem. Posteriormente, foi realizado um esfregaço
sanguíneo para determinação da parasitemia. O hematócrito e a parasitemia, pré-determinados
para cada teste, foi ajustado com a adição de hemácias “novas” e meio RPMI completo em
quantidades adequadas.
3.7.3 PREPARO DAS PLACAS PARA OS ENSAIOS DE QUIMIOTERAPIA
Culturas de parasitos sincronizadas com predomínio de anéis de P. falciparum cepa
3D7 foram distribuídas em placas de cultura de 96 poços (KASVI K12-96) adicionando-se
180 μL/poço de meio de cultura RPMI contendo 0,05% de parasitemia e 1% de hematócrito
para o teste de ELISA anti-HRPII. Anteriormente a adição da suspensão dos parasitos, 20 μL
dos compostos a serem testados foram adicionados os EAMG, EHMG, EClMG e EAcMG à
placa teste, em triplicata, e em diferentes concentrações seriadas (0,15; 0,31; 0,62; 1,25; 2,5; 5
e 10 µg.mL-1). Os poços controles (seis por teste) continham hemácias normais não infectadas
(controle negativo), ou hemácias infectadas sem adição dos compostos-testes (controle
positivo). O antimalárico padrão (cloroquina – CQ), foi testado em paralelo em todos os
experimentos realizados, em diluições seriadas (1,56; 3,15; 6,25; 12,5; 25; 50 e 100 g.mL-1).
3.7.4 TESTE IMUNOENZIMÁTICO ANTI-HRPII
No ensaio imunoenzimático anti-HRPII (NOEDL et al., 2002) duas placas de 96
poços (KASVI K12-96) foram preparadas para cada experimento, uma placa-teste, contendo
os parasitos e os compostos a serem testados (item 3.7.3), e outra pré-sensibilizada com o
anticorpo monoclonal anti-HRPII. As placas-testes foram incubadas por 24h à 37ºC, e o
conteúdo de seis poços (controle positivo) foi retirado e congelado à -20°C para ser utilizado
posteriormente como background. A placa foi novamente incubada por 48h nas condições
ideais para o crescimento do parasito. Após 72h totais de incubação, as placas foram
congeladas e descongeladas duas vezes à -20°C para que houvesse a lise das hemácias. Para a
- 74 -
sensibilização das placas no teste anti-HRPII, 100 μL do anticorpo primário (MPFM-55A
ICLLAB®, EUA) a 1,0 μg.mL-1 foram adicionados a cada poço da placa de ensaio
(Maxysorp, Nunc, Denmark). Após incubação por 12 a 16 h a 4°C, o conteúdo dos poços foi
descartado e 200 μL/poço de uma solução de bloqueio (PBS-BSA 2%) adicionada, sendo a
placa mantida à temperatura ambiente por 2 h. Após esse tempo, o conteúdo dos poços foi
novamente descartado e a placa lavada três vezes com PBS-Tween 20 a 0,05% (PBS-T). A
cada poço da placa foram adicionados 100 μL das amostras da cultura de P. falciparum
hemolisadas. Em seis poços da placa foram adicionados 100 μL dos controles congelados nas
primeiras 24h (background). A placa foi então incubada por 1 h à temperatura ambiente, em
câmara úmida, em seguida foi lavada três vezes com PBS-T, adicionando-se a cada poço 100
μL do anticorpo secundário (MPFG55P ICLLAB®, EUA) diluído a 1:5.000. Após incubação
à temperatura ambiente por 1 h, em câmara úmida e temperatura ambiente, a placa foi lavada
três vezes com PBS-T e 100μL de uma solução de TMB – 3,3´,5,5´-Tetrametilbenzidina
(TMB) acrescentados a cada poço. A placa foi incubada por 5 a 10 min à temperatura
ambiente, ao abrigo da luz, e a reação interrompida adicionando-se 50 μL/poço de uma
solução de ácido sulfúrico 1 mol/L. A leitura das absorbâncias foi realizada em  de 450 m
em espectofotômetro (BIO-RAD Modelo 3550).Os testes foram realizados no Laboratório de
Quimioterapia de Malária – LQM no Instituto de Pesquisa em Patologias Tropicais –
IPEPATRO/FIOCRUZ-RO.
3.7.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A determinação da MDL50 foi realizada a partir de regressão linear, relacionando-se
o percentual de inibição em função do logaritmo das concentrações testadas e admitindo-se
um intervalo de 99% (p<0,01), para a reta obtida utilizando-se o programa Microcal Origin
versão 8.0.
- 75 -
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL DOS CONSTITUINTES ISOLADOS DA
ENTRECASCA DE MAYTENUS GUIANENSIS
A partir do extrato acetônico da entrecasca de M. guianensis foram identificados
quatro triterpenos da classe friedelano e dois triterpenos da classe quinonametídeos.
4.1.1 DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL DE 3-OXO-FRIEDELANO (CQH-1)
29
27
12
19
20
18
11
9
2
O
28
16
8
3
4
15
25
5
22
14
10
21
17
13
1
30
26
7
6
24
23
3-Oxofriedelano (Friedelina)
(1)
O composto CQH-1 apresentou-se como um sólido branco amorfo, solúvel em
clorofórmio, com faixa de fusão de 237 - 239 oC, a análise em cromatografia em camada
delgada (CCD) com revelador universal (etanol/anidrido acético/ácido sulfúrico – 8:1:1,
v/v/v) mostrou uma única mancha de coloração pink e apresentou resultado positivo no teste
para triterpeno quando tratado com reagente de Liebermann-Burchard.
O espectro de RMN de 1H de CQH-1 (Figura 8) registrou sete singletos em δH 1,18
(s), 1,04 (s), 1,01 (s), 1,00 (s), 0,95 (s), 0,87 (s), 0,72 (s), relacionados a sete metilas e um
dubleto (J = 6,9 Hz) em δH 0,88, correspondente à metila C-23 de triterpenos da classe
friedelano (MAHATO; KUNDU, 1994).
- 76 -
FIGURA 8 - Espectro de RMN de 1 H de CQH-1 (3-oxo-friedelano) (CDCl 3 ; 400
MHz).
0.725
0.870
0.887
0.953
1.001
1.006
1.049
1.180
4000
5000
0.725
0.870
0.887
0.953
1.001
1.006
1.049
1.180
3000
2000
4000
1000
3000
1.20
ppm (t1)
1.10
1.00
0.90
0.80
0.70
2000
1000
0
6.0
ppm (t1)
5.0
4.0
O espectro de RMN de
3.0
2.0
1.0
0.0
13
C de CQH-1 (Figura 9) mostrou um sinal em δC 213,3,
atribuído ao carbono do grupo carbonila (C-3). Os sinais em δC 14,7 e 6,8 são atribuídos aos
grupos metila característicos da classe friedelano (C-24 e C-23, respectivamente) (MAHATO;
KUNDU, 1994).
Em uma análise comparativa entre os espectros de RMN
13
C (Figura 9) e RMN
13
C
(DEPT-135) (Figura 10) foi possível destacar os carbonos não-hidrogenados, monohidrogenados, di-hidrogenados e tri-hidrogenados (Tabela 1), possibilitando propor a fórmula
molecular C30H50O.
- 77 -
FIGURA 9 - Espectro de RMN DE
MHz).
13
C de CQH-1 (3-oxo-friedelano) (CDCl 3 ; 100
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
200
ppm (t1)
150
100
50
0
- 78 -
FIGURA 10 - Espectro de RMN DE
(CDCl 3 ; 100 MHz).
13
C (DEPT-135) de CQH-1 (3-oxo-friedelano)
2500
6.866
14.674
17.971
18.244
18.702
20.287
22.304
30.517
31.792
32.099
32.412
32.749
35.055
35.342
35.617
36.001
39.261
41.274
41.551
53.096
58.219
59.451
2000
1500
1000
500
0
-500
60
50
40
30
20
10
0
ppm (t1)
TABELA 1 - Deslocamentos químicos dos carbonos não-, mono-, di- e trihidrogenados de CQH-1 (3-oxo-friedelano), a partir dos espectros de
RMN 13 C (PND) e RMN 13 C (DEPT-135).
C
213,3
42,7
37,7
38,8
38,0
30,2
28,7
6 x C (C=O)
CH
58,2
53,7
60,1
42,7
4 x CH
CH2
22,3
41,5
41,6
18,2
35,6
30,5
32,8
36,0
35,4
32,4
39,3
11 x CH2
CH3
6,8
14,7
17,9
20,3
18,7
32,1
31,8
35,0
8 x CH3
C30H50O
- 79 -
À partir da comparação entre os dados de RMN 13C de CQH-1 com os dados descritos
na literatura (QUEIROGA et al., 2000, Tabela 2) para o triterpeno 3-oxo-friedelano (1), foi
possível inferir que se trata da mesma substância.
Este triterpeno já foi isolado em outras plantas do gênero Maytenus (NOSSACK et al.,
2000; QUEIROGA et al., 2000; OLIVEIRA et al., 2007; SOUSA et al., 2012), porém esta foi
a primeira vez que o mesmo foi isolado de M. guianensis.
TABELA 2 - Dados de RMN de 13 C (100 MHz, CDCl 3 ) de CQH-1 (3-oxofriedelano) e dados da 3-oxo-friedelano descritos na literatura (SOUSA
et al., 2012).
CQH-1
C
3
5
9
13
14
17
20
CH
4
8
10
18
CH2
δC
213,3
42,7
37.7
38,8
38,0
30,2
28,7
Fridelina
(SOUSA et al., 2012)
δC
213,2
42,1
37,5
39,7
38,3
30,0
28,2
58,2
53,7
60,1
42,7
58,2
53,3
59,5
42,8
1
2
6
7
11
12
15
16
19
21
22
CH3
23
24
25
26
27
28
29
30
22,8
41,8
42,0
18,1
36,1
31,0
32,9
36,5
35.8
32,3
39,7
22,3
41,5
41,6
18,2
35,6
30,5
32,8
36,0
35,4
32,4
39,3
7,3
15,2
16,8
20,7
18,4
32,6
32,3
32,6
6,8
14,7
17,9
20,3
18,7
32,1
31,8
35,0
- 80 -
4.1.2 DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL DE 3 - HIDROXIFRIEDELANO (CQH-2)
29
27
12
19
20
18
11
9
2
HO
28
16
8
3
4
15
25
5
22
14
10
21
17
13
1
30
26
7
6
24
23
3 - Hidroxifriedelano (Friedelinol) (2)
A substância denominada CQH-2, apresentou-se como um sólido branco amorfo, um
ponto de fusão 276-2810C, solúvel em clorofórmio, a análise através da técnica de
cromatografia em camada delgada com revelador universal (etanol/anidrido acético/ácido
sulfúrico – 8:1:1, v/v/v) mostrou uma única mancha de coloração pink e este também
apresentou teste positivo para triterpeno quando tratado com reagente de LiebermannBurchard.
O espectro na região do infravermelho (Figura 11) de CQH-2 apresentou bandas de
absorção em: 3619 e 3471 cm-1 característica de estiramento de ligação de hidroxila (-OH),
2925-2869 cm-1 características de estiramento simétrico e assimétrico da ligação de
compostos alifáticos (-CH) em 1448 e 1384 cm-1.
- 81 -
FIGURA 11 - Espectro de CQH-2 (3-hidroxifriedelano) obtido no infravermelho
(IV) (KBr, cm -1 ).
55
%T
50
45
40
35
30
25
20
15
4500
4250
4000
Teste Poliestireno
3750
3500
3250
3000
2750
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
1/cm
O espectro de RMN de 1H (Figura 12) de CQH-2 apresentou sete singletos em δH 0,73
(s), 0,86, 0,87 (s), 1,00 (s), 1,09 (s), 1,10 (s), 1,17 (s) e um dubleto em δH 0,96 (J=6,9 Hz)
correspondente a oito metilas, sendo o dubleto relacionado a metila C-23 de um triterpeno da
classe friedelano (MAHATO; KUNDU, 1994).
- 82 -
FIGURA 12 - Espectro de RMN 1 H de CQH-2 (3-hidroxifriedelano), mostrando
uma expansão entre 1,2-0,70 (400 MHz, CDCl 3 ).
700
0.724
0.856
0.870
0.944
0.963
0.988
0.994
1.004
1.168
1.253
1.267
1.272
1.472
1.595
2.243
2.257
3.734
3.737
600
500
400
300
200
100
0
4.0
3.0
2.0
1.0
0.0
ppm (t1)
Uma análise comparativa entre os espectros de RMN 13C (PND) (Figura 13) e RMN
13
C (DEPT-135) (Figura 14) de CQH-2 possibilitou verificar a presença de seis carbonos não-
hidrogenados, cinco mono-hidrogenados, onze di-hidrogenados e oito tri-hidrogenados,
possibilitando assim, propor a fórmula molecular C30H52O. No espectro de RMN
13
C foi
observado uma absorção em δC 73,0 relacionada a um carbono carbinólico, confirmado no
espectro de RMN 1H em δH 3,73 (sl).
- 83 -
TABELA 3 - Deslocamentos químicos dos carbonos não-, mono-, di- e trihidrogenados de CQH-2 (3-hidroxifriedelano), a partir dos espectros
de RMN 13 C (PND) e RMN 13 C (DEPT-135).
C
38,2
37,4
39,9
39,7
30,0
28,8
6xC
CH
Δ
49,8
53,4
61,9
42,3
5 x CH
CH2
74,7
41,5
41,2
39,5
35,8
32,7
30,6
29,7
27,7
22,3
18,2
10 x
CH2;(CHOH)
CH3
31,1
32,0
25,8
20,8
18,4
17,9
14,6
6,8
8 x CH3
C30H52O
FIGURA 13 - Espectro de RMN 13 C - DESACOPLADO - (CDCl 3 , 100 MHz) de
CQH-2 (3-hidroxifriedelano).
