Desenvolvimento de uma metodologia de
Bioinformática para a busca de riboswitches
de tiamina pirofosfato no genoma humano
NAN Jorge¹, CG Ferreira² , A Machado-Lima³ , F Passetti¹
¹Laboratório de Bioinformática e Biologia Computacional, Coordenação de Pesquisa Clínica e Incorporação Tecnológica, Instituto Nacional de Câncer (INCA)
²Coordenação de Pesquisa Clínica e Incorporação Tecnológica, Instituto Nacional de Câncer (INCA)
³Escola de Artes, Ciência e Humanidades (EACH), Universidade de São Paulo (USP Leste)
Apoio Financeiro: INCA/MS, CNPq-PIBIC, Swiss Bridge Foundation and Fundação do Câncer
INTRODUÇÃO
Riboswitches são estruturas encontradas nas regiões 5' e 3' UTR de alguns mRNAs de bactérias, fungos
e plantas. Essas estruturas são formadas pelo aptâmero e plataforma de expressão, a ligação de um
metabólito específico ao primeiro leva a mudanças estruturais que controlam a expressão do mRNA
através do término prematuro da transcrição, inibição da tradução (Fig.1) ou alteração no splicing, sem
participação protéica. Os genes regulados estão envolvidos na biossíntese ou transporte do metabólito
alvo. O único riboswitch descrito em eucariotos liga-se a tiamina pirofosfato (TPP). A seqüência e
estrutura secundária do aptâmero são bem conservadas em uma família de riboswitch¹, permitindo o
uso de métodos de Bioinformática para sua identificação.
Fig. 6. Porcentagem de seqüências classificadas de acordo com o e-value obtido com o Infernal nos conjuntos controles.
4. Genoma
4.1 HMMER
34 seqüências com e-value menor que 1x10-4
15 seqüências com score maior que zero
10 seqüências com genes anotados
08 seqüências em íntrons de regiões codificantes
01 em região de splicing alternativo
01 seqüência em UTR
01 seqüência em éxon
4.2 Infernal
05 seqüências com e-value menor que 1x10-4
Todos com score maior que 19,30
02 seqüências com genes anotados
Todos em íntrons de regiões codificantes
Fig. 1. Riboswitch hipotético: A)controle da transcrição. B) controle da tradução. (Figura adaptada de 2).
OBJETIVO
Avaliar a eficiência de softwares de cálculos probabilísticos a fim de desenvolver uma metodologia de
bioinformática para a busca de riboswitches de TPP no genoma humano.
METODOLOGIA
Foram criados dois conjuntos controles: “positivo” e “negativo”. O primeiro com seqüências de
aptâmeros obtidas no site Rfam³ (“Rfam”) e artigos publicados (“Conhecidos”). O segundo contém
seqüências que não são riboswitches criadas através do embaralhamento trinta vezes de cada
seqüência do conjunto “positivo” (“Embaralhado Rfam” e Embaralhado Conhecidos”) e outras famílias
de RNA com estrutura secundária similar ao riboswitch de TPP (SL2, Glicina e Qrr). Foram avaliados três
softwares: RNAshapes4, HMMER5 e Infernal6. Os softwares que apresentaram bons resultados com os
conjuntos controles foram usados contra o UniGene7 (versão 207). As regiões candidatas obtidas foram
comparadas com os contigs apresentados por Nakaya et al (2007).
Fig.7. Regiões candidatas do genoma humano. A região do aptâmero é representada pelo retângulo rosa apontado pela seta de mesma
cor. A) Região candidata do gene CHD8. B) Região candidata do gene HAPLN1. C) Região candidata do pseudogene TCRBV20S1A1N2.
4.3. Comparação com Nakaya et al (2007)
Fig. 2. Porcentagem de seqüências classificadas de acordo com as probabilidades obtidas com RNAshapes nos conjuntos controles.
Fig. 8. Região candidata em comum com Nakaya et al (2007). A região candidata a riboswitch é representada pelo retângulo rosa e o
contig indicado por Nakaya et al (2007) é indicado pelo retângulo vermelho.
DISCUSSÃO E CONCLUSÃO
Fig. 3. Porcentagem de seqüências classificadas de acordo com os scores obtidos com o HMMER nos conjuntos controles
Outros artigos relataram grande gasto computacional9 com o uso do RNAshapes, os resultados
contraditórios nos conjuntos controles demonstraram que o software não é adequado para a busca no
genoma humano. O HMMER apresentou resultados distintos para os conjuntos “negativo” e “positivo”,
apesar de não considerar a estrutura secundária adotada pelo mRNA. Todas as seqüências do conjunto
“positivo” avaliadas pelo Infernal apresentaram scores acima do valor de classificação do Rfam e
nenhuma seqüência do conjunto “negativo” teve scores acima deste valor. Os softwares HMMER e
Infernal provaram serem práticos e precisos para a busca de riboswitches durantes os testes
realizados neste estudo, sendo assim adequados para a busca no genoma humano. A busca por
riboswitch no genoma humano revelou candidatos com scores e e-values piores que os obtidos pelo
conjunto controle “positivo” e diferentes dos valores obtidos com o conjunto controle “negativo”. A
região candidata encontrada na região intronica transcrita (TIN) do genoma humano sugere um
possível papel dos riboswitches no controle da expressão de ncRNAs. As regiões candidatas estão,
atualmente, sendo validadas pelo Dr. Fabricio F. Costa no Children's Memorial Research Center em
Chicago, USA.
Fig. 4. Porcentagem de seqüências classificada de acordo com o e-value obtido com o HMMER nos conjuntos controles.
BIBLIOGRAFIA
Fig. 5. Porcentagem de seqüências classificadas de acordo com o score obtido com o Infernal nos conjuntos controles.
1.GARST, A. D. & BATEY, R. T., A switch in time: Detailing the life of a riboswitch. Biochim. Biophys. Acta, p1-8, 2009.
2.KIM, J.N. & BREAKER, R.R., Purine sensing by riboswitches. Biology of the cell, v.100, p.1-11, 2008.
3.GARDNER, P. P., et. al., Rfam: updates to the RNA families database., Nucleic Acids Res., 2009.
4.STEFFEN P. et al. RNAshapes: an integrated RNA analysis package based on abstract shapes. Bioinformatics, v.22, p.500-503, 2005.
5.EDDY, S. R., A probabilistic model of local sequence alignment that simplifies statistical significance estimation, PloS Comput Biol, 2008.
6.NAWROCKI, E. P., et. al., Infernal 1.0: inference of RNA alignments., Bioinformatics, 2009.
7. PONTIUS, J. U., WAGNER, L., SCHLUER, D. UniGene: A Unified view of the transcriptome. In: The NCBI Handbook. Bethesda (MD): National
Center for Biotechnology Information, 2003.
8. NAKAYA, H. I., et al. Genome mapping and expression analyses of human intronic nonconding RNAs reveal tissue-specific patterns and
enrichment in genes related to regulation of transcription. Genome Biol., v.8, n.3, p.R43.1-R43.25, 2007.
9.MACHADO LIMA, A., DEL PORTILLO, H. A., DURHAM, A. M. Computational methods in noncoding RNA search. J. Math. Biol., v.56, n.1-2,
p.15-49, 2007.
Projeto Gráfico: Serviço de Edição e Informação Técnico-Científica / CEDC / INCA
RESULTADOS