Rev. 04 – Out/2013
BRK200-02
BRK200-05
RT – kit para síntese de cDNA
Instruções de Uso
USO PRETENDIDO
O produto «RT – kit plus » consiste em reagentes de transcrição reversa para
a síntese de cDNA de RNA extraído de amostras celulares e não celulares.
O produto é utilizado na síntese de cDNA para detecção e quantificação de
RNA vírus humanos e para a detecção e quantificação de RNA mensageiro humano.
O cDNA sintetizado com este produto pode ser usado para testes diagnósticos
baseados em reações de amplificação de ácidos nucleicos com enzimas DNA
polimerases (como as DNA polimerases termoestáveis).
METODOLOGIA
O produto consiste de uma reação enzimática pela transcriptase reversa com
um termociclador programável. A reação usa primers randômicos e o RNA
dependente de uma DNA polimerase dependente de RNA do Moloney murine
leukaemia virus (MMLV). A reação gera cDNA de todas as diferentes moléculas de
RNA presentes nas amostras de RNA extraído. O inibidor RNAse STOP impede a
degradação do RNA extraído no caso de contaminação por RNases.
DESCRIÇÃO DO KIT
O kit fornece os seguintes reagentes:
• RT-MIX, mistura de reação para transcrição reversa, em 50 tubos
monorreagente prontos para uso. Cada tubo contém 10 µL da mistura.
• MMLV-RT, enzima transcriptase reversa, em um tubo com 70 µL.
• RNase STOP, inibidor de RNases, em um tubo com 35 µL.
• Água Ultrapura, água para biologia molecular, aliquotada em 2 tubos com
1900 µL cada.
O kit possibilita a execução de 50 reações de transcrição reversa, incluindo
controles positivo e negativo.
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MATERIAIS FORNECIDOS
Componente
Descrição
Quantidade
RT-MIX
Mistura para
transcrição reversa
em tubos de 0,2 ou
0,5mL
50 x 10 µL
MMLV-RT
200U/ µL –
14000U
Enzima
transcriptase
reversa em tubo
com tampa azul
1 x 70 µL
RNase STOP
40U/ µL –
1400U
Inibidor de RNase
em tubo com
tampa amarela
1 x 35 µL
Água
Água para Biologia
Ultrapura
Molecular
• Armazenar a -20°C ou inferior.
2 x 1900 µL
Composição
Oligonucleotídeos
hexâmeros, TRIS base,
TRIS cloridrato, Cloreto de
Potássio, Cloreto de
Magnésio, Trifosfatos
deoxyribonucleotídeos,
Dithiothreitol, Triton X100, Albumina de soro
bovino acetilado
MMLV-RTenzyme,TRIS
base, TRIS cloridrato,
Cloreto de Sódio,
Dithiothreitol, Glicerina,
EDTA de Sódio, NP-40
Inibidor RNase STOP, TRIS
base, TRIS Cloridrato,
Cloreto de Potássio,
Dithiothreitol, EDTA de
Sódio, Glycerina
_
MATERIAIS NECESSÁRIOS E NÃO FORNECIDOS
- Fluxo laminar.
- Luvas descartáveis sem talco.
- Agitador vórtex.
- Microcentrífuga de bancada (12.000 – 14.000 RPM).
- Micropipetas estéreis e ponteiras com filtro ou deslocamento positivo (0,5-10 µl, 220 µl, 5-50 µl, 50-200 µl, 200-1000 µl).
- Água bidestilada estéril.
- Real Time ABI PRISM 7000, completo com computador.
ACESSÓRIOS
Os reagentes para a extração de RNA das amostras a serem analisadas, para o
controle positivo de extração, para amplificação do cDNA e para a detecção do DNA
amplificado não estão inclusos neste kit. Para realizar estes passos analíticos, os
produtos a seguir são recomendados:
• «EXTRAgen» (EXTG01), kit para extração de ácidos nucleicos de amostras não
celulares; total de 50 extrações.
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Rev. 04 – Out/2013
•
•
«EXTRAzol» (EXTR01), kit para extração de RNA de amostras celulares; total
de 50 extrações.
«CPE-RNA – Controle Interno» (CTRRNA/2), controle positivo de extração
para RNA genômico de amostras não celulares, total de 50 extrações.
ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES
Este produto é exclusivamente para uso in vitro.
Advertências e precauções gerais
Manusear e descartar todas as amostras biológicas como potencialmente
infecciosas. Evitar o contato direto com amostras biológicas. Evitar respingos. Os
materiais que entram em contato com amostras biológicas devem ser tratados com
hipoclorito de sódio 3% por, no mínimo, 30 minutos, ou autoclavados a 121°C por
uma hora antes de serem descartados.
Manusear e descartar todos os reagentes e materiais como potencialmente
infecciosos. Evitar contato direto com reagentes. Evitar respingos. Os resíduos devem
ser tratados e descartados de acordo com normas de segurança. Resíduos líquidos
contendo ácidos ou bases devem ser neutralizados antes do descarte.
Usar jaleco, luvas e óculos de proteção.
Nunca pipetar soluções com a boca.
Não comer, beber, fumar ou aplicar cosméticos dentro da área de trabalho.
Lavar as mãos cuidadosamente após manusear amostras e reagentes.
Descartar as sobras de reagentes e resíduos de acordo com as normas de
segurança.
Ler as instruções de uso antes de utilizar o produto. Seguir as instruções.
Não usar produtos após o prazo de validade estabelecido.
Somente usar os reagentes fornecidos no kit e aqueles recomendados pelo
fabricante.
Não misturar reagentes de diferentes lotes.
Não utilizar reagentes de outros fabricantes.
Advertências e precauções de biologia molecular
Os procedimentos de biologia molecular, como a extração, a transcrição
reversa, a amplificação e a detecção de ácidos nucleicos, requerem pessoal
especializado para prevenir o risco de resultados incorretos, em particular devido à
degradação dos ácidos nucleicos das amostras ou devido à contaminação das
amostras por produtos de amplificação.
É necessário dispor de uma área separada para a extração/preparação das
reações de amplificação e para a amplificação/detecção dos produtos de
amplificação (áreas de pré e pós-PCR). Nunca introduzir um produto de amplificação
na área de extração/preparação das reações de amplificação.
É necessário uso de EPI adequado a cada uma das áreas de trabalho em
laboratório de biologia molecular. Nunca transferir materiais da área de
amplificação/detecção para a área de extração/preparação de reações.
As amostras devem ser empregadas exclusivamente a este tipo de análise. As
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Rev. 04 – Out/2013
amostras devem ser manipuladas em uma câmara de fluxo laminar. Os tubos que
contêm amostras diferentes nunca devem ser abertos ao mesmo tempo. As pipetas
utilizadas para manipular as amostras devem ser destinadas exclusivamente a este
uso. As pipetas devem ser do tipo deslocamento positivo, ou usar ponteiras com
barreira / filtro. As ponteiras utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de DNAse
e RNAse, sem a presença de DNA e RNA.
Os reagentes devem ser manipulados em câmara de fluxo laminar. Os
reagentes necessários para a amplificação devem ser preparados de modo a ser
utilizados em uma única vez. As pipetas utilizadas para manipular os reagentes
devem ser destinadas exclusivamente a este propósito. As pipetas devem ser do tipo
de deslocamento positivo, ou usar ponteiras com barreira / filtro. As ponteiras
utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de DNAse e RNAse, sem a presença de
DNA e RNA.
Os produtos de amplificação devem ser manipulados de modo a limitar ao
máximo a dispersão no ambiente para evitar a possibilidade de contaminações. As
pipetas utilizadas para manipular os produtos de amplificação devem ser destinadas
exclusivamente para sua área de trabalho.
Advertências e precauções para componentes específicos
O produto RT-MIX, deve ser descongelado e usado apenas uma vez.
•
•
•
RT-MIX, apresenta a seguinte advertência (S):
S 23-25 Não inalar vapores. Evitar contato com os olhos.
MMLV-RT, apresenta a seguinte advertência (S):
S 23-25 Não inalar vapores. Evitar contato com os olhos.
RNase STOP, apresenta a seguinte advertência (S):
S 23-25 Não inalar vapores. Evitar contato com os olhos.
AMOSTRAS E CONTROLES
Amostras
O produto deve ser utilizado com RNA extraído de amostras biológicas
celulares e não celulares.