7.350
12.154
16.376
16.951
18.128
18.803
19.180
20.663
22.838
28.732
30.601
31.207
32.352
32.657
32.926
33.426
35.562
35.807
35.923
36.152
36.676
39.848
40.262
42.337
43.447
49.782
53.787
58.822
61.974
73.304
100000
50000
0
80
ppm (t1)
70
60
50
40
30
20
10
0
- 84 -
FIGURA
14
- Espectro de RMN de 13 C (DEPT-100)
hidroxifriedelano) (CDCl 3 ; 100MHz).
de
CQH-2
(3-
50000
7.344
12.143
18.069
18.767
20.634
31.157
32.309
32.610
32.850
33.335
35.542
35.712
35.858
36.074
36.535
36.601
39.774
39.798
42.245
43.340
49.692
53.713
58.749
60.004
61.870
73.268
0
-50000
80
ppm (t1)
70
60
50
40
30
20
A comparação entre os deslocamentos químicos de RMN
10
13
C de CQH-2 com os
dados propostos para o triterpeno 3-Hidroxifriedelano (2) descritos na literatura (ALMEIDA
et al., 2011) (Tabela 4), foi possível verificar-se que se trata da mesma substância. Este
triterpeno já foi isolado em outras plantas do gênero Maytenus (ESTEVAN, 2006;
FONSECA, et al., 2007; SOUZA, 1986; SOUSA et al., 2012), porém esta foi a primeira vez
que o mesmo foi isolado de M. guianenis.
- 85 -
TABELA 4 - Dados de RMN de 13 C (100 MHz, CDCl 3 ) de CQH-2 (3Hidroxifriedelano) e dados da 3-hidroxifriedelano descritos na
literatura.
CQH-2
C
5
9
13
14
17
20
CH
3
4
8
10
18
CH2
δC
38.4
37.7
38.9
40.3
30.6
28.7
3 - Hidroxifriedelano
(SOUSA et al., 2012)
δC
38,1
37,4
38,6
39,9
30,0
28,2
73,3
49,6
53,6
61,8
43,3
72,9
49,4
53,4
61,6
43,1
1
2
6
7
11
12
15
16
19
21
22
CH3
23
24
25
26
27
28
29
30
16,31
36.6
42.3
18.8
36.1
31.2
32.9
35.9
35.8
33.4
39.8
15,8
36,3
41,9
17,6
35,6
30,6
32,3
35,8
35,4
32,8
39,5
12,1
16,9
18,7
20,6
18,7
32,3
35,5
32,6
11,6
16,4
18,2
20,1
18,6
32,1
35,2
31,8
- 86 -
4.1.3 DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL DE 3-OXO-16-HIDROXIFRIEDELANO (CQH3).
29
27
19
12
30
21
22
11
28
1
2
OH
15
25
O
24
7 26
6
23
3-oxo-16 β-hidroxifridelano (16 -hidroxifriedelina) (3)
O composto denominado CQH-3, apresentou-se como um sólido banco amorfo,
solúvel em clorofórmio, ponto de fusão 278 – 280 0C, apresentou uma única mancha de
coloração pink quando analisado em CCD com revelador universal (etanol/anidrido
acético/ácido sulfúrico – 8:1:1, v/v/v) e apresentou resultado positivo para teste de triterpeno
quando tratado com reagente de Liebermann – Buerchard.
O espectro na região do infravermelho (Figura 15), de CQH-3 apresentou bandas de
absorção em: 3630 e 3462 cm-1 característica de estiramento de ligação de hidroxila (-OH) e
em: 1748 cm-1 de carbonila (-C=O).
- 87 -
FIGURA 15 - Espectro de CQH-3 (3-oxo-16β-hidroxifriedelano) obtido no
infravermelho (IV) (KBr, cm -1 ).
35
%T
30
25
20
15
10
5
0
4500
4250
4000
Teste Poliestireno
3750
3500
3250
3000
2750
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
1/cm
A Tabela 5 destaca os deslocamentos químicos dos carbonos não-hidrogenados,
mono-hidrogenados, di-hidrogenados e tri-hidrogenados, obtidos a partir de uma análise
comparativa entre os espectros de RMN
13
C (PND) (Figura 16) e RMN
13
C (DEPT-135)
(Figura 17) de CQH-3. Os dados agrupados na Tabela 5 permitiram propor fórmula
molecular C30H52O2 para CQH-3.
- 88 -
TABELA 5 - Deslocamentos químicos dos carbonos não-, mono-, di- e trihidrogenados de CQH-3 (3-oxo-16β-hidroxifriedelano), a partir dos
espectros de RMN 13 C (PND) e RMN 13 C (DEPT-135).
C
213,1
42,2
39,9
39,1
37,5
31,9
27,9
7 x C (C=O)
*
FIGURA
CH
75,5
59,5
58,2
53,3
44,6
5 x CH(CHOH))
CH2
44,2
41,5
41,2
36,0
35,6*
35,6*
31,9
30,7
22,2
18,5
10 x CH2
CH3
35,5
30,7
24,9
21,4
20,1
18,1
14,7
6,8
8 x CH3
C30H52O2
Estas absorções estão superpostas
16
- Espectro de RMN 13 C (PND)
hidroxifriedelano) (150 MHZ, CDCL 3 ).
de
CQH-3
(3-oxo-16
10000
18.160
14.679
6.868
18.468
20.122
21.421
22.261
24.874
27.963
30.731
31.889
35.466
35.647
35.705
35.922
37.486
39.215
39.952
41.181
41.497
42.239
44.201
44.615
53.343
58.179
59.457
75.497
213.160
5000
0
200
ppm (t1)
150
100
50
0
β-
- 89 -
FIGURA 17 - Espectro de RMN 13 C (DEPT-135) de CQH-3 (3-oxo-16βhidroxifriedelano) (150 MHZ, CDCl 3 ).
14.680
0.022
6.871
18.162
18.468
20.123
21.421
22.262
24.876
30.738
31.887
35.469
35.646
35.922
41.179
41.499
44.199
44.613
53.342
58.178
59.455
75.500
1000
500
0
-500
-1000
-1500
-2000
200
150
100
50
0
ppm (t1)
O espectro de RMN 1H de CQH-3 (Figura 19) exibiu um total de oito sinais
relacionados a metilas, sete singletos em δH 1,19 (s), 1,09 (s), 1,02 (s), 1,00 (s), 0,99 (s), 0,87
(s), 0,72 (s) e um dupleto em δH 0,88 (d, J=6,6 Hz), característicos de triterpenos da classe
friedelano. Uma absorção neste mesmo espectro em δH 4,03 (t, J=8,9 Hz), juntamente com
duas absorções no espectro de RMN
13
C de CQH-3 (Figura 16) em δC 75,5 e 213,1,
permitiram propor que CQH-3 possui uma hidroxila (-OH) e uma carbonila (-C=O) em seu
esqueleto. De acordo com a posição do dupleto no espectro de RMN 1H em δH 0,88 (d, J=6,61
Hz) possibilitou localizar a carbonila na posição C-3 (NOZAKI et al., 1986).
O espectro bidimensional COESY de CQH-3 (Figura 21), forneceu as conexões
entre os hidrogênios e os respectivos carbonos. A posição da hidroxila (-OH) no C-16 foi
possível após análise no espectro bidimensional COESY de CQH-3 (Figura 22), onde foi
possível observar os acoplamentos com 2J e 3J entre o hidrogênio metínico carbinólico em δH
- 90 -
4,03 (t, J=8,9 Hz) com a metila C-28 (δC 24,9, 3J), C-15 (δC 44,2, 2J) e C-22 (δC 36,0, 3J).
Conclui-se, portanto que, que CQH-3 é um triterpeno da classe friedelano com uma carbonila
na posição C-3 e uma hidroxila (-OH) na posição C-16. A comparação entre os dados de
RMN 13C de CQH-3 (Figura 16) com dados da literatura (NOZAKI et al,. 1986) (Tabela 6)
para o triterpeno 3-oxo-16 β-hidroxifriedelano (3), comprovou tratar-se da mesma
substância. A estereoquímica para a hidroxila (-OH) foi proposta após verificar que as
correlações (Figura 18) no espectro bidimensional NOESY de CQH-3 (Figura 23) tratava-se
de um triterpeno já isolados em outras plantas do gênero Maytenus (NOZAKI et al., 1986),
porém esta é a primeira vez que esta substância foi isolada de M. guianensis.
FIGURA 18 - Algumas correlações observadas no espectro NOESY de CQH-3 (3oxo-16 β-hidroxifriedelano).
24
O
25
CH3
H3C
4
30
CH3
26
10
5
23
13
8
H
CH3
CH3
9
7
H 28
H
CH3
19
14
H
H
22
H 15
H CH3
27
17
OH
H
H
H
H
CH3 29
- 91 -
FIGURA 19 - Espectro de RMN 1 H de CQH-3 (3-oxo-16 β-hidroxifriedelano) (400
MHz, CDCl 3 ).
5000
0
7.0
ppm (t1)
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
0.0
- 92 -
FIGURA
20
- Espectro bidimensional COESY
hidroxifriedelano) (400 MHz, CDCl 3 ).
de
CQH-3
(3-oxo-16β-
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
ppm (f1)
7.0
ppm (f2)
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
0.0
- 93 -
FIGURA
21
- Espectro bidimensional COESY
hidroxifriedelano) (400 MHz, CDCl 3 ).
de
CQH-3
(3-oxo-16β-
0
50
100
150
ppm (f1)
7.0
ppm (f2)
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
0.0
- 94 -
FIGURA
22
- Espectro bidimensional HMBC
hidroxifriedelano) (400 MHz, CDCl 3 ).
de
CQH-3
(3-oxo-16β-
0
50
100
150
200
ppm (f1)
7.0
ppm (f2)
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
0.0
- 95 -
FIGURA
23
- Espectro bidimensional NOESY
hidroxifriedelano) (400 MHz, CDCl 3 ).
de
CQH-3
(3-oxo-16
0.0
5.0
ppm (f1)
5.0
ppm (f2)
0.0
β-
- 96 -
TABELA 6 - Dados de RMN 13 C e RMN 1 H de CQH-3 (3-oxo-16 βhidroxifriedelano) e comparação com os dados do triterpeno 3-oxo-16
β-hidroxifriedelano (3), descritos na literatura (NOZAKI et al., 1986).
CQCH-3
C
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
DEPT135
CH2
CH2
C
CH
C
CH2
CH2
CH
C
CH
CH2
CH2
C
C
CH2
CH
C
CH
CH2
C
CH2
CH2
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH2
CH3
δC
22,2
41,5
213,1
58,2
42,2
41,2
18,5
53,3
37,5
59,5
35,6
30,7
39,1
39,9
44,2
75,5
31,9
44,6
35,6
27,9
31,9
36,0
6,8
14,7
18,1
20,1
21,4
24,9
30,7
35,5
δH
1,98 – 1,68 (m)
2,40 – 2,27 (m)
2,27 (m)
2,40 – 2,27 (m)
1,50 – 1,43 (m)
1,45 (m)
1,54 (m)
1,35 -1,38 (m)
1,35 -1,38 (m)
1,71 (m)
4,03 (t, J=8,9 Hz)
1,878 (m) e 1,29 (m)
1,48 (m)
1,40 (m)
1,48 (m)
0,88 (d, J=6,61 Hz)
0,72 (s)
0,87 (s)
1,00 (s)
1,09 (s)
1,19 (s)
1,02 (s)
0,99 (s)
29-hidroxifriedelan-3-ona
(3)
δC
22,3
41,6
212,5
58,3
42,3
41,4
18,6
53,5
37,6
59,7
35,8
30,8
39,3
40,1
44,4
75,6
32,1
44,8
35,8
28,0
32,1
36,0
6,8
14,7
18,2
20,1
21,5
24,9
30,8
35,5
- 97 -
4.1.4 DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL DE TINGENONA + TINGENINA B (CQH-4)
30
30
27
12
11
1
O
2
18
13
9
10
4
HO
25
O
21
22
27
11
28
16
15
O
2
10
6
4
HO
25
22
OH
17
28
14
8
3
O
21
18
13
9
26
7
5
1
20
19
12
17
14
8
3
20
19
16
15
26
7
5
6
23
23
Tigenona (4)
Tigenina B (22-hidroxi-tingenona) (5)
A mistura CQH-4 apresentou-se como cristais amarelos, solúveis em clorofórmio,
ponto de fusão (indefinido), análise CCD mostrou uma única mancha de coloração
avermelhada (revelador: etanol/anidrido acético/ácido sulfúrico - 8:1:1, v/v/v) e apresentou
resultado positivo para teste de triterpeno quando tratado com reagente de LiebermannBurchard. Apesar de apresentar somente uma mancha em CCD, os dados espectrais
mostraram tratar-se de uma mistura de dois compostos os quais serão discutidos a partir de
agora.
O espectro na região do infravermelho (IV) (Figura 24) de CQH-4 apresentou
absorções de grupos hidroxilas (-OH) em 3590-3000 cm-1, carbonila em 1620 cm-1 e
absorções de anel aromático em 1610, 1520, 1500 cm-1.
- 98 -
FIGURA 24 - Espectro de CQH-4 (tingenona + tingenina b) obtido no infravermelho
(IV) (KBr, cm -1 ).
50
%T
45
40
35
30
25
20
4500
4250
4000
Teste Poliestireno
3750
3500
3250
3000
2750
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
1/cm
O espectro de RMN de 1H de CQH-4 (Figura 26) apresentou onze sinais referentes a
grupos metilas em δH 2,23 (s), 1,49 (s), 1,48 (s), 1,36 ( s), 1,35 (s), 1,22 ( s), 1,01 ( s), 0,99 (s),
0,98 (s), 0,95 ( s), 0,87 (s), 0,98 (3H, s), 0,87 (3H,s) (expansão Figura 27 e 28). Os sinais dos
grupos metila em δH 2,23 (6H, s) (C-23), juntamente com seis sinais de hidrogênios olefínicos
(C-1, 6 e 7) (ver expansão Figura 27), podem perfeitamente serem atribuídos a triterpenos
quinonametídeos (KENNEDY et al., 2011), conforme estrutura parcial de triterpenos
quinonametídeos mostrada abaixo (Figura 25):
- 99 -
FIGURA 25 - Estrutura parcial de triterpeno quinonametídeo.
1
O
2
8
3
4
HO
7
5
6
23
Fonte: ALVARENGA; FERRO, (2006).
FIGURA 26 - Espectro de RMN 1 H de CQH-4 (tingenona + tingenina b) (400 MHz,
CDCl 3 ).
