Respostas bioquímicas e fisiológicas de fungos aquáticos a stress metálico
Azevedo, Maria Manuel
ABSTRACT
Heavy metal pollution is a worldwide problem with serious environmental
consequences which increased with the Industrial Revolution. Industrial, agricultural and
mining activities increase considerably heavy metals levels in the environment. In the last
years the fight towards this type of pollution has attracted considerable attention and many
efforts are being done to minimize anthropogenic emissions of metals. Nevertheless this
problem is far to be solved, since these polutants are not degraded and persist in the
environment being transfered along food chains.
Freshwaters are frequently contaminated with heavy metals, however a group of
aquatic fungi called aquatic hyphomycetes have been described as promissor since they
tolerate and acumulate great concentrations of heavy metals which make them potentialy
candidates for futur use in bioremediation.
The aim of the present work was the study of physiological and biochemical responses
of aquatic hyphomycetes after heavy metal exposure. Data from literature showed that
toxicity towards heavy metals could be due to the production of reactive oxygen species
(ROS), so clarification of the cellular mechanisms involved in heavy metal resistance in the
present work included the study of antioxidant enzymes, catalase (CAT), superoxide
dismutase (SOD) and glucose-6-phosphate-dehydrogenase (G6-PDH); after acute and chronic
stress conditions. Our results showed that CAT had a crucial role relating to Cu and Zn stress.
Our results sugested that tolerance of aquatic hyphomycetes to Cu and Zn was associated to
the ability of these fungi developed an eficient antioxidant system. The toxicity induced by
heavy metals via ROS production can cause wide-ranging damage to proteins, nucleic acids
and lipids, eventually leading to cell death. In this context we performed experiments to study
the effects of Cu and Zn in cell wall, plasma membrane and nucleous. Our results showed that
the cell wall was not involved in aquatic hyphomycetes tolerance; nevertheless morphological
alterations induced by Cu were detected in this structure. Concerning the integrity of plasma
membrane, was demonstrated that this barrier was mainly affected by Cu, pointing this
structure as a potential target vulnerable to Cu. Chronic treatment with Cu and Zn indicated
that these metals induced nuclear morphological alterations such as chromatin condensation/
fragmentation, DNA strand breaks and caspase activation, typical markers of a process of
active cell death. In this study were also detected differences in SH-compounds production in
the presence of Cu and Zn. In addition was investigated the role of H+ATPase which was a
useful indicator of environmental stress induced by toxic heavy metal concentrations. Our
results indicated that this protein have an important role maily after acute exposure.
A poluição provocada por metais pesados é um problema que se coloca à escala global
com consequências ambientais muito graves tendo sido incrementada a partir da Revolução
Industrial. As actividades industriais, agrícolas e mineiras que daí resultaram conduziram a
um aumento considerável de metais pesados no ambiente. Nos últimos anos o combate a este
tipo de poluição tem sido alvo de considerável atenção tendo sido efectuados esforços no
sentido de minimizar as emissões destes poluentes. No entanto, este problema está longe de
ser solucionado, dado que estes poluentes não são degradados, persistem no ambiente e são
transferidos através das cadeias alimentares.
Os cursos de água doce são frequentemente contaminados com metais pesados, no
entanto um grupo particular de fungos os hifomicetos aquáticos têm sido descritos como
tendo um papel promissor dado que toleram e acumulam elevadas concentrações de metais
tornando-se potenciais candidatos para futuro uso em bioremediação.
Os hifomicetos aquáticos são um grupo ecológico de fungos filogeneticamente
heterogéneo, possuem adaptações morfológicas e fisiológicas que lhes possibilitam a
colonização e decomposição da folhada, são comuns em águas limpas e arejadas, têm a
capacidade de se manterem activos a temperaturas baixas, são capazes de produzir enzimas
extracelulares que provocam a maceração das folhas e estabelecem um importante elo trófico
entre partículas grosseiras de matéria orgânica e os macroinvertebrados.
Neste estudo numa primeira fase analisou-se o efeito dos metais pesados no
crescimento e esporulação concluindo-se que os metais inibem a esporulação e o crescimento,
no entanto a esporulação é mais sensível. Numa fase posterior investigámos o efeito do cobre
(Cu) e zinco (Zn) em barreiras celulares, nomeadamente parede celular e membrana
plasmática, verificando-se que a parede celular apesar de apresentar alterações morfológicas
não retém metal. Quanto à membrana plasmática constatou-se que é severamente afectada
pelo (Cu) e moderadamente afectada pelo (Zn).
No sentido de estudar se o Cu e Zn desencadeiam mecanismos de morte activa nestes
fungos, estudaram-se alguns marcadores apoptóticos nomeadamente produção de espécies
reactivas de oxigénio (ROS), actividade da caspase e alterações morfológicas no núcleo.
Apesar de constituírem estudos preliminares os nossos resultados parecem indiciar um
processo de morte activa (apoptose).
Dado que os metais pesados induzem a produção de ROS, os organismos podem contrariar
esta toxicidade aumentando as defesas antioxidantes (não-enzimáticas e enzimáticas). Neste
sentido medimos a actividade de enzimas envolvidas no combate ao stress oxidativo tais
como catalase, superóxido dismutase e glucose-6 fosfato desidrogenase, após exposição
aguda e crónica a Cu e Zn. Verificámos que estas enzimas estão envolvidas no processo de
desintoxicação a metais, com particular destaque para a catalase. Globalmente os nossos
resultados sugerem que a tolerância dos hifomicetos aquáticos ao Cu e Zn está associada há
habilidade destes fungos desenvolverem um sistema antioxidante eficiente.
Está também descrito na literatura que a H+ATPase da membrana plasmática poderá
estar envolvida no combate ao stress metálico, neste sentido pesquisamos o seu papel após
exposição aguda crónica. Os nossos resultados indicaram que esta enzima tem um papel
importante principalmente após exposição aguda. Numa última fase deste trabalho estudamos
a produção de compostos tiólicos (contendo grupos -SH), dado que trabalhos anteriores
noutros organismos salientaram a sua importância como mecanismo de defesa aos metais. Os
nossos resultados permitem concluir que estes compostos estão implicados na resistência aos
metais.
Após estes estudos verificamos que o estado do conhecimento no que respeita a estes
organismos é ainda bastante precário, pelo que em termos de perspectivas futuras se destacam
aspectos que considerámos prioritários desenvolver tais como:
- Estudar o efeito dos metais pesados nas taxas de respiração,
- Estudar a expressão de genes implicados na regulação das enzimas antioxidantes,
- Fazer um “screen” das actividades antimicrobianas destes fungos,
- Pesquisar metabolitos secundários produzidos por estes fungos uma vez que podem resultar
na descoberta de novos produtos bionaturais com importância médica.
- Por outro lado existe uma necessidade urgente de novos agentes anticancro que induzam
menos efeitos secundários, deste modo seria interessante investigar estes aspectos em
hifomicetos aquáticos.