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VERIFICAÇÃO DE VARIABILIDADE GENÉTICA EM LOCOS
SSR DE SEQÜÊNCIA GÊNICA EXPRESSA (EST) EM Eucalyptus
camaldulensis DEHNH. Veronica Ferreira Rangel, Mario Luiz Teixeira de Moraes,
Cristina Lacerda Soares Petrarolha Silva, Bianca Rodrigues da Cunha, Juliana Caroline
Lourenção, Janete Motta da Silva - sub-área- Genética e Melhoramento Florestal Ciências Biológicas -Departamento de Fitotecnia, Tecnologia de Alimentos e Sócio
Economia - Faculdade de Engenharia - Campus de Ilha Solteira.
O conhecimento a respeito da genética das espécies florestais é ainda incipiente. Dessa
forma, o emprego de pesquisas com os marcadores de DNA permite entre outras coisas,
quantificar os níveis de variabilidade genética intrapopulacional, estimar a divergência genética
interpopulacional, resolver questões de identificação de genótipos, visando, por exemplo,
proteção varietal ou investigação de paternidade em sistemas de polinização aberta (Kirst et al.
2005). Os marcadores microssatélites ou SSR (simple sequence repeats) são considerados ideais
para a estimação de parâmetros genéticos de populações e para a compreensão de padrões de
fluxo gênico e parentescos. Estes marcadores são abundantes e uniformemente distribuídos pelo
genoma das plantas, além de serem codominantes, multialélicos e com alta heterozigosidade
(Zucchi, 2003).
O desenvolvimento de marcadores microssatélites pode ser realizado de diferentes
formas: via bibliotecas genômicas, bibliotecas genômicas enriquecidas, bibliotecas BAC/YAC e
via bibliotecas de cDNA. Embora seja inquestionável a eficiência da aplicação dos marcadores
microssatélites nos estudos genéticos e nos programas de melhoramento de espécies florestais, o
custo de desenvolvimento destes, é muito alto. Entretanto, o método de desenvolvimento de
baseado em seqüências EST apresenta vantagens sobre os métodos tradicionais, pois implica na
utilização de seqüências EST depositadas em bancos de dados, minimizando, portanto os custos
de geração de dados (Kantety et al., 2002).
A utilização dos marcadores moleculares fornece informações diretas a respeito da
variabilidade genética, permitindo o entendimento genético da espécie. Isso possibilita, por
exemplo, indicar genitores para a produção de híbridos específicos, visando o aumento da
divergência genética nas próximas gerações a serem utilizados em futuros programas de
melhoramento genético florestal (Caixeta et al., 2003). Os microssatélites têm sido intensamente
empregados em Eucalyptus, envolvendo objetivos como: teste de paternidade e seleção de
indivíduos de Eucalyptus grandis (Kirst et al., 2005); teste de paternidade e sistema reprodutivo
em E. grandis e E. urophylla (Grattapaglia et al., 2004); mapa de ligação em E. grandis e E.
urophylla (Brondani et al., 2002) entre outros.
O objetivo do presente trabalho foi verificar a eficiência do primer SSR-EST Euca 63 na
identificação de polimorfismo alélico em Eucalyptus camaldulensis.
Foram empregadas quatro progênies de cada uma das 25 matrizes de uma população base
de E. camaldulensis, originária da região de Katherine River, no estado de Queensland,
Austrália e instalada na Fazenda de Ensino, Pesquisa e Extensão da Faculdade de Engenharia de
Ilha Solteira/UNESP. Procedeu-se a extração de DNA no Laboratório de Genética de
Populações e Silvicultura, do Departamento de Fitotecnia, Tecnologia de Alimentos e SócioEconomia, empregando-se metodologia proposta por Ferreira e Grattapaglia (1998) com
pequenas modificações. A quantificação do DNA foi realizada em Biofotômetro (Eppendorf)
nos comprimentos de 260 nm, considerando-se 1 unidade de absorbância no comprimento de
onda de 260 nm equivalente a 50 µg DNA fita dupla/ml (Sambrook et al., 1989). A verificação
de sua pureza foi avaliada por meio da relação de OD 260nm/280nm e 260nm/230nm.
Foi utilizado 1 par de primers SSR-EST flanqueadores do “motif” T(18), denominado
Euca 63 (Ceresini et al., 2005). A reação de amplificação de volume de 15 uL foi constituída de
tampão PCR (1X), 0,1mM de cada dNTP, 2 mM de MgCl2 , 1uM de cada integrante do par de
primer (F e R), 2 unidades de Taq DNA polimerase, 18 ng de DNA genômico. Para
amplificação do loco SSR, empregou-se um ciclo de 95°C por 5 min; cinco ciclos de 95ºC por
45 seg, 68ºC (diminuição de 2°C a cada ciclo) por 5 min. e 72ºC por 1 min.; cinco ciclos de
2
95ºC por 45 seg, 58ºC (diminuição de 2°C a cada ciclo) por 2 min. e 72ºC por 1 min.; 25 ciclos
de 95º por 45 seg., 50ºC por 2 min e 72ºC por 1 min; e finalmente 72ºC por 5 min.