400
0.872
0.980
1.061
1.076
1.225
1.353
1.366
1.513
1.847
2.235
4.553
6.396
6.401
6.414
6.548
6.551
6.554
6.557
7.064
7.068
7.073
7.082
7.085
300
200
100
0
15.0
ppm (t1)
10.0
5.0
0.0
- 100 -
FIGURA 27 - Expansão do espectro de RMN 1 H da região de 2,35 - 2,00 de CQH-4
(tingenona + tingenina b) (400 MHz, CDCl 3 ).
- 101 -
FIGURA 28 - Expansão do espectro de RMN 1 H da região de 7,70 - 6,20 de CQH-4
(tingenona + tingenina b) (400 MHz, CDCl 3 ).
A comparação dos sinais mais expressivos dos espectros de RMN de
CQH-4 (Figura 26) e RMN de
13
C (PND) de
13
C (DEPT-135) (Figura 28) de CQH-4 revelou tratar-se da
presença vinte e um carbonos não hidrogenados, dez mono-hidrogenados, onze dihidrogenados e onze tri-hidrogenados (Tabela 7). Entre os sinais relacionados aos carbonos
não hidrogenados, foi possível confirmar a presença dos quatro grupos carbonilas, sendo duas
conjugadas em δC 178,41 e 178,40 relacionados aos (C – 3) e dois de cetona cíclica em δC
213,92 e 213,66 (Figura 30), onde um sinal de carbono carbinólico também foi observado em
δC 75,5.
- 102 -
FIGURA 29 - Espectro de RMN 13 C (DEPT-135) de CQH-4 (tingenona + tingenina
b) (150 MHz, CDCl 3 ) .
- 103 -
FIGURA 30 - Espectro de RMN 13 C (PND) de CQH-4 (tingenona + tingenina b)
(150 MHz, CDCl 3 ) mostrando expansões entre 214 – 209 E 77-71.
- 104 -
TABELA 7 - Deslocamentos químicos dos carbonos não-, mono-, di- e trihidrogenados de CQH-4 (tingenona + tingenina b), obtidos a partir dos
espectros de RMN 13 C (PND) E RMN 13 C (DEPT-135).
δC
178,41
178.40
169,00
168.83
164,81
164.82
146,11
146.11
127.67
117.52
117.58
44.89
44,86
44,35
42,68
42.7
41,90
40,64
38,23
213,9
213.7
21 x C
δCH
134,08
133,99
119,79
119,77
119,19
118.23
76,5
43,45
41,92
41,93
10 xCH
A comparação entre os dados de RMN
δCH2
52,55
35,48
34,00
33,66
32.42
32.03
29.92
29.91
29,50
29,93
28,51
11 x CH2
13
δCH3
39,21
39,09
32,58
25.11
21,62
21,55
20.55
19,74
15,14
14,79
10.35
11 x CH3
C de CQH-4 com os dados publicados na
literatura para tingenona (4) (RODRIGUES et al., 2012) e tingenina b (5) (ALMEIDA et al.,
2010) (Tabela 8), permitiram propor que CQH-4 trata-se da mistura destes dois triterpenos.
As estruturas dos dois triterpenos participantes da mistura em CQH-4 podem ser
confirmadas através dos espectros bidimensionais COESY (Figura 31) e HMBC (Figura 32).
Os dados de RMN 1H e RMN 13C dos triterpenos estão relacionados na Tabela 9.
No espectro bidimensional HMBC foi possível verificar o acoplamento entre o
Hidrogênio carbinólico H-22 (δH 4,55) com o C-28 (δC 25,11), C-18 (δC 44,98), C-21 (δC
213,7), isto confirma a posição da hidroxila na posição C-22 da tigenina B (5). A confirmação
da tigenona pode ser realizada através das correlações também no espectro bidimensional
- 105 -
HMBC (Figura 32), através dos acoplamentos entre os hidrogênios da metila C-28 (δH 1,25)
com os carbonos C-17 (δC 38,27), C-18 (δC 43,55), C-22 (δC 52,56), C-16 (δC 35,48).
A tingenona (4) e a tingenina b (5) já foram isoladas de outras espécies de plantas do gênero
Maytenus (ALMEIDA et al., 2010; GONZALES et al., 1982; KUTNEY et al., 1981;
MAGALHÃES, 2011; MORITA et al., 2008; OLIVEIRA et al., 2006b; RODRIGUES, 2012;
SILVA, 2007; SILVA et al., 2007), porém esta é a primeira vez que foram isolados de M.
guianensis. Os quinonametídeos são triterpenos pentacíclicos aparentemente restritos às
famílias Celastraceae e Hippocrateaceae (GUNATILAKA, 1986) e, portanto, considerados
marcadores químicos destas famílias (ALVARENGA; FERRO, 2006).
FIGURA 31 - Espectro bidimensional COESY de CQH-4 (tingenona + tingenina b).
- 106 -
FIGURA 32 - Espectro bidimensional HMBC de CQH-4 (tingenona + tingenina b).
- 107 -
TABELA 8 - Comparação entre os dados de RMN 13 C de CQH-4 (tingenona +
tingenina b) com dados destes triterpenos da literatura.
Tingenona (4)
Tingenina b (5)
CQH-4
Nº
δC
RODRIGUES et al., 2012
δC
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
25
26
27
28
30
CH
C
C
C
C
CH
CH
C
C
C
CH2
CH2
C
C
CH2
CH2
C
CH
CH2
CH
C
CH2
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
119,80
178,43
146,10
117,18
127,76
133,62
118,15
168,69
42,73
164,72
33,80
29,96
40,64
44,66
28,53
35,52
38,20
43,55
32,08
41,92
213,58
52,56
10,28
39,07
21,57
19,73
32,58
15,11
119,77
178,41
146,11
117,52
127,67
134,08
119,19
169,00
42,68
164,81
33,66
29.91
40,64
44,35
28,50
35,48
38,23
43,45
32.03
41,92
213,9
52,55
10.35
39,09
21,55
19,74
32,58
15,14
δC
119,79
178,40
146,11
117,58
127,67
133,99
118,23
168,83
42,70
164,82
34,00
29,92
44,89
41,90
29,50
29,90
44,86
44,98
32,42
41,90
213,7
76,50
10,35
39,21
21,62
20,55
25,11
14,79
ALMEIDA et al., 2010
120,20
178,80
146,50
117,60
128,20
134,10
118,60
168,80
43,00
165,10
34,40
30,40
44,70
41,00
28,70
29,90
45,20
45,50
32,40
41,30
213,70
76,80
10,70
39,60
22,00
20,90
25,40
15,10
- 108 -
TABELA 9 - Correlação entre os deslocamentos químicos dos hidrogênios com os
carbonos para CQH-4 (tingenona + tingenina b).
Nº
1
6
7
11
12
15
16
18
19
20
22
CH
CH
CH
CH2
CH2
CH2
CH2
CH
CH2
CH
CH2
23
25
26
27
28
30
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CQH-4
Tingenona
δC
δH
119,77
6,44 (m)
134,08
7,07 (m)
119,19
6,40 (m)
33,66
2,21(m) e 1,99 (m)
29.91
1,87 (m)
28,50 1,89 (m) e 1,61 (m)
35,48
1,33 (m)
43,45
1,64 (m)
32.03 2,21 (m) e 1,78 (m)
41,92
2,50 (m)
52,55
2,91 (d, J=14,3)
1,83 (d, J=14,3)
10.35
2,23 (s)
39,09
1,48 (s)
21,55
1,36 (s)
19,74
0,95 9S)
32,58
1,22 (s)
15,14
1,01 (s)
δC
119,79
133.99
118.23
34,00
29.92
29,50
29,9
44.98
32.42
41,9
76,5
CQH-4
Tingenina B
δH
6,44 (m)
7,07 (m)
6,40 (m)
2,21(m) e 1,99 (m)
1,87 (m)
1,89 (m) e 1,61 (m)
1,89 (m) e 1,61 (m)
1,78 (m)
2,21 (m) e 1,78 (m)
2,50 (m)
4,55 (sl)
10.35
39.21
21,62
20.55
25.11
14,79
2,23 (s)
1,49 (s)
1,35 (s)
0,98 (s)
0,87 (s)
0,99 (s)
4.1.5 DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL DE 3-OXO-29-HIDROXIFRIEDELANO (CQCl-1)
29
27
30
CH2OH
21
19
12
22
11
28
1
16
2
15
25
O
24
7 26
6
23
3-oxo-29-hidroxifriedelano (29-hidroxifriedelina) (6)
O composto CQCl-1 apresentou-se como um sólido branco, solúvel em clorofórmio,
ponto de fusão 268-269 0C, análise em cromatografia em camada delgada com revelador
- 109 -
universal (etanol/anidrido acético/ácido sulfúrico – 8:1:1, v/v/v) mostrou uma única mancha e
apresentou teste positivo para triterpeno quando tratado com reagente de LiebermannBurchard.
O espectro na região do infravermelho (Figura 33) de CQCl-1 apresentou bandas de
absorção em: 3619 e 3471 cm-1 característica de estiramento de ligação de hidroxila (-OH) e
1697 cm-1 de carbonila (-C=O).
FIGURA 33 - Espectro de CQCl-1 (3-oxo-29-hidroxifriedelano) obtido no
infravermelho (IV) (KBr, cm -1 ).
25
%T
0
4500
4250
4000
Teste Poliestireno
3750
3500
3250
3000
2750
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
1/cm
4500
4250
4000
Teste Poliestireno
3750
3500
3250
3000
2750
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
1/cm
37,5
%T
30
22,5
15
7,5
0
Através de uma análise comparativa entre os espectros de RMN
13
C (PND) (Figura
13
34) e RMN C (DEPT-135) (Figura 35) de CQCl-1, foi possível destacar sete carbonos nãohidrogenados, quatro mono-hidrogenados, doze di-hidrogenados e sete tri-hidrogenados
(Tabela 10). Estes dados permitiram propor a fórmula C30H50O2 para CQCl-1. O espectro de
RMN 13C (PND) (Figura 34) apresentou dois sinais em δC 14,6 e 6,8 (Tabela 10), atribuídos
aos grupos metilas característicos da classe friedelano (C-24 e C-23, respectivamente)
(MAHATO; KUNDU, 1994). O espectro de RMN
13
C (DEPT-135) (Figura 35) revelou a
- 110 -
presença de um grupamento metilênico carbinólico em δC 74,7 e uma absorção em δC 213,3
da carbonila na posição C-3 (Tabela 10).
FIGURA 34 - Espectro de RMN 13 C (PND) de CQCl-1 (3-oxo-29-hidroxifriedelano)
(CDCl 3 ; 100 MHz).
17.861
6.827
18.208
14.640
18.448
20.754
22.266
25.792
27.745
29.724
30.489
30.559
32.059
32.689
33.081
35.596
35.825
37.387
38.193
39.473
39.906
41.231
41.500
41.796
42.139
53.354
58.181
59.399
74.729
213.300
150
100
50
0
200
ppm (t1)
150
100
50
0
- 111 -
FIGURA 35 - Espectro de RMN de 13 C (DEPT-135) de CQCl-1 (3-oxo-29hidroxifriedelano) (CDCl 3 ; 100MHz).
6.828
14.639
17.861
18.205
18.450
20.755
22.265
25.790
27.740
29.721
30.557
32.057
32.685
35.592
35.821
39.470
41.227
41.499
41.790
53.351
58.177
59.392
74.728
10.0
5.0
0.0
-5.0
-10.0
50
0
ppm (t1)
TABELA 10 - Deslocamentos químicos dos carbonos não-, mono-, di- e trihidrogenados de CQCl-1 (3-oxo-29-hidroxifriedelano), a partir dos
espectros de RMN 13 C (PND) e RMN 13 C (DEPT-135).
C
213,3
42,1
39,9
38,2
37,4
33,1
30,5
6xC;(C=O)
CH
59,4
58,2
53,4
41,8
4xCH
CH2
74,7
41,5
41,2
39,5
35,8
35,6
32,7
30,6
29,7
27,7
22,3
18,2
11xCH2;(CH2OH)
CH3
32,0
25,8
20,8
18,4
17,9
14,6
6,8
7xCH3
C30H50O2
- 112 -
O espectro de RMN 1H (Figura 36) de CQCl-1 apresentou seis singletos e um dubleto
em δH 1,22, 1,05, 1,03, 1,02, 0,87, 0,72 (s) e δH 0,88 (J=6,6 Hz) que podem ser relacionados a
grupos metilas de triterpenos da classe friedelano. O mesmo espectro apresentou também uma
absorção em δH 3,26 (2H, q, J =10,3 Hz) relacionado ao hidrogênio metilênico carbinólico.
FIGURA 36 - Espectro de RMN de 1 H de CQCl-1 (3-oxo-29-hidroxifriedelano)
(CDCl 3 ; 400 MHz), mostrando também as expansões entre 3,30-2,20 E
1,22-0,70.
3000
0.726
0.870
0.886
1.029
1.034
1.050
1.221
2.240
2.256
2.284
2.302
2.368
2.373
2.381
2.386
3.234
3.260
3.275
3.301
3.317
2500
3000
2000
0.726
0.870
0.886
1.029
1.034
1.050
1.221
3.234
3.260
3.275
3.301
1500
2000
2000
1000
1000
500
1500
0
0
3.300
3.290
3.280
3.270
3.260
3.250
3.240
3.230
3.220
ppm (t1)
1.30 1.20
ppm (t1)
1.10
1.00
0.90
0.80
1000
0.70
500
0
4.00
ppm (t1)
3.50
3.00
2.50
2.00
1.50
1.00
Todos estes dados possibilitaram propor que uma das metilas do esqueleto friedelano
foi oxidada e levou a formação de uma hidroxila de um álcool secundário. A posição desta
hidroxila foi proposta no carbono C-29, após uma análise do espectro de bidimensional
HMBC de CQCl-1 (Figura 37), onde foi possível observar os acoplamentos dos hidrogênios
metilênicos carbinólicos em δH 3,26 (2H, q, J =10,3 Hz) com os carbonos do grupo metila C30 δC 25,8, C-20 δC 33,3, C-19 δC 29,7 e com o C-21 δC 27,7, e ainda, através da comparação
dos deslocamentos químicos de RMN 13C de CQCl-1 com dados da literatura (BETANCOR
- 113 -
et al., 1980). Trata-se do triterpeno 3-oxo-29-hidroxifriedelano (6) já isolado em outras
plantas do gênero Maytenus (NOZAKI et al., 1986; ITOKAWA et al., 1991; GONZALES et
al., 1995; OLIVEIRA, 2007), porém esta é a primeira vez isolado de M. guianensis. Os dados
de RMN
13
C e RMN 1H de CQCl-1 suas respectivas correlações, obtidas a partir dos
espectros bidimensionais COESY (Figura 38) e HMBC (Figura 37) e comparação com os
dados do triterpeno 3-oxo-29-hidroxifriedelano (6), encontrados na literatura estão
relacionados na Tabela 11.
