UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
FACULDADE DE BIOMEDICINA
ADRIANO DA PAIXÃO SOUTO
COMPORTAMENTO CITOGENÉTICO ANÔMALO EM INDIVÍDUOS
PORTADORES DA DOENÇA DE DARIER
BELÉM
2012
ADRIANO DA PAIXÃO SOUTO
COMPORTAMENTO CITOGENÉTICO ANÔMALO EM INDIVÍDUOS
PORTADORES DA DOENÇA DE DARIER
Trabalho de Conclusão de Curso
apresentado
à
Faculdade
de
Biomedicina
da
Universidade
Federal do Pará, como requisito
parcial para a obtenção do grau de
Bacharel em Biomedicina.
Orientador: Prof. Dr. Nelson Antonio Bailão Ribeiro
BELÉM
2012
ADRIANO DA PAIXÃO SOUTO
COMPORTAMENTO CITOGENÉTICO ANÔMALO EM INDIVÍDUOS
PORTADORES DA DOENÇA DE DARIER
Trabalho de Conclusão de Curso
apresentado
à
Faculdade
de
Biomedicina
da
Universidade
Federal do Pará, como requisito
parcial para a obtenção do grau de
Bacharel em Biomedicina, aprovado
com o conceito ________________.
Belém (PA), 19 de dezembro de 2012.
Banca Examinadora:
_______________________________________
Profº Dr. Nelson Antonio Bailão Ribeiro
UEPA/ IEC – Sessão de Hepatologia
(Orientador)
_______________________________________
Profº Dr.Edivaldo Herculano Corrêa de Oliveira
(UFPA/IEC - Sessão de Meio Ambiente)
_______________________________________
Drª Maria de Fátima Lima de Assis
(IEC - Sessão de Meio Ambiente)
_______________________________________
Profº Dr. Amauri Miranda Esteves – Suplente
(UEPA - CCBS)
i
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a todos os meus colegas que escolheram a Biomedicina para
ser sua profissão, em especial, aqueles que contribuem, todos os dias, para o
entendimento da genética humana.
ii
AGRADECIMENTOS
A Deus, pai de todos os viventes, Senhor do Céu e da Terra, criador de tudo o
que existe, pelas bençãos que a todos os dias derrama sobre mim e minha família,
dentre elas, minha aprovação no vestibular e a conclusão do curso de Biomedicina.
Aos meus estimados pais, Claudio e Isolete Souto, aos quais atribuo toda a
credibilidade por a minha formação acadêmica, profissional, pessoal e cidadã.
A minha ilustríssima avó, Raimunda Palheta de Souza Filha, que com suas
orações e conselhos colaborou de sobremaneira para a minha formação acadêmica.
A Faculdade de Biomedicina da Universidade Federal do Pará, na pessoa das
professoras Rita de Cássia Moussinho e Karla Tereza Silva Ribeiro, que me permitiu
adquirir o grau de Biomédico com a mais completa excelência e confiabilidade.
Ao meu orientador, Professsor Doutor Nelson Antonio Bailão Ribeiro, que com
empenho, paciência e dignidade, me ensinou muito e me acompanhou de modo
especial na realização do meu Trabalho de Conclusão de Curso (TCC).
Ao Instituto Evandro Chagas e todos os colegas de laboratório, em especial
minha amiga Thamires Brandão, que compartilhou comigo ótimos momentos de
aprendizado e muito me ajudou na realização do meu (TCC).
A todos os meus prezados colegas de curso, em especial meus
companheiros Joelma Costa, Bruno Martins, Ana Danielle Sena, Paula Frade, Bruna
Lins e Stephanie Renteiro, que me fizeram rir, aprender e melhor entender o
significado da verdadeira amizade.
Aos demais colaboradores Dr. Manoel, Jéssica Gomes, Jéssica Gonzaga e
Rafaela Guedes.
SUMÁRIO
DEDICATÓRIA .............................................................................................................i
AGRADECIMENTOS ..................................................................................................ii
LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................iii
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ..............................................................iv
RESUMO .....................................................................................................................v
1 INTRODUÇÃO .........................................................................................................1
1.1 GENÉTICA MÉDICA .............................................................................................1
1.2 CITOGENÉTICA HUMANA ...................................................................................3
1.2.1 Cromossomos humanos .................................................................................4
1.2.2 Anormalidades cromossômicas .....................................................................6
1.2.2.1 Anormalidades do número de cromossomos ............................................6
1.2.2.2 Anormalidades na estrutura dos cromossomos ........................................8
1.2.1 Métodos de coloração para Análise de Rotina ..........................................14
1.3 DOENÇA DE DARIER .........................................................................................18
2 OBJETIVOS ...........................................................................................................22
2.1 GERAL ................................................................................................................22
2.2 ESPECÍFICOS ....................................................................................................22
3 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................23
3.1 ÁREA DE ESTUDO .............................................................................................23
3.2 LOCAL DE REALIZAÇÃO DO ESTUDO .............................................................23
3.3. OBTENÇÃO DE CROMOSSOMOS METAFÁSICOS ........................................24
3.4 PREPARAÇÃO DE LÂMINAS .............................................................................25
3.5 TÉCNICAS DE COLORAÇÕES CONVENCIONAIS............................................25
3.5.1 Coloração convencional por giemsa ............................................................25
3.5.2 Bandeamento G, segundo Seabright (1971) com modificações ................25
3.5.3 Marcação de região organizadora de nucléolo, segundo Howell & Black
(1980), com modificações .......................................................................................26
3.6 ANÁLISE CROMOSSÔMICA ..............................................................................27
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................28
5 CONCLUSÃO ........................................................................................................36
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................37
iii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Pápulas queratósicas de DD localizadas no lado esquerdo do peito
inferior. (Fonte: Goldberg et al., 2001) ......................................................................21
Figura 2. Placa verrucosa de DD localizada no tronco de um homem de 40
anos de idade (Fonte: Puri, 2011) .............................................................................21
Figura 3. Família afetada pela doença de Darier. Probandos marcados em
preto representam afetados. Tracejado representa ocorrência de demência...........31
Figura 4. Cariótipo com coloração convencional do indivíduo 7, indicando
associação pelo braço curto de dois cromossomos do grupo D ...............................35
Figura 5. Cariótipo G-bandeado do indivíduo 7 indicando associação específica
dos cromossomos dos pares 13 e 15 ........................................................................35
Figura 6. Regiões organizadoras de nucléolos em cromossomos do indivíduo 7
indicando associação de cromossomos do grupo D pela região satélite dos
braços curtos e não pela região organizadora de nucléolo .......................................36
Figura 7. Cariótipo em coloração convencional do indivíduo 5, indicando
associação pela região terminal do braço curto de dois cromossomos
acrocêntricos .............................................................................................................36
Figura 8. Cariótipo G-bandeado normal do indivíduo 7.............................................37
Figura 9. Cariótipo G-bandeado normal do indivíduo 5 ............................................37
Figura 10. Cariótipo normal em coloração convencional do indivíduo do grupo
controle .....................................................................................................................38
iv
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
2n – Diplóide
3n – Triplóide
4n - Tetraplóide
ATP – Adenosina trifosfato
DD – Doença de Darier
DNA – Ácido desoxiribonucleico
del – Deleção
FISH – Fluorescent in situ hybridization
IEC – Instituto Evandro Chagas
inv - Inversão
iso - Isocromossomo
KCl – Cloreto de Potássio
MS – Ministério da Saúde
NOR – Região organizadora de nucléolo
p – Braço curto do cromossomo
q – Braço longo do cromossomo
RNA – Ácido ribonucleico
RPM – Rotações por minuto
SERCA 2 – Retículo endoplasmático/sarcoplasmático cálcio ATPásico isorforma 2
SSC – Solução de Citrato de Sódio
SVS – Secretaria de Vigilância
t - Translocação
TCLE – Termo de consentimento livre e esclarecido
v
RESUMO
Dentro da genética humana e médica há muitos campos de interesse
indicados pelas várias direções, sendo uma das principais áreas de especialização o
estudo dos cromossomos, citogenética, pois, sabe-se, hoje, que os distúrbios
cromossômicos constituem uma categoria importante de doenças genéticas. A
doença de Darier (DD) é definida como uma doença genética autossômica
dominante, cujas manifestações clínicas consistem, sobretudo, na formação de
pápulas firmes, gordurosas e queratósicas na pele. Diversos estudos de famílias,
gêmeos e adoção relatam casos de indivíduos apresentando, além das
deformidades dermatológicas da DD, manifestações neuropsiquiátricas. A relação
fenótipo/Genótipo desta doença ainda não está totalmente compreendida. Assim,
faz-se necessário uma análise citogenética desta patologia, uma vez que, até o
presente momento, não há qualquer estudo a nível cromossômico referente a DD
presente na literatura. O presente estudo teve como objetivo geral estudar
cariotipicamente indivíduos portadores da DD. Realizou-se a obtenção de
cromossomos metafásicos pela técnica de cultura de linfócitos. O material foi
submetido à coloração convencional por Giensa, bandeamento G e marcação de
região organizadora de nucléolo. As melhores metáfases foram selecionadas para
serem fotomicrografadas com objetiva de 100X. Os resultados deste estudo indicam
fortemente a presença de rearranjo cromossômico peculiar a esta doença –
cromossomo dicêntrico - ainda não apresentado na literatura científica.
