UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
TÂNIA REGINA DE OLIVEIRA ROS A
OBTENÇÃO DE DERIVADOS ANFIFÍLICOS DA OCARBOXIMETILQUITOSANA E APLICAÇÃO NO AUMENTO DA
SOLUBILIDADE DE FÁRMACO POUCO SOLÚVEL
Itajaí-2008
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
TÂNIA REGINA DE OLIVEIRA ROSA
OBTENÇÃO DE DERIVADOS ANFIFÍLICOS DA OCARBOXIMETILQUITOSANA E APLICAÇÃO NO AUMENTO DA
SOLUBILIDADE DE FÁRMACO POUCO SOLÚVEL
Dissertação submetida à Universidade do
Vale do Itajaí como parte dos requisitos
para a obtenção do grau de Mestre em
Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Dr. Clóvis Antonio Rodrigues
Itajaí, Junho de 2008
OBTENÇÃO DE DERIVADOS ANFIFÍLICOS DA OCARBOXIMETILQUITOSANA E APLICAÇÃO NO AUMENTO DA
SOLUBILIDADE DE FÁRMACO POUCO SOLÚVEL
TÂNIA REGINA DE OLIVEIRA ROSA
Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em
Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias
Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências
Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.
____________________________________
Clóvis Antonio Rodrigues, Doutor
Orientador
_____________________________________________
Tânia Mari Bellé Bresolin, Doutora
Coordenadora do Programa Mestrado em Ciências Farmacêuticas
Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:
______________________________________
Doutor Clóvis Antonio Rodrigues (Univali) – Presidente
______________________________________
Doutora Ruth Meri Lucinda da Silva (Univali) – Membro Interno
______________________________________
Doutor Clodoaldo Machado (Furb) – Membro Externo
Itajaí (SC), junho de 2008
AGRADECIMENTOS
À DEUS que é fonte de Luz, inspiração, sabedoria, amor e proteção em todos os
momentos da minha vida, por ter me guiado por este longo caminho.
Ao meu orientador Professor Dr. Clóvis Antonio Rodrigues pela confiança,
disposição e paciência. Você sempre será um exemplo de profissional para mim. É
realmente uma honra tê-lo como meu orientador. E tenho certeza que você
representa o pai científico de muitos.
Ao meu marido Rafael, pelo incentivo, carinho, paciência e apoio durante essa longa
etapa. Você foi o porto seguro que nos momentos das grandes tormentas eu pude
contar. Você realmente é o grande amor da minha vida.
Aos meus filhos Caroline e Fabiano pela compreensão, amizade, apoio e
companheirismo nos momentos difíceis. Tenho um orgulho enorme de vocês.
Aos meus pais queridos que sempre me ensinaram que acreditar é necessário e
definitivo para a nossa felicidade, e que ética e bondade nunca sairão de moda.
A minha irmã Juliana, que além de irmã tornou-se uma grande amiga nas difíceis
etapas desta conquista.
A minha grande família que fizeram o difícil papel de ouvir, apoiar, incentivar.
As amigas Francieli, Nadir, Silvana, Taline, Fernanda e Maria Cláudia que estiveram
ao meu lado durante a realização deste trabalho, dando-me força e coragem para
finalizá-lo.
A amiga de bancada e de congressos Aline, uma jovem genial.
Aos colegas do Laboratório de Instrumentação Analítica pelo carinho, amizade,
especialmente o funcionário Pedro, que realmente é brilhante.
Aos colegas do LAPAM, especialmente Roberta e Eliziane pelo apoio, paciência e
amizade.
Ao departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Paraná, pelo apoio na
realização dos testes de tensão superficial.
Aos membros da banca interna Profa. Dra. Ruth Meri Lucinda da Silva e Profa. Dra.
Tânia Mari Bellé Bresolin, pelo indispensável apoio e total disponibilidade no sentido
de sempre colaborar.
Ao professor Dr. Roberto Dalla Vecchia, exemplo de dedicação, pelo grande apoio e
colaboração em várias fases deste trabalho.
Ao professor Dr. Rilton Alves de Freitas, modelo de determinação e pelo brilhantismo
de suas conclusões que foram muito úteis neste trabalho.
Aos professores e doutores do Programa de Mestrado: Niero, Angélica, Ângela,
Marina, César, que provaram ser muito mais que professores.
As amigas Rosélia e Vânia do PMCF pelo grande apoio e total disponibilidade.
Ao Leopoldo, meu cão, pelo seu silêncio companheiro e olhar acolhedor nas horas
de conflito.
A todos os animais, de qualquer reino ou espécie, tamanho ou idade, que
infelizmente são torturados em pesquisas sem sentido. Deixo aqui minha profunda
compaixão e a sincera indignação pelo descaso como são tratados pela Ciência.
Em todos os lugares por onde passei na elaboração do meu trabalho, várias
pessoas colaboraram prontamente. Portanto, quero expressar minha gratidão a
todos que de uma forma ou de outra contribuíram para o cumprimento de meu
objetivo.
!
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OBTENÇÃO DE DERIVADOS ANFIFÍLICOS DA OCARBOXIMETILQUITOSANA E APLICAÇÃO NO AUMENTO DA
SOLUBILIDADE DE FÁRMACO POUCO SOLÚVEL
TÂNIA REGINA DE OLIVEIRA ROSA
Junho /2008
Orientador: Clóvis Antonio Rodrigues, Dr.
Área de Concentração: Produtos Naturais e Substâncias Bioativas.
Número de Páginas: 124.
Atualmente, os polímeros estão entre os excipientes mais utilizados em
diversos sistemas terapêuticos devido a suas aplicações e biocompatibilidade. A
quitosana (poli- -(1-4)D-glucosamina) é um derivado hidrolisado da quitina, de fácil
obtenção, com muitas aplicações industriais na área de biomateriais, alimentos,
cosméticos e medicamentos. Neste estudo, a O-carboximetilquitosana (O-CMQS) foi
hidrofobicamente modificada com benzaldeído, formando um derivado anfifílico de
quitosana: O-carboximetilquitosana-N-benzeno (O-CMQSB). Os derivados anfifílicos
sintetizados foram utilizados para aumentar a solubilidade do fármaco modelo, a
triancinolona (TC). A estrutura dos derivados foi examinada por espectroscopia no
Ultravioleta, Infravermelho e Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio. O grau
de substituição da O-CMQS foi determinado por métodos de condutimetria e
potenciometria e a viscosidade intrínseca foi avaliada. Foi examinada a solubilidade
em água dos derivados sintetizados, verificando-se, ainda, sua citotoxidade in vitro.
Testes para determinar a incorporação e a liberação da triancinolona foram
realizados. A tensão de superfície da O-CMQS e O-CMQSB foi medida em
concentrações diversas com um tensiômetro. O grau de carboximetilação ficou
dentro do que é relatado pela literatura. A reação de formação de base de Shiff foi
utilizada para preparar os derivados, sendo que o grau de substituição dos derivados
variou entre 8 e 110 % dependendo da quantidade de benzaldeído utilizada. Os
valores da viscosidade intrínseca da O-CMCS e dos derivados benzilados
diminuíram com o aumento da concentração de NaCl, indicando que os polímeros
obtidos se comportam como polieletrólitos. Todos os derivados obtidos são solúveis
em quase toda a faixa de pH. A O-CMQS e os derivados anfifílicos apresentaram
características tensoativas e baixa toxicidade que permitem o seu emprego na
dissolução de fármacos. Os derivados anfifílicos O-CMQSB G, O-CMQSB F
aumentaram a solubilidade da TC em 5,5 e 3,5 vezes, respectivamente, quando
comparados com a solubilidade em água. Provavelmente, o fármaco interage com a
parte hidrofóbica do polímero quando o derivado anfifílico está disperso em água,
uma vez que não foi observada forte interação entre o polímero e a TC.
Palavras-chave:
Quitosana;
O-carboximetilquitosana;
Triancinolona; Anfifílico; Fármaco pouco solúvel.
Tensão
Superficial;
OBTAINING AMPHIPHILIC DERIVATIVES FROM
O-CARBOXYMETHYLCHITOSAN AND THEIR APPLICATION FOR INCREASING
SOLUBILITY OF A LOW SOLUBILITY DRUG
TÂNIA REGINA DE OLIVEIRA ROSA
June 2008
Supervisor: Clóvis Antonio Rodrigues, Dr.
Area of Concentration: National Products and Bioactive Substances.
Number of Pages: 124.
Nowadays, polymers are among the most commonly used excipients in
various therapeutic systems, due to their applications and biocompatibility. Chitosan
(poly-B-(1-4)D-glucosamine) is a hydrolyzed derivative of chitin, which is easily
obtained and has many industrial applications in the fields of biomaterials, foods,
cosmetics and drugs. In this study, O-carboxymethylchitosan (O-CMQS) was
hydrophobically modified by benzaldehyde, to form an amphiphilic chitosan
derivative: O-carboxymethylchitosan-N-benzene (O-CMQSB) The synthetized
amphiphilic derivatives were used to increase solubility of the model drug,
triamcinolone. The structure of the derivatives was examined by Ultraviolet, Infrared
and 1H NMR spectroscopy. The substitution degree of O-CMQS was evaluated by
conductimetry and potentiometry, and the intrinsic viscosity of the derivative was
evaluated. The water solubility and the citotoxicity in vitro of the derivatives were
tested and evaluated. Tests were carried out to determine the loading and release of
the triamcinolone. The surface tension of the O-CMQS and O-CMQSB was
measured in various concentrations, with a tensionmeter. The degree of
carboximetylation was as described in literature. The reaction of formation of the
Schiff base was used to prepare the derivatives, and the degree of substitution of
those derivatives varied between 8 and 110% depending on the amount of
benzaldehyde used. The values of the intrinsic viscosity of O-CMCS and Nbenzylated derivatives decreased with the increase of NaCl concentration, indicating
that the polymers behave like polyeletrolytes. Every derivative synthesized showed
good solubility in almost all the pH range. O-CMQS and the amphiphilic derivatives
showed tensoactive characteristics and low toxicity, which enables it to be used as a
dissolution drug. The amphiphilic derivatives O-CMQSB G, O-CMQSB F can
increase the solubilization of TC by 5.5 and 3.5 times, when compared with solubility
in water. The drug seems to be dissolved in the hydrophobic part of the polymer
when the amphiphilic derivative is dissolved in water, since no strong interaction
between the polymer and the TC was observed.
Key words: Chitosan; O-carboximethylchitosan; Surface Tension; Triamcinolone;
Amphiphilic ; Low solubility drug.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Representação da estrutura química da quitina............................... 26
Figura 2
Representação da estrutura química da quitosana.......................... 27
Figura 3
Esquema representativo da obtenção da QTS através da reação
da desacetilação da QTN para QTS usando solvente NaOH 50%
m/m, na temperatura de 110 °C, por 4 horas................................... 28
Figura 4
Esquema representando os vários derivados da quitosana.
Adaptado de Peter (1995)................................................................. 31
Figura 5
Estrutura química da N-Carboximetilquitosana................................. 32
Figura 6
Estrutura química da O-Carboximetilquitosana................................ 34
Figura 7
Calibração da Gota Pendente........................................................... 46
Figura 8
Estrutura química da Triancinolona.................................................. 48
Figura 9
Representação da estrutura química do Sudan III........................... 59
Figura 10
Representação esquemática da reação de síntese de O-CMQS.... 62
Figura 11
Representação esquemática da reação de obtenção da OCMQSB N Benzilada......................................................................... 63
Figura 12
Curva de Titulação Condutimétrica da O-CMQS Lote 01 e Lote
02...................................................................................................... 65
Figura 13
Curva de Titulação Potenciométrica da O-CMQS Lote 01 e Lote
02 na forma acidificada (pH em torno de 2,0)................................... 66
Figura 14
Curva de Titulação potenciométrica da O-CMQS Lote 01, Lote 02
na forma ácida.................................................................................. 68
Figura 15
Curva de Titulação potenciométrica da O-CMQS Lote 01 e Lote 02
na forma salina.................................................................................. 68
Figura 16
Curva de Titulação potenciométrica da O-CMQSB A, B, C, D, E, F
e G na forma acidificada pH 2,0 (HCl 0,1 mol/L).............................. 69
Figura 17
Curva de Titulação potenciométrica da O-CMQS benzilados A, B,
C, D, E, F e G na forma salina.......................................................... 69
Figura 18
Curva de Titulação potenciométrica da O-CMQSB benzilados A,
B, C, D, E, F, G na forma ácida com pH em torno de 4,0 (HCl 0,1
mol/L)................................................................................................ 70
Figura 19
Perfil das absorbâncias obtidas dos derivados sintetizados
benzilados e não benzilados, em água............................................. 71
Figura 20
Espectro de Infravermelho da O-CMQS Lote 01 e 02 na forma
salina, em temperatura ambiente..................................................... 73
Figura 21
Espectro de Infravermelho da O-CMQS Lote 01 e 02 em pH ácido,
em temperatura ambiente................................................................. 73
Figura 22
Espectro de Infravermelho da O-CMQSB na forma salina, em
temperatura ambiente....................................................................... 74
Figura 23
Espectro de Infravermelho da O-CMQSB na forma ácida, em
temperatura ambiente....................................................................... 75
Figura 24
Espectro de RMN 1H da O-CMQS Lote 2 em D2O, em temperatura
ambiente........................................................................................... 76
Figura 25
Espectro de RMN 1H da O-CMQSB E em D2O, em temperatura
ambiente........................................................................................... 77
Figura 26
Determinação gráfica da viscosidade intrínseca, para os derivados
O-CMQS Lote 01 e Lote 02 em NaCl nas concentrações de 0,1
mol/L e 0,5 mol/L, 25 °C (+/-1 °C)..................................................... 81
Figura 27
Determinação gráfica da viscosidade intrínseca para os derivados
benzilados na concentração de NaCl 0,1 mol/ a 25 °C (+/-1 °C) .... 84
Figura 28
Determinação gráfica da viscosidade intrínseca para os derivados
benzilados na concentração de NaCl 0,5 mol/ a 25 °C (+/-1 °C) .... 85
Figura 29
Valores médios da tensão superficial em relação a variação da
concentração dos derivados, utilizando-se água como solvente, a
25 C (+/- 1 °C).................................................................................. 86
Figura 30
Espectro na região do UV/visível da dispersão polimérica antes
(preto) e após contato com a solução de Sudan III (em
clorofórmio), tempo de agitação 24 hs.............................................. 89
Figura 31
Valores obtidos na determinação da hidrofobicidade por Sudan III,
leitura em 540 nm, a 25 °C (+/-1 °C)................................................. 90
Figura 32
Citotoxicidade das amostras Lote 1, derivados benzilados A, E, G,
D e C em concentração de 1000 µg/mL, pelo método MTT............. 92
Figura 33
Esquema representativo do método utilizando o corante MTT........ 92
Figura 34
Citotoxicidade das amostras Lote 1, derivados benzilados A, E, G,
D e C em concentração de 1000 µg/mL, pelo método vermelho
neutro................................................................................................ 93
Figura 35
Curva analítica da Triancinolona em metanol, leitura em 242 nm...
95
Figura 36
Perfil da solubilidade em relação à concentração de TC e dos
polímeros O-CMQS Lote 02, O-CMQSB F e G em meio básico,
leitura em 242 nm, volume de 5 mL................................................. 96
Figura 37
Perfil da solubilidade em relação à concentração de TC e dos
polímeros O-CMQS Lote 02, O-CMQSB F e G em meio ácido,
leitura em 242 nm, volume de 5 mL................................................. 97
Figura 38
Perfil de difusão da TC, pela membrana de diálise, nas diferentes
formulações, TC pura, com O-CMQS e com O-CMQSB F em PBS
(pH 7,4 solução 0,01 mol/L) em temperatura ambiente.................... 99
Figura 39
Perfil de difusão da TC, pela membrana de diálise, nas diferentes
formulações, TC pura, com O-CMQS e com O-CMQSB F em PBS
(pH 7,4 solução 0,01 mol/L) em temperatura ambiente.................... 99
Figura 40
Perfil de difusão da TC, pela membrana de diálise, nas diferentes
formulações, TC pura, com O-CMQS e com O-CMQSB F em PBS
(pH 7,4 solução 0,01 mol/L) em temperatura ambiente................... 101
Figura 41
Perfil de difusão da TC, pela membrana de diálise, nas diferentes
formulações, TC pura, com O-CMQS e O-CMQSB F em PBS (pH
7,4 solução 0,01 mol/L), leitura em 242 nm, em temperatura
ambiente........................................................................................... 102
Figura 42
Perfil de absorção no UV/visível do derivado O-CMQSB F e TC
em diferentes valores de pH em dispersão em água...................... 104
Figura 43
Tensão superficial dos derivados O-CMQSB F e O-CMQSB G
puros e com a TC incorporada em diferentes concentrações......... 105
Figura 44
Esquema simplificado das prováveis interações entre a TC e o
derivado O-CMQSB.......................................................................... 106
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Derivados benzilados obtidos a partir dos Lote 1 e 2 e relações
molares de benzaldeído utilizadas...................................................... 52
Tabela 2
Rendimentos dos derivados O-CMQS Lote 01 e 02........................... 62
Tabela 3
Rendimentos dos derivados O-CMQSB benzilados sintetizados....... 64
Tabela 4
Grau de carboximetilação dos derivados Lote 01 e 02 sintetizados.... 65
Tabela 5
Percentual de grupos amino protonáveis dos lotes sintetizados......... 67
Tabela 6
Grau de substituição no grupo NH2 dos derivados anfifílicos,
calculados a partir dos espectros de RMN 1H..................................... 78
Tabela 7
Solubilidade da O-CMQS e O-CMQSB em água com variação de
pH em temperatura ambiente.............................................................. 80
Tabela 8
Valores dos testes das viscosidades intrínsecas das dispersões nas
concentrações de 0,1 mol/L e 0,5 mol/L a 25 °C (+/-1 °C).................
Tabela 9
83
Difusão da TC através da membrana de diálise, parâmetros de
liberação e coeficientes de difusão..................................................... 101
Tabela 10 Parâmetros de Cinética de Liberação de TC segundo o Modelo de
Higuchi................................................................................................. 102
LISTA DE ABREVIATURAS
AMD – Análise Mecânica e Dinâmica
BSA – Albumina Soro bovino
CIM – concentração inibitória mínima
CMP49C8 – Carboximetilpullulan
CMQTS-g-PEA – Carboximetilquitosana com grupos Fosfadiletanolamina
DMEM – Meio Modificado Dulbeccos Eagles
DMSO – Dimetil Sulfóxido
FITC – Isotiocianato de Fluoresceína
GA – Glutaraldeído
GC – Grau de Carboximetilação
GS – Grau de Substituição
IV-TF – Infravermelho com transformada de Furrie
Kh – Constante de Huggins
MCF 7 – Células de câncer de seio humano
MEV – Microscopia Eletrônica de Varredura
MET – Microscopia Eletrônica de Tunelamento
mPEG – Polietileno Glicol Monometil Éter
MTT – 3-[4,5-Dimetil Tiazol-2-yl]-2,5-Difeniltetrazolium Brometo
Mw – Massa Molecular Viscosimétrica Média
N-CMQTS – N-carboximetilquitosana
O-CMQTS – O-carboximetilquitosana
O-CMQTSB - O-carboximetilquitosana N-benzilado
PBS – Tampão Salina Fosfato
PEA – Fosfadiletanolamina
PET – Polietileno tereftalato
PET-O-CMQTS – Polietileno tereftalato O-carboximetilquitosana
PHBV – Poli 3-hidroxibutírico ácido-co-3hidroxivalérico
PVC – Cloreto de Polivinila
QCMC – Carboximetilquitosana quaternária
QTN – Quitina
QTS – Quitosana
QTN-Fe – Quitosana Ferro
RMN 13C – Ressonância Magnética Nuclear de Carbono
RMN 1H – Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
SPH-IPNs – Poli (ácido acrílico-co-acrilamida)/O-carboximetil
quitosana interpenetrando redes de polímero.