FIGURA
37
- Espectro bidimensional HMBC
hidroxifriedelano) (400 MHz, CDCl 3 ).
de
CQCl-1
(3-oxo-29-
0
50
ppm (t1)
3.50
ppm (t2)
3.00
2.50
2.00
1.50
1.00
0.50
- 114 -
FIGURA
38
- Espectro bidimensional COESY
hidroxifriedelano) (400 MHz, CDCl 3 ).
de
CQCl-1
(3-oxo-29-
0
10
20
30
40
50
60
70
80 (t1)
ppm
5.0
ppm (t2)
0.0
- 115 -
TABELA 11 - Dados de RMN 13 C e RMN 1 H de CQCl-1 (3-oxo-29hidroxifriedelano) e comparação com os dados do triterpeno 3-oxo29-hidroxifriedelano (3), descritos na literatura.
CQCl-1
C
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
DEPT-135 δC
CH2 22,3
CH2 41,4
C
213,1
CH 58,1
C
42,1
CH2 41,1
CH2 18,4
CH 53,3
C
37,7
CH 59,4
CH2 35,6
CH2 29,7
C
39,4
C
38,1
CH2 32,7
CH2 35,8
C
30,5
CH 41,8
CH2 29,7
C
33,3
CH2 27,7
CH2 39,5
CH3 6,8
CH3 14,6
CH3 17,8
CH3 18,4
CH3 20,7
CH3 32,0
CH2 75,7
CH3 25,8
3-oxo-29-hidroxifriedelano
(OLIVEIRA et al., 2007)
δC
1,00 (m)
1,58 (m)
2,24 (m)
2,34 (m)
1,01 (m)
1,37 (m)
1,48 (m)
1,20 (m)
1,25
1,58 (m)
1,20 (m)
1,36 (m)
1,04 (m)
0,84 (d, J=6,61 Hz)
0,72 (s)
0,85 (s)
1,04 (s)
1,01 (s)
1,22 (s)
3,26 (2H, q, J =10,3 Hz)
1,00 (s)
22,3
41,5
213,2
58,2
42,2
41,3
18,3
53,4
37,4
59,5
35,6
29,8
40,0
38,3
32,7
35,9
29,8
41,9
30,6
33,1
27,8
39,5
6,8
14,7
17,9
18,4
20,8
32,1
74,8
25,8
4.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
A atividade antioxidante Maytenus guianensis foi avaliada pela captura do radical
livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazil (DPPH) que é uma molécula caracterizada como um radical
livre estável em virtude da deslocalização do elétron desemparelhado por toda a molécula.
- 116 -
Esta deslocalização confere a esta molécula uma coloração violeta, caracterizada por uma
banda de absorção em etanol em cerca de 520 m (ALVES et al., 2010). Este ensaio se baseia
na medida da capacidade antioxidante de um determinado extrato ou substância em sequestrar
o radical DPPH reduzindo-o a hidrazina de coloração amarelo pálido produzindo um
decréscimo da absorbância até 515 m (ALVES et al., 2010; RUFINO et al., 2007).
Os testes foram realizados em triplicada e repetidos duas vezes para confirmação do
resultado no o extrato acetônico da entrecasca (EAMG) e eluatos: hexânico (EHMG), eluato
clorofórmico (EClMG) e o eluato acetônico (EAcMG) (Tabela 12).
TABELA 12 - Atividade antioxiante (% AA) do extrato acetônico da entrecasca e
eluatos de Maytenus guianensis.
Concentração
(µg.mL-1)
Amostras
EAMG
EHMG
EClMG
94,91* ± 0,21 96,11* ± 0,26
EAcMG
GK
200
96,50 ± 1,52
95,40 ± 0,35
94,10 ± 0,35
150
95,93* ± 0,47 95,59* ± 0,23 94,53* ± 1,08 94,70* ± 0,07
93,73 ± 0,63
100
89,11 ± 2,23
73,04* ± 1,05 85,75* ± 1,41 90,43* ± 0,26
93,92 ± 0,42
50
48,84* ± 2,62 41,50* ± 0,87 45,88* ± 1,36 50,75* ± 0,57
75,46 ± 1,20
10
9,08* ± 1,10
17,16 ± 1,42
9,65* ± 0,28
11,42* ± 1,29 12,82* ± 0,18
Os resultados são expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.). Médias com * na mesma linha diferem
significativamente a p < 0,05 com relação ao controle Ginkgo biloba (ANOVA e Teste de Tukey). Onde EAMG = Extrato
acetônico, EHMG = Eluato Hexânico, EClMG = Eluato clorofórmico, EAcMG = Eluato Acetônico, GK = Ginkgo biloba
Os resultados (Figura 39 e 40) foram expressos em valores de Concentração Efetiva
50% (CE50), que representa a atividade de antioxidante necessária para diminuir em 50% a
concentração inicial do radical DPPH, como controle positivo foi utilizado extrato
padronizado de Ginkgo biloga (Egb 761).
Estes resultados mostram atividade antioxidante da sobrecasca de M. guianensis,
havendo diferença significativa p < 0,05 com uma porcentagem de atividade antioxidante
maior que o padrão utilizado na concentração de 200 µg.mL-1 nos eluatos hexânico (94,91 %)
e clorofórmico (96,11 %), concentração de 150 µg.mL-1 no extrato acetônico (95,93 %) e
eluatos hexânico (95,59 %), clorofórmico (94,53 %) e acetônico (94,70 %), sendo que, nas
- 117 -
demais concentrações testadas não foi verificado o mesmo comportamento quando os valores
são comparados com o padrão comercial Ginkgo biloga (Egb 761), o que denota o potencial
desta espécie. Os valores obtidos para CE50 com o extrato acetônico da entrecasca (50,44
µg.mL-1) e eluato acetônico (49,52 µg.mL-1) são os que mais se aproximam do valor obtido
com o extrato da Ginkgo biloba (46,62 µg.mL-1) (Figura 39 e 40), este fato se deve
provavelmente as substâncias de efeito antioxidante presentes, o que revela uma atividade
antioxidante promissora da espécie em estudo.
Muitas plantas e ervas consideradas como medicinais tem sido estudadas com
relação a sua atividade antioxidante. Muitos metabólitos secundários apresentam atividade
biológica, dentre estas atividades destaca-se a atividade antioxidante, sendo que, esta
atividade depende diretamente da concentração e a classe (flavonoides, taninos, terpenos,
alcaloides, etc.) destes metabólitos secundários (SUNIL et al., 2012).
M. guianensis é utilizada tradicionalmente na prevenção do câncer de pele
(REVILLA, 2002a). Estudos da propriedade antioxidante da casca do caule desta espécie
também foram realizados por Macari et al.(2006), estes realizaram estudos da absorbância e
transmitância do extrato acetônico da casca desta espécie e obtiveram resultados promissores
de absorção na faixa de 230 – 315 m (UVB) e 315 – 400 m (UVA) quando comparados
com protetores solares comerciais (diminuição de < 35% na transmitância na radiação gama,
UVB), frequências estas que estão associadas com diferentes formas de câncer de pele, tais
autores correlacionaram estes resultados com a atividade antioxidante demonstrada para esta.
Estudos anteriormente realizados com M. guianenis resultaram no isolamento e 4metilepigalocatequina, um flavonóide com estrutura hidroxilada (SOUSA et al., 1986;
MACARI et al., 2004), o que indica a presença de substâncias da classe dos flavonoides nesta
espécie, com isso também pode-se correlacionar os resultados obtidos com a capacidade
antioxidante de flavonoides, pois esta é determinada por sua estrutura, em particular por
hidroxilas que podem doar elétrons e suportar como resultado a deslocalização em torno do
sistema aromático (DORNAS et al., 2007). Outra característica estrutural importante
responsável pela atividade sequestrante dos radicais livres é a presença dos grupos hidroxila e
carbonilas, pois são grupamentos capazes de transferir o átomo de hidrogênio para o radical
peroxila (ESTEVAN, 2006). Além disso, estudos indicam que triterpenos com carbonilas e
hidroxilas em sua estrutura (exemplos: 3-oxo-friedelano e tingenona) também possuem
atividade antioxidante (ALLISON et al., 2001; ESTEVAN, 2006; SUNIL et al., 2012).
- 118 -
FIGURA 39 - Avaliação da atividade antioxidante (%) de Maytenus guianensis pelo método do DPPH.
a)
EAMG
b)EHMG
100
80
60
CE50 = 50,44 µg/mL
2
R = 1,0
40
20
Atividade Antioxidante (%)
Atividade Antioxidante (%)
100
0
80
60
CE50 = 61,39 µg/mL
2
R = 0,97
40
20
0
0
50
100
150
200
0
50
EEMG (µg/mL)
c) EClMG
150
200
d) EAcMG
100
100
Atividade Antioxidante (%)
Atividade Antioxidante (%)
100
EHMG (µg/mL)
80
60
40
CE50 = 53,28 µg/mL
2
R = 0,99
20
0
80
60
EC50 = 49,52 µg/mL
40
2
R = 0,99
20
0
0
50
100
EClMg (µg/mL)
150
200
0
50
100
150
200
EAcMG (µg/mL)
Onde a) extrato acetônico da entrecasca (EAMG), b) eluato hexânico (EHMG), c) eluato clorofórmico (EClMG) e d) eluato acetônico (EAcMG)
- 119 -
FIGURA 40 - Avaliação da atividade antioxidante (%) de Ginkgo biloba (EGB 761)
pelo método do DPPH.
Atividade Antioxidante (%)
100
80
60
EC50 = 46,62 µg/mL
2
R = 0,99
40
20
0
0
50
100
150
200
Extrato de Ginkgo biloba (µg/mL)
De acordo com os resultados obtidos nos procedimentos realizados neste estudo,
propõe-se, que o extrato acetônico da entrecasca e os eluatos, apresentam várias substâncias
que reagem com o DPPH, o que está de acordo com os valores de inibição da atividade
antioxidante, pois muitas substâncias podem estar atuando sinergisticamente. Também podese relacionar tais resultados com triterpenos hidroxilados e flavonoides, uma vez que as
plantas deste este gênero são ricas em metabólitos secundários pertencentes a estas classes.
4.1 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GENOTÓXICA
O interesse pela fitoterapia geralmente é motivado pelo seu uso tradicional e por sua
origem natural. Embora muitas atividades biológicas benéficas tenham sido cientificamente
comprovadas, o uso das plantas medicinais deve ser feito de maneira cautelosa. Apesar da
maioria dos fitoterápicos serem seguros se usados em doses recomendadas, efeitos adversos
podem surgir. Por isso, testes de genotoxicidade, como o empregado neste estudo, são
importantes na avaliação da segurança e efetividade dos produtos naturais (BRASIL, 1996;
FDA, 2008).
De acordo com os estudos químicos realizados, e durante a execução deste trabalho,
foram isolados triterpenos e outros trabalhos revelam atividades biológicas promissoras para
- 120 -
esses compostos como anti-inflamatório, antitumoral, antiulcerogênica (ALVARENGA;
FERRO, 2006; BRINKER et al., 2007; QUEIROGA et al., 2000; REYES et al., 2006;
RODRIGUES et al., 2012; SOSA et al., 2007), dentre outros.
Fiskesjo (1994) apud Bagatini et al. (2007) ressaltou a importância e a utilidade de
testes com vegetais na avaliação de riscos de genotoxicidade e enfatizou que apesar das
diferenças entre os metabolismos de plantas e animais há também similaridades, e que
ativação de pró-mutágenos possui alta relevância.
O teste de efeito mutagênico do EAMG neste estudo foi realizado em Allium cepa e
avaliado observando-se as células em interfase e divisão celular (mitose) para cálculo do
índice mitótico (IM), bem como, a ocorrência de aberrações celulares (AC), como a presença
de pontes, cromossomos retardatários, micronúcleos e células binucleadas, os resultados
obtidos neste teste estão apresentados nas Tabelas 13 e 14.
Na Tabela 13 estão apresentados o número total de células que foram analisadas,
número total de células observadas em interfase e em diferentes fases de divisão celular
durante o ciclo celular de A. cepa bem como o índice mitótico. É possível observar que há
uma diferença significativa entre os tempos de exposição de 24 e 48 h em todos as
concentrações testadas, sendo que no tempo de exposição de 48 h houve inibição da divisão
celular.
TABELA 13 - Tratamentos, número total de células analisadas no ciclo celular
(interfase, prófase, metáfase, anáfase, telófase) em células
meristemáticas de raízes de Allium cepa tratadas com o extrato
acetônico da entrecasca de Maytenus guianensis.
Tratamento
Tempo (h)
-1
50 µg.mL
-1
100 µg.mL
-1
200 µg.mL
0
24
48
0
24
48
0
24
48
Número de Células
Total
Interfase
Mitose
Índice
Mitótico (%)
5000
5000
5000
5000
5000
5000
5000
5000
5000
4.260
2.924ª
4.804ª
2.665b,c
2.797b
4.639c
4.708
3.160
4.661
740ª
2.076ª,b
196b
654ª
2.203b
361ª,b
292ª
1.840ª,b
339b
14,8
41,5
3,9
46,7
44,0
7,2
5,8
36,8
6,7
Frequências seguidas pela mesma letra diferem significativamente ao nível de 5%, pelo Teste de
Tukey.
- 121 -
Na Tabela 14, estão apresentados o número total de células analisadas, número de
aberrações celulares e o total células aberrantes.
TABELA 14 - Tratamentos, número total de células analisadas, número de
aberrações celulares e de células aberrantes de pontas de raízes de
Allium cepa tratadas com extrato acetônico de Maytenus guianensis.