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 GENÉTICA MÉDICA
Este é um período em que a genética médica atingiu um papel
reconhecido como disciplina central que lida com a variabilidade e hereditariedade
humana e ao mesmo tempo desenvolve abordagens que permitem uma nova
compreensão de muitas doenças, prometendo muito mais em um futuro breve,
devido aos avanços da genética nos últimos anos.
A genética é uma matéria multiforme, envolvida com a variação e
hereditariedade de todos os organismos vivos. Dentro deste amplo campo, a
genética humana é a ciência da variação e hereditariedade presente nos seres
humanos, e em especial a genética médica lida com a variação genética humana de
importância clínica. As duas áreas possuem uma extensa superposição e, de fato,
para muitos geneticistas são sinônimos (Thompson et al., 1993).
Dentro da genética humana e médica há muitos campos de interesse
indicados pelas várias direções, sendo as principais áreas de especialização o
estudo dos cromossomos, citogenética; o estudo da estrutura e função dos genes,
genética molecular e bioquímica; e aplicação no diagnóstico e assistência de
pacientes, genética clínica (Motta, 2000).
Outros campos da genética humana, como a genética populacional,
epidemiologia genética, genética do desenvolvimento e imunogenética, também
apresentam relevância médica, especialmente no que se refere a compreensão e
prevenção das doenças humanas (Thompson et al., 1993).
Além da prática clínica, a genética médica é aplicada à assistência dos
pacientes nas áreas de aconselhamento genético, triagem populacional para
identificar pessoas sob risco de apresentar ou transmitir um distúrbio genético, e
diagnóstico pré-natal, atuando assim no aconselhamento genético, o qual apresenta
informações sobre os riscos de doenças genéticas. Esta atividade vem crescendo
como uma nova profissão de saúde. A triagem populacional para as doenças
genéticas tornou-se uma iniciativa importante para a saúde pública. O diagnóstico
2
pré-natal, que requisita muitas especialidades clínicas e laboratoriais além da
genética, provavelmente, é a principal área de aplicação da genética a assistência
de pacientes .
Embora quase sempre estivesse ligada a pediatria, a genética médica
também é relevante para muitas outras especialidades clínicas. Em obstetrícia, o
diagnóstico pré-natal de certos defeitos genéticos tornou-se um aspecto básico da
assistência pré-natal. Na clínica médica, sabe-se que muitos distúrbios comuns,
como a doença das artérias coronárias, hipertensão arterial e diabetes mellitus,
possuem componentes genéticos importantes, além de aplicações em outros
campos como a neurologia, hematologia e oncologia (Borges-Osório & Robinson,
2002).
Apesar de muito da genética médica estar dentro da corrente médica
geral, ela difere das outras especialidades médicas no fato de se orientar
usualmente para a prevenção, além disso, muitas vezes o tratamento e seu foco não
são apenas o paciente, mas toda a família (Thompson et al., 1993).
Ao longo de muitos anos de pesquisa vários foram os casos de distúrbios
genéticos registrados pela genética médica, sendo os mesmos classificados em
cinco grupos: a) Distúrbios monogênicos: Anemia falciforme, deficiência de
adenosina-desaminase, deficiência de alfa1-antitripsina, deficiência de glicose-6fosfato-desidrogenase, distrofia miotônica, distrofia muscular de Duchenne, doença
de Huntington, doença de Tay-Sachs, fenilcetonúria, fibrose cística, hemofilia A,
hipercolesterolemia familiar, neurofibromatose tipo I, osteogênese imperfeita,
retinoblastoma, síndrome do X frágil, talassemia, tumor de Wilms; b) Distúrbios
multifatoriais: Malformações congênitas (cardiopatias congênitas, defeitos do tubo
neural, fenda labial com ou sem fenda palatina), c) Doenças adultas: (algumas
formas de câncer, diabetes mellitus, doenças das artérias coronárias); d) Distúrbios
mitocondriais: Neuropatia óptica hereditária de Leber e e) Distúrbios citogenéticos:
Síndrome de Down, trissomia do cromossomo 18, trissomia do 13, síndrome de
Klinefelter, síndrome de Turner, síndrome do XXX, síndrome do XYY, síndrome de
Prader-Willi, apresentando como objeto de estudo os cromossomos metafásicos, os
quais, só podem ser visualizados individualmente por um breve período durante a
divisão celular na metáfase, pois estão condensados ao máximo (Guerra, 1988;
Thompson et al., 1993; Borges-Osório & Robinson, 2002).
3
1.2 CITOGENÉTICA HUMANA
Uma nova era da genética médica foi inaugurada em 1959 com duas
descobertas praticamente simultâneas: o achado de Lejeune e colaboradores de
que crianças com mongolismo atualmente conhecido como síndrome de Down ou
trissomia do 21 possuem 47 cromossomos em vez de 46 nas células somáticas, e as
primeiras observações feitas por Ford e colaboradores e por Jacobs e Strong, de
anomalias
dos
cromossomos
sexuais
em
pacientes
com
distúrbios
do
desenvolvimento sexual (Motta, 2000).
Sabe-se, hoje, que os distúrbios cromossômicos constituem uma
categoria importante de doenças genéticas, respondendo por uma grande proporção
de todo o desperdício reprodutivo, malformações congênitas e retardamento mental,
além de desempenhar um importante papel na patogenia do câncer. As
anormalidades cromossômicas são responsáveis por 60 % ou mais das síndromes
identificáveis, que coletivamente são mais comuns que todos os distúrbios
monogênicos mendelianos juntos (Borgaonkar, 1989). Estima-se que afetem 0,7 %
dos nascidos vivos, 2 % das gestações em mulheres com mais de 35 anos de idade
e 50 % dos abortos espontâneos no primeiro trimestre (Thompson et al., 1993).
As anormalidades dos cromossomos podem ser numéricas ou estruturais
e envolver um ou mais autossomos, cromossomos sexuais ou ambos (Thompson et
al., 1993; Motta, 2000). Sem dúvida, o tipo mais comum de anormalidade
cromossômica clinicamente significativa é a aneuploidia, um número anormal de
cromossomos devido a um exemplar extra ou inexistente, que sempre está
associada a mau desenvolvimento físico ou mental, ou ambos. As translocações
recíprocas (troca de segmentos entre cromossomos não homólogos) também são
relativamente comuns, mas não costumam ter qualquer efeito fenotípico, embora,
estejam associadas a um risco mais elevado de prole anormal (Thompson et al.,
1993).
4
1.2.1 Cromossomos humanos
As primeiras técnicas de estudos em citogenética humana contavam
apenas com métodos de coloração convencional os quais permitiram identificar
inicialmente o que se pensou ser 48 cromossomos e mais tardiamente constatou-se
que se tratavam, na verdade, de 46 agrupados em 23 pares. Destes, 22 são
semelhantes em ambos os sexos e denominados autossomos. O par restante
compreende os cromossomos sexuais: XX no sexo feminino e XY no masculino. Os
membros de um par (descritos como cromossomos homólogos ou apenas
homólogos) possuem informações genéticas equivalentes; isto é possuem os
mesmos loci gênicos na mesma seqüência, mas em qualquer lócus específico eles
podem ter formas idênticas ou diferentes, as quais são denominadas alelos. Um
membro de cada par dos cromossomos é herdado do pai, o outro da mãe.
Normalmente os membros de um par de autossomos são microscopicamente
indistinguíveis um do outro. Nas mulheres, os cromossomos sexuais, os dois
cromossomos
X,
também
são
indistinguíveis.
Nos
homens,
contudo,
os
cromossomos sexuais diferem. Um é o X, idêntico aos Xs das mulheres, herdado de
sua mãe e transmitido às filhas, o outro é o cromossomo Y, é herdado do pai e
transmitido aos filhos (Thompson et al., 1993; Motta, 2000; Guerra, 1988).
Os autossomos são numerados de 1 a 22 com base no seu comprimento
total, sendo uma exceção o cromossomo 21, pois é um pouco mais curto que o 22.
Entretanto, antes que seu tamanho menor fosse percebido, ele já era bem
conhecido como cromossomo 21, presente em três cópias na maioria dos casos da
síndrome de Down (Motta, 2000).
