Fig. 29. Leptodactylus andreae. Distribuição corporal das glândulas granulosas: pele
total.
a) Vista da pele dorsal removida por inteiro. As glândulas granulosas concentram-se em duas
faixas longitudinais não-contínuas, desde a região pós-orbital da cabeça até a base dos
membros posteriores (seta). Na face dorsal da cabeça, as glândulas de veneno se limitam às
pálpebras e flancos dos tímpanos. Barra: 320 µm.
b) Vista da pele dorsal das coxas. Na face posterior, as coxas possuem acúmulos glandulares
circulares dispostos lado a lado, compondo uma faixa que se estende desde a cloaca até os
joelhos. Barra: 320 µm.
c) Detalhe das faixas glandulares dorsais, mostrando que as glândulas granulosas podem ser
distinguidas individualmente devido à sua baixa densidade. Barra: 80 µm.
d) Vista da pele ventral removida por inteiro. Na cabeça, uma faixa de glândulas de baixa
densidade margeia o lábio inferior e outra ocupa a região gular (seta preta). Há dois
agregados peitorais em forma de gota (seta vermelha) e um inguinal em forma de V, próximo
à base das coxas. Barra: 320 µm.
85
Fig. 30. Leptodactylus andreae. Distribuição corporal das glândulas cutâneas: dorso.
D – derme; E – epiderme; g – glândulas granulosas; m – glândulas mucosas.
a) Pele dorsal da cabeça. Notam-se glândulas granulosas e mucosas, essas com lúmen amplo.
Hematoxilina-eosina. Barra: 50 µm.
b) Pele dorsal. Nessa região, as glândulas granulosas não foram detectadas pela histologia, à
exceção de algumas na região das listas amarelas dorsais. As mucosas ocorrem em
quantidade. Azul de toluidina-fucsina. Barra: 50 µm.
c) Pele dorsal das coxas. Na face posterior das coxas, há concentração de glândulas
granulosas, compondo uma faixa de acúmulo. Menos freqüentes, as glândulas mucosas
ocupam posições mais superficiais na derme. Azul de toluidina-fucsina. Barra: 50 µm.
86
Fig. 31. Leptodactylus andreae. Distribuição corporal das glândulas cutâneas: ventre.
D – derme; E – epiderme; g – glândulas granulosas; m – glândulas mucosas.
a) Pele da margem do lábio inferior. Embora essa região apresente algum acúmulo de
glândulas granulosas, sua detecção histológica mostrou-se difícil. As glândulas mucosas, que
ocorrem em grande quantidade, possuem maior diâmetro do que no restante da superfície
corporal. Azul de toluidina-fucsina. Barra: 50 µm.
b) Pele da região ventral. A pele dessa região é rica em glândulas de muco, mas não foram
detectadas glândulas de veneno. Azul de toluidina-fucsina. Barra: 50 µm.
c) Pele ventral na região inguinal. Poucas glândulas granulosas foram encontradas nessa
região através da histologia. As glândulas mucosas, por outro lado, ocorrem em abundância.
Azul de toluidina-fucsina. Barra: 50 µm.
87
Fig. 32. Bioquímica das secreções cutâneas.
a) Análise por eletroforese (SDS-PAGE). A notável diversidade de proteínas nas secreções
cutâneas de Leptodactylus lineatus é indicada pelo grande número de bandas com diferentes
pesos moleculares nas duas amostras consideradas (L1, L2). Por outro lado, as secreções de
Ameerega picta possuem apenas uma fraca banca nas três amostras consideradas (A1, A2,
A3), indicando presença apenas pontual de proteínas. R é o padrão de pesos moleculares.
b) L. lineatus, análise de cromatografia por RP-HPLC. O grande pico na fração não-retida
(estrela) sugere grande quantidade de proteínas nas secreções dessa espécie. A presença de
picos entre os 12 e os 30 min aponta para a presença de peptídeos ou de compostos orgânicos
aromáticos.
c) A. picta, análise de cromatografia por RP-HPLC. A fração não-retida (estrela) é discreta no
cromatograma das secreções de A. picta. A presença de picos entre os 12 e os 30 min aponta
para a presença de peptídeos ou de compostos orgânicos aromáticos.
88
7. R EF ER ÊN C IAS B IB LIOGR ÁF IC AS
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94
8. A N E XOS
Encontra-se abaixo relacionada a composição dos corantes e soluções utilizados na seção
Material e Métodos:
Solução de Paraformaldeído Tamponado a 4% em tampão PBS 0,1M, pH 7,2
Paraformaldeído..................................................................................... 20 g
Água Destilada…………………………………………………………450 mL
Dissolver o paraformaldeído na água destilada, sob aquecimento, com agitador magnético.
Após dissolver completamente, acrescentar gotas de NaOH 1N até a solução ficar
transparente. Acrescentar o tampão PBS.
Tampão PBS: NaCl.................................................................................4,5 g
Tampão fosfato 0,1M pH7,2…….……………………...………..........50 mL
Preparo da solução de tampão fosfato 0,1M pH 7,2:
Solução estoque A:
Fosfato de sódio monobásico 0,2M.......................3,12 g
Água destilada.....................................................100 mL
Solução estoque B:
Fosfato de sódio dibásico 0,2M.............................2,83 g
Água destilada.....................................................100 mL
Misturar 14 mL de solução A com 36 mL de solução B e completar com água destilada para
100 mL.