TA – Triancinolona Acetato
TB – Triancinolona Benetonida
TC – Triancinolona
TCA – Triancinolona Acetonida
TD – Triancinolona Diacetato
THA – Triancinolona Hexacetonida
17
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ..............................................................................................................19
2 OBJETIVOS..................................................................................................................21
2.1 Objetivo Geral......................................................................................................21
2.2 Objetivos Específicos. ........................................................................................21
3 REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................................22
3.1 Polímeros Naturais..............................................................................................22
3.2 Quitina e Quitosana ............................................................................................25
3.3 Quitosana e seus Derivados ..............................................................................30
3.4 O-Carboximetilquitosana....................................................................................34
3.5 Aplicações dos derivados Hidrofóbicos da Quitosana....................................37
3.6 Polímeros e Tensão Superficial...........................................................................41
3.6.1 Fenômenos Interfaciais e Superficiais.................................................................41
3.6.2 Tensão Superficial...............................................................................................42
3.6.3 Tensoativos.........................................................................................................43
3.6.4 Medidas da Tensão Superficial...........................................................................45
3.6.5 Método da Gota Pendente..................................................................................46
3.7 Fármacos pouco solúveis - Triancinolona........................................................46
4 MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................50
4.1 Material.................................................................................................................50
4.1.1 Reagentes e Materiais......................................................................................50
4.1.2 Equipamentos...................................................................................................50
4.2 Métodos................................................................................................................51
4.2.1 Síntese da O-Carboximetilquitosana ..............................................................51
4.2.2 Síntese dos Derivados Benzilados .................................................................52
4.3 Caracterização dos Polímeros.............................................................................53
4.3.1 Titulação Condutivimétrica da O-CMQS ............................................................53
4.3.2 Titulação Potenciometria da O-CMQS e derivados benzilados...........................54
4.3.3 Espectroscopia no Ultravioleta.............................................................................54
4.3.4 Espectroscopia no Infravermelho.........................................................................55
4.3.5 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear..........................................55
18
4.4 Viscosidade Intrínseca............. ....................................................................56
4.5 Solubilidade dos Derivados..........................................................................57
4.6 Determinação da Tensão Superficial...........................................................58
4.7 Determinação de Hidrofobicidade por Sudan III.........................................58
4.8 Citotoxidade das matrizes......................... ..................................................59
4.9 Solubilidade do Fármaco Triancinolona.....................................................60
4.10 Liberação do Fármaco Triancinolona in vitro .........................................61
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................62
5.1 Síntese e Caracterização dos Derivados Sintetizados..............................62
5.1.1 Síntese da O-CMQS e O-CMQSB...............................................................62
5.1.2 Titulação Condutivimétrica...........................................................................64
5.1.3 Titulação Potenciométrica............................................................................66
5.1.4 Espectroscopia no Ultravioleta dos derivados sintetizados.........................70
5.1.5 Espectroscopia no Infravermelho (FT-IR)....................................................72
5.1.6 Espectroscopia de RMN 1H..........................................................................76
5.1.6.1 Determinação do grau médio de substituição...........................................77
5.1.7 Solubilidade dos derivados sintetizados......................................................79
5.2 Viscosidade Intrínseca.................................................................................80
5.3 Determinação da Tensão Superficial dos Derivados Sintetizados..........85
5.4 Determinação da Hidrofobicidade dos Derivados Sintetizados...............88
5.5 Determinação da Citotoxicidade..................................................................90
5.6 Solubilidade do Fármaco Triancinolona.....................................................94
5.7 Perfil da Dissolução do Fármaco Triancinolona in vitro ..........................98
6 CONCLUSÕES.....................................................................................................106
REFERÊNCIAS........................................................................................................110
ANEXO A Fotos do Aparelho Tensiômetro. (UFPr).............................................123
ANEXO B Foto ilustrativa da metodologia do corante Sudan IIII......................124
19
1 INTRODUÇÃO
O desenvolvimento de medicamentos mais eficazes, bem como, a descoberta
de alvos específicos e os estudos de biodisponibilidade têm contribuído na
atualidade para o avanço do arsenal terapêutico (RIOS, 2005).
Os fármacos são raramente administrados na forma de substâncias químicas
puras, sendo mais freqüente a sua administração na forma de formulações ou
medicamentos. Estes últimos podem variar desde soluções relativamente simples
até sistemas de liberação complexos, dependendo do uso apropriado de adjuvantes
de formulações ou excipientes (AULTON, 1988).
Cada fármaco em particular é uma substância específica que apresenta
características químicas e físicas que devem ser consideradas antes do
desenvolvimento
da
formulação
farmacêutica.
Entre
elas
encontram-se
a
solubilidade, o coeficiente de partição, a velocidade de dissolução, a forma física e a
estabilidade (ALLEN JÚNIOR; POPOVICH; ANSEL, 2007).
Nas últimas décadas, a aplicação dos conhecimentos da Ciência dos
Polímeros, em particular da Química e Engenharia, às Ciências Farmacêuticas
resultou em novos polímeros quer em termos de design para um fim específico, quer
em termos de novos sistemas contribuindo para o aumento da eficácia terapêutica
dos fármacos (RIOS, 2005).
A quitosana tem desempenhado um papel fundamental no desenvolvimento
de biomateriais, que respondem a estímulos específicos, como veículo para
medicamentos administrados oralmente (MAJETI; KUMAR, 2000). Este biopolímero
e seus derivados apresentam algumas vantagens importantes com relação às
atividades farmacológicas, atuando como antiácido, antiúlcera, protegendo a
mucosa gástrica e inibindo a adesão das bactérias nas células epiteliais bucais e
vaginais (BUGAMELLLI et al., 1998; CHEN; PARK, 2003).
A modificação química da quitosana é uma ferramenta útil para planejar
novos carreadores de fármacos com o objetivo principal de melhorar a atividade
biológica destes, bem como diminuir os possíveis efeitos tóxicos e aprimorar a
biodistribuição. Portanto, derivados da quitosana solúveis em valores fisiológicos de
pH são alvos de várias pesquisas (MAJETI; KUMAR, 2000).
20
Um biopolímero que na atualidade está sendo utilizado em vários sistemas
terapêuticos é a O-carboximetilquitosana (O-CMQS), derivado solúvel da quitosana.
O uso deste biomaterial vem também aumentando em outras aplicações biomédicas,
como complexação do DNA e liberação de genes, devido à presença dos grupos
carboxílico e amino livre (RAMESH; VISWANATHA; THARANATHAN, 2004).
Alguns trabalhos que utilizam a O-CMQS têm sido publicados, como a
utilização em sistema de liberação dos antibióticos gatifloxacina (dispersão
polimérica contendo o fármaco) (ZHU et al., 2007) e microesferas para a liberação
prolongada do mesilato de pazufloxacina (LIU et al., 2007b). Outra aplicação
importante é a utilização no aumento da solubilidade de fármacos pouco solúveis
como a camptotecina, utilizada no tratamento de câncer (ZHU et al., 2006).
O aumento da solubilidade e conseqüente eficácia de fármacos pouco
solúveis
em
água
pode
ser
obtido
com
derivados
de
polissacarídeos
hidrofobicamente modificados. Desta forma a modificação de polissacarídeos
através da introdução de grupos hidrofóbicos tornou-se alvo de recentes pesquisas
nesta área. Entre os polissacarídeos podemos citar a pululana modificada com
grupos alquil e utilizada para dissolver o fármaco antitumoral docetaxel (HENNISILHADI et al., 2007) e O-CMQS modificada com ácido linoleico para a formação de
nanopartículas contendo a adriamicina, também usada no tratamento do câncer (LIU
et al., 2007a).
O presente trabalho tem como objetivos trazer contribuições no campo prático
de estudos sobre obtenção de derivados anfifílicos da O-CMQS, visando o aumento
da solubilidade de fármacos pouco solúveis. A escolha do objeto da pesquisa está
relacionada com a experiência do grupo de pesquisa (NIQFAR) com derivados da
quitosana. Já a seleção do derivado N-benzilado foi motivada pela ausência de
derivados anfifílicos contendo grupos aromáticos. A utilização para aplicações no
aumento da solubilidade de fármacos pouco solúveis está relacionada com emprego
prático do polímero preparado. O fármaco modelo utilizado neste experimento foi a
triancinolona, corticóide pouco solúvel em água e facilmente monitorado através de
técnicas espectrofotométricas.
21
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Obter derivados anfifílicos da O-carboximetilquitosana para utilizá-los no aumento
da solubilidade de fármaco pouco solúvel, como a triancinolona.
2.2 Objetivos Específicos
1) Sintetizar e caracterizar a O-carboximetilquitosana;
2) Produzir derivados anfifílicos, O-carboximetilquitosana N-benzilada;
3) Caracterizar os derivados por titulação condutimétrica e potenciométrica,
espectroscopia de infravermelho, ultravioleta e ressonância magnética nuclear de
hidrogênio;
4) Determinar a viscosidade intrínseca dos derivados sintetizados;
5) Avaliar a tensão superficial da O-carboximetilquitosana e seus
derivados;
6) Determinar a hidrofobicidade da O-carboximetilquitosana e seus
derivados por colorimetria (Sudan III);
7) Analisar in vitro a biocompatibilidade da O-carboximetilquitosana e seus
derivados utilizando-se células de fibroblasto L929;
8) Verificar o efeito dos derivados anfifílicos sobre a solubilidade da
triancinolona.
22
3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 Polímeros Naturais
A pesquisa e desenvolvimento de novos fármacos representam o primeiro
estágio no caminho do desenvolvimento de medicamentos. Em sua maioria, os
processos de obtenção de fármacos se realizam pela síntese de novas substâncias
ou pela extração de princípios ativos de fontes naturais (RIOS, 2005).
O desenvolvimento e produção de um medicamento devem levar em
consideração a liberação do fármaco na quantidade e velocidade adequada ao
objetivo terapêutico proposto, caracterizado como qualidade biofarmacêutica,
relacionando a formulação e as operações farmacotécnicas à ação esperada do
medicamento (STORPIRTIS et al., 1999).
De modo geral, o fármaco deve estar dissolvido antes de ser absorvido para
os fluidos do organismo, via membranas absorventes, epitélio da pele, trato
gastrointestinal e pulmões. Os fármacos são absorvidos de duas maneiras
diferentes: por difusão passiva e por meio de mecanismos de transporte
especializado. Na absorção passiva, a qual se acredita controlar a absorção da
maioria dos fármacos, o processo é determinado pelo gradiente de concentração
existente ao longo da barreira celular, ocorrendo a passagem de moléculas da
região de maior concentração para a de menor concentração (AULTON, 1988).
A solubilidade em lipídeos e o grau de ionização do fármaco no sítio de
absorção influenciam a velocidade de difusão. Alguns mecanismso de transporte
especializado têm sido propostos como, entre outros, o transporte ativo e o
transporte facilitado. Uma vez absorvido, o fármaco pode exercer um efeito
terapêutico local ou em sítios de ação – distante do sítio de administração. Neste
último caso, o fármaco terá que ser transportado pelos fluidos do organismo (ALLEN
JÚNIOR; POPOVICH; ANSEL, 2007).
Polissacarídeos naturais e seus derivados representam um grupo de
polímeros largamente utilizados em formas farmacêuticas, sendo geralmente
selecionados, em detrimentos de polímeros sintéticos, devido à baixa toxicidade,
baixo custo e biodisponibilidade (PILLAI; PANCHAGNULA, 2001).
23
Os polímeros possuem uma característica em comum, a de serem
macromoléculas de alta massa molar, que define suas propriedades físico-químicas.
Existem também macromoléculas de baixa massa molar, conhecidas como
oligômeros que consistem em uma molécula com poucos monômeros. Suas
propriedades físicas variam com a adição ou a remoção de um ou mais monômeros
de sua estrutura molecular. O interesse crescente por polímeros biodegradáveis tem
estimulado, recentemente, a obtenção de um grande número deles (PILLAI;
PANCHAGNULA, 2001; RIOS, 2005).
Modificando as propriedades do polímero, um sistema matricial pode ser
elaborado para uma liberação sustentada ou controlada do fármaco. Materiais
poliméricos farmacêuticos, com pequena ou nenhuma toxicidade, podem ser
utilizados como membranas ou matrizes nas quais a substância ativa é dispersa ou
dissolvida. Polímeros também funcionam como veículos e podem ser adicionados
aos elementos ativos (OLIVEIRA; LIMA, 2006).
Embora a escolha seja determinada, sobretudo, de acordo com o princípio
ativo, muito dificilmente se encontra um fármaco que não é compatível com as
classes gerais de polímeros (RIOS, 2005). Contudo, casos de incompatibilidade
podem ocorrer. A interação de excipientes e fármacos influencia no mecanismo de
desintegração, liberação, absorção e biodisponibilidade do fármaco (JACKSON;
YOUNG; PANT, 2000). O fenômeno de adsorção é um exemplo da interação entre
fármaco e excipiente. A adsorção física é devido a interações eletrostáticas, ligações
hidrogênio ou forças de van der Waals e usualmente é reversível, enquanto na
adsorção química, o adsorvido é ligado ao adsorvente por ligações químicas
primárias, incluindo troca iônica, protonação e complexação, sendo um processo
irreversível (JENQUIN; MCGINITY, 1994). A extensão da adsorção depende das
propriedades físico-químicas do fármaco e do excipiente (ZHU, 2002).
Dependendo do mecanismo de liberação, o grau de ionização do polímero
também pode ser uma importante propriedade. Quando o fármaco deve ser liberado
em um pH específico (ou seja, no trato gastrintestinal ou no cólon), polímeros não
iônicos são contra indicados porque eles são pH-independentes. Para alguns
comprimidos revestidos o pH é neutro para evitar a interação entre o polímero e o
fármaco. Em outras aplicações é favorecida a liberação mais uniforme do fármaco
por todo trato gastrintestinal, que apresenta valores de pH diferentes dependendo da
localização (RIOS, 2005).
24
Em relação aos polímeros biodegradáveis, é essencial reconhecer que a
degradação é um processo químico e a erosão é um fenômeno físico dependente
dos processos de difusão e dissolução (PILLAI; PANCHAGNULA, 2001). A
biodegradabilidade pode ser manipulada pela incorporação de uma variedade de
grupos instáveis como éster, anidrido, carbonato, amida, uréia e uretano na cadeia
principal (MAO et al.,1999), e pode ocorrer por meio enzimático, químico ou
microbiano. Essas vias de degradação podem ocorrer separadamente ou de forma
simultânea e são muitas vezes influenciadas pelos seguintes fatores: estrutura
química e composição do polímero, fatores físico-químicos (carga iônica, força iônica
e pH), fatores físicos (forma, tamanho, defeitos na cadeia), morfologia (amorfos,
semicristalino, cristalino, microestrutura), distribuição de peso molecular, via de
administração e sítio de ação (PILLAI; PANCHAGNULA, 2001).
Polímeros naturais (ou biopolímeros) são usualmente biodegradáveis e
oferecem excelente biocompatibilidade, mas sofrem variação de lote a lote devido às
dificuldades na purificação. Por outro lado, polímeros sintéticos estão disponíveis em
uma extensa variedade de composições com fácil ajuste das propriedades
(ANGELOVA; HUNKELER, 1999).
Em relação às propriedades dos polímeros, dois critérios devem ser seguidos
na elaboração de uma formulação. Em primeiro lugar, as características químicas do
polímero não devem comprometer a ação das substâncias ativas; em segundo, as
propriedades físicas do polímero devem ser consistentes e reprodutíveis. Entre as
várias propriedades físicas, algumas se demonstram mais importantes quando na
elaboração de um sistema de liberação de fármacos, como a permeabilidade
(JACOBS; MASON, 1993), propriedades de superfície como hidrofilia, adesão,
solubilidade (PILLAI; PANCHAGNULA, 2001) e temperatura de transição vítrea
(ZHU, 2002).
Estes materiais podem ser usados tanto para matriz quanto para revestimento
na liberação modificada do fármaco. A permeabilidade de um fármaco através de um
material polimérico é um processo que envolve dissolução, migração e difusão das
moléculas do fármaco em função da solubilidade e coeficiente de difusão. A
estrutura cristalina de um polímero tem maior grau de empacotamento molecular e,
portanto, tende a resistir mais à difusão de um fármaco em relação a polímeros
amorfos com a mesma estrutura química (ZHU, 2002).
25
As propriedades de superfície como hidrofilia, lubricidade, uniformidade e
energia de superfície determinam a biocompatibilidade com tecidos e sangue, além
das
propriedades
físicas
influentes
como
durabilidade,
permeabilidade
e
degradabilidade (ANGELOVA; HUNKELER, 1999). As propriedades de superfície
também determinam a capacidade de absorção de água de polímeros, que sofrem
degradação hidrolítica e intumescimento.
Entre os polímeros de origem animal mais aplicados como excipientes no
controle da liberação de fármacos, podem ser citados a quitina e a quitosana
(BRESOLIN et al., 2003).
O uso de quitosana como transportador de fármacos tem permitido solucionar
problemas como insolubilidade e hidrofobicidade de diversos agentes terapêuticos
(KUBOTA et al., 2000).
3.2 Quitina e Quitosana
Quando os resíduos de animais marinhos são despejados no mar as
proteínas constituintes da casca do camarão sofrem decomposição e os produtos
resultantes dessa decomposição são poluentes e altamente tóxicos, especialmente
a histamina. Quando enterrados, causam problemas ambientais como odores
desagradáveis e reunião de animais transmissores de doenças ao ser humano
(FREEPONS, 1997).
O aproveitamento destes resíduos de forma sustentável é de fundamental
importância nos dias atuais. Não somente pelo aspecto de resolver um problema
ambiental, mas também pelo potencial que os polímeros naturais obtidos destes
resíduos podem gerar.
A quitina (QTN) é uma poliamina acetilada e atóxica (KARLSEN et al., 1999),
considerada o principal constituinte do exoesqueleto de crustáceos aquáticos, além
de ser um componente do exoesqueleto de insetos e parede celular de levedura e
fungo. Foi relatado que cerca de 50 – 80 % da composição orgânica das cascas de
crustáceos e da cutícula de insetos consistem de quitina, enquanto na levedura e
fungo a quantidade relativa está na faixa de 30 a 60 % (PETER, 1995).
A quitina é um homopolissacarídeo linear composto por unidades de N-acetilD-glucosamina
(ou 2-acetoamido-2-deoxi-D-glicose) em ligações
(1
4), muito
26
abundante na natureza, perdendo somente para a celulose em disponibilidade
(Figura 1).
Figura 1: Representação da estrutura química da quitina.
A estrutura da quitina começou a ser estudada por volta de 1930 com base
em sua hidrólise química e enzimática (MATHUR; NARANG, 1990). Possui
características similares a glicosaminas e apresenta uma composição similar à
celulose (CHANDY; SHARMA, 1993; HUGUET; GHOBOILLOT; NEUFELD, 1994),
na qual os grupos hidroxilas referentes ao carbono-2 são substituídos por resíduos
acetamido e, por essa razão assemelha-se a esta em muitas de suas aplicações.
A ampliação de procedimentos fundamentados no emprego de quitina e seus
derivados é devido às suas propriedades de polieletrólito, a presença de grupos
funcionais reativos, alta capacidade de adsorção, biodegradabilidade, influência
antitumoral, atividade bacteriostática e antifúngica (SYNOWIECKI; AL-KHATEEB,
2003).
Modificações químicas na molécula de quitina, em geral, são dificultadas em
razão deste polissacarídeo possuir estrutura altamente cristalina, com fortes
interações entre hidrogênios intra e intermoleculares (SCHIGEMASA et al., 1999).
Uma das possíveis modificações que pode ser realizada é para a obtenção de um
derivado hidrolisado da quitina, o polímero bastante estudado e conhecido como
quitosana (QTS) (THANOO; SUNNY; JAYAKRISHNAN, 1991; LEE; PARK; HA,
1996). A forma desacetilada da QTS, composta principalmente de glucosamina (2amino-2-desoxi-D-glucose), possui diferentes classes de desacetilações. São
produzidas a partir do polissacarídeo inicial (quitina) por uma reação de
27
desacetilação (LEE; PARK; HA, 1996; SRINIVASA et al., 2002). Uma de suas
principais características é a insolubilidade em água e em determinados solventes
orgânicos.
A quitosana apresenta, em maior proporção, na cadeia polimérica unidades
de β-(1
4)-2-amino-2-desoxi-D-glicose, e um menor número de unidades β-(1
4)-2-acetamido-2-desoxi-D-glicose da quitina. Possui semelhança na sua estrutura
química com a celulose, porém exibe propriedades bastante diferentes desta, sendo
quimicamente mais versátil devido à presença dos grupos amino (BADE, 1997).
Figura 2: Representação da estrutura química da quitosana.
Embora a estrutura da quitosana (Figura 2) seja representada como um
homopolímero, o processo de desacetilação (Figura 3) é raramente completo e a
maioria dos produtos comerciais é de copolímeros compostos de unidades repetidas
de quitosana e unidades de quitina repetidas ao acaso (CHANDY; SHARMA, 1993;
RATHKE; HUDSON, 1994).
28
Figura 3: Esquema representativo da obtenção da QTS através da reação da desacetilação
da QTN para QTS usando solvente NaOH 50% m/m, na temperatura de 110 °C, por 4 horas.
A quitosana, polissacarídeo obtido pela hidrólise alcalina da quitina, vem
sendo usada como sistema polimérico na liberação de fármacos, tais como
prednilisolona (INOUE et al., 1989), albumina (POLK et al., 1994) e melatonina
(AÇIKGÖZ et al., 1996). Outros trabalhos descreveram que as formulações orais
revestidas de quitosana flutuam e intumescem gradualmente em solução com
valores de pH próximos a 2,0 (HOU et al., 1985).
Muitas são as possíveis utilizações destes biopolímeros como citado em
alguns trabalhos relacionados. A lista de aplicações da quitina e da quitosana é
ainda mais extensa quando são incluídos os vários derivados de quitosana obtidos
por meio de reações químicas através das quais são inseridos diferentes grupos
funcionais às suas moléculas, conferindo diferentes propriedades e aplicações
(KUMAR; KUMAR, 2001).