A morfologia dos cromossomos é identificada a partir de uma de suas
principais estruturas, o centrômero, ou constrição primária, que desempenha uma
função-chave na divisão celular como a região na qual, as fibras do fuso se fixam,
sendo um ponto de referência citológico básico, dividindo o cromossomo em dois
braços, designados “p” para o braço curto e “q” para o longo. Os braços são
indicados pelo número do cromossomo seguido da letra “p” ou “q”. Assim, “11p”
siginifica braço curto do cromossomo 11 e “Yq”, braço longo do cromossomo Y. Os
cromossomos humanos classificam-se segundo a posição do centrômero em três
tipos: metacêntricos, com um centrômero relativamente central e braços de
5
comprimento aproximadamente iguais; submentacêntricos, com um cromossomo
excêntrico e braços de comprimentos nitidamente diferentes; acrocêntricos, com o
centrômero próximo a uma extremidade (Thompson et al., 1993).
Os cromossomos acrocêntricos humanos (cromosomos 13, 14, 15, 21 e
22) apresentam apenas massas de cromatina (regiões satélites) fixadas aos seus
braços curtos por pedículos estreitos, constrições secundárias, estas contendo
genes que codificam o RNA ribossomal 45 S (Lewis, 2004).
Embora
os
especialistas
muitas
vezes
analisem
dispersões
cromossômicas diretamente ao microscópio, um procedimento comum é cortar os
cromossomos de uma fotomicrografia e arranjá-los em pares na classificação
padronizada. A figura montada passa a se chamar cariótipo. O mesmo termo,
cariótipo, é usado também para o conjunto básico de cromossomos de um indivíduo
(Thompson et al., 1993).
Como citado anteriormente, os métodos de coloração originalmente
disponíveis para análise citogenética humana permitiam apenas a avaliação de
tamanho e morfologia dos cromossomos, mas não a identificação precisa dos 24
tipos de cromossomos (22 autossomos, X e Y). De fato, os cromossomos podiam
apenas ser classificados em sete grupos, conhecidos pelas letras A a G, de acordo
com seu comprimento total e a posição do centrômero. Contudo com as técnicas
atualmente
empregadas
tornou-se
possível
a
identificação
de
todos
os
cromossomos. Possibilitando a identificação dos cromossomos alterados em número
e morfologia, surgindo então os primeiros trabalhos nesta área (Lewis, 2004).
Imediatamente após as primeiras publicações descrevendo anomalias
cromossômicas, ficou evidente a necessidade de uma padronização internacional da
nomenclatura dos cromossomos humanos, feito nas conferencias de Denver, em
1960; Londres, em 1963; Chicago, em 1966; Paris, em 1971; Estocolmo, em 1977;
além de outras de mapeamento cromossômico como a de Edimburgo, em 1979, e
os relatos do Comitê de Nomenclatura de Citogenética Humana, como o de 1981,
sendo aceito internacionalmente, o sistema
uniforme de classificação de
cromossomos, originalmente formulado na conferência de Paris, em 1971, com uma
revisão feita após esse encontro, a fim de descrever os cromossomos vistos em
preparações na prófase e prometáfase (Motta, 2000).
6
1.2.2 Anormalidades cromossômicas
As anormalidades do número e estrutura dos cromossomos, que em geral
são clinicamente significativas, podem surgir nas células somáticas e gametas por
erros na divisão celular. No entanto, apenas àquelas presentes nas células de
linhagem germinativa é que podem ser transmitidas aos descendentes (Motta, 2000;
Borges-Osório & Robinson, 2002).
1.2.2.1 Anormalidades do número de cromossomos
As alterações cariotípicas no número de cromossomos resultam de falhas
na segregação dos cromossomos na formação de gametas que fecundarão ou serão
fecundados, ou durante a divisão celular do zigoto. Neste último caso, surgem os
mosaicos-indivíduos com linhagens celulares alteradas e normais (Thompson et al.,
1993).
Além do número diplóide (2n) típico das células somáticas normais,
algumas vezes relatam-se dois outros complementos cromossômicos euplóides,
triplóide (3n) e tetraplóide (4n). Até o presente momento foram observados poucos
casos de triploidia e a tetraploidia em fetos, além disso, alguns bebês triplóides
nasceram vivos, embora sua sobrevida fosse curta. A expressão fenotípica de um
cariótipo triplóide depende da fonte do conjunto de cromossomos extras; os
triplóides com um conjunto extra de cromossomos paternos têm uma placenta
anormal e são classificados como molas idatiformes parciais, mas aqueles com
conjuntos adicionais de cromossomos maternos não se classificam assim e são
abortados espontaneamente mais cedo na gravidez (Motta, 2000).
Os tetraplóides sempre são 92, XXXX ou 92, XXYY, sugerindo que a
tetraploidia resulta de uma falha da conclusão de uma divisão por clivagem inicial do
zigoto (Thompson et al., 1993).
A aneuploidia é o tipo mais comum e clinicamente significativo de
distúrbios dos cromossomos humanos, ocorrendo em pelo menos 3 a 4 % das
7
gestações reconhecidas. Embora por definição uma pessoa seja aneuplóide se
possuir mais ou menos cromossomos do que um múltiplo exato do conjunto
haplóide, a maioria dos pacientes aneuplóides apresenta trissomias (três
cromossomos em vez de dois) ou menos, frequentemente, monossomia (apenas um
representante de um cromossomo). Tanto a trissomia como a monossomia
apresentam conseqüências fenotípicas severas (Borges-Osório & Robinson, 2002).
A trissomia pode envolver qualquer cromossomo do conjunto, mas a
trissomia de um cromossomo inteiro raramente é compatível com a vida. O tipo mais
comum em recém-nascidos vivos é indubitavelmente, a trissomia do 21 (cariótipo 47,
XX + 21 ou 47 XY +21), constituição cromossômica encontrada em 95 % dos
pacientes com a síndrome de Down. A monossomia de um cromossomo inteiro
quase sempre é letal, sendo uma exceção importante é a monossomia do
cromossomo X (Lewis, 2004).
Além das alterações numéricas são encontradas em populações
humanas diferentes formas de alterações cromossômicas estruturais, as quais
podem ou não levar a quadros clínicos graves.
8
1.2.2.2
Anormalidades na estrutura dos cromossomos
Os rearranjos estruturais resultam de quebra cromossômica, seguida de
reconstituição numa combinação modificada. O rearranjo pode ocorrer de muitas
maneiras, sendo todas mais raras que a aneuploidia; o tipo mais comum uma
translocação balanceada (recíproca ou robertsoniana), está presente em cerca de 1
em 500 recém-nascidos. A troca de segmentos entre cromossomos ocorre
espontaneamente numa baixa freqüência e também pode ser induzida por agentes
causadores de quebras (clástogenos) como radiação ionizante, algumas infecções
virais e diferentes substâncias químicas. A exemplo das anormalidades numéricas
os rearranjos estruturais podem estar presentes em todas as células de uma pessoa
ou na forma em mosaico (Thompson et al., 1993).
Os rearranjos estruturais são definidos como balanceados, se o conjunto
de cromossomos possuir o complemento normal de informações genéticas, ou nãobalanceados, se houver informações a mais ou a menos. Alguns rearranjos são
estáveis, capazes de passar por divisões celulares inalterados, enquanto outros são
instáveis. Para ser estável, um cromossomo rearranjado deve ter elementos
estruturais normais, incluindo um único centrômero funcional e dois telômeros
(Motta, 2000).
Nos rearranjos não balanceados, o fenótipo é provavelmente, anormal,
devido a deleção, duplicação, ou ambas. A duplicação de parte de um cromossomo
é comparável à trissomia parcial; enquanto que a deleção corresponde a uma
monossomia parcial (Thompson et al., 1993; Motta, 2000; Lewis, 2004).
Segundo Thompson et al. (1993) e Lewis (2004) deleção é a perda de um
segmento cromossômico, resultando em desequilíbrio da composição gênica. O
portador de uma deleção cromossômica (com um homólogo normal e um deletado)
é hemizigótico para as informações genéticas no segmento correspondente do
homólogo normal. As consequências clínicas dependem do tamanho do segmento
deletado e do número e função dos genes que ele contém. Uma deleção pode ser
terminal ou intersticial. As deleções podem originar-se simplesmente por quebra
cromossômica e perda do segmento acêntrico. Por outro lado, um crossing-over
desigual entre cromossomos homólogos desalinhados ou cromátides-irmãs é
9
responsável por deleções em alguns casos. As deleções também são geradas por
segregação anormal a partir de uma translocação ou inversão balanceada.
Em geral são identificadas numerosas deleções na investigação de
pacientes dismórficos e no diagnóstico pré-natal, mas o conhecimento dos genes
funcionais perdidos nos segmentos deletados e sua relação com as conseqüências
fenotípicas é extremamente limitada no presente, sabendo-se apenas que diversas
síndromes dismórficas estão associadas a deleções citogeneticamente visíveis
(Thompson et al., 1993; Motta, 2000; Lewis, 2004 ).