Os produtos de amplificação foram separados em géis de agarose 3%, em corrida
eletroforética com TBE (1X) com tensão constante de 110 V. Para estimar o tamanho dos
fragmentos amplificados (alelos) foi utilizado um padrão de tamanho molecular 100 pb laeder
(GE) na mesma corrida eletroforética.
A inferência dos genótipos maternos foi realizada pelo método do genótipo mais provável,
usando o programa MLTR (Ritland, 2004), uma vez que apenas as progênies foram tipadas. A
diversidade genética da geração adulta e das progênies foi caracterizada pelos índices número
médio de alelos por loco ( A ), número efetivo de alelos por loco ( Ae ), heterozigosidade
observada ( H o ), heterozigosidade esperada segundo expectativas do equilíbrio de HardyWeinberg ( H e ) e o índice de fixação ( F ) utilizando-se o programa CERVUS 3.0 (Marshall,
1998).
As reações de amplificações resultaram na genotipagem da maior parte dos indivíduos
amostrados. Nas Figuras 1 e 2 são apresentados alguns dos perfis eletroforéticos dos alelos
amplificados quando se utilizou o primer Euca 63. Importante verificação foi a ocorrência de
alelos nulos em diferentes amostras avaliadas.
Há que se considerar que, na literatura científica, não existem relatos de primers SSR
desenvolvidos especificamente para E.camaldulensis. Dessa forma, o que se empregou foi o
princípio da transferabilidade (Zucchi, 2003) entre espécies relacionadas. Assim, uma possível
explicação para a verificação de alelos nulos, nesta pesquisa, seria a ausência de homologia
entre as seqüências de DNA das regiões que flanqueiam os microssatélites de Eucalyptus spp
(E. grandis X E. urophylla) (CeresinI et al. 2005), para os quais foram desenvolvidos os
primers, e de E. camaldulensis, para o qual se empregou os primers. Em um estudo de
construção de mapas de ligação em E. camaldulensis, Agrama et al. (2002) obtiveram sucesso
na amplificação de 8 amostras de DNA com os primers EMBRA 1, 2, 3, 5, 8, 8, 9, 10, 11, 16,
18 e 20.
Pb
PM
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
PM
800
500
400
300
200
100
Figura 1. Perfil eletroforético dos alelos SSR de indivíduos adultos (canaletas 1 a 12) de Eucalyptus
camaldulensis amplificados com o primer Euca 63. PM- padrão de tamanho molecular 100 pb.
As setas indicam diferentes alelos observados para o locus.
.
3
pb
PM
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13 PM
800
500
400
300
200
100
Figura 2. Perfil eletroforético dos alelos SSR de indivíduos adultos (canaletas 1 a 13) de
Eucalyptus camaldulensis amplificados com o primer Euca 63. PM- padrão de
tamanho molecular 100 pb. As setas indicam diferentes alelos observados para o
locus.
O locus microssatélites Euca 63 analisado na população evidenciou ocorrência de
polimorfismos, totalizando 3 alelos nas matrizes e 4 nas progênies (Figura 1 e Tabela 1).
A heterozigosidade observada nas matrizes foi de 0,800, superando a heterozigosidade
esperada que foi de 0,569, o que acabou por determinar um índice de fixação ( F̂ ) negativo,
ocorrente quando se observa um excesso de heterozigotos.
Nas progênies, para o locus em questão, a heterozigosidade observada foi de 0,287,
enquanto a esperada foi de 0,620. Portanto, nesta geração, o índice de fixação foi superior à
zero, indicando a ocorrência de endogamia. Portanto, para este locus, os cruzamentos não
ocorreram de forma aleatória, tendo ocorrido cruzamentos entre indivíduos aparentados e
também de autofecundação.
Tabela 1. Características* do loco microssatélite amplificado pelo primer SSR-EST Euca 63
analisado em E. camaldulensis.
Locus Euca 63
n
k
 e
Ĥ o
Ĥ e
F̂
Freq. alelos nulos
Adultos
Progênies
25
94
3
4
2,32
2,63
0,800
0,287
0,569
0,620
-0,406
0,537
-0.190
0,389
*Tamanho amostral (n); número de alelos detectados (k); heterozigosidade observada ( H o ); heterozigosidade
esperada em equilíbrio de Hardy-Weinberg ( H e ); índice de fixação ( F )
Dessa forma conclui-se que o primer Euca 63 foi eficiente para a identificação de
polimorfismos e, portanto, de variabilidade alélica daquele locus na população estudada.
Para obter-se maior cobertura genômica na investigação da variabilidade genética presente
nestes indivíduos se faz necessária a utilização de um maior número de primers.
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Bolsa: Sem Bolsa