TÍTULO: IDENTIFICAÇÃO DA PRESENÇA DE ENZIMAS LIPOLÍTICAS EM DIFERENTES VARIEDADES
DE UVAS
CATEGORIA: CONCLUÍDO
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE
SUBÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
INSTITUIÇÃO: CENTRO UNIVERSITÁRIO DE RIO PRETO
AUTOR(ES): LUIS GUILHERME RODRIGUES DA SILVA, ANNA CAROLINA PERES STIVAL, GIOVANA
MARTINS VICENTINI, GIOVANE MUNHOZ ALVES DA SILVA, NATHÁLIA RODRIGUES MENDONÇA
ORIENTADOR(ES): PATRICIA PERES POLIZELLI
RESUMO
Enzimas são proteínas globulares de estrutura terciária ou quaternária que agem
como catalisadores biológicos e estão envolvidas em todos os processos do
metabolismo animal e vegetal. Esses biocatalisadores apresentam vantagens na sua
aplicação com relação aos catalisadores químicos, incluindo sua especificidade e o
fato de serem efetivas em baixas concentrações. Estudos envolvendo o uso de
enzimas têm sido cada vez mais freqüentes sendo de grande valia para diversos
setores industriais como de produtos farmacêuticos e alimentos. A pesquisa por
novas fontes de enzimas tem sido intensificada nos últimos anos devido ao alto
custo de enzimas microbianas e animais, o que restringe seu uso em escala
industrial. Este trabalho teve por objetivo efetuar a identificação da presença de
enzimas lipolíticas em diferentes variedades de uvas (Vitis labrusca L. (Niagara
Rosada), Vitis vinifera L. (Thompson Seedless) e Vitis vinifera L. (Crimson
Seedless), sendo que essa fruta tem recebido muita atenção nos últimos anos,
devido aos benefícios à saúde associados com a alta capacidade antioxidante. Os
extratos enzimáticos foram submetidos a ensaios bioquímicos, e a determinação da
atividade enzimática foi realizada por titulação ácido-base usando óleo de soja como
substrato enzimático, fenolftaleína como indicador e hidróxido de sódio como
titulante. Observou-se que a variedade Vitis vinifera L. demonstrou maior atividade
relativa em comparação com as demais, além disso, o extrato de sementes da
variedade de uva Vitis labrusca L. demonstrou uma atividade lipolítica acima do
encontrado para a fruta completa. A presença de enzimas lipolíticas é mais comum
em extratos obtidos a partir de sementes como já foi evidenciado para outras fontes
vegetais.
INTRODUÇÃO
As enzimas, catalisadores de sistemas biológicos, são notáveis dispositivos
moleculares que determinam o perfil de transformações químicas e também
participam na transformação de uma forma de energia em outra. As características
mais impressionantes das enzimas são o seu poder catalítico e a sua especificidade
(STRYER; BERG; TYMOCZKO, 2004).
A característica que distingue uma reação catalisada por enzima é que ela
se realiza dentro de um bolsão confinado da enzima, chamado de sítio ativo e a
molécula que é ligada no sítio ativo é denominada de substrato. A superfície do sítio
ativo é revestida com resíduos de aminoácidos com grupos substituintes que ligam o
substrato e catalisam sua transformação química. Frequentemente, o sítio ativo
envolve um substrato, sequestrando-o completamente da solução (LEHNINGER;
NELSON; COX, 2011).
As lipases são enzimas de origem animal, vegetal ou microbiana,
classificadas como hidrolases, pois catalisam a hidrólise total ou parcial de óleos e
gorduras, fornecendo ácidos graxos livres, acilgliceróis parciais e glicerol (OLIVEIRA;
GIOIELLI; OLIVEIRA, 1999). Essas enzimas são capazes, ainda, de catalisar
reações de hidrólise, esterificação e transesterificação, sendo esta flexibilidade
aliada a diferentes possibilidades de especificidade aos substratos existentes entre
as diferentes lípases. Tais características conferem a estas enzimas um potencial
enorme de aplicações (CASTRO; ANDERSON, 1995; GANDHI, 1984; MACEDO;
PASTORE 1997).
As lipases podem também catalisar reações de interesterificação de óleos e
gorduras obtendo-se produtos que não são formados pelos métodos químicos de
interesterificação (GIOIELLI, et al., 1994). A grande vantagem do uso de enzimas,
com relação aos catalisadores químicos, inclui sua especificidade e o fato de serem
efetivas em baixas concentrações (LEHNINGER; NELSON; COX, 2011).
Uvas são frutos que crescem em plantas trepadeiras lenhosas do gênero
Vitas. Suas sementes apresentam componentes que estão relacionados com a
melhora em diversos quadros patológicos, como na resistência à insulina,
restaurando os receptores de insulina, uma descoberta que pode ser útil no
tratamento de pessoas com diabetes e pré-diabetes. Sendo os principais
constituintes fenólicos presentes nas uvas, por ordem crescente em termos de
concentração,
flavonódes,
ácidos
fenólicos,
antocianinas,
catequinas
e
proantocianidinas (LAUREANO, 1988; ROGGERO; COEN; RAGONNET, 1986).