A atividade antifúngica é uma das mais importantes bioatividades da
quitosana, e estudos recentes mostram que a quitosana pode reduzir o grupo de
fungos fitopatogênicos, que são causadores de danos nas culturas de frutas e
vegetais (SUDARSHAN; HOOVER; KNORR, 1992; ROLLER; COVILL, 1999).
Quando a intenção é a aplicação de biopolímeros nas áreas farmacêutica e
biomédica uma das principais vantagens é a sua baixa toxicidade. A quitosana
apresentou uma baixa toxicidade (DL50 DE 16 g.kg-1, v.o, em estudos realizados in
29
vivo, utilizando camundongos). O polímero é biodegradável apresenta ausência de
alergenicidade e proporciona atividade anticoagulante, antifúngica, antimicrobiana,
entre outras (FELT; BURI; GURNY, 1998).
As características biológicas peculiares à quitosana são explicadas muitas
vezes pelo grupamento amino livre presentes nas unidades desacetiladas, que são
suscetíveis a protonação abrindo assim várias possibilidades de aplicação
(DUREJA; TIWARY; GUPTA, 2001).
Uma etapa muito importante que antecede a utilização da quitosana na
formulação de produtos farmacêuticos é a necessidade de purificação. De fato, no
contexto de algumas aplicações de quitosana, tais como em dispositivos para a
liberação modificada de fármacos, um elevadíssimo grau de pureza é requerido. A
purificação da quitosana na forma neutralizada, solúvel em meios moderadamente
ácidos, é bastante prática do ponto de vista do tempo, materiais e equipamentos
necessários à sua execução. Porém, a solubilidade restrita das amostras purificadas
limita a sua caracterização em determinadas condições e, de certa forma, dificulta a
comparação da quitosana com outros polieletrólitos (SIGNINI; CAMPANA FILHO,
1998).
Na preparação de comprimidos, a quitosana pode ser empregada na
compressão direta como diluente, aglutinante, lubrificante e desintegrante. Contudo,
a sua aplicação é limitada pela falta de propriedades de fluidez e compressibilidade.
A mistura da quitosana com outros excipientes convencionais, como o manitol,
lactose ou amido, melhoram a fluidez das misturas de pós (SINGLA; CHAWLA,
2001).
Filmes de quitosana podem ser empregados no revestimento de comprimidos
e cápsulas. Normalmente os comprimidos são revestidos com filmes formados pela
evaporação da dispersão de quitosana em ácido acético. A resistência do filme
depende da temperatura e do tempo de secagem do comprimido. Foi observado que
o comportamento de liberação da teofilina não depende da temperatura de secagem
(NUNTHANID, 2002).
Tozaki e colaboradores (1997) utilizaram cápsulas deste polímero revestidas
com ftalato de hidroximetilpropilcelulose para a administração de insulina por via
oral. Os resultados mostraram que as cápsulas passaram intactas pelo estômago e
pelo intestino delgado, observando-se o efeito hipoglicemiante, em ratos tratados
com as cápsulas, no período de 6 a 16 horas após a administração. Yamamoto et al.
30
(2000) e Tozaki et al. (2002) empregaram o mesmo sistema para a liberação de
fármacos antiinflamatórios usados no tratamento de colite ulcerativa. As cápsulas
atingiram o intestino grosso dos ratos 3,5 horas após a sua administração. A
ausência de ácido 5-aminosalicílico na mucosa gástrica e no intestino delgado
mostrou que as cápsulas passaram intactas pelo estômago, indicando que as
cápsulas são eficientes para a liberação do ácido 5-aminosalicílico no intestino
grosso. Também foi observada uma aceleração na cura de ratos com colite
ulcerativa induzida pelo trinitrobenzenosulfonato de sódio.
Os hidrogéis a base de quitosana, formados por redes poliméricas híbridas
(HPNs), ocorre pela formação de uma rede de quitosana reticulada e a rede do
polímero poli(álcool vinílico) também reticulado podendo existir interações
covalentes entre cadeias dos diferentes tipos de polímeros. Os HPNs obtidos de
quitosana e poli(álcool vinílico) foram empregados na liberação da amoxicilina,
sendo avaliada a influência da composição química deste hidrogel nas propriedades
térmicas e eletroquímicas e na liberação de amoxicilina. Os estudos mostraram que
a condutividade iônica de filmes é influenciada pela composição do hidrogel e as
amostras com maior proporção de poli (álcool vinílico) apresentam maior liberação
de amoxicilina devido ao maior grau de intumescimento (RODRIGUES et al., 2006).
3.3 Quitosana e seus Derivados
A modificação estrutural de biopolímeros como a quitosana é de grande
interesse para uso em muitos fins terapêuticos. Por possuir uma grande quantidade
de grupamentos reativos, como as hidroxilas e os grupos amino, a quitosana é
susceptível às mudanças estruturais, principalmente em reações de N-acetilação, Nalquilação, N-carboxilação, N-sulfonação e formação de bases de Schiff com
aldeídos e cetonas (PETER, 1995). A Figura 4 mostra os diversos derivados da
quitosana.
31
Figura 4: Esquema representando derivados da quitosana. Adaptado de Peter (1995).
Muitos destes derivados são utilizados frequentemente pela indústria
farmacêutica a fim de melhorar as propriedades terapêuticas dos fármacos. O
cloreto de trimetil quitosana mostrou um aumentou na absorção intestinal de
peptídeos e absorção para buserelina e análogos de octreotide por epitélios
intestinais (THANOU et al., 2001).
O cloreto de N-trimetilquitosana foi sintetizado por Hamman, Schultz e Kotzé
(2003) e utilizado para aumentar o transporte de fármacos. Esta função se dá
através do epitélio, pela abertura das estreitas junções entre as células. Foram
realizados experimentos com diferentes graus de quartenização do polímero. Na
conclusão dos ensaios citados, a absorção considerada ótima ocorreu em um grau
intermediário de quartenização.
Sandri e colaboradores (2004) estudaram diferentes derivados de quitosana
que aumentaram a penetração de aciclovir adicionando o fármaco a várias
dispersões de quitosana modificadas: 5-metil-pirrolidinona-QTS, quitosanas de baixo
32
peso molecular, quitosana parcialmente reacetilada e cloridrato de quitosana. Neste
trabalho, o polímero modificado apresentou a melhor mucoadesividade e aumentou
as propriedades de penetração/permeação do fármaco estudado.
Derivados carboximetilados da quitosana como, por exemplo, a Ncarboximetilquitosana, a N-carboxibutilquitosana e a succinilquitosana têm sido
estudados como polímeros carreadores de fármacos (KATO; ONISHI; MACHIDA,
2004; ZHU; LIU; YE, 2006).
A N-carboximetilquitosana (Figura 5) é um derivado da quitosana que também
apresenta grupamentos acetatos, tendo característica de polieletrólito negativo.
Quimicamente é uma glicana -(1
4), de unidades 2-amino-2-desoxi-D-glicose e
2-carboxi-amino-2-desoxi-D-glicose, sendo solúvel em água (PETER, 1995).
Figura 05: Estrutura química da N-Carboximetilquitosana.
Derivados da quitosana, especialmente a N-carboximetilquitosana (N-CMQS)
também têm sido estudados quando à sua caracterização físico-química (MIRANDA
et al., 2003) e sua propriedade de formação de filme (MACHADO; FARIAS, 2003).
Foi observado que os filmes de N-CMQS têm estrutura mais compacta, com
disposição reticulada e fibras em uma única direção quando analisados usando
Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e Análise Mecânica e Dinâmica (AMD).
A análise cinética térmica mostrou um lento processo de degradação para a NCMQS quando comparado com a quitosana, e uma energia de ativação 13 vezes
maior para a anterior, confirmando alta estabilidade do polímero modificado. Os
filmes dos polímeros estudados mostraram que podem suportar altas tensões, com
baixa elasticidade, conforme revelado pelas análises do AMD (MIRANDA et al.,
2006).
Os estudos de avaliação do potencial tóxico agudo e crônico da N-CMQS se
fizeram necessário uma vez que somente os dados toxicológicos da quitosana eram
conhecidos. Lopez e colaboradores (2005) avaliaram a toxicidade aguda oral (dose
33
única) da N-CMQS. No estudo não foram encontrados alterações ou danos
atribuídos à administração da N-CMQS. Quanto à sobrevivência dos animais os
pesquisadores obtiveram 100% em doses de 200 mg/kg. O que indica que a NCMQS pode ser considerada como “sem classificação” quanto à toxicidade e que,
por analogia, a sua DL50 por via oral é superior a este valor.
Prabaharan,
Reis
e
Mano
(2007)
realizaram
modificações
na
carboximetilquitosana com grupos fosfadiletanolamina (PEA), mostrando que este
biopolímero possui um bom potencial para a liberação modificada de fármacos
hidrofóbicos. Para o estudo de liberação, a vesícula CMQTS-g-PEA mostrou um
comportamento de intumescimento pH-dependente, o qual pode ser apropriado em
pH básico na liberação de fármacos. Estudos preliminares com cetoprofeno, como
fármaco modelo, foram realizados. Os experimentos de incorporação e liberação
indicam que o sistema parece ser um veículo promissor para a administração no
controle de liberação de fármacos hidrofóbicos com pH-alto.
Derivados da quitosana também têm sido preparados com o objetivo de
aplicação como antimicrobiano. Três classes de bases de Schiff preparadas pela
reação entre a carboximetilquitosana e aldeídos aromáticos melhoraram a atividade
fungicida contra os fungos Valsa mali, Alternaria solani e Fusarium oxysporium f. sp.
vasinfectum
(GUO
et
al.,
2006).
Derivados
N-alquil
e
N-benzilquitosana
apresentaram atividade inseticida (contra larvas de Spodoptera littoralis) e
antifúngica (Botrystis cinérea e Pyricularia grisea) sendo que os derivados contendo
grupos nitros foram os mais ativos (RABEA et al., 2005).
Em outro estudo, a atividade antifúngica da quitosana e de derivados
carboximetilados foram comparados. O cloridrato de quitosana de baixo e de alto
peso molecular solúvel em água, a carboximetilquitosana, o oligossacarídeo de
quitosana e a N-acetil-D-glicosamina foram testados contra C. albicans, C. krusei e
C. glabrata. As espécies C. albicans e C. krusei foram as mais sensíveis, enquanto a
C. Glabrata também foi inibida, mas em menor intensidade. Porém, apenas os
cloridratos de quitosana mostraram um efeito antifúngico dose dependentes. A
carboximetilquitosana, a quitosana de oligossacarídeo e a N-acetil-D-glicosamina
apresentaram atividade fraca ou nenhuma atividade antifúngica (SEYFARTH et al.,
2007).
A modificação hidrofóbica da quitosana e seus derivados vêm recebendo
especial atenção na última década tanto na preparação de formas farmacêuticas
34
sólidas quanto de dispersões. A N-acilação da quitosana com cloretos de ácido
graxos provocou um aumento da sua hidrofobicidade podendo ser utilizada como
matriz hidrofóbica para a liberação de fármacos, como por exemplo, o paracetamol.
Os resultados mostraram uma relação direta entre o grau de substituição e a
velocidade de liberação do paracetamol. Acredita-se que a interação hidrofóbica
aumenta a estabilidade da quitosana substituída via auto-agregação hidrofóbica
(TIEN et al., 2003).
3.4 O-Carboximetilquitosana
Várias pesquisas são realizadas sintetizando derivados de quitosana solúveis
em água através de técnicas de alterações químicas diversas, conforme Figura 4
(CHEN; PARK, 2003). Entre os derivados de quitosana solúveis em água, a Ocarboximetilquitosana (O-CMQS) é um derivado de éter anfótero, que contém grupos
de COOH e grupos de NH2 na molécula. Este polímero, um derivado biocompatível
da quitosana, tem o grupamento o-hidroxila substituído por um grupamento carboxil
em cada monômero, através da formação de uma ligação éter, como está
representado na Figura 6.
Figura 6: Estrutura química da O-Carboximetilquitosana.
Essas modificações estruturais concedem novas propriedades químicas e
biofísicas para o polímero que, na atualidade, são focos de várias pesquisas (ZHU;
ZHANG; ZHANG, 2004; ZHU et al., 2005b).
Os primeiros trabalhos realizados com a O-carboximetilquitosana mostravam
a potencialidade destes derivados. Em 2001, Tokura e Tamura já relataram com
35
sucesso, o emprego deste polímero na restauração e na regeneração de tecidos
ósseos.
A avaliação da segurança da O-carboximetilquitosana em ratos albinos foi
analisada. Possíveis mudanças no peso corporal, peso dos órgãos vitais,
parâmetros hematológicos e histopatológicos foram pesquisadas. Em relação aos
estudos efetuados o polímero mostrou-se biocompatível, não alterando qualquer
propriedade estudada (RAMESH; VISWANATHA; THARANATHAN, 2004).
O estudo do comportamento de agregação da O-CMQS mostrou os valores
de concentração de agregação crítica entre 0,042 mg/mL e 0,050 mg/mL. Segundo
os autores (ZHU et al., 2005a) as ligações de hidrogênio entre a água e O-CMQS
pela presença do grupo carboxil na cadeia tornaram o polímero solúvel em água. As
ligações de hidrogênio intermoleculares da O-CMQS e a repulsão eletrostática entre
elas formam as forças motrizes principais para agregação em dispersão.
A aplicação da O-CMQS como matriz para a liberação de fármacos foi
relatada por Zhu, Liu e Ye (2006). No estudo foi relatada a incorporação do fármaco
antitumoral camptotecina que é pouco solúvel em água, sendo observado que a
característica hidrofóbica do polímero melhora a eficiência na incorporação do
fármaco.
Posteriormente, Zhu e colaboradores (2007) prepararam sistema de liberação
da gatifloxacina incorporada a O-CMQS. A concentração inibitória mínima (CIM) do
complexo em estudo contra as bactérias gram-positivas é semelhante ao do
antibiótico sem a complexação. Porém, a matriz de O-CMQS e gatifloxacina tem um
efeito transmissor nas bactérias gram-negativas, promovendo uma CIM quatro vezes
menor que o da solução de gatifloxacina livre.
Em 2007a, Liu e colaboradores relataram que microesferas de Ocarboximetilquitosana contendo o antibiótico denominado pazufloxacina foram
preparadas usando emulsão água/óleo e posterior reticulação com glutaraldeído. A
modificação na O-CMQS produziu uma matriz polimérica com capacidade de
modificar a liberação controlada de fármacos.
Hidrogéis porosos contendo poli (ácido acrílico-co-acrilamida)/O-CMQS
interpenetrando redes de polímero (SPH-IPNs) foram preparados através de
reticulação de O-CMQS com glutaraldeído, após a preparação dos hidrogéis. O
comportamento de intumescimento dos SPH-IPNs foi dependente do conteúdo de OCMQS, da quantidade de glutaraldeído e do tempo de reticulação. Devido à rede de
36
reticulação de O-CMQS, a força de muco-adesão in vitro e as propriedades
mecânicas, incluindo compressão e módulo elástico do SPH-IPN foram aumentadas,
apresentando características melhores quando comparada com o convencional
SPH. Com as propriedades mecânicas melhoradas, bem como a força mucoadesiva
in vitro, o SPH-IPN pode ser usado como um sistema muco-adesivo potencial para
liberação peroral de proteínas e peptídeos (YIN et al., 2007).
A carboximetilquitosana quaternária (QCMC), preparada pela reação da OCMQS com 2,3-epoxipropiltrimetilamonio, pode estimular a formação de uma fina
camada de dentina reparadora, quando colocada diretamente junto à polpa exposta.
A QCMC foi adicionada ao hidróxido de cálcio no capeamento pulpar em
experimentos em animais. Neste estudo, o polímero pode induzir formação de
dentina reparadora e foi capaz de formar uma dentina induzida melhor quando
comparada com o hidróxido de cálcio. Esta foi a primeira vez que tal propriedade
bioativa mostrou a simulação da formação de dentina reparadora, abrindo novas
perspectivas para futuras terapias com capacidade osso-indutoras. Os resultados
também mostraram que este derivado apresentou atividade antimicrobiana contra S.
aureus e E. coli (SUN et al., 2006).
Em 2005, Zhao e colaboradores sintetizaram e caracterizaram uma nova
formulação de nanopartículas magnéticas cobertas com uma matriz polimérica de OCMQS. Tal produto sintetizado foi utilizado no estudo como carreador de fármacos e
genes com atividade antitumoral. As nanopartículas magnéticas carrearam a
substância ativa e agruparam-se de forma estável nos vasos capilares do
antitumoral in vitro, apontando benefícios terapêuticos consideráveis na liberação de
fármacos.
Zhu, Yuan e Liao (2008) prepararam QTS e O-CMQS que foram aplicadas
como dispersantes para preparar suspensão
de nanopartículas de Fe3O4
magnético. As nanopartículas de Fe3O4 foram caracterizadas
quanto à sua
morfologia, propriedades magnéticas, composição e distribuição de tamanho por
microscopia eletrônica de tunelamento (MET), microscopia eletrônica de varredura
(MEV), infravermelho com transformada de Furrie (IV-TF). Os mecanismos de
adsorção da quitosana e O-CMQS sobre nanopartículas de Fe3O4 magnético são
atrações eletrostáticas e interação de coordenação, respectivamente. A estabilidade
das suspensões de nanopartículas de QTS/Fe3O4 e O-CMCS/Fe3O4 ocorrem
provavelmente pela repulsão eletrostática entre as partículas.
37
3.5 Aplicações dos Derivados Hidrofóbicos da Quitosana
Polímeros hidrossolúveis hidrofobicamente modificados têm sido alvo de
estudos. Esses polímeros consistem de cadeias hidrossolúveis com uma pequena
proporção de grupos hidrofóbicos inseridos na cadeia polimérica (ARGILLIER et al.,
1996). São macromoléculas que apresentam um comportamento ímpar, com
estabilidade à hidrólise, viscosidade elevada sob condições severas (alta
temperatura e concentração de sais) e capacidade de reduzir a tensão superficial,
comportando-se como um tensoativo, o que justifica o interesse que eles despertam
para pesquisa com fármacos de baixa solubilidade (CANDAU; SELB, 1999).
A estrutura de tais polímeros pode variar de copolímeros anfifílicos em blocos
a polímeros anfifílicos de enxerto. A vantagem do último comparado com o primeiro
é que a interação hidrofóbica pode ocorrer não somente entre cadeias poliméricas
diferentes (interações intermoleculares), mas também entre cadeias da mesma
cadeia polimérica (interações intramoleculares) (SUI et al., 2004).
Em solução aquosa, segmentos hidrofílicos são responsáveis pela hidratação
dos polímeros, enquanto os domínios hidrofóbicos minimizam seu contato com água
através da auto-agregação. Vale notar que o balanço entre interações intra e
intermolecular pode facilmente ser controlado pelo ajuste do tamanho e/ou número
de cadeias laterais hidrofóbicas de enxertos (PEIT-AGNELY; ILLIOPOULOS; ZANA,
2000; ESQUENET et al., 2004; SIMON et al., 2003; HENNI et al., 2005).
Polímeros anfifílicos são constituídos de uma cadeia principal hidrofílica e
alguns substituintes hidrofóbicos, que podem se encontrar distribuídos de forma
aleatória ao longo da cadeia polimérica ou nas suas extremidades (PEIT-AGNELY;
ILLIOPOULOS; ZANA, 2000). A estrutura anfifílica desses polímeros pode exibir
atividade
superficial
e
adsorver
em
interfaces
(YAHYA;
HAMAD,
1995;
CHAUVETEAU; LECOURTIER, 1998). Esta atividade interfacial capacita estes
materiais para emprego tecnológico nas mais variadas aplicações, tais como:
obtenção de emulsões utilizadas em formulações cosméticas (AKIYAMA et al.,
2006); modificação da superfície de partículas de negro de fumo (RIDAOUI et al.,
2006) ou diminuição seletiva da permeabilidade de reservatórios de petróleo
(TAYLOR; NASR-E1-DIN, 2004).
38
Foi comprovado que a hidrofilia dos filmes de poli (3-hidroxibutírico) ácido-co3-hidroxivalérico (PHBV) pode ser aumentada por enxerto com quitosana. O enxerto
de quitosana sobre o PHBV melhora a adesão de fibroblastos, ainda que reduza a
proliferação celular. Imobilizando o enxerto de quitosana com colágeno sobre a
membrana de PHBV reduziu-se pouco a melhora da adesão dos fibroblastos, porém
houve um aumento da proliferação celular além de demonstrar atividade
antibacteriana importante contra quatro patógenos: Staphylococcus aureus – 1
(MRSA), Staphylococcus aureus – 2, Pseudomonas aeroginosa e Escherichia coli
(HU; JOU; YANG, 2004).
Derivados anfifílicos da deoxiclorato-quitosana, da carboximetilquitosana e da
quitosana pura foram utilizados na preparação de nanomicelas. Os resultados
encontrados mostraram que a agregação depende do pH e da força iônica do meio
aquoso. A força iônica aumentou a agregação de deoxiclorato-quitosana, mas não
teve nenhuma influência para a carboximetilquitosana e a quitosana pura.
