Faculdade de Medicina da Universidade do Porto
Instituto de Embriologia e Histologia – Disciplina de Biologia Molecular e Celular
Cultura de células de DRG’s e
transdução viral
Realizado por:
Francisco A. F. Ferro de Beça
Francisco M. Pinto da Costa
Luís F. Silva Machado
Rita M. Marinho Pires
Porto - 2004
Orientado por:
Dra. Joana Gomes
Objectivos
1. Estabelecer uma cultura de células;
Cultura de células
O que é?
É um tipo de cultura de tecidos que
implica a desagregação (mecânica ou
enzimática) do tecido original e em que as
células são cultivadas numa camada
aderente, num substrato sólido ou em
suspensão em meio de cultura.
Tipos de cultura de tecidos (adaptado de Freshney,
2000).
Cultura de células
Vantagens
•Controlo das condições ambientais (pH,
temperatura, concentração de O2 e CO2,
etc);
Limitações
•Necessidade
de
operadores
experientes (com conhecimentos da
técnica asséptica, etc);
•Obtenção
de
células
com
boa
homogeneidade e bem caracterizadas;
•Custo do esforço e material (baixa
quantidade de células produzidas para
o material e esforço gasto);
•Economia de animais, reagentes, tempo,
etc.
•Perda de características fenotípicas;
•Necessidade do uso de marcadores
devido à perda de características
fenotípicas;
•Instabilidade das células (sobretudo
em linhas celulares imortais).
Cultura de células
Algum do material utilizado:
Dorsal Root Ganglions (DRG’s)
•Gânglios que se localizam nas raízes
dorsais dos nervos raquidianos.
•Possuem sobretudo os corpos
celulares de neurónios aferentes
primários sensitivos.
–Neurónios pseudounipolares com 2
axonónios: sendo um dirigido à
periferia para fazer a enervação
sensitiva dos tecidos; e o outro para
a medula espinal.
Estrutura da medula espinal (adaptado de
Martin, 1989).
Neurónio de um DRG (adaptado de Kandel et al.,
1985).
Actividade experimental
1ª experiência (parte 1) - Protocolo
1.
Sacrificou-se um ratinho (C57 BL / 6J) e dissecaram-se os DRG’s;
2.
Procedeu-se à digestão enzimática dos DRG’s com colagenase durante 3 horas;
3.
Cobriram-se os poços de cultura com PORN (Poly-DL-ornitina hidrobromido) e
esterilizaram-se os mesmos com luz UV;
4.
Após a digestão enzimática, lavaram-se as células com meio de cultura;
5.
Transferiram-se as células para para um falcon com BSA (sterile bovine serum
albumin type IV) a 15% e centrifugaram-se (durante 10 min a 1000 rpm);
6.
Semearam-se as células nos poços de cultura;
7.
Incubaram-se durante 2 dias a 37ºC e a 5% de CO2.
1ª experiência (parte 1) - Resultados
Objectivos
1. Estabelecer uma cultura de células; 
2. Infectar as células com HSV-1;
HSV-1 (Herpes simplex vírus tipo 1)
Neurónio de um DRG (adaptado de Kandel et al., 1985).
HSV-1 (Herpes simplex vírus tipo 1)
Que vantagens oferece o HSV-1 como
vector sobre outros vírus?
•Genoma extenso (150 Kb) e zona de
inserção também (35 Kb);
•Não integra o seu genoma no da
célula hospedeira;
•Infecta preferencialmente
quiescentes.
Estrutura da partícula viral
(Adaptado de Burton et
al.,2002).
células
Infecção pelo HSV-1 (Adaptado de Fink et al., 1996).
HSV-1 (Herpes simplex vírus tipo 1)
Utilizou-se uma versão do herpes vírus alterado
geneticamente para:
• Não ser replicativo;
• Não ser patogénico;
• Incluir no seu DNA uma cassete contendo a unidade
transcripcional do gene codificador da GFP (Green
Fluorescence Protein) .
Esquema do genoma recombinado (adaptado de
Wilson et al., 1999).
Transcrição em cascata do genoma do HSV
wildtype 1.
1ª experiência (parte 2) - Protocolo
6.
Incubaram-se as células com um meio de cultura com HSV-1(diluição 1/5000 –
8x102 Pfu) e durante 2h para infecção das mesmas pelo vírus;
7.
Após infecção substituiu-se o meio de cultura com o vírus por novo meio e
incubaram-se de novo as células;
8.
Passadas 24 horas procedeu-se à fixação das células com etanol e posterior
observação destas no microscópio confocal para pesquisa do sinal verde da
GFP.
2ª experiência (parte 1) - Protocolo
1.
Sacrificou-se um rato (Wistar) e dissecaram-se os DRG’s.
2.
...
6.
Adicionou-se NGF (Nerve Growth Factor) ao meio (50 ng/mL).
7.
Semearam-se as células nos poços de cultura.
8.
Incubaram-se durante 5 dias a 37ºC e a 5% de CO2.
9.