Tratamento
50 µg.mL-1
100 µg.mL-1
200 µg.mL-1
Tempo
(h)
Nº total de
Células
analisadas
0
24
48
0
24
48
0
24
48
5000
5000
5000
5000
5000
5000
5000
5000
5000
Aberrações Celulares
Cromossomo
retardatário em
anáfase
1
2
-
Pontes em anáfase e
telófase
Total de
células
aberrantes
1
1
0
0
0
0
0
0
2
1
Frequências seguidas pela mesma letra diferem significativamente ao nível de 5%, pelo Teste
de Tukey
Os resultados indicam que os tratamentos nas primeiras 24 horas aumentou a divisão
celular de maneira significativa e esta divisão ocorreu sem provocar anomalias
cromossômicas. Estes resultados são consistentes quando comparados com estudos realizados
por Bruni et al.(2006) e Reid et al.(2006).
Os tratamentos com o EAMG apresentaram dois tipos de aberrações celulares:
cromossomos retardatários em anáfase e pontes em anáfase e telófase. Estas aberrações foram
encontradas nos tratamentos para a concentração de 200 µg.mL-1.
Porém os resultados para 48 horas em todas as concentrações evidenciam a
capacidade antiproliferativa de M. guianensis a longo prazo, Tabela 13, pois houve inibição
da divisão celular de A. cepa, conforme o aumento do tempo de exposição aos extratos.
Verifica-se então que em um tempo de exposição prolongado (48 h) há um efeito danoso nas
células de A. cepa, sendo possível que as moléculas bioativas presentes neste extrato estejam
interferindo no controle das divisões celulares, havendo porém pouca ação genotóxica.
Os efeitos de extratos de plantas sobre o ciclo celular de Allium cepa têm sido
relatados por vários autores (RAINHO et al., 2010; MENDES et al., 2012; STURBELLE et
al., 2010), os quais mostraram que os principais efeitos que ocorrem são mutagênicos e
- 122 -
antimutagênicos, bem como o aumento e diminuição da proliferação celular de pontas de
raízes tratadas com diferentes espécies de plantas. Nestes trabalhos, as raízes de A. cepa foram
expostas aos extratos respectivos por período de 24 horas e em concentrações diferentes.
Estes autores observaram efeito antiproliferativo em todas as plantas testadas. Entretanto,
nenhuma destas plantas apresentou potencial mutagênico, conforme observado no presente
estudo.
Apesar de a literatura destacar os triterpenos como principais compostos bioativos da
espinheira-santa Corsino et al.(1998) destacaram que a família Celastraceae é uma fonte rica
de sesquiterpenos, tais autores ao verificarem a ação citotóxica do extrato de M. aquilifolium
em mutantes de Saccharomyces cerevisiae sugeriram que os sesquiterpenos podem ser os
principais responsáveis por causarem pequenos danos no DNA.
Os resultados obtidos por Camparato et al.(2002), corroboram com os resultados
obtidos neste trabalho, pois em análises de células meristemáticas A. cepa verificaram que
concentrações mais elevadas de extrato de espinheira-santa (M. ilicifolia) promoveram
redução no índice mitótico e nenhum surgimento de alterações cromossômicas.
O efeito citotóxico de M. ilicifolia também foi verificado por Souza et al.(2005),
estes realizaram testes de germinação, primeira contagem e índice de velocidade de
germinação, que avaliaram o efeito alelopático, em sementes de alface e cebola e também a
determinação da citotoxicidade, através do índice mitótico pela técnica de varredura, ambos
frente ao extrato aquoso de folhas de M. ilicifolia. Seus resultados revelaram que na
concentração de 40 mg.mL-1, houve alterações cromossômicas (ponte anafásica), sugerindo
um potencial genotóxico. Tais autores também concluíram que o extrato aquoso das folhas de
espinheira-santa apresenta efeito alelopático sobre sementes de alface (que pode ser explicado
pela presença de saponinas, taninos e flavonas) e também efeito citotóxico sobre sementes de
alface e de cebola.
Reid et al.(2006) investigaram os efeitos mutagênicos e anti-mutagênicos de plantas
utilizadas na medicina tradicional sul-africana, entre elas Maytenus senegalensis, através do
teste de Ames utilizando as linhagens TA98 e TA100 de Salmonella typhimurium, na
ausência e presença das misturas S9 e 4NQO. As plantas foram selecionadas de acordo com
seu uso etnobotânico na medicina tradicional sul-africana e na sua disponibilidade. Os
resultados indicaram que os extratos de Helichrysum smillimum, H. herbaceum e
Lelichirysum rugulosum apresentaram atividade mutagênica em ausência e presença de S9 na
- 123 -
linhagem TA98, porém o extrato da raiz de Maytenus senegalensis neste experimento não
apresentou atividades mutagênica e antimutagênica.
Estudos adicionais são necessários para uma maior compreensão das atividades
genotóxicas do extrato de M. guianensis. No entanto, os resultados preliminares apresentados
pela primeira vez por este estudo, podem direcionar tais investigações e, contribuir
futuramente para a validação de um fitoterápico.
4.3 ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA
O protocolo desenvolvido para o teste de atividade anti-inflamatória de M.
guianensis foi a avaliação do efeito de EAMG, EHMG, EClMG, CQH3-3 e CQH-2 via
intraperitoneal sobre o edema de pata induzido por carragenina. A carragenina é um
polissacarídeo sulfatado, derivado de algas marinhas usada como estímulo inflamatório, para
induzir artrites em modelos animais com roedores. Winter et al.(1962) foi o primeiro a
descrever a utilidade do método para rastrear drogas anti-inflamatórias. A injeção subplantar
de carragenina na pata traseira dos animais causa um edema constituído por uma fase inicial
rápida e por uma fase tardia mais sustentada. A primeira fase é mediada pela liberação de
histamina, serotonina e cininas, enquanto que a segunda fase é relacionada à liberação de
prostaglandinas (WINTER et al., 1962).
Os resultados apresentados na Tabela 15 e Figura 41 mostram que o tratamento com
o EAMG da entrecasca do caule, pela via intraperitoneal, apresentou um efeito significativo
sobre o edema induzido pela carragenina 1% (50 µL/pata direita traseira). O EAMG da
entrecasca inibiu o edema durante as três horas de avaliação, de forma dependente da dose. O
valor médio da dose de inibição 50% do edema de pata (DI50) foi de 102,5 mg/kg, e a inibição
máxima (Imax) de 48,8 % no tempo de 30 minutos, para a dose de 100 mg/kg. Esta Imax
apresentada pela dose de 100 mg/kg, não apresentou diferença significativa quanto
comparado com controle positivo (diclofenaco de sódio 10 mg/kg, via i.p.) para o mesmo
tempo.
- 124 -
TABELA 15 - Efeito da administração do EAMG sobre edema de pata induzido por
carragenina a 1%.
Amostra
Dose
(mg/Kg)
Volume de pata (mL)
30´
0,1025
Carr 1%
60´
±
0,04
Diclo
10
12,5
0,0450
±
25
0,0675
±
0,0655
±
0,0625
100
0,0525
0,03***
±
0,150 ± 0,03
0,0950
0,0775
±
0,0700
±
0,0800
##
0,03 **
±
0,2075
30´
60´
120´
180´
±
-
-
-
-
0,12
±
±
0,1100
±
56,10
62,22
76,66
84,33
±
±
34,14
15,55
20,00
33,73
±
36,09
31,11
26,66
36,14
±
39,24
37,77
30,00
42,16
±
48,79
28,88
36,66
44,57
0,03 ***
±
###
0,0950
###
0,03 ***
0,1200
###
0,01 ***
±
0,1325
###
0,02 **
0,1050
0,1375
0,02###***
##
±
0,0325
0,01***
0,04### *
0,02***
±
0,0350
0,02***
0,02 **
0,01***
EAMG
0,0425
##
0,02 ***
50
180´
0,04
0,01###
#
EAMG
±
0,02***
0,01#***
EAMG
120´
0,03
0,02***
EAMG
0,1125
Inibição do Edema (%)
0,04 ***
±
0,1150
###
0,01 ***
Os camundongos foram tratados com EAMG (12,5, 25, 50 e 100 mg/kg, via i.p. 1 h antes) ou diclofenaco de
sódio (10 mg/kg, via i.p. 1 h antes) ou solução salina apirogênica (controle). Em seguida, após o tempo indicado,
os animais foram injetados na pata direita com carragenina (1%) e solução salina apirogênica na pata esquerda.
O edema foi avaliado por plestismografia após os intervalos de tempo de 30 minutos; 60 minutos; 120 minutos e
180 minutos, e expresso em mL. Os dados representam a média ± EPM (n=5). A comparação entre os grupos foi
realizada através da análise da variância (ANOVA) seguida do teste de Tukey *p < 0,05, **p < 0,01 ou ***p <
0,001 quando comparado ao grupo carragenina (carr) e #p < 0,05, ##p < 0,01 ou ###p < 0,001 quando
comparado ao grupo diclofenaco de sódio (diclo).
- 125 -
FIGURA 41 - Efeito da administração do EAMG sobre o edema de pata induzido
por carragenina a 1%.
Carr
Diclo
0.20
100 mg/kg
50 mg/kg
25 mg/kg
Edema (mL)
0.15
12,5 mg/kg
0.10
0.05
0.00
30
60
90
120
Minutos
150
180
Os camundongos foram tratados com EAMG (12,5, 25, 50 e 100 mg/kg, via i.p. 1 h antes) ou diclofenaco de
sódio (10 mg/kg, via i.p. 1 h antes) ou solução salina apirogênica (controle). Em seguida, após o tempo indicado,
os animais foram injetados na pata direita com carragenina (1%) e solução salina apirogênica na pata esquerda.
O edema foi avaliado por plestismografia após os intervalos de tempo de 30 minutos; 60 minutos; 120 minutos e
180 minutos, e expresso em mL. Os dados representam a média ± EPM (n=5).
- 126 -
Para a avaliação do efeito antiedematogênico do EHMG da entrecasca, pela via
intraperitoneal, os resultados estão apresentados na Tabela 16 e Figura 42, e mostram que este
tratamento apresentou efeito sobre o edema induzido pela carragenina 1% (50 µL/pata direita
traseira). O EHMG da entrecasca inibiu o edema durante as três horas de avaliação, de forma
dependente da dose. O valor calculado para a DI50 foi de 135,1 mg/kg, e a Imax de 37,35 % no
tempo de 180 minutos, para a dose de 100 mg/kg.
TABELA 16 - Efeito da administração do EHMG sobre edema de pata induzido por
carragenina a 1%.
Amostra
Dose
(mg/Kg)
Volume de pata (mL)
30´
0,1025
Carr 1%
60´
±
0,04
Diclo
10
12,5
0,0450
0,860
0,03
EHMG
25
±
EHMG
50
EHMG
100
180´
0,150 ± 0,03
±
##
0,1100
±
±
0,02
±
##*
0,1275
0,005
±
±
60´
120´
180´
±
-
-
-
-
±
0,02
±
###***
0,1475
0,01
±
±
56,10
62,22
76,66
84,33
±
16,09
2,20
15,00
28,91
±
27,80
4,44
15,00
30,12
±
±
4,39
0,0
25,00
33,73
±
23,90
26,66
30,00
37,35
###***
0,1375
0,02
±
###***
0,1450
0,01
###**
0,1050
0,01
±
###
0,1125
0,0325
0,01***
###
0,1275
0,01
###
0,0825
0,02
±
###
0,1125
0,0350
0,02***
###
0,1075
0,01
0,2075
30´
0,04
0,0425
0,01
###
0,0780
0,02
±
#*
0,0980
0,01
±
0,02***
##
0,0740
0,03
120´
0,03
0,02***
EHMG
0,1125
Inibição do Edema (%)
###***
0,1300
0,01
###***
Os camundongos foram tratados com EHMG (12,5, 25, 50 e 100 mg/kg, via i.p., 1 h antes) ou diclofenaco de
sódio (10 mg/kg, via i.p., 1 h antes) ou solução salina apirogênica (controle). Em seguida, após o tempo
indicado, os animais foram injetados na pata direita com carragenina (1%) e solução salina apirogênica na pata
esquerda. O edema foi avaliado por plestismografia após os intervalos de tempo de 30 minutos; 60 minutos; 120
minutos e 180 minutos, e expresso em mL. Os dados representam a média ± EPM (n=5). A comparação entre os
grupos foi realizada através da análise da variância (ANOVA) seguida do teste de Tukey *p < 0,05, **p < 0,01
ou ***p < 0,001 quando comparado ao grupo carragenina (carr) e #p < 0,05, ##p < 0,01 ou ###p < 0,001 quando
comparado ao grupo diclofenaco de sódio (diclo).
- 127 -
FIGURA 42 - Efeito da administração do EHMG sobre o edema de pata induzido
por carragenina a 1%.
Carr
0.20
Diclo
12,5 mg/kg
25 mg/kg
Edema (mL)
0.15
50 mg/kg
100 mg/kg
0.10
0.05
0.00
0
50
100
Tempo (minutos)
150
200
Os camundongos foram tratados com EHMG (12,5, 25, 50 e 100 mg/kg, via i.p., 1 h antes) ou diclofenaco de
sódio (10 mg/kg, via i.p., 1 h antes) ou solução salina apirogênica (controle). Em seguida, após o tempo
indicado, os animais foram injetados na pata direita com carragenina (1%) e solução salina apirogênica na pata
esquerda. O edema foi avaliado por plestismografia após os intervalos de tempo de 30 minutos; 60 minutos; 120
minutos e 180 minutos, e expresso em mL. Os dados representam a média ± EPM (n=5).
- 128 -
Para a avaliação do efeito antiedematogênico do EClMG da entrecasca, pela via
intraperitoneal, os resultados estão apresentados na Tabela 19 e Figura 51, e mostram que este
tratamento não apresentou efeito significativo sobre o edema induzido pela carragenina 1%
(50 µL/pata direita traseira). O EClMG surtiu pouco efeito sobre a inibição do edema durante
as três horas de avaliação para todas as concentrações testadas. Esta baixa inibição pode ser
observada pela comparação entre as médias e pelo Teste de Tukey, pois só houve diferença
significativa em p < 0,05 a partir da concentração 50 mg.mL-1 ,via i.p., no tempo de 120
minutos. O valor calculado para a DI50 foi de 139 mg/kg, e a Imax de 36,04 % no tempo de180
minutos, para a dose de 100 mg/kg.
TABELA 17 - Efeito da administração de EClMG sobre edema de pata induzido por
carragenina a 1%.