Modificações de grupos hidrofóbicos e hidrofílicos influenciaram as propriedades
reológicas da quitosana e de seus derivados. A agregação de deoxiclorato-quitosana
em dispersão pode ser controlada por um processo de emulsificação óleo/água
usando cloreto de metileno. As nanomicelas de deoxiclorato-quitosana podem ser
usadas para encapsular compostos lipossolúveis e ser empregado como sistemas
de liberação de fármacos (PANG et al., 2007).
Yao e colaboradores (2007) sintetizaram uma série de derivado de quitosana
com octil, sulfato e polietilenoglicol monometil éter (mPEG) como grupos
hidrofóbicos que formam micelas em meio hidrofílico. Na incorporação do fármaco
paclitaxel, em dispersão micelar, a solubilidade do mesmo foi amplamente
aumentada.
A concentração do fármaco na dispersão micelar mPEG foi 3,94
mg/mL. Isto representa um aumento de aproximadamente 4000 vezes quando
comparado com o paclitaxel livre em água (menos de 0.001 mg /mL).
Em 2005, Yu e colaboradores prepararam um derivado hidrofóbico da Ocarboximetilquitosana. Através da reação da O-CMQTS com poliuretano, por meio
da via mistura de polímero e enxerto por ligação transversal modificada com
interpenetramento (semi-IPN) do polímero, com várias cadeias de poliuretano. Este
novo material apresentou um aumento na miscibilidade da membrana resultando na
melhora da capacidade antibacteriana e resistência a trombo, sendo desta forma um
39
bom candidato para ser empregado como biomaterial para dispositivos de liberação
endovenosa.
Outros polímeros foram preparados através de enxerto da O-CMQS por
polímeros sintéticos como, por exemplo, o tereftalato de polietilono (PET). Foi
observado que a compatibilidade sanguínea da PET-O-CMQS está relacionada com
seu potencial zeta. O potencial zeta reflete o potencial de superfície das partículas,
que é influenciado pelas mudanças na interface com o meio dispersante. Em razão
da dissociação de grupos funcionais na superfície da partícula temos equilíbrio de
hidrofilia/hidrofobicidade e com baixa adsorção de proteína. Esta metodologia pode
ser aplicada na preparação de filmes PET, mas também para o cloreto de polivinil,
poliuretano, celulose, borracha de silicone e os outros biopolímeros (ZHU; CHEN,
2006; YU; MCGERVEY; JAMIESON, 2007).
A interação entre albumina de soro bovino (BSA) e nanopartículas autoagregadas de O-carboximetilquitosana modificadas por colesterol, com graus
diferentes de substituição, foi estudado através de várias metodologias. A formação
do complexo foi possível devido às interações hidrofóbicas do colesterol com o meio
aquoso. Os grupos carboximetil carregados negativamente são importantes na
morfologia e na estabilidade das nanopartículas. O grau de substituição de
substância contendo colesterol é significativamente afetado pela interação entre
BSA e nanopartículas auto-agregadas de O-CMQS. Os resultados como, por
exemplo, a resistência a desnaturação contra a uréia, permite o seu emprego como
carreador de proteínas (WANG; LIU; ZHANG, 2007). A uréia não perde a sua
estrutura tridimensional e, portanto, as suas propriedades.
O polissacarídeo carboximetilpululana foi modificado hidrofobicamente com
cadeias alquílicas de 8 carbonos. A modificação ocorreu através da associação
espontanea em meio aquoso induzindo a formação de nanoagregados solúveis com
um núcleo de natureza hidrofóbica e externamente com natureza hidrofílica. Estes
agregados
melhoraram
a
solubilidade
de
docetaxel,
fármaco
hidrofóbico,
especialmente a modificação contendo grande quantidade de unidades alquílicas.
Soluções do fármaco-CMP49C8 provaram ser menos tóxico contra macrofagócito que
do Tween 80 (o excipiente usado na formulação comercializada de docetaxel). Os
testes também mostraram bons resultados em relação a atividade citotóxica contra
células de câncer de seio humano (HENNI-SILHADI et al., 2007).
40
Entre
os
polímeros
anfifílicos,
os
polissacarídeos
hidrofobicamente
modificados atraíram atenção especial como promissores veículos para fármacos
insolúveis em água, por causa de sua biocompatibilidade, biodegradabilidade e
baixa toxicidade (HENNI-SILHAI et al., 2007). Os primeiros estudos dos tensoativos
baseados em polissacarídeos iniciaram no início dos anos 80. O trabalho de Landoll
(1982) relacionou com viscometria, solubilidade, propriedades tensoativas da
celulose de enxertos com as cadeias alquil.
O estudo das interações tensoativo-polímero pode tanto modelar pesquisas
de interações de lipídio-biopolímero in vivo, como o aprimoramento das aplicações
tecnológicas destes sistemas na estabilização de soluções nas indústrias de
alimentos e de fármacos (BOGNOLO, 1999).
Em um outro estudo, Qun e Ajun (2006), comprovaram que a tensão
superficial diminui ligeiramente com o aumento da concentração de quitosana em
alta diluição. A tensão superficial aumenta aparentemente nas quitosanas de alto
peso molecular ou nas soluções de baixa força iônica; enquanto o grau de acetilação
tem pouco efeito na tensão superficial de quitosana, especialmente em solução de
ácido clorídrico. As mudanças de tensão superficial são atribuídas à transição de
conformação de moléculas dentro de solução diluída, resultando em uma variação
de interações intra e (ou) intermoleculares, nas ligações de hidrogênio, interação
hidrofóbica e interação eletrostática.
Outro tipo de derivado anfifílico de quitosana foi preparado pela introdução de
(2-hidroxipropil-3-butoxi) propil para obtenção da succinil-quitosana. O estudo
mostrou que o aumento da concentração do novo derivado sintetizado provoca a
diminuição da tensão superficial e formação de agregados na solução. A habilidade
de diminuir a tensão superficial e formar agregados foi melhorada aumentando o
grau de substituição de grupo hidrofóbico e a adição de sal (SUI et al., 2004).
Pesquisas realizadas com a succinil-quitosana mostraram que ela pode se
concentrar na superfície para diminuir a tensão superficial e se associar com cadeias
hidrofóbicas para formar agregados em solução. A modificação com o grupo 2hidroxipropil-3-butoxi provocou uma redução significativa da tensão superficial. Estes
resultados indicam que o sistema pode ser utilizado em sistema de liberação para
fármacos hidrofóbicos (SUI et al., 2008).
41
3.6 Polímeros e Tensão Superficial
3.6.1 Fenômenos Interfaciais e de Superfície
A modificação da superfície dos polímeros vem se tornando uma importante
área de pesquisa. Muitos desses materiais possuem boas propriedades mecânicas e
apresentam baixos custos, no entanto, muitas das aplicações industriais e
farmacêuticas
requerem
propriedades
superficiais
especiais,
bem
como
compatibilidade com cargas. Os tratamentos superficiais são capazes de alterar as
propriedades físicas e químicas das superfícies poliméricas sem afetar suas
propriedades mecânicas e convertem o material, inicialmente de baixo custo a um
elevado valor agregado (DORAI; KUSHNER, 2003).
O aumento da força de adesão entre a interface polímero – polímero é feita
através de uma ligação covalente primária (VAN KREVELEN, 1997). Vários
mecanismos, modelados a partir da termodinâmica e cinética molecular são
considerados na literatura para interpretar o fenômeno da adesão. Isso permite
examinar a estrutura e as propriedades da superfície dos polímeros na resistência
da junção adesiva (VAN KREVELEN, 1997; JAHAGIRDAR; TIWARI, 2004).
As características da adesão são afetadas por duas propriedades dos
polímeros, simultaneamente nomeadas de energia superficial e mobilidade
molecular.
Contudo,
a
mobilidade
e
a
habilidade
difusiva
das
cadeias
macromoleculares através do aumento da força de adesão entre materiais
poliméricos, e a existência da difusão, depende do estado físico do polímero
(BEAKE; LING; LEGGETT, 1998).
A fronteira entre duas fases geralmente é descrita como uma interface
(ADAMSON; GAST, 1997). No âmbito farmacêutico, os fenômenos que ocorrem na
interface de dois ou mais sistemas têm um papel importante, tanto na formulação
como na preparação de um medicamento quanto para assegurar a atividade e a
estabilidade do mesmo. Os principais fenômeno são: tensão interfacial e tensão
superficial (NETZ; GONZÁLEZ ORTEGA, 2002).
42
3.6.2 Tensão superficial
As forças coesivas entre as moléculas no interior de um líquido são
compartilhadas com os átomos vizinhos. Aquelas da superfície não têm átomos
vizinhos acima delas e exibem uma força atrativa mais forte sobre suas vizinhas na
superfície. Este aumento das forças atrativas intermoleculares na superfície é
chamado tensão superficial (ROSENTHAL, 2001).
Em 2005 Babak, Desbrieres e Tikhonov explicaram que esta força, a tensão
superficial, que atua na superfície dos líquidos, geralmente, pode ser quantificada
determinando-se o trabalho necessário para aumentar a área superficial.
A tensão superficial surge nos líquidos como resultados do desequilíbrio entre
as forças agindo sobre as moléculas da superfície em relação àquelas que se
encontram no interior da solução (ADAMSON; GAST, 1997).
Pela mesma razão ocorre a formação dos meniscos, e a conseqüente
diferença de pressões através de superfícies curvas ocasiona o efeito denominado
capilaridade (ROSENTHAL, 2001).
O valor (ou
) é chamado de tensão interfacial (ou superficial) e é igual ao
trabalho reversível necessário para aumentar a interface. Sua dimensão é N/m, o
que é formalmente equivalente à energia interfacial (J/m²). Ambos os termos muitas
vezes são equiparados, o que a rigor somente é verdadeiro sob condições
isotermais e é permitido para corpos sólidos quando a energia mecânica de
mudanças estruturais for desprezível (ADAMSON; GAST, 1997). As tensões
interfaciais são conseqüências diretas das forças de interação intramoleculares. As
tensões superficiais ou interfaciais de líquidos podem ser medidas diretamente por
métodos tensiométricos. No entanto, tensões superficiais de sólidos somente podem
ser determinadas indiretamente. O método usado com maior freqüência para
determinar a tensão superficial de sólidos com baixa energia superficial (como
plásticos) é a determinação dos dados do ângulo de molhabilidade (DESHMUKH;
BHAT, 2003).
A molhabilidade pode ser também considerada como um fenômeno cinético
que contribui para uma boa difusão, pois é favorecida pelo contato das
macromoléculas durante a migração de líquidos da superfície de um polímero para
seu interior. Além disso, a molhabilidade de um polímero é também necessária para
um bom mecanismo de adsorção, levando a formação de interações moleculares
43
como interações de Van de Waals, interações ácido-base e ligações de hidrogênio
interfacial (GRANT; DUNN; MCCLURE, 1988).
3.6.3 Tensoativos
Os tensoativos constituem uma classe importante de compostos químicos
amplamente utilizados em diversos setores industriais. A grande maioria dos
tensoativos disponíveis comercialmente é sintetizada a partir de derivados de
petróleo (INAGARI; NARUSHIMA; LIM, 2003). Entretanto, o crescimento da
preocupação ambiental entre os consumidores, combinado com novas legislações
de controle do meio ambiente levaram à procura por tensoativos naturais como
alternativa aos produtos existentes (NITSCHKE; PASTORE, 2002).
Os tensoativos são moléculas anfipáticas constituídas de uma porção
hidrofóbica e uma porção hidrofílica. A porção apolar é freqüentemente uma cadeia
de hidrocarbonetos, enquanto a porção polar pode ser iônica (aniônica ou catiônica),
não-iônica ou anfótera (DESAI; BANAT, 1997).
Em função da presença de grupos hidrofílicos e hidrofóbicos na mesma
molécula, os tensoativos tendem a se distribuir nas interfaces entre fases fluidas
com diferentes graus de polaridade (óleo/água e água/óleo) (BOGNOLO, 1999). A
formação de um filme molecular, ordenado nas interfaces, reduz a tensão interfacial
ou superficial, sendo responsável pelas propriedades únicas dos tensoativos. Estas
propriedades fazem os tensoativos serem adequadas para uma ampla gama de
aplicações
industriais
envolvendo:
detergência,
emulsificação,
lubrificação,
capacidade espumante, capacidade molhante, aumento da solubilidade e dispersão
de fases. A maior utilização dos tensoativos se concentra na indústria de produtos
de limpeza (sabões e detergentes), na indústria de petróleo e na indústria de
cosméticos e produtos de higiene (BANAT, 2000).
Vários compostos com propriedades tensoativas são sintetizados por
organismos vivos, desde plantas (saponinas) até microrganismos (glicolipídios) e
também no organismo humano (sais biliares), sendo considerados tensoativos
naturais (BOGNOLO, 1999).
Atualmente, nos países industrializados 70-75% dos tensoativos consumidos
são de origem petroquímica, enquanto que nos países em desenvolvimento os
compostos de origem natural predominam (BANAT, 2000).
44
Entretanto, nos países industrializados existe uma tendência para a
substituição dos tensoativos sintéticos pelos naturais. Esta tendência é movida pela
necessidade de produtos mais brandos, pela necessidade de substituição de
compostos não biodegradáveis (alquil benzenos ramificados) e pelo aumento da
especificidade dos produtos (BOGNOLO, 1999).
As principais características do uso de tensoativos estão relacionadas à
formação de ambientes organizados, também conhecidos como ambientes
micelares (QUN; AJUN, 2006). Os tensoativos são frequentemente empregados
para modificar o meio reacional permitindo dissolução de espécies com baixa
solubilidade. Também são capazes de promover um novo meio que pode modificar a
velocidade reacional, a posição de equilíbrio das reações químicas e em alguns
casos a estereoquímica destas dependendo da natureza da reação, do tipo de
reativo (eletrofílico, nucleofílico, etc) e característica iônica (catiônica, aniônica)
(RAUEN; DEBACHER; SIERRA, 2002).
3.6.4 Medidas da Tensão Superficial
Na atualidade existem diversos métodos que podem ser empregados para a
determinação da tensão superficial e estes são classificados em estáticos, dinâmicos
e de desprendimento (ou separação) (DESHMUKH; BHAT, 2003). O Quadro 1 reúne
os principais métodos usados para medir a tensão superficial.
45
Quadro 1: Métodos usados para medir a Tensão Superficial.
Método
Placa de
Adequação
Adequação
Tempo de
Precisão
para soluções
para líquidos
efetivação
[mN/m]
tensoativos
viscosos
~0,1
Limitado
Muito bom
>10 s
~0,1
Limitado
Não
>30 s
Wilhelmy
Anel de Du
Nouy
Pressão
recomendado
0,1-0,3
Muito bom
Máxima de
Não
1 ms-100 s
recomendado
Bolha
Ascensão
<<0,1
Muito bom
Capilar
Volume da
>10 s
recomendado
0,1-0,2
Limitado
Gota
Gota Pendente
Não
Não
1 s-20min
recomendado
~0,1
Muito bom
Não
>10 s
recomendado
Gota Séssil
~0,1
Bom
Muito bom
>10 s
Fonte: Adaptado de MACLEOD; RADKE, 1993.
3.6.5. Método da Gota Pendente
Tem como base o equilíbrio entre a força gravitacional e a tensão do líquido.
Através da equação de Laplace-Young, é descrito o balanço entre força gravitacional
e a tensão superficial (NETZ; GONZÁLEZ ORTEGA, 2002). A calibração da imagem
é realizada através do diâmetro externo (mm) da seringa que é conhecido. Mede-se
o número de pixels correspondentes ao diâmetro externo da seringa, obtendo-se a
resolução da imagem em mm/pixel. A Figura 07 mostra a imagem da calibração
destacando a simetria da gota em relação ao eixo z, possibilitando assim análise
apenas de um dos lados.
46
Figura 07: Calibração da gota pendente.
No ato da formação de uma gota de líquido, mediante escoamento livre e
perpendicular do mesmo através de capilar, o volume da gota é inversamente
proporcional à tensão superficial do líquido (NETZ; GONZÁLEZ ORTEGA, 2002).
Na dinâmica do fenômeno, duas forças atuam simultaneamente e de modo
oposto. Uma delas, a força ascendente (Fa), devida à tensão superficial, opõe-se à
força descendente determinada pela massa da gota (Fd). A massa de cada gota é
expressa como Vi x g, onde Vi é volume individual da gota e g, a força gravitacional.
No momento imediatamente anterior ao desprendimento da gota, Fa e Fd se igualam.
3.7 Fármacos pouco solúveis – Triancinolona
Para se ter um efeito terapêutico eficaz, todo fármaco, independentemente da
via de administração, deve ter uma solubilidade em água, mesmo limitada. Por isso,
substâncias relativamente insolúveis em água podem apresentar uma absorção
incompleta, tornando recomendável o uso de sais solúveis ou de outros derivados
químicos. Alternativas que podem ser utilizadas são a micronização, complexação
ou técnicas de dispersão sólida. A solubilidade e, especialmente, o grau de
saturação no veículo também podem ser importantes na absorção do fármaco já
dissolvido em uma forma farmacêutica, uma vez que pode ocorrer a precipitação do
fármaco no trato gastrintestinal, alterando a sua biodisponibilidade (AULTON, 1988).
A solubilidade de fármacos no trato gastrintestinal também pode ser
melhorada por meio da dissolução micelar. A capacidade dos sais biliares de
aumentar a solubilidade de fármacos depende, especialmente, da lipofilia do
fármaco (NAYLOR, 1995).
47
Uma característica comum entre os corticosteróides é a baixa solubilidade em
água. Este fator limita o uso destes fármacos apesar de sua comprovada eficácia.
Os corticosteróides exercem efeitos sobre quase todas as células, influenciando o
metabolismo protéico, lipídico e glucídico, o balanço hidroeletrolítico, as funções
cardiovascular, renal, da musculatura esquelética, do sistema nervoso e de
praticamente todos os tecidos e órgãos. Desempenham um papel importante na
homeostasia dos estímulos nóxicos internos e externos (BOSCH et al., 2004).
Os corticosteróides são substâncias endógenas quimicamente classificadas
como esteróides, originalmente identificados no córtex da glândula adrenal. A
glândula adrenal consiste em duas pequenas glândulas dispostas acima dos rins. A
porção externa da glândula adrenal, o córtex adrenal, é essencial para a vida. Sua
origem embriológica é completamente diferente daquela da medula adrenal (RANG;
DALE; RITTER, 2003).
Os
glicocorticóides
possuem
a
propriedade
terapêutica
de
diminuir
significativamente a resposta inflamatória e suprimir a imunidade. O mecanismo
exato é complexo e não totalmente compreendido. Contudo, sabe-se que a
diminuição e a inibição dos linfócitos e macrófagos periféricos têm participação no
processo (HARPER, 1997).
Quanto à administração, os glicocorticóides podem ser administrados com
outros fármacos para prevenir rejeição de órgãos transplantados e para o tratamento
de certos tipos de neoplasias, como leucemias e linfomas (BOSCH et al., 2004).
A Triancinolona (TC) Figura 8, e seus derivados, tais como, acetonida (TCA),
acetato (TA), hexacetonida (THC), diacetato (TD), benetonida (TB) de triancinolona
são corticosteróides da família de glicocorticóide, derivados naturalmente de
prednisona e prednisolona (DAMIANI et al., 2001). Estes são antiinflamatórios e
imunossupressores muito utilizados para o tratamento de várias enfermidades tais
como artrites, osteoartrites, dermatites de contato e atópica, inflamações orais,
lesões e úlceras, bursites, quelóides, desordens da pele, tais como psoríase e
eczema, doenças relacionadas aos rins, olhos, anemia hemolítica, desordens
intestinais, como colite ulcerativa e doença de Crohn, asma e alergias (BOSCH et
al., 2004).
48
Figura 8: Estrutura química da Triancinolona.
A triancinolona (TC, 9 -fluor-11 ,16 ,17 ,21-tetrahidroxipregna-1,4-diene3,20-diona) (Figura 08) é um potente glicocorticóide sintético de depósito com
propriedades antiinflamatórias e imunossupressoras (BOOBIS et al., 1999). Atua
inibindo a síntese de prostaglandinas e leucotrienos, com conseqüente efeito
antiinflamatório (HOOD et al., 1999).
A dose terapêutica da triancinolona é praticamente desprovida da ação
mineralocorticóide, não provoca distúrbios psíquicos e nem os outros efeitos
colaterais da hidrocortisona, porém estas ações variam conforme o paciente
(MARTINDALE, 1999). Quando administrados 4 mg de triancinolona são
equivalentes, em atividade antiinflamatória, a cerca de 5 mg de Prednisolona (e
equivalentes à da metilprednisolona) (MORENO; MATOS; FEVEREIRO, 2001).
Quanto aos efeitos colaterais, estes são semelhantes aos dos glicocorticóides.
Dentre os componentes de ação intermediária, é o que possui meia vida mais longa
(cerca de 5 horas) (DAMIANI et al., 2001).
A triancinolona possui solubilidade em água de 80 mg/L. Na atualidade está
disponível no mercado farmacêutico com as seguintes formas: pasta dental,
ungüento tópico, spray nasal, suspensão intrasinovial, creme tópico, suspensão
intramuscular, suspensão intra-articular. A solução a 1% em água possui pH de 4,5 a
6 e pka de 8,1 (DAMIANI et al., 2001).