As duplicações, a exemplo das deleções, podem originar-se por crossingover desigual ou por segregação anormal da meiose num portador de uma
translocação ou inversão. Em geral a duplicação parece ser bem menos nociva do
que a deleção. Contudo, a duplicação presente em um gameta resulta em
desequilíbrio cromossômico, e como as quebras cromossômicas que a geram
podem romper genes, a duplicação frequentemente produz alguma anormalidade
fenotípica (Motta, 2000).
Embora muitas duplicações tenham sido descritas, bem poucas, foram
estudadas até agora, e generalizações sobre fenótipos associados seriam
prematuras. Apesar de que, certos fenótipos parecem estar associados a
duplicações de determinadas regiões cromossômicas (Lewis, 2004).
Os cromossomos em anel formam-se quando um cromossomo sofre duas
quebras e as extremidades rompidas se reúnem numa estrutura circular. Se o
centrômero estiver dentro do anel, os dois fragmentos distais, carentes de um
centrômero são perdidos (Guerra, 1988). Segundo Thompson et al. (1993) os
cromossomos em anel são bastante raros, no entanto já foram detectados em todos
os cromossomos humanos.
De acordo com Motta (2000) um isocromossomo é um cromossomo no
qual um braço está ausente e o outro, duplicado. Portanto, uma pessoa com 46
cromossomos que possui um isocromossomo tem uma única cópia do material
genético de um braço e três cópias do material genético do outro braço, sendo
parcialmente monossômica e parcialmente trissômica.
O tipo mais comum de um isocromossomo é o braço longo do
cromossomo X, i(Xq), em alguns indivíduos com a síndrome de Turner. No entanto
10
também foram descritos isocromossomos de vários autossomos, incluindo o braço
curto do cromossomo 18, i(12p). Os isocromossomos também são observados com
freqüência em cariótipos de tumores sólidos e de cânceres hematológicos (Lewis,
2004).
Os cromossomos dicêntricos são um tipo raro de cromossomo anormal,
no qual, dois segmentos cromossômicos (de cromossomos diferentes ou das duas
cromátides de um único), cada um apresentando um centrômero, fundem-se
extremidade com extremidade, com perda dos fragmentos acêntricos. Em virtude
dos seus dois centrômeros, os cromossomos dicêntricos tendem a quebrar-se na
anáfase; contudo, se os dois centrômeros estiverem próximos, ou se um for
inativado (Therman et al., 1974), um cromossomo dicêntrico pode ser estável. Tais
cromossomos são designados pseudodicêntricos. Os pseudodicêntricos mais
comuns envolvem um ou ambos os cromossomos sexuais (Thompson et al., 1993;
Lewis, 2004). De acordo com Abramova et al. (1993) e Prokofieva-Belgovskaya et al.
(1968), a associação de cromossomos acrocêntricos pelas regiões satélites tem sido
alvo de variados estudos que investigam sua possível relevância na etiologia de
anormalidades cromossômicas. Contudo, os resultados de tais investigações
apresentam-se, às vezes, bastante contraditórios, especialmente quando se pondera
a participação de regiões organizadoras de nucléolo neste processo ou sua relação
com parâmetros de idade, sexo, genótipo, condições de cultivo, entre outros. Uma
explicação aceita para a formação de cromossomos dicêntricos é baseada na
habilidade de regiões heterocromáticas, localizadas no braço curto de cromossomos
não
homólogos,
em conjugar-se.
Assim,
a
associação
de
cromossomos
acrocêntricos pode ser condicionada por alterações nas propriedades do nucléolo ou
na natureza destas regiões heterocromáticas.
Os rearranjos cromossômicos não costumam ter nenhum efeito fenotípico
se forem balanceados, por que todas as informações genéticas estão presentes,
embora acondicionadas de forma diferente. Contudo os rearranjos estruturais
representam uma ameaça à geração seguinte, porque os portadores produzem uma
alta freqüência de gametas não-balanceados e, portanto, têm um risco aumentado
de uma progênie anormal com cariótipos não-balanceados. Há também a
possibilidade de que uma das quebras cromossômicas destrua um gene, levando a
mutação. Esta é uma causa bem documentada de doenças ligadas ao X em
11
mulheres portadoras de translocações X-autossomo, sendo um indício útil da
localização do gene responsável por uma doença genética. As translocações
balanceadas são mais comuns em indivíduos com retardamento mental, em casais
que tiveram dois ou mais abortos espontâneos e em homens inférteis do que na
população em geral (Motta, 2000).
As translocações consistem em trocas de segmentos entre cromossomos
não homólogos. Havendo dois tipos principais: a translocação recíproca e a
robertsoniana (Guerra, 1998).
Nas translocações recíprocas o rearranjo resulta da quebra de
cromossomos não homólogos, com troca recíproca dos segmentos soltos. Estes
rearranjos costumam ser inofensivos, para o portador, mas a exemplo de outros
rearranjos estruturais balanceados, estão associadas a um alto risco de gametas
não-balanceados e progênie anormal. Relativamente comuns e encontradas em
cerca de 1 em 500 recém-nascidos, estas translocações são descobertas durante o
diagnóstico pré-natal ou quando os pais de uma criança anormal com uma
translocação não-balanceada são cariotipados. Já as translocações robertisonianas
envolvem dois cromossomos acrocêntricos que se fundem próximo a região do
centrômero com perda dos braços curtos. O cariótipo balanceado resultante tem
apenas 45 cromossomos, incluindo o cromossomo com translocação que na
verdade é constituído pelo braço longo dos dois cromossomos. Como os braços
curtos dos cinco pares de cromossomos acrocêntricos possuem cópias múltiplas de
genes do RNA ribossômico, a perda dos braços curtos de dois destes cromossomos
não é nociva, exceto para a prole (Thompson et al., 1993; Motta, 2000; Lewis, 2004).
Sabe-se que, estruturalmente, os braços curtos dos cromossomos acrocêntricos são
semelhantes. Assim, especula-se que as propriedades compartilhadas por estes são
cromossomos seja um fator causal de translocações robertsonianas (Cheng &
Naluai-Cecchini, (2004). Ohno et al. (1961) observou que há uma tendência para
cromossomos acrocêntricos em formar um nucléolo comum durante a mitose e
postularam que translocações robertisonianas, portanto, poderiam ocorrer durante
mitose ou meiose I como resultado da troca cromática entre acrocêntricos que foram
associados pelos mesmos nucléolos.
Uma inversão ocorre quando um único cromossomo sofre duas quebras,
sendo reconstituído com o segmento intersticial invertido. As inversões são de dois
12
tipos: paracêntricas (sem envolver o centrômero), nas quais as duas quebras
ocorrem em um único braço, e pericêntricas (envolvendo o centrômero), quando há
uma quebra em cada braço. Como as inversões paracêntricas não alteram as
proporções dos braços dos cromossomos,
são identificáveis apenas por
bandeamento. Já as inverções pericêntricas são mais fáceis de identificar
citogeneticamente, porque podem alterar a proporção dos braços cromossômicos
além do padrão de bandeamento (Thompson et al., 1993).
Assim como as translocações as inversões geralmente não causam um
fenótipo anormal nos portadores, pois é um rearranjo balanceado. Sua importância
médica é para a progênie; o portador de um dos tipos de inversão corre o risco de
produzir gametas anormais que podem levar a uma prole não-balanceada (Motta,
2000; Lewis, 2004).
Poucos foram os casos de inversões identificados na espécie humana. No
entanto, existe o registro de um com particularidades familiais interessante, o de
uma inversão pericêntrica do cromossomo 3, observada inicialmente em uma família
de múltiplas gerações da ilha de Terra Nova (Allderdice et al., 1975), é uma das
poucas inversões para as quais se obtiveram dados suficientes para permitir uma
estimativa da segregação do cromossomo com inversão na prole dos portadores.
Desde então, a inv(3) (p25q21) foi relatada por vários centros norte-americanos em
famílias cujos ancestrais provinham de Terra Nova. Os portadores dos cromossomos
3 invertidos são normais, mas alguns de seus filhos apresentam fenótipos anormal
típico associado ao cromossomo 3 recombinante, no qual há duplicação do
segmento distal 3q21 e deficiência do segmento distal 3p25.
Nove indivíduos portadores da inversão tiveram 53 gestações registradas
que resultaram em 7 abortos espontâneos, 31 crianças fenotipicamente normais e
15 crianças com anomalias congênitas múltiplas, das quais 12 morreram no primeiro
ano de vida (Allderdice et al., 1975). Embora tais dados possam ser típicos por
serem viciados devido a inclusão deliberada de portadores com fracas histórias
reprodutivas, o elevado risco empírico de um resultado anormal da gravidez neste
grupo (22/53, ou > 40%) indica a importância dos estudos cromossômicos das
famílias para identificar portadores e oferecer informação genética e diagnóstico prénatal.