1. Solução Karnovsky em tampão cacodilato de sódio 0,1M - pH 7,2
Solução A -
Glutaraldeído 10% em cacodilato de sódio 0,2 M pH 7,2:
Glutaraldeído 50% ..................................................10 ml
Cacodilato de sódio 0,2M pH 7,2 ............................ 40 ml
Solução B -
Paraformaldeído 8%:
Paraformaldeído ..........................................................4 g
Água destilada .........................................................50 ml
Acrescentar 2-4 gotas de NaOH para clarear. Misturar a solução A com a solução B a 1:1.
2. Solução A (pré-inclusão em historresina)
Peróxido de benzoíla....................................................................... 0,15 g
Hidroxietil metacrilato..................................................................... 15 ml
95
Dissolver o peróxido de benzoíla (1%) em hidroxietil metacrilato, agitando por 10-15
minutos.
3. Solução B (inclusão em historresina)
Solução A........................................................................................ 5 ml
Polimerizador.............................................................................. 0,33 ml
Misturar em agitador magnético por 4 minutos.
4. Albumina de Mayer
Clara de ovo "batida em neve"....................................................... 50 ml
Glicerina..........................................................................................50 ml
Misturar bem e filtrar em papel de filtro. Adicionar cristais de timol como conservante.
5. Azul de Toluidina 0,1%
Azul de Toluidina............................................................................ 0,1 g
Borato de sódio.....................................................................................1g
Água destilada.............................................................................. 100 ml
6. Fucsina Básica 0,05%
Fucsina básica.............................................................................. 0,05 g
Água destilada............................................................................. 100 ml
7. Hematoxilina de Harris
Hematoxilina...................................................................................... 1 g
Alúmen de potássio...........................................................................20 g
Dióxido de mercúrio........................................................................ 0,5 g
Água destilada............................................................................... 200 ml
Dissolver a hematoxilina em aproximadamente 10 ml de álcool absoluto e, separadamente,
dissolver o alúmen em água quente destilada. Após, misturar as duas soluções e ferver até
ebulição. Adicionar o dióxido de mercúrio.
8. Eosina Y (Gill)
Eosina Y......................................................................................... 0,5 g
Etanol 96%................................................................................... 100 ml
Ácido acético glacial.................................................................... 3 gotas
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Dissolver a eosina no álcool e acrescentar o ácido acético.
9. Azul de Bromofenol
Bicloreto de mercúrio....................................................................................10 g
Azul de Bromofenol .................................................................................100 mg
Etanol 95% ...................................................................................……….100 ml
10. Solução tampão PBS pH 7,2
Solução stock
NaCl...................................................................................................................26,4g
Na2HPO4.12H2O………………………………………………………...….....7,95g
NaH2PO4.H2O…………………………………………………………………0,93g
Dissolver em 1 litro de água destilada. Essa solução está 3 vezes concentrada. Diluir na hora
do uso.
11. Alcian Blue pH2,5
Alcian Blue.........................................................................................1 g
Ácido Acético 3%......................................................................... 100 ml
12. Reativo de Schiff
Fucsina básica.................................................................................. 1 g
Água destilada............................................................................. 400 ml
Metabissulfito de potássio................................................................. 9 g
HCl.................................................................................................10 ml
Levar ao bico de Bunsen a fucsina com a água destilada. Retirar antes de ferver e filtrar.
Levar ao agitador magnético e colocar aos poucos o metabissulfito. Em seguida, com
agitador magnético adicionar o HCl puro. Adicionar 1 colher de café de carvão ativado.
Ativar por 3-5 minutos e filtrar novamente.
13. Água sulforosa
HCl 1N............................................................................................10 ml
Metabissulfito de sódio 10%........................................................... 10 ml
Água destilada............................................................................. 180 ml
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14. Safranina 0,5%
Água destilada............................................................................. 50 ml
Álcool absoluto............................................................................ 50 ml
Safranina........................................................................................... 1g
Misturar e adicionar em 100 ml de água destilada, 0,5 ml da solução acima.
15. Tetróxido de ósmio 1% em tampão cacodilato 0,1M pH 7,2
OsO4 4%
Água destilada
Tampão cacodilato 0,2 M
Primeiramente misturar o tetróxido de ósmio e a água destilada em uma proporção de 1:1.
Misturar o volume desta solução de ósmio a um volume igual de tampão cacodilato 0,2 M.
16. Acetato de uranila 0,5% + Sacarose a 13,3%
Água destilada............................................................................. 100 ml
Acetato de uranila........................................................................... 0,5 g
Sacarose.........................................................................................13,3 g
17. Resina Epon
Polybed 812........................................................................………. 21 ml
DDSA...............................................................................……........13 ml
NMA................................................................................................ 11 ml
DMP-30......................................................................................... 0,7 ml
Misturar com agitador magnético os três primeiros componentes e por último adicionar o
catalisador (DMP-30).
18. Citrato de chumbo
Nitrato de chumbo......................................................................... 1,33 g
Citrato de sódio............................................................................. 1,76 g
Água destilada fervida (fria)........................................................... 30 ml
Misturar em balão volumétrico de 50 ml, agitando vigorosamente por 5 minutos. Continuar
agitando de vez em quando por mais 30 minutos, até a solução tornar-se leitosa. Acrescentar
8 ml de NaOH 1 N (4%), recentemente preparada com água destilada fervida. Completar o
volume até 50 ml com água destilada fervida.
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