A farmacocinética da triancinolona administrada por via oral, como qualquer
outro glicocorticóide, é rápida e completamente absorvida pelo trato gastrointestinal
e liga-se às globulinas e à albumina séricas, em forma inativa. É rapidamente
convertida no fígado. Por ser uma pequena molécula lipofílica penetra nas células
49
por difusão simples. Atinge o efeito máximo após administração oral em 1 a 2 horas
e sua ação dura 1,25 a 1,5 dias. A meia vida plasmática da hidrocortisona é de 90
minutos e da triancinolona de 3,4 a 3,8 horas. A meia-vida biológica (tecidual) é de
18 a 36 horas (agente de ação intermediária). Seu metabolismo ocorre nas células
hepáticas e em outras células, com excreção pela urina. Quase todos os metabólitos
são excretados em 72 horas (MORENO; MATOS; FEVEREIRO, 2001).
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material
4.1.1 Reagentes e Materiais
Os reagentes e solventes utilizados neste experimento foram de grau analítico
(PA) e usados sem purificação prévia. Os reagentes e solventes utilizados:
•
Ácido Monocloroacético (Labsynth),
•
Benzaldeído (Biotec),
•
Boroidreto de Sódio (Biotec),
•
Água Destilada,
•
Etanol (Biotec),
•
Álcool Isopropanol (Biotec),
•
Membrana de acetato de celulose, massa molecular de corte 12400 – Sigma
Aldrich,
•
Triancinolona Base em pó (Galena, lote: TL 040402, Fabricação: 21/04/2004,
Origem: China, Validade: 21/04/2009).
•
Quitosana em pó (Purifarma lote: K041120338, Origem: China, Fabricante:
Golden Shell, data de fabricação: 12/2005, data de validade: 12/2007,
fracionada em: 06/06/2006).
•
Células de fibroblasto L929 (linhagem não tumorogênica) (Banco de Células
do Rio de Janeiro - RJCB).
4.1.2 Equipamentos
Principais aparelhos utilizados:
•
Potenciômetro pHmetro (Digimed, DM-21) – Univali.
•
Viscosímetro de Ostwald-fenske – Univali.
•
Condutivímetro (CD-21 Digimed/Tecnal escalas µS/cm 2000, const. Cel.
(cm-1) 1,0, coef. Temp. (%) = 2,0) – Univali.
51
•
Tensiômetro (Dataphysics OCA-Contact Angle System 15 plus, voltagem 12
UDC, com força de 55W) – Laboratório de Bioquímica – UFPR.
•
Sonicador (Sonics – Vibra cell SIM Sonda 630-0209) – Laboratório de
Bioquímica – UFPR.
•
Espectrofotômetro (Shimadzu UV 1601 - PC) – Univali.
•
Espectrofotômetro Infravermelho (Bomem MB 100) – Univali.
•
Espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear (Bruker – AC 300) –
Univali.
•
Centrífuga (Fanem, Excelsa Baby, 206/1) – Univali.
•
Liofilizador (Micro Modulyo-115) – Univali.
•
Freezer (Ultralow/6511) – Univali.
4.2 Métodos:
4.2.1 Síntese da O-carboximetilquitosana
Primeiramente, uma amostra de 26 g de hidróxido de sódio foi dissolvida em
20 mL de água e 180 mL de isopropanol. Em seguida, 20 g de pó de quitosana foi
adicionado e agitado durante uma hora a - 8 °C, a fim de alcalinizar e provocar o
intumescimento da quitosana. A mistura foi mantida em temperatura controlada em
banho de gelo, e depois armazenada em temperatura - 8 °C por, no mínimo, 24
horas. Posteriormente, 30 g de ácido monocloroacético foram dissolvidos em 40 mL
de isopropanol, que foram gotejados na mistura e reagiram por, no mínimo, 24
horas, à temperatura de - 8 °C. A reação foi interrompida pela adição de 400 mL de
álcool etílico 70%.
O sólido branco formado foi filtrado, enxaguado em álcool etílico 70-90% e
seco a vácuo em temperatura ambiente. A seguir, 10 g do sal de NaCM-quitosana
foi suspenso em 1 L de uma solução aquosa de álcool etílico 80%. Posteriormente,
100 mL de ácido clorídrico 37% foram adicionados e agitados por 30 minutos, a fim
de obter a forma ácida do derivado. O sólido foi filtrado e enxaguado em álcool
etílico 70-90% e seco a vácuo para neutralização (CHEN; PARK, 2003).
52
4.2.2 Síntese dos Derivados N-Benzilados
Os derivados benzilados foram sintetizados partindo-se inicialmente de 3 g
de O-CMQS-Na que
foram dispersos em 300 mL de água. Em seguida, nesta
dispersão foi adicionada uma solução de benzaldeído com relação molar de 0,1, 0,5,
1,0, 1,5 e 5,0, com base no monômero da O-CMQS, dissolvidos em metanol. A
adição de benzaldeído à dispersão de O-CMQS realizou-se em temperatura
ambiente e, posteriormente, a dispersão foi agitada durante 48 horas. O pH da
dispersão foi ajustado para 4,5 com uma solução de NaOH 1 mol/L. Uma solução de
boroidreto de sódio, contendo 1,5 g em 40 mL de água, foi adicionada. A solução em
seguida foi agitada por uma hora e meia. Os derivados benzilados da O-CMQS
formados foram precip itados e lavados pela adição de acetona. O aldeído em
excesso e os produtos inorgânicos foram removidos através de purificação em
Soxlet durante dois dias na presença de acetona. Depois, foram secos em
dessecador em temperatura ambiente para a obtenção dos derivados desejados
(RABEA et al., 2005). Conforme é mostrado na Tabela 1, foram obtidos sete
derivados benzilados com diferentes relações molares partindo-se dos Lote 01 e 02
de O-CMQS.
Tabela 1: Derivados benzilados obtidos a partir dos Lote 1 e 2 e relações molares de benzaldeído
utilizadas
Derivados
Sintetizados
O-CMQSB A
Lote de partida
01
Relações molares de
benzaldeído/O-CMQS
1:1
O-CMQSB B
01
0,1:1
O-CMQSB C
01
1,5:1
O-CMQSB D
02
0,5:1
O-CMQSB E
02
5,0:1
O-CMQSB F
02
1,5:1
O-CMQSB G
02
1,5*:1
*Preparado a partir da forma ácida.
53
O derivado anfifílico O-CMQSB G, apesar de possuir a mesma relação molar
de benzaldeído do derivado O-CMQSB F é uma amostra diferente, pois, a
metodologia de síntese deste derivado partiu da forma ácida da O-CMQS. Todos os
outros derivados benzilados foram sintetizados partindo-se de amostras na forma
salina. As amostras O-CMQSB C e O-CMQSB F apesar de possuirem a mesma
relação molar apresentam diferenças entre si quanto o lote de partida. O derivado OCMQSB C foi sintetizado a partir do Lote 1 da O-CMQS, já a O-CMQSB F foi
sintetizada a partir do Lote 2 da O-CMQS.
4.3 Caracterização dos Polímeros
4.3.1 Titulação Condutimétrica da O-CMQS
Para determinar o grau de carboximetilação da O-CMQS foram dispersos 50
mg de O-CMQS, na forma ácida, em 60 mL de água. Em seguida, foram
adicionadas alíquotas de 0,25 mL de NaOH 0,1 mol/L com o auxílio de uma bureta,
sob agitação constante. Os valores da condutividade foram obtidos com o auxílio de
um condutivímetro. Os dados obtidos foram utilizados para construir um gráfico de
condutividade versus volume de hidróxido de sódio adicionado (CASU; GENNARO,
1975).
Os valores dos dois volumes (V1 e V2) foram obtidos através da primeira
derivada e foram substituidos na Equação 1 para calcular o grau de
carboximetilação.
CH2 COO% = V2 – V1 x 5,8 x 100
Equação 1
50 mg
Onde:
•
V2 e V1 – volume de titulante no primeiro e no segundo ponto de inflexão
•
5,8 – relativo a massa molecular do acetato
•
50 mg – massa do polímero pesado
54
4.3.2 Titulação Potenciométrica da O-CMQS e derivados benzilados
Para determinar o percentual de grupos amino remanescentes na O-CMQS e
nos derivados benzilados foram dispersos 50 mg da amostra na forma acidificada
em 45 mL de água. Em seguida, o pH foi ajustado para 2,0 e posteriormente foram
adicionadas alíquotas de 0,25 mL de NaOH 0,1 mol/L com o auxílio de uma bureta
e sob agitação constante. Todos os valores da potenciometria foram obtidos com o
auxílio de um pHmetro. Os dados obtidos foram empregados para construir um
gráfico de pH versus volume de NaOH adicionado.
Este procedimento para caracterização dos polímeros, por titulação
potenciométrica, também foi realizado para os derivados benzilados na forma ácida
e forma salina.
A partir dos dois volumes obtidos através da aplicação da primeira derivada,
foi possível calcular a porcentagem de NH2 livre após a carboximetilação aplicandose a Equação 2.
%NH2 = M NaOH (V2 – V1) 161 x 100
m
Equação 2
Onde:
•
MNaOH é a molaridade da solução de NaOH (mol/L),
•
V1 e V2 são os volumes de NaOH usados respectivamente para neutralizar o
excesso de HCl e o NH3+,
•
161 é a massa molecular da unidade monomérica da quitosana,
•
m é a massa de amostra utilizada para a titulação, em gramas.
4.3.3 Espectroscopia no Ultravioleta
Para a espectroscopia de absorção na região de Ultravioleta, as amostras dos
polímeros O-CMQS e O-CMQSB na concentração de 1 mg/mL foram dispersas e
analisadas em espectrofotômetro em varredura 800-200 nm. Os espectros foram
55
obtidos no laboratório de instrumentação analítica do Curso de Farmácia da
UNIVALI.
4.3.4 Espectroscopia no Infravermelho
Para a espectroscopia de absorção na região do infravermelho as amostras
dos polímeros O-CMQS e O-CMQSB foram trituradas com brometo de potássio na
proporção
de
100:2
mg
de
polímero.
Os
espectros
foram
obtidos
em
espectrofotômetro no laboratório de instrumentação analítica do Curso de Farmácia
da UNIVALI.
4.3.5 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear
Para a espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear as amostras dos
polímeros O-CMQS e O-CMQSB na concentração de 20 mg/mL foram dissolvidas
em CD3COOD/D2O em temperatura ambiente. Os espectros foram obtidos no
laboratório de Ressonância Magnética Nuclear do Curso de Fármacia da UNIVALI.
O grau de susbtituição dos derivados benzilados foi calculado através dos
valores das integrais dos espectros de RMN de 1H. A metodologia utilizada para a
determinação do grau de substituição (GS) dos grupos NH2 da O-CMTS pelo
benzaldeído foi a de Liu e colaboradores (2006). O método está fundamentado na
relação entre o valor da integral dos hidrogênios aromáticos (próximo a 7,0 ppm) e o
valor da integral do hidrogênio ligado ao C-2 do anel glicosídico (em torno de 3,0
ppm) de acordo com a Equação 3.
GS = [(AI 1H arom)/ (AI 1H C-2)]x(1/N 1H arom)
Equação 3
Onde:
AI 1H arom- área correspondente a integral dos hidrogênios aromáticos
AI 1H C-2 - área correspondente a integral do hidrogênio ligado ao C-2
N 1H arom – número de prótons ligado ao anel aromático.
56
4.4 Viscosidade Intrínseca
Inicialmente foram pesadas cinco amostras diferentes de O-CMQS e também
dos derivados benzilados obtidos nas seguintes concentrações: 0,050, 0,100, 0,150,
0,200 e 0,250 g, as quais foram dispersos em 25 mL de água destilada obtendo
respectivamente dispersões de 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 e 2,5 %. Posteriormente, foi
adicionado às dispersões 145 mg de NaCl, obtendo assim uma concentração do sal
de 0,1 mol/L. Com auxílio do viscosímetro de Ostwald-fenske, foi analisado o tempo
de escoamento de cada solução a temperatura próxima a 25 ºC. Obtendo assim a
leitura na primeira concentração do sal. Depois de realizada a leitura na
concentração de NaCl 0,1 mol/L, adicionou-se mais 580 mg de NaCl em cada
amostra para obter a concentração 0,5 mol/L, realizando-se assim a segunda leitura.
Cada ensaio foi repetido até alcançar uma variação inferior a 0,5% (FARMACOPÉIA
BRASILEIRA, 1988).
As viscosidades relativas de todos os derivados testados foram obtidas a
partir da utilização do viscosímetro capilar de Ostwald-fenske e de um cronômetro
para registrar o tempo de escoamento do líquido através do capilar, utilizando-se
água como líquido de referência para calibração do viscosímetro. A viscosidade
relativa (
rel)
foi obtida através da Equação 4 :
rel
Onde:
rel
= t sol / to
Equação 4
: viscosidade relativa da amostra
tsol : tempo de escoamento de cada uma das dispersões
to : tempo de escoamento do solvente.
A viscosidade específica (
esp)
esp
Onde:
esp:
rel:
Equação 5
viscosidade relativa da amostra
red)
red
red:
= nrel – 1
viscosidade específica da amostra
A viscosidade reduzida (
Onde:
foi obtida através da Equação 5:
foi obtida aplicando-se a Equação 6:
=
esp
/C
viscosidade reduzida da amostra
Equação 6
57
esp:
viscosidade específica da amostra
C: concentração da dispersão polimérica
A viscosidade intrínseca foi determinada a partir de representação gráfica da
relação de Huggins, pela extrapolação da
red
em função da concentração em
polímero (C), extrapolando a reta à concentração nula conforme ilustrado na
Equação 7.
red
Onde:
red:
= [ ] + C.Kh.[ ]2
Equação 7
viscosidade reduzida da amostra
[ ]: viscosidade intrínseca da amostra
C: concentração da solução
Kh: constante de Huggins
A partir da viscosidade intrínseca foi determinado a massa molecular
viscosimétrica média (Mw), determinada a partir da equação de Mark-HouwinkSakurada conforme Equação 8.
[η] = K Mwa
Equação 8
Onde: [η]: viscosidade intrínseca da dispersão;
K e a: constantes que dependem do polímero e do sistema de
solvente utilizado.
4.5 Solubilidade dos derivados
Para o teste de solubilidade foram preparados 100 mL de dispersão de cada
derivado sintetizado: O-CMQS (Lotes 01 e 02) e O-CMQSB A (1:1), O-CMQSB B
(0,1:1), O-CMQSB C (1,5:1), O-CMQSB D (0,5:1), O-CMQSB E (5:1), O-CMQSB
F(1,5:1) e O-CMQSB G (1,5:1), na concentração de 1 mg/mL. O pH da dispersão
polimérica foi reduzido para 2,0 com HCl 0,1 mol/L. Então, em seguida foi
adicionado NaOH 0,1 mol/L a fim de aumentar o pH em uma unidade. Cada
58
dispersão polimérica teve ajustado o pH de 2 a 12, sendo que de cada leitura do pH
ajustado foi retirada uma alíquota de 3 mL em tubo de ensaio para ser analisada. A
leitura da transmitância das amostras foram realizadas em 600 nm, em
espectrofotômetro. Sendo considerado;
Solúvel T > 99%
Levemente Solúvel T 85 – 99%
Insolúvel abaixo de 85%
4.6 Determinação da Tensão Superficial
As medidas de tensão superficial foram realizadas em Curitiba no laboratório
de Bioquímica na Universidade Federal do Paraná.
Para os testes de tensão superficial foram preparadas diluições das amostras
sintetizadas de O-CMQS e O-CMQSB em água destilada nas seguintes
concentrações: 0,001, 0,01, 0,1, 1,0 e 1,2 mg/mL. As amostras foram dispersas 24
horas antes do experimento. A dispersão ocorreu em pH ácido (2,0) e pH básico
(10,0). Antes de iniciar o experimento todas as diluições foram ambientadas por
duas horas em temperatura ambiente (25 ºC aproximadamente). A leitura dos testes
foi realizada em aparelho tensiômetro (ANEXO A, p. 122). Foi utilizado o programa
de software SCA 20 para obtenção dos dados através do método da gota pendente.
O método da gota pendente consiste essencialmente de uma câmara
experimental aquecida onde a gota é formada, de um sistema óptico para capturar a
imagem da gota pendente e de um sistema de aquisição de dados num
microcomputador pentium PC para inferir a tensão superficial do perfil da gota. Um
procedimento de digitalização automático foi usado nas medidas de tensão
superficial apresentadas neste trabalho. A imagem da gota pendente é digitalizada
por um frame grabber interligado num microcomputador PC e as medidas de tensão
superficial são analisadas (COSTA et al., 2006).
Este procedimento foi realizado também para as dispersões contendo o
fármaco triancinolona.
4.7 Determinação de Hidrofobicidade por Sudan III
Os experimentos de verificação da hidrofobicidade dos polímeros sintetizados
foram realizados utilizando-se o método descrito por Oh e colaboradores (2006),
59
com modificações.
Inicialmente foi preparada a solução estoque do corante hidrofóbico Sudan III
(10 mg/mL) em clorofórmio. A Figura 9 mostra a estrutura do Sudan III.
Figura 9: Representação da estrutura química do Sudan III.
Os polímeros O-CMQS e O-CMQSB foram dispersos em água numa
concentração de 1 mg/mL, compondo a dispersão inicial. Posteriormente, volumes
de 0,02 mL, 0,1 mL, 0,2 mL, 0,3 mL e 0,4 mL da dispersão estoque foram diluídos
para 5 mL com água em duas dispersões diferentes: uma com pH ácido em torno de
2,0 e outra em pH básico em torno de 10,0. Nestas dispersões foi adicionado 1 mL
da solução estoque de Sudan III. As amostras foram agitadas por 24 horas a fim de
estabelecer a homogeneidade entre as substâncias misturadas (ANEXO B, p. 123).
Após o período de 24 horas de repouso foi realizada a leitura da absorbância
da fase aquosa, em 540 nm, correspondendo ao pico máximo de absorção do
Sudan III, usando-se água como branco para leitura em cubeta de quartzo. O cálculo
do corante dissolvido foi realizado com auxílio de uma curva padrão do Sudan III em
clorofórmio.
4.8 Citotoxicidade das matrizes
As células de fibroblasto L929 (linhagem não tumorogênica) foram obtidas do
Banco de Células do Rio de Janeiro (RJCB Collection). Estas foram crescidas em
meio DMEM (Meio Modificado Dulbeccos Eagles), suplementado com 10% de soro
fetal bovino, 10 mmoL/L de L-glutamina e 1% de aminoácidos não essenciais, 100
µg/mL de penicilina e 100 ug/mL de estreptomicina, em estufa a 37 ºC , com 5% de
CO2/95 ar. A citotoxicidade celular foi realizada utilizando-se 6 concentrações
crescentes da O-CMQS e O-CMQSB a saber 1000, 100, 10, 1, 0,1 e 0,01 µg/mL,
que foram dissolvidas em meio DMEM e esterilizados por filtração por 0,22 µm. Após
60
24 horas de incubação das células plaqueadas a 20000 células/poço, o meio de
cultura foi substituído por meio ausente de soro fetal bovino contendo as diluições
apresentadas e incubadas por 1 e 24 horas. Posteriormente, o meio contendo as
amostras foi substituído por novo meio de cultura com ausência de soro fetal bovino
e aplicados 20 µL de uma solução de (3-[4,5-Dimetil Tiazol-2-yl]-2,5- Brometo
Difeniltetrazolium) (MTT) estéril, em tampão PBS, pH 7,4 (5mg/mL), para gerar uma
concentração final de 0,5 mg MTT/mL. Após 4 horas, o corante não reativo foi
removido por inversão e os cristais de formazan insolúveis formados foram
dissolvidos em 200 µL/poço de Dimetil Sulfóxido (DMSO). A quantificação celular foi
realizada a 570 nm (INVITTOX/ERGATT/FRAME, 1990). A morte celular foi
caracterizada como necrose por lactato desidrogenase (LDH) e apoptose por
Annexina V conjugada com isotiocianato de fluoresceína (FITC) e atividade de
caspase 3. Os testes de citotoxicidade foram realizados no laboratório de
Farmacologia in vitro da UNIVALI.
4.9 Solubilidade do fármaco Triancinolona
Neste experimento foram utilizados dispersões de O-CMQS e O-CMQSB nas
concentrações de 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1,0 mg/mL. Em 10 mL destas dispersões foram
adicionadas 2 mg de TC. Posteriormente os tubos de ensaio foram agitados durante
24 horas a fim de garantir a saturação dos derivados e formação dos complexos,
este experimento foi realizado em pH 4,0 e 9,0. A triancinolona não incorporada foi
removida por centrifugação. Este procedimento também foi realizado com uma
solução aquosa de TC em pH 4,0 e 9,0 para efeito comparativo.
A quantidade de fármaco incorporado foi determinada por espectrofotometria
no ultravioleta, com leitura da absorbância em 242 nm. Os cálculos foram realizados
com base na absorbância da curva padrão analítica preparada com a TC dissolvida
numa solução de metanol/água 10/90 na concentração de 1 mg/mL. Todas as
soluções incluindo as dispersões poliméricas e curva padrão analítica, foram diluídas
10 vezes antes da leitura.