13
Apesar da inversão do cromossomo 3 ter se tornado um marco para
estudos populacionais e de aconselhamento genético, a inversão mais comum dos
cromossomos humanos é uma pequena inversão pericêntrica do cromossomo 9,
que está presente em até 1% dos indivíduos testados por laboratórios de
citogenética. A inv(9)(p11q12) não tem efeito nocivo conhecido sobre os portadores
e não parece estar associada a um risco significativo de aborto ou prole não
balanceada; por isso, geralmente é considerada uma variante normal (Lewis, 2004).
Algumas vezes foram observados cromossomos marcadores muito
pequenos em culturas de cromossomos, geralmente num estado em mosaico,
existindo além do complemento cromossômico normal, cromossomos extras,
denominados cromossomos supranumerários. Embora superficialmente pareça ser
uma anormalidade numérica, um cromossomo marcador também é um rearranjo
estrutural (Thompson et al., 1993).
14
1.2.1
Métodos de coloração para análise de rotina
Vários métodos de bandeamento são empregados rotineiramente nos
laboratórios de citogenética para identificação dos cromossomos e análise da
estrutura cromossômica. Como a coloração convencional, que permite a
visualização do tamanho e morfologia dos cromossomos; o bandeamento G que
evidencia bandas claras e escuras distribuídas ao longo dos cromossomos,
possibilitando a identificação dos pares de cromossomos homólogos assim como
alterações estruturais que estes possam apresentar; o bandeamento C, que
identifica regiões cromossômicas contendo heterocromatina constitutiva (classe de
DNA altamente repetitivo), normalmente localizada nas áreas pericentroméricas; e
marcação das regiões organizadoras de nucléolo (RONs), que identifica os
cromossomos portadores dos genes codificadores de RNA ribossomal 45 S.
Normalmente
encontrados
nas
regiões
de
constrições
secundárias
dos
cromossomos metafásicos (Borges-Osório & Robinson, 2002).
Em virtude da complexidade e custo da análise dos cromossomos, seu
uso costuma limitar-se a casos com indicações precisas. Além dos fenótipos
mencionados, nos quais, a análise cromossômica é parte essencial da avaliação
clínica, existem também quatro indicações clínicas gerais inespecíficas sugerindo a
necessidade de análise citogenética:
1- Vários problemas do crescimento e desenvolvimento iniciais.
Atraso
do
crescimento
e
desenvolvimento,
fácies
dismórfica,
malformações múltiplas, baixa estatura, genitália ambígua e retardamento mental
são achados freqüentes em crianças com anormalidades cromossômicas, embora
não restritos a esse grupo. A menos que haja um diagnóstico não cromossômico
claro, deve-se realizar a análise cromossômica dos pacientes que apresentam uma
combinação desses problemas (Thompson et al., 1993).
15
2-Parto de natimorto e morte neonatal.
Sabe-se atualmente que a incidência de anormalidades cromossômicas é
bem mais alta entre natimortos do que entre nativivos. Também é elevada em bebês
que morrem no período neonatal. A análise cromossômica deve ser realizada em
todos os natimortos e casos de morte neonatal que possam ter uma base
citogenética, a fim de, identificar uma possível causa ou, então, excluir uma
anormalidade cromossômica como o motivo da perda. Em tais casos a cariotipagem
é essencial a uma informação genética precisa, além de fornecer dados importantes
para o diagnóstico pré-natal em gestações futuras (Thompson et al., 1993).
3-Problemas de fertilidade.
Os estudos dos cromossomos estão indicados para mulheres que se
apresentem com amenorréia e casais com história de infertilidade ou aborto habitual.
Encontra-se uma anormalidade cromossômica (em geral um rearranjo estrutural ou
mosaicismo dos cromossomos sexuais) em um ou outro genitor numa proporção
significativa (3 a 6 %¨) dos casos que apresentaram dois abortos espontâneos
sucessivos ou infertilidade (Thompson et al., 1993).
4-História familiar.
Uma anormalidade cromossômica conhecida ou suspeita em um parente
de primeiro grau é uma indicação de análise cromossômica em certas
circunstâncias. A análise cromossômica em familiares com fenótipo normal é
obviamente desnecessária quando se sabe que o probando tem a síndrome de
Down com trissomia do 21. Por outro lado, se um paciente tiver a síndrome de Down
por translocação, deve-se analisar os cromossomos dos pais e caso se constate que
um genitor é portador de uma translocação, é necessário estender o estudo a outros
familiares e algumas vezes a populações (Thompson et al., 1993).
A incidência dos diferentes tipos de aberrações cromossômicas foi
medida em grandes levantamentos populacionais, sendo identificados como
principais distúrbios numéricos três tipos de trissomias autossômicas (do 21, do 18 e
16
do 13) e quatro tipos de aneuploidias dos cromossomos sexuais: síndrome de
Turner (geralmente 45, X); síndrome de Klinefelter (47, XXY; 47, XYY e 47, XXX). A
triploidia e a tetraploidia responsáveis por pequena porcentagem dos casos,
sobretudo em abortos espontâneos (Thompson et al., 1993). No entanto, algumas
patologias caracterizadas como de origem genética, menos freqüentes, não foram
devidamente estudadas por meio de dados citogenéticos, tendo como conseqüência
um diagnóstico inconclusivo. Assim, os estudos citogenéticos tem se tornado uma
chave para a compreensão de alguns estados patológicos na espécie humana,
sendo importante conhecer a distribuição e freqüência das numerosas alterações
cromossômicas presentes, as quais, tem sido bastante úteis (Borgaonkar et al.,
1978; Schinzel, 1984; Mitelman, 1985).
Estudos citogenéticos realizados em pacientes com quadros clínicos
sugestivos de mutações cromossômicas, tem levado a um crescente conhecimento
e caracterização de doenças genéticas até então desconhecidas, muitas delas
associadas a casos de câncer. Notou-se também nesses estudos que alguns tipos
de tumores apresentam alterações cromossômicas particulares.
Vários estudos têm sugerido que indivíduos com síndrome de Klinefelter
(47,XXY), apresentam um risco aumentado de desenvolver câncer de mama (Coley
et al., 1971; Lynch et al., 1974; Sanchez et al., 1986) e outras malignidades tais
como tumores gonadais (Beker, 1972; Gustavson et al., 1975; Isurugi et al., 1977;
Nagata et al., 1978).
Dhaliwal et al. (1989) estudaram citogeneticamente o sarcoma dos
pulmões e os sintomas clínicos da síndrome de Klinefelter em um homem branco de
20 anos de idade. Este paciente apresentava linhagens celulares múltiplas
demonstrando polissomias de ambos os cromossomos sexuais, observando-se as
seguintes constituições cromossômicas: 49, XXYYY, 48,XXYY, 47,XXY e 46,XY em
sua primeira amostra de sangue. No entanto, na segunda amostra recebida um ano
depois ele mostrou somente 49,XXYYY e 48,XXYY, indicando que as células mais
alteradas do ponto de vista citogenético haviam tornado-se mais numerosas.
Duarte et al. (1990) descreveram um caso raro de mosaicismo
cromossômico 46, XX,r(13)/46,XX, iso psu dic (13) em uma paciente que
apresentava sinais clínicos semelhantes aos observados na síndrome do
cromossomo 13 em anel (Niebuhr, 1977), discutindo uma hipótese de origem
17
comum para as duas linhagens celulares e comparam os achados clínicos e
citogenéticos aos descritos na literatura.
Baseado nos trabalhos descritos acima, verifica-se que as anomalias
fenotípicas geradas por alterações cromossômicas podem ser as mais variadas
como: retardamento mental, microcefalia, dismorfismo, anormalidades ósseas e
outras. Nesse âmbito, a citogenética vem sendo caracterizada como uma subdisciplina dentro da genética que associa variações cromossômicas a características
específicas, inclusive doenças, sendo de grande utilidade na detecção de alterações
cromossômicas numéricas e estruturais, além de desempenhar um importante papel
no aconselhamento genético. Como exemplo mais claro, temos os dados do projeto
genoma, que associados aos citogenéticos estão permitindo identificar os genes
relacionados aos sintomas de síndromes cromossômicas pouco conhecidas (Lewis,
2004).
18
1.3 DOENÇA DE DARIER
A doença de Darier (DD) é definida como uma doença genética
autossômica dominante, cujas manifestações clínicas consistem, sobretudo, na
formação de pápulas firmes, gordurosas e queratósicas na pele, localizadas
predominantemente nas áreas seborreias da região anterior do tórax, costas,
pescoço, couro cabeludo e nas flexuras (virilhas, axilas, região anogenital, entre
outras). Apresenta uma expressividade diferenciada, variando de leve, assinalada
por pápulas queratósicas esparsamente espalhadas ou lesões limitadas a uma ou
duas por área (figura 1), a severa, assinalada por placas verrucosas ou flexuras
grosseiramente hipertróficas (figura 2). A DD tem uma prevalência estimada de 1 em
55.000. A idade de início dos sintomas é tipicamente na secunda década de vida
com pico entre 11 e 15 anos podendo, posteriormente, ocorrer pequena ou nenhuma
regressão (Burge & Wilkinson, 1992; Cooper & Burge, 2003; Munro, 1992; Jacobsen
et al., 1999).