O volume de RNA extraído a ser adicionado na reação de transcrição reversa
deve ser de 10 µL. Quando usar volumes menores de amostra, ajustar o volume da
amostra para 10 µL com água ultrapura.
A quantidade de RNA extraído a ser adicionada na reação de transcrição
reversa não deve exceder 1ug a fim de prevenir o aparecimento de produtos não
específicos e possível efeito de inibição na próxima reação de amplificação de ácidos
nucleicos.
Recomenda-se a criação de vários frascos das amostras a serem armazenadas
congeladas, a fim de evitar repetidos ciclos de congelamento e descongelamento.
Quando usar amostras congeladas, descongela-las somente antes da extração, a fim
de prevenir uma possível degradação de ácidos nucleicos.
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Rev. 04 – Out/2013
Substâncias interferentes
O RNA extraído de amostras não deve conter heparina, hemoglobina, dextrana
ou Ficoll, a fim de evitar problemas de inibição e a possibilidade de resultados
inválidos.
Não existem dados disponíveis a respeito da inibição causada por drogas
antivirais, antibióticos, quimioterápicos e imunossupressores.
Controles de transcrição reversa
É absolutamente necessário validar cada sessão de transcrição reversa com
controles de reação positivos e negativos.
Para o controle negativo utilizar água bidestilada estéril (não incluída no kit)
para acrescentar à reação no lugar do RNA extraído da amostra ou o controle
negativo de extração.
Para o controle positivo utilizar um RNA extraído de uma amostra positiva já
testada.
PROCEDIMENTO
Procedimento da seção de Transcriptase reversa. (Deve ser realizada na área
amplificação / detecção de produtos de amplificação).
Antes de iniciar a seção, considerando-se o instrumento, é necessário possuir:
- Certificar-se de que o termociclador é compatível com o formato
<<monotest>> e de que é adequado para microtubos de 0,2 e 0,5 mL:
- Realizar a montagem dos parâmetros da ciclagem da transcriptase reversa no
termociclador como mostrado na tabela abaixo:
Ciclos da transcriptase reversa
Etapas
Temperatura
Tempo
Anelamento do primer
25°C
10 minutos
Transcrição reversa
37°C
45 minutos
Passo de desnaturação
95°C
5 minutos
Procedimento de transcriptase reversa
(deve ser preparada na área de extração / e preparação de reação de amplificação).
Antes de iniciar a sessão, é necessário:
- descongelar as amostras contendo o alvo a ser analisado. Agitar gentilmente,
dar spin por 5 segundos e manter em gelo.
- descongelar os microtubos da RT – MIX <<monotest>> em número suficiente
para as amostras da sessão. Agiotar gentilmente e dar SPIN por 5 segundos,
marcar cada microtubo usando uma caneta permanente e manter em gelo.
- Pegar o microtubo contendo a enzima Transcriptase reversa MMLV – RT 200u /
µL (tampa azul) e o tubo contendo RNAse stop 40 u / µL (tampa amarela). Dar
SPIN nos tubos por 5 segundos e manter em gelo.
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Rev. 04 – Out/2013
OBSERVAÇÃO: A enzima Transcriptase Reversa MMLV – RT e a RNAse STOP são
extremamente sensíveis à temperatura. Para prevenir a reatividade destes
reagentes, é recomendado mantê-los fora do freezer pelo tempo necessário para
realizar a montagem da reação.
-
diluir a enzima Transcriptase reversa (40u / µL) e a enzima RNAse STOP (4u /
µL) com água ultrapura, conforme descrito na tabela abaixo. Preparar
quantidade suficiente da reação para todas as amostras incluindo controles (1
amostra a mais). As enzimas diluídas não podem ser estocadas.
OBSERVAÇÃO: As enzimas Transcriptase reversa e RNAse stop diluídas são muito
sensíveis à temperatura. Para prevenir a redução da atividade enzimática,
recomenda-se mantê-las fora do gelo apenas pelo tempo necessário para a
dispensação nos microtubos.