61
4.10 Liberação do Fármaco Triancinolona in vitro
Primeiramente foram pesados 50 mg do polímero de O-CMQS Lote 02 e 50
mg do polímero O-CMQSB F, que foram dispersas em 20 mL de água. Após
agitação foram adicionados 20 mg de TC. As misturas ficaram sob agitação por mais
12 horas. Posteriormente, 10 mL destas dispersões foram colocadas numa
membrana de diálise (membrana de acetato de celulose, massa molecular de corte
12400 – Sigma Aldrich). Uma terceira membrana foi preenchida com 10 mL de água
e 10 mg de TC. Estas membranas foram mergulhadas em 250 mL de solução
tampão fosfato pH 7,4 utilizada como solução receptora, sob agitação constante em
temperatura ambiente.
Em intervalos de tempo pré-determinados de 0, 15, 30, 60, 90, 120, 150, 360,
420, 480, 1380 minutos foi retirado 1 mL do meio para quantificar a absorbância
em 242 nm por espectrofotômetro no Ultravioleta.
Para o cálculo da liberação da TC foi aplicado o modelo do coeficiente de
difusão mostrado na Equação 9
Ln[(1-Mt)/M∞] = (ln8/π2 ) – [(Dπ2)/l2]t
Equação 9
Onde: Mt quantidade de TC liberada no tempo t
M∞ quantidade de TC liberada no equilíbrio
l espessura da membrana utilizada (51µm)
D coeficiente de difusão da TC.
O comportamento de liberação da TC, nos diferentes sistemas, foi avaliado
segundo o modelo de cinética de liberação de Higuchi mostrado na Equação 10.
Q = K.t1/2
Equação 10
Onde: Q representa a porcentagem de TC liberada
K constante aparente de liberação
t tempo
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Síntese e Caracterização dos Derivados Sintetizados
5.1.1 Síntese da O-CMQS e O-CMQSB
Na síntese da O-CMQS foi utilizado o método descrito por Chen e Park (2003)
modificado, partindo-se da quitosana com grau de desacetilação de 80%. As
modificações foram feitas em relação a temperatura e o tempo de reação. A síntese
dos derivados foi realizada em banho de gelo próximo a 0 °C e o armazenamento
ocorreu num período mínimo de 24 horas a - 8 °C, em congelador. Os demais
procedimentos do método também foram realizados em banho de gelo, visando
trabalhar em temperatura próxima de 0 °C, para que a substituição fosse direcionada
para a posição da hidroxila do carbono 6 permanecendo o grupamento NH2 livre. A
Figura 10 representa a reação da síntese do derivado O-CMQS.
Figura 10: Representação esquemática da reação de síntese da O-CMQS.
Os derivados O-CMQS foram sintetizados em dois momentos diferentes,
partindo-se da mesma metodologia, a fim de produzir dois lotes: O-CMQS Lote 01 e
O-CMQS Lote 02. Os dois derivados obtidos são do mesmo lote de quitosana de
partida. Na Tabela 2 constam os rendimentos obtidos da síntese dos dois lotes
produzidos.
Tabela 2: Rendimentos dos derivados O-CMQS Lote 01 e 02
Polímeros
Massa
Massa obtida
Rendimento (%)
pH
Sintetizados
quitosana (g)
(g)
Lote 01
20
17,19
85,95
9,57
Lote 02
20
17,24
90,85
9,03
(1 mg/mL)
63
O pH da dispersão da O-CMQS Lote 01 e Lote 02 são próximos a 9,0 devido
ao processo de síntese no qual é utilizada uma condição extremamente básica,
tendo como resultado um polímero na forma salina. A posterior conversão para a
forma ácida, através da dispersão do polímero numa solução etanólica ácida, resulta
num polímero que quando disperso em água apresenta um pH próximo a 4,2.
As sínteses dos derivados anfifílicos, contendo grupos benzênicos em sua
estrutura, foram realizadas através de reações entre o benzaldeído e os derivados
carboximetilados da quitosana através da formação das bases de Schiff (reação
entre a carbonila do aldeído e os grupos amino do polímero) levando à formação de
uma imina. Esta imina foi posteriormente reduzida para a obtenção dos respectivos
derivados, em um processo conhecido como aminação redutiva.
Foram utilizados os derivados O-CMQS Lote 1 e Lote 2 como material de
partida para a obtenção dos derivados anfifílicos com diferentes relações molares
entre os lotes e o benzaldeído segundo a ordem de 1:0,1, 1:0,5, 1:1, 1:1,5 e 1:5. Os
cálculos foram feitos com base na massa molar do monômero da O-CMQS (209,0
mg/mL). A Figura 11 mostra a reação de obtenção da O-CMQSB N-benzilada.
Figura 11: Representação esquemática da reação de obtenção da O-CMQSB N-Benzilada.
Na Tabela 3 estão listados os valores da massa, rendimento obtido na
síntese, bem como o pH da solução aquosa dos derivados. Conforme pode ser
observado, neste caso também o pH da dispersão aquosa dos derivados em água
está próximo de 9,0. O pH da dispersão dos derivados anfifílicos estão levemente
básico resultado da adição do NaBH4. Portanto, os derivados obtidos na síntese
estão na forma salina.
64
Tabela 3: Rendimentos dos derivados O-CMQSB benzilados sintetizados.
Derivados
Sintetizados
Massa
obtida
(g)
Rendimento
obtido
(%)
pH**
A
Lote de Relações
partida
molares
de
benzaldeído/OCMQS
01
1:1
4,99
79,15
8,63
B
01
0,1:1
4,53
72,13
8,95
C
01
1,5:1
5,3
84,39
8,85
D
02
0,5:1
4,92
78,34
9,11
E
02
5,0:1
5,19
84,23
9,07
F
02
1,5:1
5,13
81,68
8,99
G
02
1,5*:1
4,69
74,68
8,75
*método modificado. **pH em dispersão aquosa.
A escolha do método homogêneo de síntese dos derivados anfifílicos tem
como principal desvantagem o consumo de solvente orgânico para a obtenção do
sólido. Apesar desta desvantagem, este método foi escolhido uma vez que
resultados anteriores, utilizando o método heterogêneo resultaram em materiais com
baixa solubilidade, mesmo em valores de pH no qual os derivados da quitosana são
solúveis (DEBRASSI, 2008).
5.1.2 Titulação Condutivimétrica
A condutividade é a medida da mobilidade das espécies iônicas em solução e
depende do número de íons presente. Para eletrólitos fortes, a concentração de íons
na solução é diretamente proporcional à concentração de eletrólito adicionado à
solução, enquanto que para eletrólitos fracos, a concentração de íons na solução
depende de seu equilíbrio de dissociação: a condutividade depende do número de
íons presente e, portanto, do grau de ionização do eletrólito (CASU; GENNARO,
1975).
O princípio básico das titulações condutimétricas é a substituição dos íons
que têm certa condutividade, por outros íons, com condutividade diferente
(MUZZARELILI et al., 1982). Com as curvas de titulação condutivimétricas e os
65
respectivos pontos de inflexão foi possível calcular o percentual de substituição,
determinando o grau de carboximetilação (GC), aplicando a Equação 1 (p. 53) . Os
resultados e os valores são mostrados na Figura 12.
1800
O-CMQTS LOTE 01
O-CMQTS LOTE 02
1600
CONDUTÂNCIA (µS)
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
VOLUME DE NaOH (mL)
Figura 12: Curva de Titulação Condutimétrica da O-CMQS Lote 01 e Lote 02. Massa de
amostra de 50 mg, temperatura de 25 °C (+/-1°C) tituladas com solução de NaOH 0,1 mol/L.
Com auxílio da curva de titulação foram encontrados os volumes de hidróxido
de sódio que após a aplicação na Equação 1 resultaram nos valores mostrados na
Tabela 4. A preparação dos lotes em etapas diferentes teve como resultado
polímeros com praticamente o mesmo GC.
Tabela 4: Grau de carboximetilação dos derivados Lote 01 e 02 sintetizados.
Polímeros O-CMQS
V1 (mL)
V2 (mL)
Grau de Carboximetilação (%)
Lote 01
2,0
3,25
20,3
Lote 02
0,25
2,25
23,2
Os GC encontrados estão de acordo com Casu e Gennaro (1975) e
encontram-se dentro da faixa dos valores de 14 – 58% descritos por Muzzarelli et al
(1982). Contudo, o valor está muito distante daquele relatado por Chen e Park
(2003), que realizaram a síntese em temperaturas elevadas na faixa de 20 – 60 oC, e
66
obtiveram GC que variou entre 60 e 120 %, porém os polímeros resultantes
apresentavam a carboximetilação em diferente posições como o C-6, C-3 e NH2 da
quitosana.
5.1.3 Titulação Potenciométrica
Na titulação potenciométrica a medida do potencial de um indicador foi usada
para acompanhar a variação da concentração da espécie iônica envolvida na
reação, e assim detectar o ponto final da titulação. A titulação potenciométrica, como
apresentado na Figura 13, foi utlilizada primeiramente para a determinação da
quantidade de grupos NH2 que permaneceram livres após o processo de
carboximetilação.
12
10
pH
8
6
4
O-CMQS L1
2
O-CMQS L2 1 derivada
a
O-CMQS L1 1 derivada
O-CMQS L2
a
0
0
5
10
15
20
25
30
Volume de NaOH (mL)
Figura 13: Curva de titulação potenciométrica da O-CMQS Lote 01 e Lote 02 na forma acidificada
(pH 2,0). Massa de amostra de 50 mg, temperatura de 25 °C (+/-1°C), e tituladas com solução de
NaOH 0,1 mol/L.
Neste experimento o pH da solução de O-CMQS foi ajustado para 2,0 com
HCl e em seguida esta solução foi titulada com NaOH. O resultado deste
procedimento está mostrado na Figura 13. O perfil das curvas mostram três inflexões
atribuída a neutralização dos ácidos fracos –CH3COOH e –NH3+ e do HCl em torno
de 10,15 e 18 mL, respectivamente.
67
No mesmo gráfico também é mostrado a primeira derivada, método mais
indicado para a determinação dos volumes de neutralização das espécies presente
na solução. Como podem ser observados, os dois lotes apresentam o mesmo
comportamento durante o processo de titulação, mostrando que não existe
diferenças significativas entre eles. Os volumes dos pontos de neutralização foram
aplicados na Equação 2 (p.54) e os resultados são mostrados na Tabela 5. O grau
de desacetilação da quitosana foi de 80 %.
Tabela 5: Percentual de grupos amino protonáveis dos lotes sintetizados.
Polímeros O-CMQS
V1 (mL)
V2 (mL)
Grupos amino (%)
Lote 01
11,8
18,8
66,7
Lote 02
11,3
17,6
68,6
Apesar
do
controle
da
temperatura
próxima
a
0o
C,
ocorreu
a
carboximetilação também nos grupos NH2 da quitosana. A carboximetilação da
amina livre também foi observada por Chen e Park (2003) mesmo trabalhando numa
faixa de temperatura mais alta, no caso destes pesquisadores o GC nos grupos
amina livre ficou em torno de 10 %.
Na Figura 14 é mostrada a curva de titulação da O-CMQS Lote 01 e O-CMQS
Lote 2 na forma ácida. Conforme mencionado anteriormente, o pH inicial da
dispersão foi aproximadamente 4,0. Quando comparado com a titulação no qual o
pH da dispersão foi ajustada para 2,0 (com HCl) é possível notar uma diferença
significativa no perfil das curvas de titulação. Neste caso, na ausência do HCl, as
curvas representam apenas a neutralização dos ácidos fracos presentes nos
polímeros que neste caso são os grupos –CH3COOH e –NH3+.
As várias inflexões que aparecem nas curvas estão relacionadas com as
diferentes substituições que ocorreram durante o processo de síntese, entre as
quais se pode citar: carboximetilação do C6, C3 e NH2 resultando em diferentes
unidades monoméricas no polímero. Este comportamento também é observado na
titulação da forma salina dos derivados com HCl, conforme mostrado na Figura 15.
68
13
12
O-CMQTS LOTE 01
O-CMQTS LOTE 02
11
10
pH
9
8
7
6
5
4
3
0
2
4
6
8
VO LUME DE NaOH (mL)
Figura 14: Curva de Titulação potenciométrica da O-CMQS Lote 01 e Lote 02 na forma ácida.
Massa de amostra de 50 mg, temperatura de 25 °C (+/-1°C), e tituladas com solução de NaOH 0,1
mol/L.
10
O-CMQS LOTE 01
O-CMQS LOTE 02
9
8
pH
7
6
5
4
3
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
VOLUME DE HCl (mL)
Figura 15: Curva de titulação potenciométrica da O-CMQS Lote 01 e Lote 02 na forma salina.
Massa de amostra de 50 mg, temperatura de 25 °C (+/-1°C) tituladas com solução de HCl 0,1 mol/L.
Utilizando-se da mesma técnica já descrita para a caracterização por titulação
potenciométrica das amostras de O-CMQS Lote 01 e Lote 02 foram realizadas as
caracterizações para os derivados benzilados. O mesmo padrão de caracterização
foi realizado para as titulações potenciométricas na forma ácida, forma salina e
69
forma acidificada. A Figura 16 representa o gráfico que foi construído com os
resultados obtidos na forma acidificada, já as Figuras 17 e 18 representam a forma
salina e forma ácida, respectivamente.
12
10
O-CMQSB
O-CMQSB
O-CMQSB
O-CMQSB
O-CMQSB
O-CMQSB
O-CMQSB
pH
8
6
A
B
C
D
E
F
G
4
2
0
2
4
6
8
10
VOLUME DE NaOH (mL)
Figura 16: Curva de titulação potenciométrica da O-CMQSB A, B, C, D, E, F, G na forma
acidificada com pH 2,0 (HCl 0,1 mol/L). Massa de amostra de 50 mg, temperatura de 25 °C (+/-1°C),
tituladas com solução de NaOH 0,1 mol/L.
O-CM QSB
O-CM QSB
O-CM QSB
O-CM QSB
O-CM QSB
O-CM QSB
O-CM QSB
10
9
8
A
B
C
D
E
F
G
pH
7
6
5
4
3
0
2
4
6
8
10
12
VOLUME DE HCl (mL)
Figura 17: Curva de titulação potenciométrica da O-CMQS A, B, C, D, E, F e G na forma
salina. Massa de amostra de 50 mg, temperatura de 25 °C (+/-1°C), e tituladas com solução de HCl
0,1 mol/L.
70
14
12
pH
10
O-CMQSB A
O-CMQSB B
O-CMQSB C
O-CMQSB D
O-CMTSB E
O-CMQSB F
O-CMQSB G
8
6
4
0
2
4
6
8
VOLUME DE NaOH (mL)
Figura 18: Curva de titulação potenciométrica da O-CMQSB A, B, C, D, E, F e G na forma
ácida pH em torno de 4,0. Massa de amostra de 50 mg, temperatura de 25 °C (+/-1°C), e tituladas
com solução de NaOH 0,1 mol/L.
A análise dos perfis das curvas de titulação mostra que não existe uma
relação direta entre a quantidade de aldeído utilizada na síntese e os resultados da
titulação potenciométrica. Devido a presença de mais um substituinte na cadeia
polimérica (anel aromático) a interpretação das curvas fica mais difícil. Por este
motivo esta metodologia não foi utilizada para a determinação da quantidade de NH2
e, consequentemente, o grau de substituição dos grupos NH2 pelo anel aromático.
A complexidade das curvas de titulação pode ser observada nas Figuras 17 e
18 que representam a titulação dos derivados anfifílicos na forma salina e ácida,
respectivamente. De maneira geral podemos observar que na ausência de HCl ou
NaOH na dispersão inicial, não existe diferença significativas das curvas de
titulação.
5.1.4 Espectroscopia no Ultravioleta (UV) dos derivados sintetizados
Medidas de absorção baseadas em radiação ultravioleta encontram vasta
aplicação para identificação e determinação de muitas espécies inorgânicas e
orgânicas. Os métodos de absorção molecular talvez sejam os mais amplamente
usados dentre todas as técnicas de análises quantitativas em laboratórios químicos
(LIMA, 1997).
71
A espectroscopia de absorção ultravioleta envolve a absorção de luz UV por
uma molécula promovendo o deslocamento de um elétron desde um orbital
molecular fundamental a um orbital excitado. As características de absorção das
moléculas orgânicas na região no ultravioleta dependem das transições eletrônicas
que podem ocorrer e dos efeitos do ambiente em que estão os átomos sobre as
transições (SILVERSTEIN; BASSELER; MORRIL, 1994).
No presente trabalho a metodologia no UV foi utilizada para a análise
qualitativa dos derivados O-CMQS Lote 01 e O-CMQSB A, B, D, E, e G, conforme é
mostrado na Figura 19.
4 ,0
3 ,5
O - C M Q S L o te 0 1
O -C M Q S B A
O -C M Q S B B
O -C M Q S B D
O -C M Q S B E
O -C M Q S B G
ABSORBÂNCIA (µ.a)
3 ,0
2 ,5
2 ,0
1 ,5
1 ,0
0 ,5
0 ,0
200
300
C O M P R IM E N T O D E O N D A ( n m )
Figura 19: Perfil de absorbâncias obtidas dos derivados sintetizados benzilados e não
benzilados, em água.
A espectroscopia na região no ultravioleta é a forma mais simples de verificar
se ocorreu a introdução do anel benzênico na O-CMQS. Conforme mostrado na
Figura 19 existe uma diferença muito grande entre os espectros dos derivados
anfifílicos e da O-CMQS. Nos derivados é possível observar uma banda na região
próxima a 250 nm, atribuída a presença do anel no polímero. Por outro lado, na OCMQS esta banda está ausente. A posição desta banda está muito próxima dos
valores para o tolueno, 262 nm (SILVERSTEIN; BASSELER; MORRIL, 1994).
72
5.1.5 Espectroscopia no infravermelho (FT-IR)
A espectroscopia na região do infravermelho (IV) é uma técnica de grande
importância na análise orgânica qualitativa, sendo amplamente utilizadas nas áreas
de química de produtos naturais, síntese e transformações orgânicas. O
infravermelho e demais métodos espectroscópicos modernos como a ressonância
magnética nuclear de hidrogênio (RMN–1H) são, na atualidade, muito utilizados em
trabalhos de pesquisa a fim de caracterizar polímeros e seus derivados hidrofóbicos
(LOPES; FASCIO, 2004).
A condição para que ocorra absorção da radiação na região do infravermelho
é que haja variação do momento de dipolo elétrico da molécula como conseqüência
de seu movimento vibracional ou rotacional (o momento de dipolo é determinado
pela magnitude da diferença de carga e a distância entre dois centros de carga)
(SILVERSTEIN; BASSELER; MORRIL, 1994).
Somente nessas circunstâncias o campo elétrico alternante da radiação
incidente interage com a molécula, originando os espectros. De outra forma, pode-se
dizer que o espectro de absorção no infravermelho tem origem quando a radiação
eletromagnética incidente tem uma componente com freqüência correspondente a
uma transição entre dois níveis vibracionais (SILVERSTEIN; BASSELER; MORRIL,
1994).
As bandas de absorção características dos derivados sintetizados Lote 1 e 2
foram obtidas de amostras na forma salina e ácida. Na Figura 20 estão destacados
os espectros de infravermelho na forma salina e na Figura 21 em pH ácido.
Na Figura 20, analisando os dois espectros de IV dos lotes 1 e 2,
semelhanças podem ser observadas pela presença de bandas características nos
sinais em 1076 cm-1 (C–O– estiramento), 1610 cm-1 (–COOH), 3400 cm-1 (–O–H
estiramento).
O IV realizado na forma salina não evidencia outras bandas, somente dá
destaque para as bandas enumeradas. Os dois lotes se comportam de forma
semelhante.
73
65
O -C M Q S L o te 0 1
O -C M Q S L o te 0 2
60
TRANSMITÂNCIA
55
50
45
40
35
30
25
4000
3500
3000
2000
1500
1000
500
N ú m e ro d e o n d a (c m -1 )
Figura 20: Espectro de infravermelho da O-CMQS Lote 01 e Lote 02 na forma salina, leitura
em temperatura ambiente.
Na comparação dos espectros das amostras dos Lotes 1 e 2 da O-CMQS
(Figura 21) em pH ácido, obtidos sobre os suportes de pastilhas de KBr, e
relacionados com dados da literatura, foram observadas diferenças significativas
entre os espectros.
65
60
Transmitância (%)
55
50
45
40
35
30
25
4000
O-CMQS lote 1
O-CMQS lote 2
3500
3000
2000
1500
1000
500
-1
Número de onda (cm )
Figura 21: Espectro de infravermelho da O-CMQS Lote 01 e Lote 02 em pH ácido, leitura em
temperatura ambiente.