Incubaram-se as células com um meio de cultura com HSV-1 (com 2 diluições
diferentes, uma 1/5000 – 8x102 Pfu e outra 1/2500 – 1,6x103 Pfu) durante 24h
para infecção das mesmas pelo vírus.
10. Substituiu-se o meio de cultura com o vírus por novo meio de cultura e
incubaram-se de novo as células durante 2 dias.
11. Procedeu-se à fixação das células em PFA (Paraformaldeído) (a 4%) e posterior
observação destas ao microscópio confocal para pesquisa do sinal verde da
GFP.
2ª experiência (parte 1) - Resultados
2ª experiência (parte 1) - Resultados
Objectivos
1. Estabelecer uma cultura de células. 
2. Infectar as células com HSV-1.

3. Verificar se as células infectadas eram de
facto neurónios.
2ª experiência (parte 2) - Protocolo
13. Seguidamente, realizou-se uma imunocitoquímica começando por se lavar
duas vezes os poços com PBS (Phosphate Bufer Salive) ( 8 min cada lavagem);
14. Lavaram-se os poços com PBS-T (PBS+Triton)(durante 5min);
15. Adicionou-se uma solução de PBS+glicínia+NGS (Normal Goat Serum)(15mg
glicínia em 2mL de PBS e 10% de NGS) e aguardou-se 1 hora;
16. Retirou-se a solução anterior e adicionou-se o anticorpo primário anti-Neu N,
utilizando-se duas soluções (anti-Neu N em PBS + 2% NGS) com concentrações
diferentes ( 1/2500 e 1/5000);
17. Incubou-se à temperatura ambiente overnight;
18. Lavaram-se os poços duas vezes com PBS e uma com PBS-T como
anteriormente;
19. Adicionou-se o anticorpo secundário goat anti-mouse (goat anti-mouse em PBS
com uma diluição 1/1000) e aguardou-se 1 hora;
20. Lavaram-se os poços com PBS 2 vezes (5 min cada lavagem);
21. Observou-se ao microscópio confocal para pesquisa do sinal.
3ª experiência - Protocolo
O protocolo usado foi o basicamente o mesmo da 2ª experiência
com as seguintes alterações:
1. Voltamos a utilizar ratinhos em vez de ratos;
2. Apenas incubamos as células 3 dias antes de as infectarmos
com o HSV-1;
3. Na imunocitoquímica não realizamos as lavagens com PBS-T.
3ª experiência - Resultados
3ª experiência – Resultados
Conclusões
•Foi possível estabelecer uma cultura de DRG’s viáveis ultrapassando a
complexidade da técnica da cultura celular;
•Ocorreu uma transdução viral eficiente e consequente expressão da GFP nas
células em cultura;
•Verificou-se que o vírus infectou neurónios bem como outras células.
Estratégias a seguir em trabalhos futuros
•Efectuar uma contagem dos sinais para se conhecer a percentagem de células
infectadas pelo HSV-1 face à percentagem de neurónios.
•Realizar novas imunocitoquimicas com outros marcadores (p.e. GFAP para certas
células gliais) de forma a conhecer os outros tipos de células infectados pelo HSV-1,
bem como a percentagem de infecção.
•Elaborar um novo protocolo que permita investigar se a entrada do vírus nos
neurónios se processa pelos prolongamentos celulares ou se efectivamente entra
pelo corpo celular.
Bibliografia
Burton E. A., Fink D. J., Glorioso J. C.. “Gene delivery using herpes simplex virus vectors”. (2002) DNA
and Cell Biology, 21(12):915-36.
Fink D. J., DeLuca N. A., Goins W. F., Glorioso J. C.. “Gene transfert to neurons using herpes simplex
virus-based vectors”. (1996). Anual Review of Neuroscience, 19:265-87.
Freshney R.I.. “Culture of Animal Cells, a manual of basic technique”. 4th ed., (2000), Wiley-Liss.
chapter 1, p. 7, fig. 1.2.
Kelly J.P.. “Anatomical Basis of Sensory Perception and Motor Coordination” in: Kandel, E.R. and
Schwartz J.H. (edit). “Principles of Neuronal Science”. 2nd ed.,(1985), Elsevier. Vol 20, p. 223, fig.201.
Martin J.H. “Neuroanatomy, Text and Atlas”. 1st ed., (1989), Elsevier. p.8, fig. 1.4.
Mullen, R. J. Buck, C.R. Smith, A. M.. “NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates”.
(1992), Developement, p.201-211.
Wilson S. P., Yeomans D. C., Bender M.A., Lu Y, Goins W.F., Glorioso J.C.. “Antihyperalgesic effects of
infection with a preproenkephaline-encoding herpes simplex”. (1999) Procedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America, 96:3211-3216.
Agradecimentos
À Dra. Isabel Martins por nos ter disponibilizado as amostras de HSV-1, informação
sobre o mesmo e ainda pela ajuda na operação do microscópio confocal bem
como na realização desta apresentação.
À Profa. Fani Neto e à Dra. Sandra Rebelo pela disponibilização do material
biológico (ratinhos e ratos).