RNAse STOP
Número de
MMLV – RT
Água
(tampa
Volume total
reações
(tampa azul)
ultrapura
amarela)
4
4 µL
2,0 µL
14,0 µL
20 µL
5
5 µL
2,5 µL
17,5 µL
25 µL
6
6 µL
3 µL
21 µL
30 µL
7
7 µL
3,5 µL
24,5 µL
35 µL
8
8 µL
4 µL
28 µL
40 µL
9
9 µL
4,5 µL
31,5 µL
45 µL
10
10 µL
5 µL
35 µL
50 µL
11
11 µL
5,5 µL
38,5 µL
55 µL
12
12 µL
6 µL
42 µL
60 µL
13
13 µL
6,5 µL
45,5 µL
65 µL
14
14 µL
7 µL
49 µL
70 µL
15
15 µL
7,5 µL
52,5 µL
75 µL
16
16 µL
8 µL
56 µL
80 µL
17
17 µL
8,5 µL
59,5 µL
85 µL
18
18 µL
9 µL
63 µL
90 µL
19
19 µL
9,5 µL
66,5 µL
95 µL
20
20 µL
10 µL
70 µL
100 µL
21
2 µL
10,5 µL
73,5 µL
105 µL
1. Para cada teste <<monotest>> adicionar 5 µL das enzimas MMLV e RNAse
STOP diluídas (total de 200U de Transcriptase reversa MMLV e 20U RNAse
STOP) pipetando com precisão dentro da mistura.
2. Para cada teste <<monotest>> adicionar 10 µL de RNA pipetando com
cuidado o volume de 10 µL 3 vezes dentro da mistura. Proceder da mesma
forma com os controles negativo e positivo.
3. Transferir os microtubos testes <<monotest>> para o termociclador e iniciar
a ciclagem da Transcriptase reversa.
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Rev. 04 – Out/2013
Produtos que podem ser usados depois
da Transcriptase Reversa
<< Amplificação por NESTED>>
<<Amplificação REAL TIME>>
<<Amplificação DUPLEX REAL TIME>>
<<MONOREAGENT DUPLEX REAL TIME
Como usar os produtos da reação
Usar diretamente o produto de reação
Dilui r o produto da reação em 40 µL
de água ultrapura, para termos 65 µL
de volume final
OBSERVAÇÃO: Os produtos da reação podem ser estocados a -20°C por no máximo 1
mês.
OBSERVAÇÃO: Os produtos da reação podem contaminar subsequentes testes de
diagnóstico. Fechar ou descartar adequadamente as reações residuais e descartar o
lixo subsequente. Usar este produto somente com RNA extraído de amostras
biológicas celulares e não celulares.
Não usar RNA extraído de amostras heparinizadas com este produto: heparina
inibe a amplificação de ácidos nucleicos e pode causar resultados inválidos.
Não usar RNA extraído que esteja contaminado com hemoglobina, dextrana ou
Ficoll, com este produto: estas substâncias inibem a amplificação de ácidos nucleicos
e podem causar resultados inválidos.
Não existem dados avaliando a inibição causada por antivirais, antibióticos,
quimioterápicos e drogas imunossupressoras.
Os resultados obtidos dependem de adequados processos de coleta,
estocagem e transporte, além do processamento correto das amostras. Para impedir
resultados incorretos, é necessário tomar cuidado durante estes passos e seguir as
instruções de uso dos produtos de extração de ácidos nucleicos.
Este produto deve ser manuseado por pessoal treinado no manuseio de
amostras biológicas potencialmente infecciosas e de preparações químicas
classificadas com perigosas, para prevenir acidentes sérios com consequências para o
usuário e outras pessoas.
Este produto requer o uso roupas de trabalho e áreas específicas para
processar amostras biológicas potencialmente infectadas e preparações químicas
classificadas como perigosas evitando-se acidentes com sérias consequências para o
usuário e outras pessoas.
Este produto deve ser manuseado por pessoal treinado em técnicas de Biologia
molecular, assim como extração, transcrição reversa, amplificação e detecção de ácidos
nucleicos, para evitar resultados incorretos nos passos subsequentes evitando serias
consequências para o paciente.
É necessário possuir áreas separadas para extração / preparação das reações
de amplificação e para amplificação / detecção dos produtos da amplificação para
evitar resultados falso positivos nos passos de análise dos ácidos nucleicos evitando
sérias consequências para o paciente.
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Rev. 04 – Out/2013
Este produto requer o uso de roupas especiais e instrumentos para
extração/preparação das reações de amplificação e para amplificação/ detecção de
produtos de amplificação para impedir a liberação de resultados falsos positivos
durante a análise, impossibilitando consequências sérias para o paciente.
CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO
Eficiência da transcriptase reversa: teste com RNA do fago MS2
A eficiência da reação da transcriptase reversa permite de obter uma razão
de quantidade de cDNA igual a 50% do RNA extraído adicionada a reação.
A eficiência da reação de Transcriptase reversa foi testada usando-se como
referência RNA genômico do fago MS2, a concentração inicial foi mensurada usandose um espectrofotômetro. O RNA do fago foi diluído com títulos de 100 a 10 copias a
cada 10 µL em RNA de leveduras á um título de 1 µg a cada 10 µL. cada diluição foi
testada 10 vezes para se testar a Transcriptase reversa, adicionando-se 5 µL de cDNA
à reação de PCR Real time usando-se produtos acessórios da Nanogen Advanced
Diagnostics S.P.A. Os resultados concordam com suposição da razão da eficiência da
Transcriptase reversa sendo igual a 50%. O resultado final esta resumido na tabela a
seguir:
Cópias do RNA do fago
Cópias de cDNA do fago
MS2 adicionados à
MS2 na reação de PCR
Resultados
reação de transcriptase
real time Esperado (50%
Positivo / cópias
reversa
de eficiência)
100
10
10/10
10
1
5/10
As amostras de cDNA sintetizadas de 10 cópias de RNA do fago MS2 na reação
de Transcriptase reversa apresentaram um título menor que o limite de detecção da
reação de PCR real time. Neste caso resultados randômicos podem ser apresentados.
A eficiência da reação de transcriptase reversa foi testada usando-se como
material genômico o RNA do fago MS2, com titulação inicial mensurada em
espectrofotômetro. A quantidade de 20 000 cópias do RNA do fago MS2 foi
adicionado em 6 amostras de 300 µL de plasma coletados em EDTA. Cada amostra foi
usada para contaminar a extração. Tanto para a transcriptase reversa, quanto para a
amplificação em tempo real, foram usados produtos e acessórios da Nanogen
Advanced Diagnostics S.P.A. O teste foi repetido com 3 diferentes lotes de
Transcriptase reversa. Os resultados concordam com suposição da razão da eficiência
de reação da Transcriptase reversa sendo igual a 50%. Os resultados finais estão
resumidos na tabela seguinte:
Cópias do RNA do fago
Cópias do cDNA do fago
Razão da quantidade de
MS2 esperados na
MS2 na reação real time
cDNA do fago MS2
reação de Transcriptase
(50% de eficiência
mensurado na
reversa
esperada)
amplificação real time
10667
1067
1237
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Rev. 04 – Out/2013
Eficiência da transcriptase reversa: teste com RNA total positivo para
Cromossomo Philadelphia p210
A Eficiência da transcriptase reversa foi testada usando como referência um
RNA total proveniente da translocação t(9:22) p210 positivo (célula K562) diluído 1:
10000 em RNA normal. A amostra foi usada 6 vezes para alcançar uma análise total.
Tanto para a transcriptase reversa quanto para a e a amplificação real time foram
usados produtos e acessórios da Nanogen Advanced Diagnostics S.P.A. O resultado
final esta resumido na tabela abaixo:
Razão da
Razão da
Positivo /
% de p210 /
Amostra
amplificação
amplificação
cópias
ABL
de p210
de ABL
1:10 000
(RNA)
6/6
38
142834
0,027%
p210 positivo
Todas as duplicações foram detectadas corretamente. O resultado
quantitativo esta expresso como uma quantificação absoluta do cDNA de p210 e cDNA
do gene ABL, mas também em porcentagem. Estes resultados mostram uma alta
eficiência dos produtos da transcriptase reversa.
Eficiência da transcriptase reversa: teste com material de referência certificado
A reação de Transcriptase reversa foi testada usando-se um material de
referência certificado com diluições de um painel de Enterovírus (Coxackievírus A9)
com 3 diferentes títulos (Qnostics EV Mini panel, Qnostics Ltd, Scotland, UK). Cada
amostra do painel foi reconstituída para se obter um titulo de 1,5 vezes menor que o
esperado para se determinar o limite de detecção do produto. Cada amostra foi
usada em 3 cópias para se alcançar uma análise total. A extração e amplificação Real
Time foram realizadas com produtos e acessórios da Nanogen Advanced Diagnostics
S.P.A.