Vitis labrusca L. “Niagara Rosada” é uma videira-americana de frutos
globosos, de casca fina e lisa, polpa suculenta de sabor doce-acidulado, com
sementes. Vitis vinifera L. “Thompson Seedless” originada na Ásia possui frutos com
bagas globosas, de epicarpo fino, com polpa suculenta doce ou ácida e é a uva sem
sementes mais cultivada no mundo, tanto para mesa, passas e vinhos licorosos
(LORENZI; ABREU, 2008). Vitis vinifera L. variação “Crimson Seedless” foi obtida
pelo programa de melhoramento genético do Serviço de Pesquisa Agrícola do
Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA/ARS), localizado em
Fresno, Califórnia, e lançada para cultivo em 1989.
A busca por novas fontes enzimáticas é um processo crescente, devido às
inúmeras aplicações destas ferramentas bioquímicas nos mais diversos processos
industriais. Sendo assim, o presente projeto visa à identificação da presença de
enzimas de origem vegetal, o que torna sua utilização menos dispendiosa.
OBJETIVO
O objetivo deste projeto foi efetuar a identificação da presença de lipases
nas variedades de uva Vitis labrusca L. (Niagara Rosada), Vitis vinifera L.
(Thompson Seedless) e Vitis vinifera L. (Crimson Seedless).
METODOLOGIA
A extração enzimática foi realizada por maceração, utilizando-se a polpa e
as sementes das diferentes variedades de uvas. Os extratos enzimáticos obtidos
foram submetidos a ensaios bioquímicos, e a determinação da atividade enzimática
foi realizada por titulação ácido-base, usando óleo de soja como substrato
enzimático, fenolftaleína como indicador e hidróxido de sódio como titulante.
DESENVOLVIMENTO
A extração enzimática por maceração foi conduzida acondicionando as uvas
em um almofariz com pistilo em uma solução de tampão fosfato (gelado) 0,05 M pH
7,4. O macerado foi imediatamente filtrado e passou para a clarificação, realizada
por centrifugação a 2.500 RPM por 10 minutos em temperatura ambiente. O líquido
sobrenadante foi separado dos sólidos precipitados e armazenado no gelo.
A determinação da atividade enzimática foi realizada por titulação ácidobase onde óleo de soja foi o substrato enzimático escolhido e fenolftaleína 1% foi
utilizada como indicador e hidróxido de sódio (0,1 M) como titulante. Para o meio
reacional, foi utilizado 5 ml de óleo de soja, 1ml de glicerina, 2 ml de tampão fosfato
(pH 7,4) e, em seguida, 2 ml de extrato enzimático de acordo com cada variedade
de uva. O tempo de incubação foi de 15 minutos a temperatura ambiente. após esse
tempo, foram adicionados 1ml de ácido clorídrico e duas gotas de fenolftaleína 1%.
Para os testes apenas com as sementes a polpa foi descartada e o procedimento
descrita acima, foi repetido. Todos os testes foram realizados em triplicatas.
RESULTADOS
Através dos dados obtidos foi possível observar baixa presença de enzima
lipolítica nas amostras estudadas, conforme observado na figura 1. Resultados
semelhantes foram apresentados para testes realizados com trigo e cevada, mas
valores contrários foram demonstrados para testes com algodão (BARROS; FLEURI;
MACEDO, 2010; GIRELLI; SALVAGNI; TAROLA, 2012). Contudo, o extrato obtido a
partir das uvas da variedade Thompson Seedless apresentou maiores valores na
atividade enzimática (figura 2).
Figura 1- Variação no volume de base forte utilizada no procedimento de titulação
versus as variedades de uvas estudadas.
As sementes da variedade de uva Niagara Rosada foram testadas e
demonstraram atividade lipolítica acima do encontrado para a fruta (figura 3). A
presença de enzimas lipolíticas é mais comum em extratos obtidos a partir de
sementes como evidenciado para sementes de Jatrophas curcas (COELHO et al.,
2013), Arabidopsis thaliana (QUETTIER; EASTMOND, 2009) e Glycine Max
(GADGE et al., 2011).
Figura 2 - Variação na atividade relativa da enzima lipolítica versus as variedades
de uvas estudadas.
As análises desenvolvidas na presença apenas da polpa não apresentaram
resultados positivos.
Figura 3 - Variação na atividade relativa da enzima lipolítica versus o extrato de
sementes da variedade Niagara Rosada.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os testes evidenciaram baixa presença de enzima lipolítica nos extratos
obtidos a partir de uvas das variedades Thompson Seedless, Crimson Seedless e
Niagara Rosada. A maior atividade enzimática pode ser observada para Thompson
Seedless, e para o extrato de sementes de Niagara Rosada. Constatou- se a partir
dos dados obtidos nesse trabalho, que as uvas testadas não são boas fontes de
lipases ou a metodologia empregada não apresentou resolução suficiente para a
identificação das mesmas.
FONTES CONSULTADAS
BARROS, M.; FLEURI, L.F.; MACEDO, G.A. Seed lipases: sources, applications and
properties- a review. Brazilian Journal of Chemical Engineering, v.27, n.1, p.15-29,
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LAUREANO, O. A matéria corante dos vinhos tintos. Relações com a cor e a
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