Figura 1. Pápulas queratósicas de DD
localizadas no lado esquerdo do peito inferior.
(Fonte: Goldberg et al., 2001)
Figura 2. Placa verrucosa de DD
localizada no tronco de um homem de
40 anos de idade (Fonte: Puri, 2011)
19
Dentre as outras manifestações clínicas da DD, a coceira tem o maior
número de queixas por parte dos pacientes ocorrendo em cerca de 88% de uma
série de casos. A dor também pode ser um sintoma, mas as pápulas podem ser
assintomáticas. Muitos pacientes reclamam ainda de mau cheiro especialmente em
locais de flexuras, onde infecções secundárias aparecem frequentemente. Calor,
sudorese, luz solar, e estresse podem agravar as lesões. Uma minoria das mulheres
afetadas relatam exacerbação dos sintomas no período pré-menstrual. O
envolvimento de unhas é um sinal, muitas vezes, característico. Implicação oral,
geralmente palatal, pode ser observada variando de um granulado fino para uma
aparência grosseira de 'cascalho' no palato. Menos frequentemente, há o
envolvimento lingual ou bucal (Burge & Wilkinson, 1992; Cooper & Burge, 2003).
Diversos estudos de famílias, gêmeos e adoção relatam casos de
indivíduos
apresentando,
além
das
deformidades
dermatológicas
da
DD,
manifestações neuropsiquiátricas tais como epilepsia, deficiência mental, transtornos
de humor, comportamento suicida e psicose (Burge & Wilkinson, 1992; Jacobsen et
al., 1999).
O diagnóstico de DD é realizado através da análise clínica e da análise
histológica de biópsias das lesões cutâneas. Histologicamente, as características
típicas observadas são de áreas focais de separação entre células epidérmicas
suprabasais
(acantólise),
fissuras
e
disqueratose
suprabasal
incomum
(queratinização anormal) com queratinócitos disceratóticos redondos (corpos
redondos). Análises em microscopia eletrônica revelam perda de anexos
desmossomais, agregações perinucleares de filamentos de queratina e vacuolização
citoplasmática. Tais observações permitem entender que as moléculas que
medeiam a adesão entre os queratinócitos, tais como as caderinas desmossomais e
proteínas de placa, ou proteínas dos filamentos intermediários podem estar
envolvidas na perda de adesão célula-célula na epiderme (Burge & Garrod, 1991).
O tratamento para DD é empírico a parcialmente eficaz em alguns
pacientes. Porém, consiste, sobretudo, em controlar o sintoma mais frequente: a
irritação da pele (Burge, 1999). Todos os pacientes devem ser orientados sobre
emolientes simples e substitutos de sabão e a manter a pele sempre fresca, usando
roupas de algodão confortável. Cremes corticosteroides de uso tópico podem ser
20
úteis em alguns pacientes. Protetor solar é recomendado para aqueles com um
histórico de agravamento ao ter exposição à luz solar (Cooper & Burge, 2003).
O gene causador da DD foi identificado na região cromossômica 12q23q24.1 e tem sido alvo de diversos estudos genéticos que consideram haver uma
associação entre esta região e as manifestações neurológicas co-ocorrentes. Este
gene foi aferido como o gene ATP2A2 afetado por várias mutações específicas
descritas em famílias com histórico de DD. Este gene codifica SERCA2 - um retículo
endoplasmático/sarcoplasmático cálcio ATPásico isorforma 2, o qual desempenha
uma função importante na sinalização intracelular de cálcio (Bashir et al., 1993;
Craddock et al., 1993; Sakuntabhai et al., 1999).
Íons
cálcio
são
conhecidos
por
participarem
na
regulação
da
diferenciação celular e na montagem de desmossomas. Ao que parece, as lesões
ocorrentes na DD são resultado de perda de aderência como consequência de
quebra dos desmossomas, proveniente da perda total ou parcial da função de \
(Cooper & Burge, 2003; Sakuntabhai et al., 1999).
Jacobsen et al. (1999) realizaram um estudo onde confirmou haver uma
associação entre as mutações no gene ATP2A2 (do exon/íntron 1 a 19) e a DD.
Nele, foram identificadas 17 mutações possíveis, distribuídas por todo o gene
ATP2A2 em um número de domínios funcionais considerados fundamentais para o
correto funcionamento da molécula de SERCA2. Tais mutações podem causar um
término precoce da tradução e também um decaimento acelerado de mRNA, que,
por sua vez, leva a uma síntese deficiente de proteínas. Consequentemente, tem-se
interrupções funcionais tais como: anormais transporte e processamento proteico no
retículo endoplasmático ou sinalização cálcio-dependente alterada. É possível ainda
que estas interrupções funcionais, em alguns indivíduos, interajam com fatores
secundários de susceptibilidade relacionados aos fenótipos neuropisiquiátricos
decorrentes. Estes fatores poderiam tratar-se de proteínas neuronal-específicas as
quais possuem polimorfismos funcionais.
Em outro estudo realizado por Jones et al. (2002) em uma família
caucasiana
de
origem
europeia,
a
qual
alguns
indivíduos
apresentavam
conjuntamente DD e transtorno afetivo e outros apenas transtorno afetivo, observouse que a tão somente mutação de Darier não é causa suficiente para a ocorrência
de transtorno afetivo. Assim, apontam-se três hipóteses para a coocorrência de DD
21
e sintomas neuropsiquiátricos: (1) transtorno afetivo é uma reação psicológica
paralela a doença crônica de pele e não relacionada a susceptibilidade biológica; (2)
a mutação de Darier em si aumenta a vulnerabilidade a transtorno afetivo (hipótese
de efeito pleiotrópico); ou (3) há uma ligação genética entre o gene da DD e um ou
mais genes de susceptibilidade à transtorno afetivo individuais, localizados na
mesma região cromossômica. Esta última hipótese está de acordo com Cordeiro et
al. (2000) e Green et al. (2005), os quais reafirmam que, uma vez que ambos
órgãos, pele e cérebro, compartilham a mesma origem embrionária, ectoderma, há a
possibilidade
de
que
a
co-ocorrência
de
DD
e
os
referidos
sintomas
neuropsiquiátricos se deva a uma associação entre o gene ATP2A2 e outros genes
localizados na mesma região cromossômica (12q23-q24).
Moriuchi et al.(2008) apontam, ainda, um caso incomum de uma paciente
de 32 anos de idade, diagnosticada com DD, apresentando lesões cutâneas restritas
as extremidades corpóreas e não nos locais habituais como face e regiões
seborreias do tronco. A mesma não possuía histórico familiar de doenças de pele e
não apresentava qualquer problema neurológico ou psiquiátrico. Este achado indica
que se faz necessária uma análise mais aprofundada dos dados referentes a
mutações no gene ATP2A2 para se elucidar precisamente a correlação
genótipo/fenótipo na DD, a qual ainda não está totalmente compreendida (Cooper &
Burge, 2003).
Diante do exposto e tendo em vista a importância da caracterização
cariotípica em doenças genéticas raras, sejam estas gênicas ou de causa
cromossômica, pois permite a melhor compreensão dos mecanismos genéticos
envolvidos e auxilia no diagnóstico, prognóstico e aconselhamento genético, faz-se
necessária uma análise citogenética desta patologia, uma vez que, até o presente
momento, não há qualquer estudo a nível cromossômico referente a DD presente na
literatura.
22
2 OBJETIVOS
2.1 GERAL
Estudar cariotipicamente indivíduos portadores da doença de Darier,
provenientes de uma família com histórico da doença, residente no município de
Terra Alta/PA/Brasil.
2.2 ESPECÍCOS
Caracterizar citogeneticamente indivíduos portadores da DD, verificando a
ocorrência de manifestações cromossômicas anormais.
Comparar os dados obtidos neste estudo com os já publicados na
literatura, a fim de propor (novas) alterações cromossômicas relacionadas à DD.
Averiguar a coocorrência de DD e os sintomas neuropsiquiátricos
associados em uma família com histórico da doença.
Contribuir para o melhor entendimento da relação Fenótipo/Genótipo da
DD.
23
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 ÁREA DE ESTUDO
O presente estudo teve como alvo dois indivíduos pertencentes a uma
família com histórico de doença de Darier, residente no município de Terra Alta/
Pará/ Brasil. Os mesmos se submeteram a coleta de sangue mediante a assinatura
de um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE). Foi coletado também
sangue de um indivíduo sem histórico de doença de Darier que representou o grupo
controle do estudo.