Amostra
Dose
(mg/Kg)
Volume de pata (mL)
30´
0,1025
Carr 1%
60´
±
0,04
Diclo
10
12,5
0,0450
0,0975
0,01
EClMG
25
±
EClMG
50
EClMG
100
±
##**
0,1075
±
±
±
###*
0,0350
0,1375
0,01
±
60´
120´
180´
0,2075 ± 0,04
-
-
-
-
±
0,0325
±
56,10
62,22
76,66
84,33
±
4,87
4,44
8,33
22,10
±
2,43
6,66
17,00
29,07
±
±
14,63
17,70
25,00
33,72
0,1250
±
±
26,83
24,44
28,33
36,04
###*
0,1675
0,01
±
±
###***
0,1525
0,01
###*
0,1075
0,01
±
###
0,1125
0,01
0,01***
###
0,005
###
0,0850
0,02
±
###
0,0925
0,01
30´
±
0,02***
###
0,1050
0,02
0,150
180´
0,03
0,0425
0,02
###
0,0750
0,02
±
###
0,0875
0,01
±
0,02***
###
0,1000
0,02
120´
0,03
0,02***
EClMG
0,1125
Inibição do Edema (%)
###***
0,1425
0,005
±
###***
0,1375
0,01
###***
Os camundongos foram tratados com EClMG (12,5, 25, 50 e 100 mg/kg, via i.p. 1 h antes) ou diclofenaco de
sódio (10 mg/kg, via i.p. 1 h antes) ou solução salina apirogênica (controle). Em seguida, após o tempo indicado,
os animais foram injetados na pata direita com carragenina (1%) e solução salina apirogênica na pata esquerda.
O edema foi avaliado por plestismografia após os intervalos de tempo de 30 minutos; 60 minutos; 120 minutos e
180 minutos, e expresso em mL. Os dados representam a média ± EPM (n=5). A comparação entre os grupos foi
realizada através da análise da variância (ANOVA) seguida do teste de Tukey *p < 0,05, **p < 0,01 ou ***p <
0,001 quando comparado ao grupo carragenina (carr) e #p < 0,05, ##p < 0,01 ou ###p < 0,001 quando
comparado ao grupo diclofenaco de sódio (diclo).
- 129 -
FIGURA 43 - Efeito da administração do EClMG sobre o edema de pata induzido
por carragenina a 1%.
0.25
Carr
Diclo
0.20
12,5 mg/kg
Edema (mL)
25 mg/kg
50 mg/kg
0.15
100 mg/kg
0.10
0.05
0.00
0
50
100
Tempo (minutos)
150
200
Os camundongos foram tratados com EClMG (12,5, 25, 50 e 100 mg/kg, via i.p. 1 h antes) ou diclofenaco de
sódio (10 mg/kg, via i.p. 1 h antes) ou solução salina apirogênica (controle). Em seguida, após o tempo indicado,
os animais foram injetados na pata direita com carragenina (1%) e solução salina apirogênica na pata esquerda.
O edema foi avaliado por plestismografia após os intervalos de tempo de 30 minutos; 60 minutos; 120 minutos e
180 minutos, e expresso em mL. Os dados representam a média ± EPM (n=5).
- 130 -
O efeito da CQH-2, administrada via intraperitoneal, sobre o edema produzido pela
administração de carragenina 1% (50 µL/ pata traseira direita), está demonstrado na Tabela 18
e Figura 44. A CQH-2 exerceu efeito antiedematogênico dose-dependente, principalmente
nos tempos de 30 e 180 minutos, sendo que, os resultados para a concentração de 25 mg/kg,
via i.p., no tempo de 30 minutos destacou-se por inibinir 48,78 % do edema e não apresentou
diferença significativa no Teste de Tukey p < 0,05, p < 0,01 e p < 0,001 com relação ao
controle positivo (diclofenaco de sódio 10 mg/kg via i.p. administrado 1 h antes), a
concentração que atingiu DI50 foi a de 24,70 mg/kg via i.p., sendo que a Imax obtida de 50,60%
para a dose de 25 mg/kg via i.p.. Entretanto a concentração de 12,5 mg/Kg via i.p. não
apresentou diminuição do edema de pata no tempos de 60 e 120 minutos.
TABELA 18 - Efeito da administração de CQH-2 sobre edema de pata induzido por
carragenina a 1%.
Amostra
Dose
(mg/Kg)
Volume de pata (mL)
30´
0,1025
Carr 1%
60´
±
0,04
Diclo
10
12,5
0,0450
0,0800
0,03
CQH-2
25
±
CQH-2
50
±
±
**
0,1250
±
±
±
±
###
0,1575
±
±
±
###**
0,0325
0,1750
0,02
±
###*
0,1000
0,02
60´
120´
180´
±
-
-
-
-
±
56,10
62,22
76,66
84,33
±
21,95
0,0
0,0
15,66
±
48,78
2,22
25,00
50,60
±
36,65
0,0
33,33
44,57
0,01***
###
0,1125
0,01
0,2075
30´
0,04
0,0350
0,01
###
0,1150
0,02
±
0,02***
###
0,1100
0,01
0,150
180´
0,03
0,0425
0,02
***
0,0650
0,02
±
0,02***
#
0,0525
0,02
120´
0,03
0,02***
CQH-2
0,1125
Inibição do Edema (%)
0,1025
0,01
±
###*
###***
0,1150
0,02
###***
Os camundongos foram tratados com CQH-2 (12,5, 25 e 50 mg/kg, via i.p. 1 h antes) ou diclofenaco de sódio
(10 mg/kg, via i.p. 1 h antes) ou solução salina apirogênica (controle). Em seguida, após o tempo indicado, os
animais foram injetados na pata direita com carragenina (1%) e solução salina apirogênica na pata esquerda. O
edema foi avaliado por plestismografia após os intervalos de tempo de 30 minutos; 60 minutos; 120 minutos e
180 minutos, e expresso em mL. Os dados representam a média ± EPM (n=5). A comparação entre os grupos foi
realizada através da análise da variância (ANOVA) seguida do teste de Tukey *p < 0,05, **p < 0,01 ou ***p <
0,001 quando comparado ao grupo carragenina (carr) e #p < 0,05, ##p < 0,01 ou ###p < 0,001 quando
comparado ao grupo diclofenaco de sódio (diclo).
- 131 -
FIGURA 44 - Efeito da administração de CQH-2 sobre edema de pata induzido por
carragenina a 1%.
0.25
Carr
Diclo
12,5 mg/kg
0.20
25 mg/kg
Edema (mL)
50 mg/kg
0.15
0.10
0.05
0.00
30
60
90
120
Minutos
150
180
Os camundongos foram tratados com CQH-2 (12,5, 25 e 50 mg/kg, via i.p. 1 h antes) ou diclofenaco de sódio
(10 mg/kg, via i.p. 1 h antes) ou solução salina apirogênica (controle). Em seguida, após o tempo indicado, os
animais foram injetados na pata direita com carragenina (1%) e solução salina apirogênica na pata esquerda. O
edema foi avaliado por plestismografia após os intervalos de tempo de 30 minutos; 60 minutos; 120 minutos e
180 minutos, e expresso em mL. Os dados representam a média ± EPM (n=5).
- 132 -
O efeito da CQH-3, administrada via intraperitoneal, sobre o edema produzido pela
administração de carragenina 1% (50 µL/pata traseira direita), está demonstrado na Tabela 19
e Figura 45. A CQH-3 exerceu efeito antiedematogênico dose-dependente, principalmente
nos tempos de 120 e 180 minutos na dose de 50 mg/kg, via i.p.. Porém no tempo de 120
minutos para esta dose foi obtida a Imax 65%, sendo que este resultado não apresentou
diferença significativa no Teste de Tukey p < 0,05, p < 0,01 e p < 0,001 com relação ao
controle positivo (diclofenaco de sódio 10 mg/kg via i.p. administrado 1 h antes), e a
concentração calculada para a DI50 foi de 38,46 mg/kg.
TABELA 19 - Efeito da administração de CQH-3 sobre edema de pata induzido por
carragenina a 1%.
Amostra
Dose
(mg/Kg)
Volume de pata (mL)
30´
0,1025
Carr 1%
60´
±
0,04
Diclo
10
12,5
0,0450
0,0750
0,02
CQH-3
25
±
CQH-3
50
±
±
###
0,1150
±
±
±
±
±
###
0,0750
0,005
##**
0,0350
0,1375
0,02
±
±
60´
120´
180´
±
-
-
-
-
±
0,01***
0,1350
0,02
±
###**
0,0525
0,0325
±
56,10
62,22
76,66
84,33
±
26,83
0,0
8,33
34,93
±
2,43
4,44
30,00
40,96
±
24,40
33,33
65,00
48,20
0,01***
###
0,1050
0,01
0,2075
30´
0,04
0,02***
###
0,1075
0,01
0,150
180´
0,03
0,0425
0,01
#
0,0775
0,02
±
0,02***
#*
0,1000
0,02
120´
0,03
0,02***
CQH-3
0,1125
Inibição do Edema (%)
0,1225
0,02
±
###***
###***
0,1075
0,01
###***
Os camundongos foram tratados com CQH-3 (12,5, 25 e 50 mg/kg, via i.p. 1 h antes) ou diclofenaco de sódio
(10 mg/kg, via i.p. 1 h antes) ou solução salina apirogênica (controle). Em seguida, após o tempo indicado, os
animais foram injetados na pata direita com carragenina (1%) e solução salina apirogênica na pata esquerda. O
edema foi avaliado por plestismografia após os intervalos de tempo de 30 minutos; 60 minutos; 120 minutos e
180 minutos, e expresso em mL. Os dados representam a média ± EPM (n=5). A comparação entre os grupos foi
realizada através da análise da variância (ANOVA) seguida do teste de Tukey *p < 0,05, **p < 0,01 ou ***p <
0,001 quando comparado ao grupo carragenina (carr) e #p < 0,05, ##p < 0,01 ou ###p < 0,001 quando
comparado ao grupo diclofenaco de sódio (diclo).
- 133 -
FIGURA 45 - Efeito da administração de CQH-3 sobre edema de pata induzido por
carragenina a 1%.
0.25
Edema (mL)
0.20
Carr
Diclo
0.15
12,5 mg/kg
25 mg/kg
0.10
50 mg/kg
0.05
0.00
30
60
90
120
150
180
Tempo (minutos)
Os camundongos foram tratados com CQH-3 (12,5, 25 e 50 mg/kg, via i.p. 1 h antes) ou diclofenaco de sódio
(10 mg/kg, via i.p. 1 h antes) ou solução salina apirogênica (controle). Em seguida, após o tempo indicado, os
animais foram injetados na pata direita com carragenina (1%) e solução salina apirogênica na pata esquerda. O
edema foi avaliado por plestismografia após os intervalos de tempo de 30 minutos; 60 minutos; 120 minutos e
180 minutos, e expresso em mL. Os dados representam a média ± EPM (n=5).
A resposta inflamatória aguda é caracterizada por um aumento na permeabilidade
vascular e no infiltrado celular, levando à formação de edema como resultado do
extravasamento de fluido, proteínas e acúmulo de leucócitos no sítio inflamatório. Há muitos
mediadores envolvidos na inflamação: histamina, serotonina, BK, PG e o óxido nítrico, entre
outros, os quais são produzidos ou liberados por diferentes tipos celulares, como leucócitos,
células endoteliais e células nervosas sensoriais, e estão envolvidos no aumento da
permeabilidade vascular (POSADAS et al., 2004).
Entre os métodos utilizados para selecionar e avaliar drogas anti-inflamatórias, a
técnica mais comum, avalia a inibição do edema produzido na pata de camundongos pela
injeção de um agente flogístico, e entre os diversos agentes, o mais utilizado é a carragenina
(OLIVEIRA, 2002). O modelo de resposta inflamatória induzida pela injeção de carragenina
- 134 -
na pata de ratos foi introduzido em 1962 (WINTER et al., 1962), e em 1969 foi adaptado para
camundongos (LEVY, 1969). A carragenina é um mucopolissacarídeo coloide obtido por
extração em fase aquosa de variedades naturais de algas das famílias Gigartinaceae,
Solieriaceae, Hypneaeceae e Furcellariaceae da classe Rhodophyceae (algas vermelhas). A
carragenina causa uma inflamação do tipo adaptativa, não produz efeitos sistêmicos e
proporciona alto grau de reprodutibilidade (BOLETA-CERANTO et al., 2005). Sinais
cardinais da inflamação, tais como edema, hiperalgesia e eritema desenvolvem-se
imediatamente após injeção de carragenina no tecido subcutâneo (JORGE et al., 2006).
Em 1969, Levy descreveu que a injeção de carragenina 1% na pata de camundongos
causa um edema semelhante, em duração, ao rato, mas menos intenso em proporção. Por volta
de 12 anos depois, Sugishita et al.(1981) caracterizaram a fase aguda do edema de pata em
camundongos utilizando carragenina 3%.
Conforme verificado neste estudo o diclofenaco de sódio, um derivado do ácido
fenilacético, que é um anti-inflamatório não esteroidal (AINE), e atuou de maneira
significativa sobre a formação do edema na pata dos camundongos submetidos ao agente
flogístico, neste caso a carragenina na concentração de 1% p/v. Assim como acontece com
todos os AINEs, o diclofenaco exerce sua ação pela diminuição da síntese de prostaglandinas
inibindo a ciclooxigenase (COX), que é importante na resposta inflamatória (GAN, 2010).
Considerando a importância das plantas medicinais como fonte de novas drogas úteis
para o tratamento de diversas patologias e o envolvimento do processo inflamatório em
inúmeras doenças, buscou-se uma planta que fosse utilizada popularmente para tratar
condições inflamatórias para a realização de um estudo com a finalidade de isolar compostos
com atividade anti-inflamatória. M. guianensis, conhecida popularmente como ´´chichuá`` é
utilizada na medicina popular, sendo que suas raízes e caule são utilizados como analgésico,
anti-inflamatório, afrodisíaco, relaxante muscular, antirreumática e antidiarreica, e também é
indicada no tratamento de artrite, impotência, resfriado, bronquite, hemorroidas, verminoses,
úlceras externas e usos ginecológicos (BORRAS, 2003). Outros fatores que contribuíram para
a escolha dessa planta, além do uso na medicina popular foi a escassez de estudos
farmacológicos sobre a mesma, e também o fato de haver apenas um relato na literatura sobre
a investigação de sua atividade anti-inflamatória realizado por Lima, Vargas e Pohlit (2010)
que analisaram as atividades anti-inflamatória e antiplaquetária do extrato da casca.