74
Na Figura 21 aparecem os seguintes sinais: em 1650 cm-1 (–COOH), 1490
cm-1 (–NH2), 2900 cm-1 (estiramento C–H), 1060 cm-1, 1030 cm-1 e 1160 cm-1
representa –C–O estiramento, –CH2–OH no álcool primário e –C–O–C– no éter,
respectivamente. Os picos observados em 1590 cm-1 e 1410 cm-1 representam
estiramento assimétrico e estiramento simétrico de –COO-. Picos em 3420 cm-1 e
2920 cm-1 estiramento em –O–H e –C–H, respectivamente. Em 1400 cm-1 o pico é
resultado da sobreposição dos picos NH2, –COOH e –COO-. No derivado Lote 01 os
picos são menores quando comparados com os picos do Lote 02. Também pode ser
observado que para o Lote 01 é bem evidente a banda 3450 cm-1 (estiramento –O–
H) o mesmo não aparecendo com esta clareza para o Lote 02. Os dois lotes se
comportam de forma diferente quando analisados pelo IV em pH ácido.
Na comparação dos espectros dos derivados benzilados na forma salina,
Figura 22, e na forma ácida Figura 23, semelhanças podem ser observadas pela
presença de bandas características nos espectros e também é possível a
identificação de um número maior de bandas em pH ácido.
70
TRANSMITÂNCIA
60
50
40
O -C M Q S B
O -C M Q S B
O -C M Q S B
O -C M Q S B
O -C M Q S B
O -C M Q S B
30
20
4000
3500
3000
2000
1500
1000
A
B
C
E
F
G
500
N ú m e ro d e o n d a (c m -1 )
Figura 22: Espectro de infravermelho das O-CMQSB na forma salina, leitura em temperatura
ambiente.
Sinais em 1076 cm-1 (–C–O– estiramento), 1710 cm-1 (–COOH), 1590 cm-1 (–
NH2), 3450 cm-1 (estiramento –O–H), 2700 cm-1 (estiramento –C–H), 1260 cm-1 (–C–
N), 1500 cm-1 aumento do pico resultado da sobreposição dos picos NH2, –COOH e
75
–COO- especialmente para o IV em pH ácido (Figura 23). No IV na forma ácida ainda
se observa uma série de picos entre as bandas 1300 a 700 cm-1.
70
TRANSMITÂNCIA
60
50
40
30
O-CMQSB
O-CMQSB
O-CMQSB
O-CMQSB
O-CMQSB
O-CMQSB
20
10
4000
3500
3000
A
B
C
D
F
G
2000
1500
1000
500
Número de onda (cm-1)
Figura 23: Espectro de infravermelho das O-CMQSB na forma ácida, leitura em temperatura
ambiente.
O espectro na forma salina traz bem evidente a banda caracterizada pela
substituição do benzeno, através do pico 1650 cm-1, na forma ácida esta banda não
possui o mesmo destaque com exceção para o espectro que representa o derivado
O-CMQSB C.
Os espectros de todas as amostras na forma salina apresentam uma banda
estreita e fechada em 3450 cm-1, e quando comparados entre si os espectros das
amostras, poucas diferenças são evidenciadas, exceção para o derivado benzilado
O-CMQSB C.
Já os espectros dos mesmos derivados na forma ácida apresentam uma
banda larga e arredondada na região de 3500-3000 cm-1, representando o
estiramento de grupos –OH e –NH2. As bases de Schiff obtidas a partir da O-CMQS
apresentam um contorno maior na forma salina, sugerindo mudanças na absorção
dos grupos amino.
Os resultados mostram que o polissacarídeo O-CMQS foi modificado por
reação com benzaldeído (obtenção de bases de Schiff). Observa-se também o
76
aparecimento de novos picos de absorção devido a mudanças estruturais após a
reação.
5.1.6 Espectroscopia de RMN–1H
A análise do espectro de RMN 1H da O-CMQS Lote 02, Figura 24, permitiu
fazer algumas considerações quanto a estrutura química. Na observação dos sinais
correspondentes aos hidrogênios ligados aos carbonos, o sinal do próton da OCMQS aparece em 1,06 ppm (CH3, grupo acetamido), 3,22 ppm (CH, carbono 2 do
anel), 3,77 ppm (CH, carbono, 2 do anel de glicosamina com o grupo amino
substituído), 3,7- 4,0 ppm (CH, carbono 3, 4 e 6 do anel de glicosamina), 4,09 ppm
(CH2, grupo carboximetil), 4,11 ppm (CH, carbono 5 do anel da glicosamina), 4,85
ppm (CH, carbono 1 do anel de glicosamina).
1
Figura 24: Espectro de RMN H da O-CMQS Lote 02 em D2O, em temperatura ambiente.
Estas ressonâncias podem ser encontradas no espectro de RMN de 1H da
quitosana descrito por Kubota e Eguchi (1997) e Shigemasa et al. (1996). Na região
entre 4,05 e 4,55 ppm, as ressonâncias são dos prótons da substituição em 6 (–O –
CH2 –COOH) da O-CMQS. E o sinal pode ser encontrado nos espectros de RMN 1H
da N-carboximetilquitosana (MUZZARELLI; ILARI; PETRARULO, 1994). Os
77
resultados mostram que os grupos amino foram em parte carboximetilados junto
com os grupos hidroxila.
Na Figura 25 é mostrado o espectro de RMN 1H do derivado O-CMQSB E. O
padrão do espectro foi observado para todos os derivados anfifílicos preparados.
1
Figura 25: Espectro de RMN H da O-CMQSB E em D2O, em temperatura ambiente.
Na análise da Figura 25, alguns sinais são parecidos com o espectro da OCMQS. Porém, observa-se que alguns sinais sofreram um leve deslocamento para a
direita, pela influência do anel benzênico em 7,17 ppm. No espectro da Figura 24
este sinal não foi identificado, pois ele resulta da substituição realizada no derivado
O-CMQS pelo benzaldeído. Nos dois espectros aparecem dois sinais, um em 1,99
ppm é relativo ao solvente CD3COOD e outro em 2,08 correspondente ao D2O nesse
mesmo solvente (GOTTLIEB; KOTLYAR; NUDELMAN, 1997).
5.1.6.1 Determinação do grau médio de substituição
Os valores das integrais dos espectros de RMN de 1H dos derivados foram
utilizados para a determinação do grau de substituição (GS) dos grupos NH2 da OCMTS pelo benzaldeído por Liu e colaboradores (2006). O método esta baseado na
relação entre o valor da integral dos hidrogênios aromáticos (próximo a 7,0 ppm) e o
valor da integral do hidrogênio ligado ao C-2 do anel glicosídico (em torno de 3,0
78
ppm). A partir da Equação 3 (p. 55) foi possível calcular o GS para os derivados
anfifílicos.
Tabela 6: Grau de substituição no grupo NH2 dos derivados anfifílicos, calculados a partir dos
1
espectros de RMN H
Derivado
Relação benzaldeido:O-CMQS
GS (%)
O-CMQSB A
1:1
53
O-CMQSB B
0,1:1
12
O-CMQSB C
1,5:1
88
O-CMQSB D
0,5:1
40
O-CMQSB E
5:1
110
O-CMQSB F
1,5:1
8
O-CMQSB G
1,5:1
73
Conforme mostrado na Tabela 6, há relação entre a quantidade de
benzaldeído utilizado na síntese e o GS dos derivados anfifílicos. O GS para o
derivado O-CMQSB E acima de 100 % pode ser devido a dissubstituição dos
nitrogênios da amina pelos grupos, pois foi utilizado um excesso de cinco vezes. O
GS foi proporcional à quantidade de aldeído utilizada na síntese. Um resultado
inesperado, foi a diferença entre os dois derivados preparados com a relação 1,5:1
de benzaldeído uma vez que a reação ocorre somente entre a carbonila do aldeído e
os grupos NH2 livre do polímero. Os dois foram preparados com a O-CMQS Lote 02
sendo a única diferença, a forma utilizada, salina para o derivado F e ácida para o
derivado G. Para todos os outros derivados a O-CMQS utilizada foi na forma salina.
O GS de derivados da O-CMQS depende de vários fatores como, por
exemplo, a rota sintética, a estrutura química do substituinte, a característica do
polímero de partida, entre outros. Derivados preparados com aldeídos aromáticos
através da formação de base de Shiff em meio homogêneo apresentaram valores
próximos a 60 %, independente dos aldeídos utilizados (GUO et al., 2006). Um
derivado preparado com ácido linoleico através da formação de amida apresentou
um GS de 3% (LIU et al., 2007a). Derivados contendo grupos hexanoil foram obtidos
através da reação com anidrido hexanóico com DS entre 30 e 48 % (LIU et al.,
2007b). A reação entre a O-CMQS e o anidrido succínico em meio aquoso gerou um
derivado com DS de 72 % (ZHU et al., 2007).
79
5.1.7 Solubilidade dos Derivados sintetizados
Segundo Zhu e colaboradores (2005a), a quitosana é insolúvel em solução
aquosa neutra ou alcalina e é solúvel em soluções ácidas. Presumivelmente, o
grande número de sítios catiônicos ao longo da cadeia permite a solubilidade em
água por aumentar tanto a polaridade do composto quanto o grau de repulsão
eletrostática entre unidades do polímero. Evidentemente, a quitina possui uma
porcentagem insuficiente de unidades de glucosamina para permitir solubilidade em
água, até mesmo em condições ácidas. Esta característica de solubilidade é talvez a
principal diferença entre estas duas estruturas.
Na Tabela 7 é mostrada a solubilidade dos polímeros em diferentes valores
de pH. A carboximetilação da quitosana provoca um aumento da solubilidade devido
a introdução dos grupos carboxilado, conforme descrito na literatura (CHEN; PARK,
2003). A solubilidade depende do processo e do grau de carboximetilação e da
metodologia utilizada no processo de carboximetilação.
No presente estudo foi observado uma pequena precipitação do polímero
durante a mudança de pH, indicado na tabela como insolúvel (INS), em outros casos
apenas uma leve turvação da solução, indicando como pouco solúvel (LIN). Outro
ponto a ser destacado neste estudo é a concentração utilizada na preparação das
dispersões, 1 mg mL-1,
cinco vezes maior do que o utilizado por Chen e Park
(2003). A alteração na metodologia foi feita, pois na concentração descrita no
método a dispersão mantinha-se transparente em toda a faixa de pH.
80
Tabela 7: Solubilidade da O-CMQS e O-CMQSB em água com variação de pH em temperatura
ambiente.
pH
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Lote 1
S
S
S
S
S
INS
S
S
S
S
S
Lote 2
S
S
S
S
S
INS
S
S
S
S
S
A
S
S
S
S
LIN
INS
S
S
S
S
S
B
S
S
S
S
LIN
INS
S
S
S
S
S
C
S
S
S
S
LIN
INS
S
S
S
S
S
D
S
S
S
S
LIN
INS
S
S
S
S
S
E
S
S
S
S
LIN
INS
S
S
S
S
S
F
S
S
S
S
LIN
INS
S
S
S
S
S
G
S
S
S
S
LIN
INS
S
S
S
S
S
Amostra
S= solúvel, LIN= pouco solúvel, INS= insolúvel
Em pH ácido a porção da molécula que contém o grupamento NH2 apresentase protonada, isto é NH3+, o que torna o polímero solúvel. Por outro lado, em pH
básico os grupos referentes ao ácido carboxílico estão na forma salina resultando
também na solubilização do polímero.
Observa-se, comparando os dados obtidos, que em todas as amostras em pH
7,0 os derivados são insolúveis. A introdução dos grupos hidrofóbicos praticamente
não alterou a solubilidade dos derivados, apenas em pH 6,0 ocorreu uma pequena
turvação da dispersão. Este comportamento era esperado uma vez que a
derivatização provoca a diminuição dos grupos NH2 livres presente na O-CMQS,
principais responsáveis pela dissolução do polímero em valores de pH baixo
(formação do NH3+).
5.2 Viscosidade Intrínseca
Em soluções diluídas as dimensões das cadeias ou o volume hidrodinâmico
de uma cadeia isolada, podem ser caracterizados através da determinação da
viscosidade intrínseca da solução, dependente de algumas variáveis como: massa
molecular, estrutura química e conformação das moléculas, pureza do solvente,
temperatura e, por vezes, da velocidade de cisalhamento (CANDAU; SELB, 1999).
81
A viscosidade intrínseca foi determinada a partir da representação gráfica da
relação de Huggins pela extrapolação da viscosidade reduzida, expressa em função
da concentração em polímero, à concentração nula.
As amostras de O-CMQS foram dispersas em água e deixadas em agitação
constante por 2 horas para a completa dissolução. Uma vez estabelecida às
condições de trabalho iniciou-se a determinação do tempo de escoamento das
soluções poliméricas. Os dados da viscosidade intrínseca [η] a 25°C (+/-1°C) foram
determinados medindo-se inicialmente os tempos de escoamento das soluções de
O-CMQS Lote 01 e Lote 02 e, aplicando as equações 04,05 e 06.
De acordo com a Equação 7 (p. 57), a [η] é obtida a partir do coeficiente linear
da reta do gráfico da ηred em função da concentração. Na Figura 26 são mostradas
as curvas da ηred versus concentração da dispersão dos polímeros de partida.
600
O-CMQSLOTE 01 (0,1 mol/L)
O-CMQSLOTE 02 (0,1 mol/L)
O-CMQSLOTE 01 (0,5 mol/L)
O-CMQSLOTE 02 (0,5 mol/L)
ηred (mL/g)
500
400
300
200
100
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
CONCENTRAÇÃO DO POLÍMERO (mg/mL)
Figura 26: Determinação gráfica da viscosidade intrínseca para os derivados O-CMQS Lote
01 e Lote 02 em NaCl nas concentrações de 0,1mol/L e 0,5 mol/L, a 25°C (+/-1°C).
Conforme mostrado na Tabela 8, a viscosidade intrínseca dos Lotes 01 e 02
da O-CMQS não diferem muito entre si. Estes resultados eram esperados, pois o
grau de carboximetilação (GC) dos dois lotes foram muito próximo. Este
82
comportamento também foi relatado por Chen e colaboradores (2006) para
dispersões da O-CMQS com diferentes GC.
Chen e colaboradores (2005) relataram que a viscosidade intrínseca da
solução de O-CMQS varia muito pouco com o grau de substituição, mas por outro
lado, a viscosidade intrínseca aumentou com o grau de desacetilação de 28 a 74%.
Quando o grau de desacetilação é aproximadamente 95% a viscosidade aumenta
com o grau de substituição.
A partir da viscosidade intrínseca foi determinado a massa molecular
viscosimétrica média (Mw), determinada a partir da equação de Mark-HouwinkSakurada, Equação 8 (p. 57).
Os valores de “K” e “a” utilizados neste trabalho foram 7,9x10-5 e 1,00
respectivamente, considerando que a quitosana utilizada tem grau de desacetilação
de 77% (GE; LUO, 2005).
Conforme observado na Tabela 8, a carboximetilação da quitosana produz
polímeros com [η] e Mw que parece menor quando comparada com o polímero de
partida. A diminuição da viscosidade intrínseca está relacionada com a introdução
de grupos que sofrem o processo de ionização em meio aquoso aumentando a
interação entre as cadeias poliméricas, efeito semelhante à adição de sal.
Outro parâmetro alcançado a partir da Equação 8 é a constante de Huggins
(Kh), obtido a partir do coeficiente angular da reta e da [η], que é uma medida da
interação entre polímero-polímero em solução.
O Kh é independente da massa molecular para polímeros de cadeia longa,
com valores entre 0,30-0,40 para um bom solvente, e entre 0,5-0,8 para um solvente
θ. Elevados valores de Kh indicam que existe forte interação entre as moléculas e
quando o valor de Kh é muito alto existe associação entre as moléculas (XIONG;
TAM; GAN, 2005; PEESAN et al., 2006). Um solvente teta nem estende nem contrai
a cadeia de polímero. Um solvente θ está entre um solvente "bom" e um solvente
"mau". Um bom solvente estende as cadeias de polímero (mais distância entre os
extremos do polímero). Um "mau" solvente contrai a cadeia de polímero, e isto
diminui distância extremo a extremo.
A viscosidade dos derivados anfifílicos foi utilizada para verificar a influência
dos substituintes na massa molecular média e também comparar o efeito do anel
aromático nas interações intramoleculares em soluções diluídas do polímero. Os
83
dados da viscosidade intrínseca para os derivados anfifílicos também foram obtidos
a 25°C (+/-1°C) medindo-se inicialmente os tempos de escoamento das soluções de
O-CMQSB A, B, C, D, E, F e G nas seguintes concentrações: 0,1; 0,2; 0,5; 0,8 e 1,0.
Tabela 8. Valores dos testes das viscosidades intrínseca das dispersões nas concentrações de
0,1mol/L e 0,5 mol/L, a 25°C (+/-1°C).
Concentração
Viscosidade
Erro*
Massa
Constante
de NaCl
Intrínseca
[η]
Viscosimétrica
de Huggins
mol/L
[η] (mL/g)
(mL/g)
(mg/mL)
(Kh)
QTS
535
-
58,8 X 105
0,69
0,9978
O-CMQS Lote 01 0,1
163
5,7
2,06 x105
2,31
0,9993
O-CMQS Lote 02 0,1
167
28,9
2,16 x 105
1,02
0,9854
O-CMQS Lote 01 0,5
141
21,3
1,77 x 105
2,75
0,9899
O-CMQS Lote 02 0,5
209
10,1
2,64 x 105
0,59
0,9916
5
3,56
0,9916
R
O-CMQSB A 0,1
122
6,5
1,56 x 10
O-CMQSB B 0,1
169
17,0
2,13 x 105
1,73
0,9933
O-CMQSB C 0,1
161
2,7
2,03 x 105
1,97
0,9998
O-CMQSB D 0,1
179
4,8
2,26 x 105
1,47
0,9994
O-CMQSB E 0,1
88
2,2
1,11 x 105
2,64
0,9993
O-CMQSB F 0,1
105
2,9
1,31 x 105
1,02
0,9970
5
0,61
0,9998
O-CMQSB G 0,1
245
1,85
3,10 x 10
O-CMQSB A 0,5
115
3,4
1,45 x 105
3,15
0,9996
O-CMQSB B 0,5
134
6,7
1,69 x 105
2,66
0,9997
O-CMQSB C 0,5
131
14,0
1,48 x 105
2,49
0,9992
O-CMQSB D 0,5
199
12,0
2,51 x 105
0,87
0,9931
5
1,40
0,9981
O-CMQSB E 0,5
100
2,5
1,26 x 10
O-CMQSB F 0,5
98
1,7
1,24 x 105
1,40
0,9990
O-CMQSB G 0,5
179
1,2
2,26 x 105
0,80
0,9998
*Erro obtido a partir da regressão linear
As Figuras 27 e 28 representam os valores das viscosidades intrínsecas
obtidos nas duas concentrações de NaCl utilizadas 0,1 e 0,5 mol/L
84
600
500
O-CMQSB A
O-CMQSB B
O-CMQSB C
O-CMQSB D
O-CMQSB E
O-CMQSB F
O-CMQSB G
ηred(mL/g)
400
300
200
100
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
CONCENTRAÇÃO (g%)
Figura 27: Determinação gráfica da viscosidade intrínseca para os derivados benzilados na
concentração de NaCl 0,1 mol/L, a 25°C (+/-1°C).
Considerando a [η], é possível observar que não existe uma relação entre o
GS dos derivados anfifílicos e a [η].
De maneira geral o processo de síntese dos derivados alterou o
comportamento viscosimétrico dos polímeros. No caso O-CMQSB E que apresentou
um valor [η] abaixo do polímero de partida para a mesma concentração de NaCl,
outro resultado discrepante ocorreu com o O-CMQSB G que apresentou aumento
na viscosidade após o processo de síntese, quando comparado com o polímero de
partida.
85
600
550
500
450
O-CMQSB A
O-CMQSB B
O-CMQSB C
O-CMQSB D
O-CMQSB E
O-CMQSB F
O-CMQSB G
ηred(mL/mg)
400
350
300
250
200
150
100
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
CONCENTRAÇÃO DO POLÍMERO (mg/mL)
Figura 28: Determinação gráfica da viscosidade intrínseca para os derivados benzilados na
concentração de NaCl 0,5 mol/ a 25 °C (+/-1 °C) .
A [η] diminuiu com o acréscimo da concentração de NaCl na dispersão
mostrando que os derivados mantiveram as características de polieletrólito. Com
relação à Mw a introdução do anel aromático no polímero não provocou alteração
significativa nos valores quando comparado com o Mw da O-CMQS.
Recentemente Ortona e colaboradores (2008) encontraram uma relação entre
a viscosidade intrínseca e o tamanho da cadeia alquílica introduzida na quitosana.
Relacionando o aumento da hidrofobicidade do polímero com a diminuição da
viscosidade intrínseca atribuindo este comportamento ao efeito de quebra da cadeia
polimérica. Com exceção para a O-CMQSB F, este comportamento também foi
observado neste trabalho.
5.3 Determinação da Tensão Superficial dos Derivados Sintetizados
Quando se iniciou a caracterização dos derivados benzilados da O-CMQS foi
observado que as amostras quando dispersadas em água apresentavam a formação
de certa quantidade de espuma (bolhas) de forma constante e permanente.
86
Relacionando a formação de espuma com tensão superficial, já estudada
para a quitosana recentemente por Babak, Desbriesres e Tikhonov (2005) e Qun e
Ajun (2006), teve início a investigação da tensoatividade dos derivados.