Os resultados são reportados na tabela a seguir:
Razão de
Amostra
Título viral
cT esperado
Positivas/ cópias
cT´s
ENT06D
Alta
28 -30
3/3
30
ENT06C
Média
33 – 36
3/3
33
ENT06B
Baixa
38 - 45
3/3
39
Todas as amostras foram detectadas corretamente.
Os resultados
quantitativos estão expressos em Cycle Threshold (cT) e estão dentro de uma razão
definida pela Qnostics, sem a padronização de 1,5 vezes da diluição das amostras. Os
resultados mostram uma alta eficiência dos produtos da Transcriptase reversa.
OBSERVAÇÃO: Os dados e resultados completos desta avaliação de desempenho da
Transcriptase reversa estão reportados na seção 7 dos arquivos técnicos do produto
“RT - kit plus”, FTB BRK 200.
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Rev. 04 – Out/2013
SOLUÇÃO DE PROBLEMAS
Falso Positivo
Causas Possíveis
Erro na dispensação do RNA
extraído.
Contaminação dos reagentes
preparados para a sessão.
Contaminação da H2O ultrapura
usada nas diluições.
Contaminação da enzima
estoque.
Contaminação da área de
extração / preparação de
reações.
Falso Negativo
Causas Possíveis
Enzimas muito diluídas ou erros
de dispensação
Redução da reatividade da
enzima
Erro de dispensação do RNA
extraído.
Degradação dos ácidos
nucleicos extraídos
Superdiluição do extraído
Erro na ciclagem do
termociclador
Erro na dispensação das
enzimas da reação de
Transcriptase reversa
Soluções
Abrir um tubo de cada vez, evitar o
derramamento dos conteúdos dos tubos,
sempre trocar as ponteiras.
Tomar muito cuidado quando diluir e pipetar as
enzimas, sempre trocar as ponteiras.
Usar uma nova alíquota da H2O ultrapura.
Usar uma nova alíquota de enzimas.
Limpar as superfícies e instrumentos usando
detergentes aquosos, lavando as coberturas e
trocando as ponteiras e tubos usados.
Soluções
Checar os cálculos de diluições. Tome muito
cuidado quando dispensar as enzimas na Mix.
Manter os tubos contendo as enzimas em gelo.
Usar uma nova alíquota de enzimas.
Tomar muito cuidado quando adicionar o RNA
extraído.
Usar plásticos livres de DNAse e RNAse. Mudar a
alíquota usada e de Etanol absoluto, reagentes
de lavagem e H2O ultrapura.
Extrair uma nova alíquota da amostra e diluir o
depósito de ácidos nucleicos em H2O ultrapura
Checar a ciclagem do termociclador
Com cuidado, remover e dispense a reação de
transcriptase reversa no tubo de reação.
Produtos não específicos na reação de amplificação de cDNA
Causas Possíveis
Soluções
Calcular a concentração do RNA
Excesso de RNA extraído na reação
extraído. Não exceder a concentração de
1pg de RNA na Transcriptase reversa
Não exceder a quantidade de produtos
Excesso de cDNA ou reagentes da
na reação de transcriptase reversa,
Transcriptase reversa
transferido para o tubo de reação
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Rev. 04 – Out/2013
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
GARSON J. A. et al. (1990) Lancet 336: 878 - 879
IDENTIFICAÇÃO DO DISTRIBUIDOR
Biometrix Diagnóstica Ltda.
Estrada da Graciosa, 1081 - Curitiba – PR - CEP: 82840-360
Tel: (41) 2108-5250
Fax: (41) 2108-5252
DDG: 0800-7260504
E-mail: [email protected]
Website: www.biometrix.com.br
CNPJ: 06.145.976/0001-39
INFORMAÇÕES DO FABRICANTE
Nanogen Advanced Diagnostics S.P.A.
C.so Torino, 89/d - 10090 Buttigliera Alta (TO) - Itália
REGISTRO ANVISA
Isento
RESPONSÁVEL TÉCNICA
Edna Cristina Kurokawa Guimarães Ferreira
CRQ/PR: 09302336
Aprovação:
20/12/2013
X
Maurício Cichon
Laboratório
Assinado por: Maurício Cichon
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