3.2 LOCAL DE REALIZAÇÃO DO ESTUDO
Os procedimentos de armazenamento das coletas de sangue, técnicas de
bandeamento G, fotografia, montagem e análise dos cariótipos foram realizados no
Instituto Evandro Chagas (IEC), localizado na Rodovia BR-316 km 7 s/n , bairro
Levilândia – Ananindeua. O IEC é um órgão vinculado à Secretaria de Vigilância em
Saúde (SVS) do Ministério da Saúde (MS). Sua área de atuação está relacionada às
investigações e pesquisas nas áreas de Ciências Biológicas, Meio Ambiente e
Medicina Tropical. O instituto tem se notabilizado por inúmeras descobertas, o que o
torna referência mundial como centro de excelência em pesquisas científicas.
24
3.3. OBTENÇÃO DE CROMOSSOMOS METAFÁSICOS
Os cromossomos metafásicos foram obtidos pela técnica de cultura de
linfócitos, com modificações: Nesse procedimento foram coletados de 3-5 mililitros
(mL) de sangue periférico de cada indivíduo em seringa estéril e heparinizada. Em
seguida, este sangue foi transferido para o meio de cultura 199, previamento
acrescido de 0,2 ml de Fitohemaglutinina, onde foi misturado por meio de agitações
suaves. A seguir, as culturas foram incubadas à 37° C em estufa durante 72 horas
(h). Após essa etapa foi procedida a obtenção dos cromossomos, com as etapas de
colchicinização, hipotonização e fixação.
A colchicinização realizou-se 1 hora antes de se completarem as 72 h.
Nesta, acrescentou-se 0,1 mL de solução de colchicina na concentração de
0,0016%. Ao término deste período, o material foi homogeneizado, transferido para
tubo de ensaio e centrifugado a uma velocidade de 1000 rotações por minuto (RPM)
durante 10 minutos. O sobrenadante foi desprezado, e o sedimento ressuspendido
suavemente com 5 mL de solução hipotônica de Cloreto de Potássio (KCl) a 0,56 %
(0,075 M) e mantido em estufa à uma temperatura de 37 0 C durante 10 minutos para
se realizar a hipotonização das células.
Após esses 10 minutos, realizou-se a fixação do material. Para tal,
acrescentou-se 1 mL de fixador Carnoy (3 mL de metanol (MERCK) para 1 mL de
ácido acético glacial (MERCK) - fixador (3:1), sendo a suspensão homogeneizada
com auxílio de pipeta Pasteur. O material foi centrifugado a 1000 rpm por 10
minutos, o sobrenadante desprezado e o sedimento ressuspendido com pipeta
Pasteur em 5 mL de fixador (3:1). Este procedimento foi repetido mais duas vezes,
sendo que na última vez, após desprezar o sobrenadante, foi acrescentada uma
pequena quantidade de fixador (3:1), suficiente para que a suspensão celular
apresentasse uma concentração adequada.
25
3.4 PREPARAÇÃO DE LÂMINAS
As lâminas, devidamente lavadas e mantidas em álcool a 70 %, foram
secas com papel toalha e colocadas sobre um suporte no interior de um banhomaria a 600C, até ficarem umedecidas pelo vapor. A suspensão celular foi gotejada
de três a cinco vezes em cada lâmina e então foram deixadas para secar a
temperatura ambiente. As lâminas foram identificadas, guardadas em caixas
plásticas apropriadas, e mantidas em refrigerador até o procedimento de análise.
3.5 TÉCNICAS DE COLORAÇÕES CONVENCIONAIS
3.5.1 Coloração convencional por giemsa
As lâminas com o material fixado foram colocadas sobre um suporte e
coradas com uma solução de Giemsa (MERCK), diluída em tampão fosfato (10,6794
g de Na2HPO4. 2H2O : 8,1654 g de KH2PO4 para 1 litro de água destilada, pH 6,8)
na proporção de 1:30, por 10 minutos. Em seguida as lâminas foram lavadas com
água destilada e secas a temperatura ambiente.
3.5.2 Bandeamento G, segundo Seabright (1971) com modificações
As lâminas foram colocadas em solução de 2x SSC (Na3C6H6O7 . 2H2O
citrato de sódio 8,82 g + NaCl cloreto de sódio 17,532 g para 1 l de água destilada)
por 1 minuto. Foram lavadas em água destilada e secas. A seguir, foram coradas
com solução de Wright (2,5 g do corante de Wright (SIGMA) diluído em 1000 mL de
metanol MERCK) diluída a uma proporção de 1:3 (1 parte de solução estoque para
26
três partes de tampão, pH 6,8), durante dois minutos e trinta segundos. Então, foram
lavadas e secas a temperatura ambiente.
3.5.3 Marcação de região organizadora de nucléolo, segundo Howell
& Black (1980), com modificações
As lâminas foram colocadas sobre um suporte e sobre elas foram
despejadas duas gotas de solução de gelatina (5 g de gelatina + 25 mL de água
deionizada à 600C + 0,25 mL de ácido fórmico), e quatro gotas de solução de nitrato
de prata (AgNO3), a 50 %. A seguir, este material foi coberto com uma lamínula. As
lâminas foram invertidas e colocadas em uma câmara úmida escura, que, em
seguida, foi levada para a estufa e mantida à 600C por cerca de 5 minutos, estando
este tempo sujeito a variações. Após isto, as lâminas foram lavadas, secas e
coradas por 1 minuto com solução de Giemsa diluída em tampão fosfato pH 6,8 a
uma proporção de 1:100.
27
3.6 ANÁLISE CROMOSSÔMICA
As lâminas processadas com as técnicas descritas acima foram
analisadas em fotomicroscópio Olympus, inicialmente com objetivas de menor
aumento 10 X, 20X, 40X, ocular de 10X, e optovar 1,25, onde as melhores
metáfases foram selecionadas para serem fotomicrografadas com objetiva de 100X,
utilizando um sistema de captura de imagens do tipo Karyotyping em microscópio
Axioskop 40. Para tal, utilizou-se o Sistema de software BandView para
bandeamento G automático, incluindo PC/frame Grabber/VDS-CCD/windows MultiSpecies,
para
uso
com
BandView,
C-mount
de
0.63x
para
adaptação
microscópio/câmera para uso com Softwares BandView/ Fish View/ CGH. O padrão
de montagem dos cariótipos seguiu os já apresentados por Guerra (1988),
Thompson et al. (1993), Motta (2000), Borges-Osório et al. (2002) e Lewis (2004).
28
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os dois indivíduos analisados neste estudo, indivíduo 7 e indivíduo 5,
pertenciam a uma família composta por 7 pessoas, sendo 5 destas diagnosticadas
com DD dentre essas, 2 apresentado sintomas neuropsiquiátricos: uma menina de 2
anos de idade, afetada com DD, filha única de mãe afetada com DD e apresentando
demência e pai não-afetado; avó materna afetada com DD e apresentando
demência; tio e tia maternos afetados com DD e avô materno não-afetado (figura 3).
1
2
I
3
4
5
6
II
7
III
Figura 3. Família afetada pela doença de Darier. Probandos marcados em
preto representam afetados. Tracejado representa ocorrência de demência.
Observando-se a figura 3, que contém o padrão de herança mendeliana
da DD nesta família, pôde-se inferir que a mesma caracteriza-se como autossômica
dominante, pois as manifestações fenotípicas surgem em todas as gerações (I, II e
III) e têm incidência semelhante em ambos os sexos (Thompson et al.,1993; Motta,
2000). Este achado está de acordo com os dados apresentados por Burge &
Wilkinson (1992); Munro (1992); e Jacobsen et al. (1999), que identificaram o
mesmo padrão de herança gênica para a DD.
Porém, um achado contrário ao
destes autores foi o fato de o indivíduo 7 apresentar sintomas da referida doença de
forma precoce, uma vez que o mesmo possuía dois anos de idade e os primeiros
sintomas surgem, geralmente, a partir da segunda década de vida. No entanto, Dal
Magro et al. (2003) relataram um caso de um indivíduo do sexo feminino cujas
29
primeiras manifestações da DD surgiram aos 18 meses de idade, semelhante ao
ocorrido no indivíduo 7 deste estudo, o que permite inferir que esta doença, ainda
que esporadicamente, pode iniciar nos primeiros anos de vida.
Nota-se também que as manifestações neuropsiquiátricas apresentam-se
em dois indivíduos das duas primeiras gerações, ambos portadores da DD. Este
dado consente com a hipótese apresentada por Jones et al. (2002), Cordeiro et al.