O presente estudo mostrou o significativo efeito antiedematogênico decorrente da
administração (via i.p.) do extrato acetônico da entrecasca do caule (EAMG), do eluato
- 135 -
hexânico (EHMG), eluato clorofórmico (EClMG), eluato acetônico (EAcMG), CQH-2 e
CQH-3 de M. guianensis, quando utilizado o teste de edema de pata em camundongos com
carragenina 1%. Neste aspecto, está classicamente demonstrado por Winter et al.(1962) e Di
Rosa, Willoughby e Giroud (1971) que, durante o desenvolvimento da resposta
edematogênica neste teste, na primeira hora da formação do edema estão envolvidos os
mediadores derivados de aminas biológicas histamina e serotonina, na segunda hora há a
liberação de bradicinina e calidina e, na fase final do edema, a de maior intensidade, que
ocorre na 3ª hora após a injeção de carragenina, ocorre a participação de eicosanóides como
as prostaglandinas.
Para tanto, os resultados obtidos após administração do EAMG, EHMG, EClMG,
CQH-2 e CQH-3 de M. guianensis demonstraram que as doses testadas, nos tempos
avaliados, foram efetivas em inibir a formação do edema Figuras 41 a 45 sendo sua eficácia
maior para o EAMG (Tabela 15 e Figura 41) e CQH-3 (Tabela 19 e Figura 45), notadamente
pela administração de CQH-3, onde obteve-se a inibição de 65% de volume de formação de
edema no tempo de 120 minutos na dose de 50 mg/kg. Estes resultados sugerem que o
EAMG inibe os mediadores inflamatórios nas duas primeiras fases: agindo, primeiramente, as
aminas biológicas histamina e serotonina, depois a liberação de bradicinina e calidina, porém
CQH-3 atua primordialmente no segundo e terceiro ciclo do edema (LINDHAL;
TAGESSON, 1997).
A inibição do edema induzido pela carragenina na pata dos animais por uma determinada
droga é altamente preditiva de ação anti-inflamatória da droga em estados inflamatórios em
humanos. Foi com o uso do modelo de edema de pata induzido pela carragenina que
pesquisadores da Merck, Sharp & Dohme demonstraram a atividade anti-inflamatória da
indometacina. Portanto, esse modelo foi, e continua sendo importante para o desenvolvimento de
novas drogas com potencial anti-inflamatório (MORRIS, 2003)
As atividades farmacológicas de algumas plantas, especialmente da família
Celastraceae são atribuídas ao seu conteúdo de sesquiterpenos, triterpenos e triterpenoides
quinonametídeos e entre os compostos reportados, estão principalmente, oleanos, lupanos,
friedo-oleanos, ursanos que vem sendo isolados a partir de espécies de Celastraceae e uma
ampla gama de atividades biológicas tem sido relatada, tais como atividades frente a microorganismos
(bactericida,
antiplasmodial,
fungicida),
células
tumorais,
atividade
antinociceptiva, atividade anti-inflamatória e atividade cicatrizante (ALVARENGA; FERRO,
2006; JORGE et al., 2004; LEON, LOPEZ, MOUJIR, 2010; LIMA; VARGAS; POHLIT,
- 136 -
2010; MARTINS et al., 2012; NOZAKI et al., 1986; PENG et al., 2010; SANTOS et al.,
2012; SANTOS et al., 2013; SOSA et al., 2007).
Os resultados obtidos mostraram-se semelhantes ao estudo de Sosa et al.(2007), tais
autores avaliaram a atividade anti-inflamatória dos extratos da raiz, de lupenona, ácido
maitenóico e -amirina isoladas das raízes de M. senegalensis, o que sugere que estes efeitos
derivam, provavelmente, da ação de terpenos. Esta proposta encontra apoio também em dados
obtidos a partir de outros estudos que evidenciaram a significativa ação anti-inflamatória de
triterpenos (COSTA et al., 2003; FREIRE et al., 1991; GONZALES et al., 1982; JORGE et
al., 2004; NIKIEMA et al., 2001; SAFAVHI; SAILER, 1997).
Podemos relacionar o efeito do EAMG e dos eluatos EHMG e EClMG com alguns
metabólitos secundários como o celastrol, pois mesmo não tendo sido isolado neste estudo,
este metabólito secundário é um marcador taxônomico do gênero Maytenus (ALVARENGA;
FERRO, 2006), uma vez que estudos realizados por Allison et al.(2001) relatam que o
celastrol diminui a produção de citocinas pró-inflamatórias como TNF- e IL-1 em
macrófagos e monócitos humanos com um IC50 variando entre 30 e 100 M. Outro estudo
realizado por Koch et al. (2001) demonstraram que sesquiterpenos lactônicos -metilenicos
com grupos carbonilas conjugados, que também são metabólitos secundários comuns no
gênero Maytenus (ALVARENGA; FERRO, 2006) reduzem a produção de IL-1, TNF- e
IL-6 por macrófagos peritoneais de camundongos de maneira dose-dependente com IC50
variando entre 0,69 e 1,70 M. Também pode-se citar o estudo realizado por Huang et al.
(2001) que avaliou a atividade da tingenona, (metabólito isolado neste estudo e considerado
como marcador taxonômico do gênero Maytenus (ALVARENGA; FERRO, 2006), de M.
canariensis Kunk na produção de IL-1 em monócitos humanos, onde obtiveram uma IC50
variando entre 40 e 58 M. Desta forma pôde-se correlacionar o resultado antiedematogênico
obtido com o EEBM, EHMG e EClMG com os metabólitos secundários que podem estar
atuando sinergisticamente em processos anti-inflamatórios, o que proporciona embasamento
científico em seu uso na medicina popular para enfermidades relacionadas a processos antiinflamatórios como os citados anteriormente.
Ainda considerando o efeito antiedematogênico, a administração das substâncias
isoladas CQH-2 e CQH-3 de M. guianensis (Figuras 44 e 45, Tabelas 18 e 19) apresentaram
efeitos significativ, sendo suas DI50 de 24,70 mg/kg para CQH-2 e 38,46 mg/kg via i.p. para a
CQH-3, porém com maior eficácia em reduzir a formação do edema no segundo ciclo de
- 137 -
inflamação (120 e 180 minutos), quando comparado com os resultados obtidos com o EAMG
(Figura 41 e Tabela 15). A substância CQH-3 apresentou maior efeito inibitório quando
administrado na dose 50 mg/kg, via i.p., com uma Imax de 65 % volume de formação de edema
no tempo de 120 minutos. Estes dados sugerem a capacidade de inibição dos diferentes
mediadores a partir da ação dos ativos nestas doses e permitem inferir que, nestes intervalos
de tempos, as doses testadas podem ser efetivas para a inibição da geração do edema, uma vez
que os resultados obtidos neste estudo estão de acordo com os dados obtidos por Ding et al.
(2010) que avaliaram a propriedade apresentada pelo 3-oxo-friedelano, em regular a secreção
de TNF- com a linhagem celular RAW64.7 de macrófagos e seus resultados demonstraram
que o 3-oxo-friedelano inibiu em 23,5 % a produção de TNF- e também com os resultados
obtidos por NOUFOU et al.(2012) que testaram a atividade antiedematogênica de extratos
ricos em 3-oxo-friedelano e lupeol de Peterocarpus erinaceus Poir pelo do teste de edema de
pata com carragenina 1% em camundongos, onde obtiveram 64,28% de inibição do edema.
Em modelos de úlcera induzidos por indometacina e estresse, a infusão das folhas de
duas espécies de espinheira santa (M. ilicifolia e M. aquifolia), utilizadas popularmente no
tratamento de úlceras, gastrites (MONTANARI; CARVALHO; DOLDER, 1998) reduziu o
índice de lesões ulcerativas (SOUZA-FORMIGONI et al., 1991). Alguns autores sugeriram
que a atividade antiulcerogênica é produzida pelos triterpenos 3-oxo-friedelano e 3hidroxifriedelano, encontrados nessa espécie (ALONSO et al., 1998). Com o objetivo de
identificar os princípios antiulcerogênicos dessas espécies, foram realizados estudos destes
triterpenos (3-oxo-friedelano e friedelanol) para avaliação em modelos de úlcera por
indometacina. Nesse modelo diversas doses desses triterpenos não provocaram diminuição do
índice de lesões ulcerativas, descartando essas substâncias como as responsáveis pela
atividade antiulcerogênica (QUEIROGA et al., 2000). Porém os resultados obtidos neste
estudo foram promissores para CQH-3 o que caracteriza que este pode estar atuando na
produção dos mediadores inflamatórios liberados no teste de edema de pata induzido pela
carragenina, como citocinas (TNF-, interleucina - 1).
Calixto, Otuk e Santos (2003) em sua revisão sobre “Compostos anti-inflamatórios
de origem de plantas, Parte 1” descrevem que os triterpenos pentacíclicos constituem uma
classe de metabólitos secundários que possuem várias ações biológicas, e dentre estas, uma
relevante ação anti-inflamatória, e que esta atividade anti-inflamatória pode estar relacionada
com a atuação sobre a cadeia das substâncias biológicas responsáveis pelo processo
inflamatório.
- 138 -
Safayhi e Sailer (1997) salientam que muitas plantas, como a M. guianensis, que são
utilizadas na medicina popular para o tratamento de enfermidades com quadros inflamatórios
contém triterpenoides com ações anti-inflamatórias, sendo que tais atividades incluem a
supressão da produção de citocinas inflamatórias e prostanoides, bem como a inibição da
atividade enzimática da peroxidação lipídica, assim como a possibilidade de que os efeitos
biológicos observados pela administração do EAMG, EHMG e EClMG sejam decorrentes
também das ações de esteroides, o que encontra apoio nos resultados obtidos em estudos
realizados sobre a toxicidade aguda desses compostos e nos extratos das plantas do gênero
Maytenus (ANDRADE et al., 2007; FORMIGONI et al., 1991; GONZALES et al., 2001;
JORGE et al., 2004; MARTINS et al., 2012).
Metabólitos secundários com atividade anti-inflamatória podem agir em várias etapas
dos processos fisiopatológicos. Por exemplo, um composto poderia bloquear a biossíntese de
mediadores pró-inflamatórios que possuíssem interação direta com uma enzima (por exemplo,
a inibição da ciclo-oxigenase-Il) ou diminuindo a expressão de uma enzima (por exemplo,
esteróides anti-inflamatórios), ou com a redução dos níveis de substrato (por exemplo,
redução da libertação de ácido araquidônico). Alternativamente, ou em adição, um composto
(neste caso em particular um metabólito secundário) podem agir em vários passos do processo
fisiopatológico, podendo inibir a biossíntese de mediadores pela interação direta com
enzimas-chaves (como inibidores da COX), ou reduzindo as concentrações de substratos
(redução da liberação de ácido araquidônico). Adicionalmente podem agir inibindo a
liberação de mediadores pré-formados (por ex. histamina) ou por meio da imunoestimulação
(por ex.: maturação de células mielóides ou estimulação de fagocitose), removendo a
substância irritante e diminuindo a agressão tecidual (SAFAYHI; SAILER, 1997).
Assim, o conjunto dos resultados obtidos permite supor que a possível ação dos
terpenos, presentes nos extratos da entrecasca de M. guianensis há uma ação e esta precisa ser
melhor estudada pois pode estar envolvida com a inibição da geração dos mediadores
inflamatórios. Seus efeitos, nas condições adotadas, foram acompanhados da ausência
aparente de ocorrência de sinais tóxicos, o que sugere a possibilidade de obtenção de novos
compostos com significativa eficácia e baixos riscos de utilização. Novos estudos poderão
determinar os mecanismos de ação envolvidos nestes efeitos, bem como as reais condições de
eficácia e segurança de uso clínico.
- 139 -
4.4 ATIVIDADE CITOTÓXICA
Com o objetivo de avaliar a atividade citotóxica de M. guianensis e realizar uma
varredura para direcionar as concentrações que poderiam ser utilizadas nos experimento de
atividade anti-Plasmodium falciparum, foi realizado o ensaio de viabilidade celular utilizando
o método MTT na linhagem celular, HepG2 (hepatoma humano) e calculado as doses letais
para 50% das células (MDL50), em diferentes concentrações (9,37; 18,75; 37,5; 75; 150; 300 e
600 g.mL-1 para EAMG, EHMG, EClMG, EAcMG; e 2,34 4,68; 9,37; 18,75; 37,5; 75; 150
g.mL-1 para CQH-2 e CQH-3) e tempo de exposição de 24 horas para as amostras em
triplicata. Os resultados obtidos estão indicados na Figura 46 e 47. Foi observado que dentre
as amostras testadas (EAMG, EHMG, EClMG, EAcMG, CQH-2 e CQH-3), nenhuma
apresentou atividade citotóxica considerável, pois segundo o protocolo do National Cancer
Institute (NCI), valores de MDL50  30 g.mL-1 devem ser considerados significativos para
extratos brutos de origem vegetal, assim como os valores de MDL50  4 g.mL-1 são
considerados significativos para substâncias puras (SUFFNESS; PEZZUTO, 1990). Sendo os
mais citotóxicos o Eluato Hexânico (EHMG) com uma MDL50 de 36,69 µg.mL-1 e o menos
citotóxico o Eluato Acetônico (EAcMG) com uma MDL50 de 147,42 µg.mL-1 (Figura 46).
Com base nestes resultados, deu-se a continuidade do estudo anti-Plasmodium falciparum
com os EAMG, EHMG, EClMG e EAcMG.