(2000) e Green et al. (2005) de que haja uma associação entre o gene responsável
pela DD (ATP2A2) e um ou mais genes de susceptibilidade ao fenótipo
neuropsiquiátrico anormal que leva a ambas ocorrências em alguns indivíduos. Além
disso, vê-se que a hipótese de efeito pleiotrópico do gene ATP2A2 tende a ser
refutada pelo fato de três indivíduos afetados pela DD não apresentarem qualquer
alteração neuropsiquiátrica, reforçando o exposto por Jones et al. (2002) de que a
mutação de Darier, por si só, não é causa suficiente de ocorrência de sintomas
neuropsiquiátricos. Entretanto, não se descartam as possibilidades de que estes
indivíduos desenvolvam sintomas neuropsiquiátricos em momento posterior e/ou
que haja um ou mais genes, com padrão de herança diferenciado, localizados em
outra região cromossômica, os quais assumam papel na regulação da expressão do
gene ATP2A2 no tecido nervoso, uma vez que neste estudo não foi feita nenhuma
análise gênica a nível molecular da DD.
A partir da técnica de cultura de linfócitos dos dois indivíduos analisados,
obtiveram-se cromossomos metafásicos de boa qualidade pelos quais foi possível
realizar coloração convencional, bandeamento G e
marcação de regiões
organizadoras de nucléolo. Por coloração convencional notou-se, no indivíduo 7, a
presença de um cromossomo dicêntrico (cromossomo com dois centrômeros)
formado pela união dos braços curtos de dois cromossomos acrocêntricos do grupo
D (Figura 4). Os cromossomos do grupo D (pares 13, 14 e 15) juntamente com os do
grupo G (pares 21 e 22) são portadores de regiões organizadoras de nucléolo,
localizadas no braço curto. Desse modo, algumas vezes são encontrados
associados por essa região, devido ao estado homogêneo do nucléolo no núcleo
interfásico (Ferguson-Smith & Handmaker's, 1961). No entanto, a frequência com a
qual foram vistos associados neste indivíduo, 80 % das metáfases analisadas em
um total de 141, é atípico, sendo sugestivo de rearranjo cromossômico.
30
A presença de rearranjo foi reforçada através do bandeamento G, no qual
se identificou a associação de cromossomos específicos, um cromossomo do par 13
e um do par 15 (Figura 5). Este achado permite inferir que, já que as associações
pelas RONs ocorrem de forma aleatória entre os cromossomos dos grupos D e G, tal
associação não ocorreria se fosse uma simples associação de RONs, sendo
portanto, qualificada como um rearranjo e não uma simples associação
cromossômica de RONs. Este achado é reforçado ao se comparar com os de um
estudo realizado por Hecht et al. (1968), o qual observou que, de um total de 33
translocações esporádicas dos grupos D e G, 30 envolviam o cromossomo 14 e
apenas 3 destas envolviam o cromossomo 15, e aos achados de Shaw et al. (1969)
e de Donahue & Jacobs (1982), que em seus estudos afirmaram que alguns
indivíduos possam ter padrões particulares de associação cromossômica. Além
disso, pela marcação das RONs, verificou-se que existe uma pequena porção de
DNA entre as marcações (Figuras 6a, 6b e 6c), ratificando que a associação dos
cromossomos não é pelas RONs.
No indivíduo 5 (mãe do indivíduo 7) observou-se por coloração
convencional a presença, novamente, de um cromossomo dicêntrico, em algumas
células, formado pela união de dois acrocêntricos do grupo D (Figura 7), semelhante
ao encontrado em sua filha, o que foi observado em 62% das metáfases analisadas
em um total de 20. Por outro lado, não se observou qualquer manifestação atípica
no cariótipo G bandeado do indivíduo 5, logo, não foi possível identificar quais pares
cromossômicos estiveram associados pela coloração convencional. E assim, tanto o
indivíduo 7 como o indivíduo 5 apresentaram cariótipos com constituições normais
(Figuras 8 e 9, respectivamente). Estes dados sugerem três hipóteses explicativas:
(1) há a possibilidade de mosaicismo cromossômico, no qual parte das células
apresentam cromossomos associados e parte não, indicando a necessidade de
estudos complementares, cujo intuito seja confirmar a presença do mesmo e
identificar sua origem, caso confirmado; (2) as associações cromossômicas
constatadas não tem relação com o fenótipo de Darier, sendo alegóricas de outras
características genéticas dos indivíduos analisados, o que é relevado no estudo de
Shaw et al. (1969), que observou que, em um total de 67 metáfases analisadas,
provenientes de mulheres normais, 36 possuíam cromossomos acrocêntricos
associados; e (3) este comportamento cromossômico está sujeito apenas aos
31
linfócitos (células utilizadas na técnica obtenção de cromossomos metafásicos desta
pesquisa), às condições de cultivo aplicadas e/ou a indivíduos do sexo feminino, que
foram o alvo deste estudo, pois, conforme abordado por Abramova et al. (1993) e
Prokofieva-Belgovskaya et al. (1968), associações envolvendo cromossomos
acrocêntricos ocorrem de maneira não totalmente compreendida, variando conforme
parâmetros de idade, sexo, genótipo, tipo celular, alterações patológicas e condições
de cultivo.
Por outro lado, no indivíduo utilizado como grupo controle observou-se
que 100 % dos cariótipos analisados, em um total de 20 metáfases, não
apresentaram nenhum tipo de associação ou rearranjo cromossômico (figura 10), o
que avigora a presença atípica das associações cromossômicas observadas nos
indivíduos 7 e 5 e reduz a possibilidade de as mesmas serem resultado de falha nos
métodos de obtenção dos cromossomos metafásicos ou análise dos mesmos.
As observações do mesmo padrão cariotípico nos dois indivíduos alvo
deste estudo, um cromossomo dicêntrico, sugerem tratar-se de um comportamento
cromossômico anômalo característico da DD, com possibilidade de transmissão aos
decendentes. Contudo, não há qualquer relato na literatura científica que apresente
tal rearranjo como peculiar nesta enfermidade. Do mesmo modo, Bashir et al.
(1993), Craddock et al. (1993) e Sakuntabhai et al. (1999) identificaram o gene
responsável pela DD presente no cromossomo 12, porém, neste estudo, não se
observaram alterações cromossômicas de nenhuma natureza neste cromossomo, o
que o torna alvo de estudos futuros que visem encontrar relação entre ele e os
cromossomos rearranjados presentes nos indivíduos 7 e 5.
Em suma, faz-se necessária uma ampliação deste projeto, tanto a nível
cariotípico quanto gênico, que se estenda a todos os constituintes da referida
família, a fim de reforçar a presença do rearranjo cromossômico observado,
verificando se o mesmo está, de fato, relacionado a DD, bem como de averiguar
qual(is) mutação(es) ocorrem no gene ATP2A2 destes indivíduos e se as mesmas
tem ligação com possíveis genes de susceptibilidade a fenótipos neuropsiquiátricos,
o que permitirá contribuir para o melhor entendimento desta patologia.
32
Figura 4. Cariótipo com coloração convencional do indivíduo 7, indicando
associação pelo braço curto de dois cromossomos do grupo D.
Figura 5. Cariótipo G-bandeado do indivíduo 7 indicando associação específica dos
cromossomos dos pares 13 e 15.
33
Figura 6. Regiões organizadoras de nucléolos em cromossomos do indivíduo 7
indicando associação de cromossomos do grupo D pela região satélite dos braços
curtos e não pela região organizadora de nucléolo.
Figura 7. Cariótipo em coloração convencional do indivíduo 5, indicando associação
pela região terminal do braço curto de dois cromossomos acrocêntricos do grupo D.
34
Figura 8. Cariótipo G-bandeado normal do indivíduo 7.
Figura 9. Cariótipo G-bandeado normal do indivíduo 5.
35
Figura 10. Cariótipo normal em coloração convencional do indivíduo do grupo
controle.
36
5 CONCLUSÃO
A DD apresenta-se como um instigante desafio para a genética médica,
uma vez que, até o presente momento, carece de uma elucidação precisa de todos
os fatores genéticos responsáveis por suas variadas manifestações clínicas.
Os resultados deste estudo sugerem que a coocorrência de sintomas
neuropsiquiátricos e dos sintomas dermatológicos típicos da DD, tal qual descrito na
literatura, se deva a uma associação genética, ainda não totalmente compreendida,
entre o gene de Darier (ATP2A2) e outros genes de susceptibilidade ao fenótipo
neuropsiquiátrico.
O estudo cromossômico de indivíduos portadores da DD pode ampliar a
compreensão desta enfermidade, visto que os achados deste trabalho indicam
fortemente a presença de rearranjo cromossômico peculiar a esta doença –
cromossomo dicêntrico - ainda não apresentado na literatura científica.
Faz-se necessária uma pesquisa ampla que busque descrever todas
características genéticas da família analisada neste estudo, para fornecer
informações relevantes ao estudo da DD.
37
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