- 140 -
FIGURA 46 - Determinação citotoxicidade do extrato acetônico da entrecasca e eluatos frente a linhagem celular HepG2.
b)EHMG
100
100
80
80
Viabilidade Celular (%)
Viabilidade Celular (%)
a) EAMG
60
40
MDL50 = 101,23 µg/mL
2
R = 0,945
20
0
60
MDL50 = 36,69 µg/mL
2
R =0,996
40
20
0
10
100
10
100
EAMG (µg/mL)
d)EAcMG
100
100
80
80
Viabilidade Celular (%)
Viabilidade Celular (%)
c) EClMG
EHMG (µg/mL)
60
40
MDL50 = 98,13 µg/mL
2
R = 0,899
20
60
40
MDL50= 147,42 µg/mL
2
R = 0,9601
20
0
0
10
100
EClMG (µg/mL)
10
100
EAcMG (µg/mL)
Onde: a) extrato acetônico da entrecasca (EAMG), b) eluato hexânico (EHMG), c) eluato clorofórmico (EClMG) e d) eluato acetônico (EAcMG).
- 141 -
FIGURA 47 - Determinação citotoxicidade de CQH-2 e CQH-3 frente a linhagem
celular HepG2.
a) CQH-2
100
MDL50 = 54,33 g/mL
80
Viabilidade Celular (%)
2
R = 0,75
60
40
20
0
10
100
CQH-2 (g/mL)
c) CQH-3
100
MDL50 = 37,50 g/mL
2
Viabilidade Celular (%)
R = 0,94
80
60
40
20
0
10
100
CQH-3 (g/mL)
Onde: a) 3-Hidroxifriedelano (CQH-2) e b) 3-oxo-16 β-Hidroxifridelano (CQH-3)
Células HepG2 possuem a capacidade de reter muitas funções especializadas, as
quais normalmente são perdidas em culturas primárias de hepatócitos, pois conservam
proteínas essenciais para o metabolismo hepático, enzimas e componentes de Fase I como
- 142 -
citocromo P450, hidroxilases, citocromo C, redutases, catalases, peroxidases, NADPH e
enzimas de Fase II (MERSCH-SUNDERMANN et al., 2004).
Para os triterpenos do tipo friedelanos, estudos mostraram que a 3-oxo-friedelano
(CQH-1) apresentou leve atividade citotóxica frente à linhagem celular de câncer de mama
humano (MBA-MD-231) (EE et al., 2005) e obtiveram uma MDL50 = 35,0 μg.mL-1, porém
expressiva atividade analgésica e antipirética (ANTONISAMY et al., 2011).
Das cascas de raízes de M. chuchuhuasca, Morita et al.(2008) isolaram a tingenona
(CQH-4) e 22-hidroxitingenona (CQH-4) e avaliaram suas atividades citotóxicas e
antitumorais, obtendo resultados positivos e atribuíram estes resultados à inibição da
polimerização da tubulina. Também foram realizados testes com infuso das folhas de M.
aquifolium e M. ilicifolia e os resultados não demonstraram potencial tóxico ou teratogênico
(OLIVEIRA et al., 1991). O potencial abortivo do extrato hidroalcoólico das folhas de M.
ilicifolia em ratos foi testado por Montanari e Belivacqua (2002) e seus resultados
demonstraram que tal extrato causa uma implantação lenta, mas não afeta a implantação
propriamente dita ou a organogênese do embrião e também não encontraram efeito
embriotóxico. Magalhães (2011) realizou estudos sobre a atividade citotóxica de 16hidroxipristimerina isolada da raiz de M. salicifolia frente às células HeLa (carcinoma
cervical) e A-459 (carcinoma de pulmão) sendo ambas sensíveis, porém a atividade mais
pronunciada foi sobre a HeLa, neste mesmo estudo foi verificado que o aumento do tempo de
incubação não aumentou significativamente a citotoxicidade frente às mesmas.
Os resultados obtidos com este experimentos, superiores aos valores considerados
controles de MDL50  a 30 g.mL-1, que são os valores de base do National Cancer Institute
(NCI), nos permitiu continuar com os testes de atividade anti-P. falciparum com os EAMG,
EHMG, EClMG e EAcMG.
4.5 ATIVIDADE anti-P. falciparum
Os extratos foram testados quanto a sua atividade antiplasmodial contra o P.
falciparum, utilizando a linhagem 3D7 (sensível à cloroquina) em um ensaio
imunoenzimático com anticorpos monoclonais dirigidos contra a proteína rica em histidina e
alanina (HRPII) específica do parasito, essencial à sua sobrevivência. Após a realização
desses ensaios os valores de IC50 foram determinados em curvas de dose-resposta.
Os extratos de M. guianensis apresentaram uma boa atividade anti-P. falciparum
(Tabela 20 e Figura 48 e 49), nos ensaios de HRPII, sendo o resultado mais ativo foi para
- 143 -
EAMG com IC50 de 190,37 g.mL-1 e o menos ativo para o EHMG com IC50 de 305, 23
g.mL-1.
TABELA 20 - Atividade anti-P. falciparum (cepa 3D7) do extrato acetônico da
entrecasca e eluatos, utilizando o ensaio imunoenzimático anti-HRPII.
Amostras
IC50 (g.mL-1) (média ± DP)
Extrato acetônico da entrecasca
250,02 ± 0,02
Eluato hexânico
305,23 ± 0,03
Eluato clorofórmico
294,76 ± 0,01
Eluato Acetônico
190,37 ± 0,04
Cloroquina
11,51 ± 0,02
Buscando novos antimaláricos de baixo custo, alta eficiência e baixa toxicidade,
pesquisou-se, então, a ação do EAMG, EHMG, EClMG e EAcMG de M. guianensis usada
popularmente para tratar infecções e inflamações em geral, e de acordo com o levantamento
bibliográfico realizado para a execução deste trabalho, este é o primeiro estudo desta espécie
em ensaios de atividade anti-Plasmodium falciparum, porém diversas plantas pertencentes a
este gênero vêm mostrando atividade antiplasmodial (CLARKSON et al., 2004; MALEBO et
al., 2009; MUTHAURA et al., 2011; OLIVEIRA et al., 2011), o que corrobora com os
resultados obtidos (Tabela 20) e permitiu confirmar que está é mais uma espécie deste gênero
com atividade biológica importante.
A presença e/ou quantidades de compostos bioativos (metabólitos secundários) nas
plantas são influenciadas pelos fatores edafoclimáticos, parte da planta utilizada, idade da
planta, entre outros fatores. Portanto, as diferenças de resultados observados em estudos
realizados in vitro de partes de plantas utilizadas podem surgir a partir do fato de as amostras
serem coletadas em diferentes locais, diferentes épocas e, possivelmente, em plantas de
diferentes idades. Tais diferenças de atividade antiplasmodial in vitro de algumas plantas
também podem estar correlacionadas a fatores farmacológicos, pois alguns metabólitos
podem estar atuando como pró-drogas, os quais devem sofrer alterações (químicas e
estruturais) durante o metabolismo no organismo para se tornar ativas, como é o caso com o
antimalárico biguanida, que é primeiro metabolizado a triazina, um metabólito de baixa ação e
posteriormente a cicloguanil (composto ativo) (FIDOCK et al., 1998).
- 144 -
FIGURA 48 - Atividade anti-P. falciparum (cepa 3D7) do extrato acetônico da entrecasca e eluatos, utilizando o ensaio
imunoenzimático anti-HRPII.
b) EAMG
b) EHMG
300
300
200
Viabilidade (%)
Viabilidade (%)
200
100
IC50 = 0,250 µg/mL
0
2
R = 0,88
100
IC50 = 305,23 g/mL
2
R = 0,97
0
-100
-100
-200
-200
0,1
1
0,1
10
EAMG (µg/mL)
c) EClMG
10
d)EAcMG
300
300
200
200
Viabilidade (%)
Viabilidade (%)
1
EHMG (µg/mL)
100
IC50 = 294,76 g/mL
2
R = 0,82
0
100
IC50 = 190,37 g/mL
2
R = 0,85
0
-100
-100
-200
-200
0,1
1
EClMG (µg/mL)
10
0,1
1
10
EAcMG (µg/mL)
Onde a) extrato acetônico da entrecasca (EAMG), b) eluato hexânico (EHMG), c) eluato clorofórmico (EClMG), e d) eluato acetônico (EAcMG).
- 145 -
FIGURA 49 - Atividade anti-P. falciparum (cepa 3D7) de Cloroquina (CQ),
utilizando o ensaio imunoenzimático anti-HRPII.
120
100
Viabilidade (%)
80
60
40
IC50 = 11,51 ug/mL
20
2
R = 0,997
0
1
10
100
Cloroquina (g/mL)
Muthaura et al.(2011) realizaram uma revisão etnofarmacológica sobre as plantas
que são utilizadas como antimaláricos pela medicina popular e dentre estas foram citadas M.
aquifolim Mart. e M. boaria (Mayten). Também Muthaura et al.(2007) realizaram ensaios
antiplasmodiais em modelo murino utilizando extratos metanólicos e aquosos de M. undata e
M. putterlickioides, os quais demonstraram atividade parcial contra P. berghei, tais autores
atribuíram esta atividade aos diversos metabólitos secundários presentes neste gênero. Em
outro estudo, Oliveira (2011) também demonstrou a atividade antiplasmodial in vivo da
espécie M. rigida com uma redução de 45% da parasitemia também contra P. berghei na dose
de 1000 mg de extrato acetônico/kg de camundongo.
Ensaios in vitro contra cepas de Plasmodium vêm sendo realizados com extratos de
plantas do gênero Maytenus, dentre estas pode-se citar: extrato metanólico de folhas de M.
senegalensis frente a cepa P. falciparum 3D7 com IC50 de 3.9 µg.mL-1, e frente a cepa Dd2
com IC50 de 10 µg.mL-1 (EL TAHIR; SATTI; KHALID, 1999); o extrato hidroalcoólico das
folhas de M. scutioides frente a cepa de P. falciparum F32 onde o IC50 > 10 µg.mL-1
(BOURDY et al., 2004); o extrato acetônico das cascas da raiz de M. senegalensis frente a
cepa de P. falcirapum K1 onde o IC50 foi de 2,05 µg.mL-1 (MALEBO et al., 2009); o extrato
diclorometano de raízes de M. senegalensis frente a cepa de P. falciparum D10 onde o IC50 de
15,5 µg.mL-1 (CLARKSON et al., 2004).
- 146 -
Várias espécies do gênero Maytenus também são citadas em estudos etnobotânicos e
etnofarmcalógicos devido o seu uso na medicina tradicional para a malária, dentre tais
espécies podemos citar: Maytenus ssp conhecida como “chuchuasca”, sendo a parte utilizada
as entrecascas na forma de chá no estado de Loreto – Peru (KVIST et al., 2006); o decocto
das raízes de M. senegalensis que é utilizada por comunidades da área rural do Quênia
(MUTHAURA et al., 2007); o chá das cascas de M. macrocarpa que é utilizada por
comunidades indígenas do Peru (RUIZ et al., 2011).
Os resultados obtidos com o EAMG, EHMG, EClMG e EAcMG podem estar
correlacionados com a presença da tingenona e tingenina b (CQH-4), pois estudos realizados
por Lião et al.(2007) testaram ambas as substâncias frente ao Trypanosoma cruzy e obtiveram
53,3% (tingenona) e 75,2% (tingenina b) de inibição na concentração de 200 µg.mL-1. Santos
et al.(2013) testaram a atividade antiprotozoária da maitenina e primisterina (triterpenos
quinonametídeos considerados marcadores taxômicos da família Celastraceae) isolados de M.
ilicifolia frente Leishimania amazonensis, L. chagasi e T. cruzy e os resultados foram
positivos, sendo valores de IC50 < pentamidina para os testes frente a Leishmania nas formas
promastigotas e amastigotas, e frente ao T. cruzy os IC50 foram de 0,25 M (maitenina) e 0,30
M (primisterina). Tais estudos servem como parâmetros para a atividade anti-P. falciparum
obtida nos testes efetuados neste trabalho.
Este trabalho proporcionou informações importantes sobre a atividade antiPlasmodium falciparum desta espécie, abrindo perspectivas para a continuação da pesquisa no
campo da biodiversidade e de espécies vegetais utilizadas na medicina tradicional como fonte
no desenvolvimento de novos antimaláricos, fato de importância relevante uma vez que a
resistência do P. falciparum torna o arsenal profilático e terapêutico contra a malária bastante
restrito. Como perspectivas futuras tem-se a realização de testes in vitro dos metabólitos
isolados CQH-2 e CQH-3 e também com a cepa de P. falciparum W2 (resistente à
cloroquina).
- 147 -
5 CONCLUSÃO

O em estudo produz duas classes de triterpenos na sua entrecasca os friedelanos e os
quinonametídeos;

Na avaliação da capacidade antioxidante por redução do DPPH, o extrato acetônico da
entrecasca e os eluatos apresentaram capacidade antioxidante sendo que, o eluato
acetônico se mostrou com melhor capacidade com relação aos demais, porém inferior ao
padrão Ginkgo biloba;

No teste de atividadade genotóxica o extrato acetônico da entrecasca e os eluatos
apresentaram atividade antiproliferativa com tempo de exposição prolongado, porém a
ação clastogênica foi baixa sem significativo efeito aneugênico;

A ação anti-inflamatória foi apresentada em todos os extratos e substâncias testadas, de
forma dose dependente, porém os melhores resultados foram para o extrato acetônico da
entrecasca (EAMG) e 3-oxo-16 β-hidroxifrielano (CQH-3);

Todos os extratos testados apresentaram atividade anti-P. falciparam frente a cepa 3D7,
sendo o melhor resultado o obtido para o eluato acetônico (EAcMG) com IC50 de 190,37
± 0,04 g.mL-1.
Estes resultados são preliminares, entretanto animadores, este trabalho vem
comprovar a riqueza de metabólitos secundários ativos em Maytenus guianensis e incentivar a
continuidade do estudo fitoquímico e atividade biológica desta espécie e de outras plantas do
mesmo gênero encontradas na região amazônica.
- 148 -
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- 167 -
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- 168 -
7. ANEXOS
ANEXO I
Formulário de Autorização de coleta de material vegetal de Maytenus guianensis Klotsch ex Reissek
- 169 -
- 170 -
ANEXO II
Certificado da Comissão de Ética no Uso de Animais
- 171 -
APÊNDICE I
Espectros da análise da Atividade Antioxidante
Espectro do DPPH
- 172 -
Espectro do Extrato Acetônico da Entrecasca (EAMG)
- 173 -
Espectro do Eluato Hexânico (EHMG)
- 174 -
Espectro do Eluato Clorofórmico (EClMG)
- 175 -
Espectro do Eluato Acetônico (EAcMG)