Tensoativos são importantes devidos, principalmente, à sua capacidade de
modificar algumas propriedades reacionais com conseqüente melhoria em
sensibilidade e/ou seletividade analíticas (GUTERRES et al., 1995).
A tensão superficial diminui com o aumento da concentração para a maioria
dos polímeros. A variação da tensão superficial com a concentração dos diferentes
polímeros é mostrada na Figura 29.
78
TENSÃO SUPERFICIAL (mN/m)
77
76
75
74
LOTE 01
LOTE 03
O-CMQSB A
O-CMQSB B
O-CMQSB C
O-CMQSB D
O-CMQSB E
O-CMQSB F
O-CMQSB G
H2O
73
72
71
70
1E-3
0,01
0,1
1
CONCENTRAÇÃO (mg/mL)
Figura 29: Valores médios da tensão superficial em relação a variação da concentração das
dispersões poliméricas aquosas dos derivados, utilizando-se água como solvente, a 25°C (+/-1°C).
A mudança na tensão superficial é pequena quando comparado com os
dados relatados por Zhu e colaboradores (2005a), entretanto o grau da
carboximetilação no trabalho descrito pelos autores foi de 100%. Para os derivados
O-CMQSB G, O-CMQSB F e O-CMQSB C ocorre uma queda acentuada na tensão
superficial quando a concentração atinge 1,0 mg/mL. Segundo vários autores a
queda referida é atribuída a concentração de agregação crítica. Este valor é 20
vezes maior do que da concentração de agregação crítica relatado por Zhu e
colaboradores (2005a) para a O-CMQS (0,05 mg/mL).
87
A concentração de agregação crítica (cac) é uma característica de cada
polímero, fenômeno estudado recentemente por Ortona e colaboradores (2008).
Eles relataram a diminuição da cac com o aumento da cadeia alquílica em derivados
hidrofóbicos da quitosana. Também o valor encontrado no presente trabalho foi
superior a cac da N-succinil-O-CMQS, 0,2-0,3 mg/mL (ZHU et al., 2007).
Várias diferenças de comportamento podem ser observadas se comparadas
as amostras em relação a tensão superficial. Considerando-se o valor da
tensoatividade da água obtido (77,19 mN/m), pode-se observar que vários derivados
analisados manifestam tensoatividade, pois em algumas amostras analisadas
valores menores que o referente da água, foram obtidos em mais de uma
concentração.
A tensão superficial depende da concentração para os derivados sintetizados.
A formação de agregados no sistema indica uma interação diferenciada,
possivelmente mediada com maior ênfase pelas interações hidrofóbicas (SUI et al.,
2006).
A O-CMQS é um polímero aniônico, solúvel em água, que tem pequena
propriedade de atividade de superfície, visto que não possui nenhum grupo
hidrofóbico no polímero. Depois que foi modificada com grupo hidrofóbico, o
derivado anfifílico resultante pode concentrar na superfície, direcionando suas de
cadeias hidrofóbicas para o ar enquanto as cadeias hidrofílicas ficam na superfície,
para reduzir tensão superficial (QUN; AJUN, 2006).
O resultado demonstra que a introdução de substituintes hidrofóbicos fez os
derivados obtidos se tornarem polímeros anfifílicos que podem diminuir a tensão
superficial.
Provavelmente,
como
polímero
aniônico
anfifílico,
as
cadeias
hidrofóbicas de diferentes moléculas do polímero sintetizado podem associar para
formar agregados na solução enquanto eles concentram na superfície antes da
tensão de superfície adquirir o mais baixo valor (SUI et al., 2006).
De acordo com o componente da teoria da tensão superficial, a tensão de
superfície de dispersões de quitosana, é principalmente determinada pela ligação de
hidrogênio, interação hidrofóbica e interação eletrostática. Há bastantes grupos de
OH e NH2 nas cadeias moleculares de quitosana, uma forte ligação de hidrogênio e
uma interação eletrostática pode existir dentro da solução aquosa ácida. Para o
mesmo grau de acetilação de quitosana em solução com a mesma força iônica e pH,
88
o grau de protonação deveria ser o mesmo; a interação da ligação de hidrogênio
dominou as mudanças de tensão de superfície.
É interessante destacar o fato de a tensão superficial estar diretamente
relacionada com a densidade do líquido, mas não necessariamente com a
viscosidade. A necessidade de atrelar um valor de tensão superficial à temperatura
experimental decorre do fato de essa diminuir quase linearmente com o aumento da
temperatura, tornando-se muito pequena quando se atinge a temperatura crítica do
líquido (NETZ; GONZÁLES ORTEGA, 2002).
5.4 Determinação da Hidrofobicidade dos Derivados Sintetizados
Polímeros hidrofobicamente modificados e que são solúveis em água têm
encontrado um grande número de aplicações práticas nos últimos 20 anos (PEIT et
al., 1997). Devido à alta capacidade que possuem de aumentar a viscosidade em
meio aquoso, eles podem ser utilizados nas mais diversas áreas, principalmente nos
sistemas de liberação modificada de fármacos poucos solúveis em água. Estes
polímeros são constituídos de uma cadeia principal hidrofílica e alguns substituintes
hidrofóbicos, que podem se encontrar distribuídos de forma aleatória ao longo da
cadeia polimérica ou nas suas extremidades (PETIT-AGNELY; ILLIOPOULOS;
ZANA, 2000). Devido a sua estrutura anfifílica, esses polímeros podem exibir
atividade
superficial
e
adsorver
nas
interfaces
(YAHYA;
HAMAD,
1995;
CHAUVETEAU; LECOURTIER, 1998; YANG; PAULSON, 2000).
Para este experimento foram escolhidos os derivados O-CMQSB F e OCMQSB G, porque estes derivados apresentaram maior efeito sobre a redução da
tensão superficial. Como foi mencionado, estes derivados foram preparados com a
mesma quantidade de benzaldeído e apresentaram GS distintos.
Os testes foram realizados seguindo a metodologia de Oh e colaboradores
(2006), com modificações. O corante hidrofóbico Sudan III foi usado como uma
combinação modelo para avaliar a capacidade de dispersão da O-CMQSB
benzilada. A concentração do Sudan III nas dispersões dos polímeros estudados foi
determinada através de absorbância do corante em 540 nm depois de subtrair a
absorbância das soluções saturadas do corante em água (Oh et al., 2006).
89
Para o experimento foram selecionados os derivados que apresentaram
propriedades de tensoatividades, incluindo o polímero de partida. O pH do meio foi
ajustado para a condução ácida (4,0) e básica (9,0).
Na Figura 30 é mostrado o espectro na região do ultravioleta e visível da
dispersão de O-CMQSB G após permanecer em contato com a solução de Sudan
III. Como é possível observar, a medida que aumenta a concentração de polímero
aumenta a intensidade das bandas correspondente a presença do corante na
dispersão polimérica. Conforme é mostrado na figura, na concentração de 5,0 mg/L
as absorbância na região de 360 nm e 540 nm ficam mais acentuada.
O-CMQSB G
0,5 mg/L
2,5 mg/L
3,5 mg/L
5,0 mg/L
Absorbância (u.a)
0,5
0,0
300
400
500
600
700
Comprimento de onda (nm)
Figura 30: Espectro na região do UV/visível da dispersão polimérica antes (preto) e após
contato com a solução de Sudan III (em clorofórmio). Tempo de agitação 24 hs.
Na Figura 31 é mostrado que o aumento na concentração do polímero
melhora a solubilidade do Sudan III independentemente do polímero utilizado. Outra
observação é que de maneira geral a forma de pH ácido favorece a solubilidade
quando comparada, com o pH básico. Em pH ácido o polímero apresenta os grupos
–COOH na forma não dissociada –COONa. A forma não dissociada do polímero
apresenta características mais hidrofóbicas do que o meio salino. O pH da solução
aquosa saturada de corante não alterou a solubilidade do mesmo, as leituras das
absorbâncias em ambos os casos ficaram próximas a zero.
90
Lote 02 m eio ácido
Lote 02 m eio básico
O-CMQSB F m eio ácido
O-CMQSB F m eio básico
O-CMQSB G m eio ácido
O-CMQSB G m eio básico
3,5
CONCENTRAÇÃO SUDAN III
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0
1
2
3
4
5
CONCENTRAÇÃO DO POLÍMERO(mg/L)
Figura 31: Valores obtidos na determinação da hidrofobicidade por Sudan III, leitura em
540nm, a 25°C (+/-1°C).
A presença dos grupos hidrofóbicos no polímero melhorou a solubilidade do
corante, especialmente em soluções mais diluídas. Estes resultados mostram que a
presença dos grupos hidrofóbicos no polímero favorece a dissolução do corante. À
medida que a concentração do polímero aumenta, a interpretação dos resultados
fica comprometida devido principalmente a turdidez da dispersão.
Quando são confrontados os valores da solubilidade do Sudan III com os
valores da tensão superficial na concentração de 1,0 mg/mL, se observa que existe
uma relação entre os dois experimentos. O derivado O-CMQSB G apresenta menor
tensão superficial, entretanto apresenta pequena capacidade de dissolução do
corante. Por outro lado, O-CMQSB F e O-CMQS Lote 02 apresentam capacidade de
dissolução e elevada tensão superficial.
5.5 Determinação da Citotoxidade
O desenvolvimento dos testes de citotoxicidade in vitro e seu reconhecimento
pelos órgãos internacionais como Food and Drug Admnistration, em 1993 e
Organization for Economic Cooperation and Development, em 1987 (HUGGET et al.,
91
1996) tem favorecido a substituição dos ensaios que utilizam animais de
laboratórios.
Vários métodos in vitro que utilizam culturas celulares têm sido padronizados
para avaliação da toxicidade de biomateriais, tais como: método de difusão em agar
(GILL, 1982), método de extração (UNITED STATES PHARMACOPEIS, 1995)
método de contato direto (GILL, 1982; WENZEL; COSMA, 1983) método de inibição
metabólica (WENZEL; COSMA, 1983; WILLIAMS; DUNKEL; RAY, 1983), além dos
métodos enzimáticos (HUGGET et al., 1996).
A linhagem de fibroblastos L929 é citada como referência para testes de
citotoxidade em biopolímeros (SERRANO et al., 2004). L929 é um subclone da
linhagem parental L, uma linhagem celular estabelecida por W. R. Earle no ano de
1940. Foi uma das primeiras linhagens celulares a serem estabelecidas em cultura
contínua. A linhagem L é derivada do tecido aureolar subcutâneo e adiposo de um
camundongo macho de 100 dias (BAXTER et al., 2002).
Os fibroblastos são as células predominantemente encontradas em tecidos
conectivos perdidos ou danificadas, e são importantes nos mecanismos de
reparação tecidual e na fase de remodelamento dos tecidos (PAN; JIANG; CHEN,
2006). Estas células são importantes na produção de muitos componentes
essenciais do tecido conectivo, como os componentes de matriz extracelular e, no
tecido fibroso, o colágeno (BRUNETTE; CHEHROUDI, 1999). O encapsulamento
fibroso é causado pelas células tipo fibroblasto que aderem às suas vizinhas
preferencialmente ao suporte, e pode prejudicar a efetividade de implantes, por
exemplo (VERRIER et al., 1996; BAXTER et al., 2002).
Para a determinação da citotoxidade dos derivados sintetizados foram
utilizados
dois
métodos
diferentes:
o
método
(3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5
difeniltertrazolim brometo) (MTT) e o método do vermelho neutro.
A Figura 32 mostra os resultados dos testes realizados com o método MTT
para viabilidade após 24 horas de contato com células L929. Como controle positivo
foi utilizado DMSO e como controle negativo meio de cultura. As barras representam
uma média e desvio padrão de uma octaplicata (Teste t student/Anova p<0,05).
92
0 ,8
Absorbância (570 nm)
0 ,7
0 ,6
0 ,5
0 ,4
0 ,3
0 ,2
0 ,1
0 ,0
Lo
te
1
Hi
d
A
Hi
d
E
Hi
d
G
Hi
d
D
Hi
Co
A m o s tra s
d
nt
C
ro
le
Po
s it
Co
iv o
nt
ro
le
Ne
ga
t iv
o
Figura 32: Citotoxicidade das amostras Lote 1, derivados benzilados A, E, G, D e C, em
concentração de 1000 µg/mL, pelo método MTT.
Pelo método do MTT não foi observada diferença estatisticamente
significativa (p<0,05) para todas as amostras analisadas. Pode-se observar quando
se analisa o gráfico mostrado na Figura 32, a diferença significativa entre as
amostras e o controle positivo. Através desta análise é possível afirmar que os
derivados sintetizados são biocompatíveis. A Figura 33 representa a metodologia
utilizando o corante MTT.
Figura 33: Esquema representativo do método com o corante MTT.
93
Outro parâmetro utilizado para avaliar a toxicidade (viabilidade celular) foi o
corante vermelho neutro, solúvel em água. Muitas substâncias danificam as
membranas resultando no decréscimo de captura e ligação do vermelho neutro.
Portanto, é possível distinguir entre células vivas e danificadas ou mortas, pela
medida de intensidade de cor da cultura celular (CHAPEKAR, 2000)
O corante vermelho neutro, após 24 horas de contato com células L929, foi
analisado tendo como controle positivo DMSO e como controle negativo meio de
cultura. A Figura 34 mostra os resultados obtidos para o método vermelho neutro. As
barras representam uma média e desvio padrão de uma octaplicata (* Teste t
student/Anova p<0,05).
Absorbância (570 nm)
0 ,6
0 ,5
*
*
*
0 ,4
0 ,3
0 ,2
0 ,1
0 ,0
Lo
te
1
Hi
d
A
Hi
d
E
Hi
d
G
Hi
d
D
Hi
Co
A m o s tra s
d
nt
C
ro
le
Po
s it
Co
iv o
nt
ro
le
Ne
ga
tiv
o
Figura 34: Citotoxicidade das amostras O-CMQS Lote 1, derivados A, E, G, D e C em
concentração de 1000 µg/mL, pelo método vermelho neutro.
Para as amostras O-CMQS Lote 1 e O-CMQSB A e G pode-se observar
redução da viabilidade celular (p<0,05), com redução de 17,5; 14,5 e 21,4 % da
viabilidade celular, respectivamente. Porém, a pequena redução da viabilidade
celular para os derivados destacados não impede seu uso como materiais
biocompatíveis. É necessário destacar que todos os derivados testados passaram
por diálise e liofilização. No entanto, resíduos de produtos do processo de síntese
podem ainda de alguma forma ter interferido no resultado do método em estudo.
Culturas de células in vitro podem avaliar o potencial de citotoxidade de
biomateriais. Este procedimento indica a capacidade intrínseca do material de
94
promover alteração metabólica de células em cultura, podendo levar ou não à morte
celular (DUCH EYNE et al., 2005).
No estudo de Hu, Jou e Yang (2004), foi observado que o filme de poli (3hidroxibutírico ácido-co-3-hidroxivalérico) (PHBV) obtido demonstrou atividade de
adesão sobre fibroblastos quando enxertado com quitosana. Num outro estudo,
Chatelet, Damour e Domard (2001) constataram que a quitosana pode ser citostática
para fibroblastos, isto é não citotóxica, mas inibidora da proliferação celular.
Kadnaim
e
colaboradores
(2008)
prepararam
carboximetilquitosana
modificada com poliuretano contendo poli(adipato de etileno). Foi testada a
citotoxicidade e biocompatibilidade do material, utilizando-se para estes testes
células L929. Os autores relataram que através da análise do material sintetizado,
estes indicaram que o polímero é considerado não-tóxico.
O estudo apresentado por Henni-Silhadi e colaboradores (2007), também
relatou que soluções do fármaco livre-CMP49C8 provaram ser menos tóxico contra
macrofagócito que Tween 80 (o excipiente usado na formulação comercial de
docetaxel), e na presença do fármaco, as soluções poliméricas mostraram
semelhante atividade citotóxica em relação as células MCF 7.
Estudos com culturas de células em tempos mais prolongados devem ser
feitos para complementar os dados obtidos para culturas de curto prazo e verificar
através dos mesmos parâmetros o comportamento celular desta linhagem. Porém,
os resultados obtidos com as duas metodologias empregadas mostram que os
derivados testados são biocompatíveis.
5.6 Solubilidade do Fármaco Triancinolona
A partir dos dados relacionados com a introdução dos grupos aromáticos,
propriedades de tensoatividade e baixa toxicidade dos derivados sintetizados, foi
dado continuidade aos estudos para a aplicação destes polímeros na dissolução de
fármacos.
Para este estudo foram escolhidos dois derivados que apresentaram
propriedades tensoativas mais pronunciadas, os derivados O-CMQSB F e OCMQSB G, que foram preparados com a mesma relação molar de benzaldeído e
95
apresentaram GS muito diferente. O objetivo desta escolha foi avaliar o efeito do GS
sobre a solubilidade do fármaco.
A triancinolona, por apresentar estrutura química esteroidal, demonstra baixa
solubilidade em água, 80 mg/L, propriedade esta que é melhorada em pH levemente
básico. É sabido que a triancinolona é solúvel em metanol sendo este solvente
utilizado para a preparação das soluções da curva analítica padrão para a
quantificação espectrofotométrica.
Para determinar a concentração de triancinolona nas dispersões dos
polímeros anfifílicos foi feita uma curva analítica padrão de triancinolona com leitura
no comprimento de onda de absorção de 242 nm.
A partir das curvas (Figura 35) foram obtidas as equações da reta para meio
básico (Equação 11) e ácido (Equação 12).
y = 0,03025x - 0,06582 com R2 = 0,9978
Equação 11
y = 0,05399x - 0,07673 com R2 = 0,9970
Equação 12
pH 9,0
1,6
pH 4,0
ABSORBÂNCIA (240 nm)
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
TRIANCINOLONA (µg/mL)
Figura 35: Curva analítica da Triancinolona em metanol, leitura em 242 nm.
Neste estudo foram analisados os efeitos da concentração dos derivados
escolhidos e o pH da solução.
96
Nas Figuras 36 e 37 são mostrados a quantidade de TC dissolvidas nas
diversas concentrações de O-CMQS Lote 02, O-CMQSB F e O-CMQSB G. Em meio
básico, Figura 36, é possível observar que existe uma relação entre a quantidade de
TC dissolvida e a quantidade de polímero na solução. Quando são comparados os
valores da quantidade de TC dissolvida pelos derivados anfifílicos com o polímero
não modificado, nota-se a influência dos grupos hidrofóbicos incorporados à OCMQS.
Na concentração dos polímeros de 1,0 mg/mL a diferença na dispersão é de
aproximadamente 5,5 vezes para O-CMQSB G e 3,5 vezes para a O-CMQSB F
quando comparado com a O-CMQS. Outra observação importante é a existência de
diferença entre os dois derivados na dissolução do fármaco.
Outro resultado obtido a partir dos gráficos é a solubilidade da TC. Na
dispersão dos polímeros na concentração de 0,2 mg/mL, a solubilidade da TC foi
360 µg/mL, 230 µg/mL e 73 µg/mL para a O-CMQSB G, O-CMQSB F e O-CMQS
Lote 02, no caso dos dois derivados anfifílicos ocorreu um aumento significativo da
solubilidade da TC quando comparado com a solubilidade em água.
400
O-CMQSB G
O-CMQSB LOTE 02
O-CMQSB F
QUANTIDADE DE TC (µg)
350
300
250
200
150
100
50
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
MASSA DO POLÍMERO (mg)
Figura 36: Perfil da solubilidade em relação à concentração de TC e dos polímeros O-CMQS
Lote 2, O-CMQSB F e G em meio básico, leitura em 242 nm, volume de 5 mL.
Comparando com outros sistemas polimero/fármaco observou-se que o
presente sistema apresenta vantagens como, por exemplo, O-CMQS/Camptotecina,
o fármaco apresenta solubilidade de 3,3 vezes maior na concentração de polímero
97
1,0 mg/mL (ZHU et al., 2007). Outro sistema formado pelo pullulan/docetaxel, a
dissolução do fármaco é melhorada 1,2 vezes na mesma concentração de polímero
(HENNI-SILHADI et al., 2007).
Dados da literatura mostram que a presença de grupos aromáticos no
derivado ftalato de quitosana aumentou a eficiência no encapsulação da
dexametasona quando comparado com o derivado succinato de quitosana, sendo
que esta diferença foi atribuída à hidrofobicidade provocada pela presença dos anéis
aromáticos no polímero (AIEDEH et al., 2005).
Outro exemplo que mostra o efeito do substituinte hidrofóbico na quitosana foi
relatado por Liu e colaboradores (2006), que utilizaram a quitosana modificada com
grupos n-hexanoil para incorporar o ibuprofeno. Os resultados mostraram que a
presença da cadeia alquílica aumentou muito a eficiência de incorporação do
fármaco, estende provavelmente o aumento da eficiência foi relacionado com a
propriedade de formação de micela.
A Figura 37 mostra o comportamento de dissolução da TC nas diferentes
dispersões poliméricas em meio ácido. Neste caso a solubilidade da TC ficou abaixo
daquela observada para o meio básico. A presença dos polímeros aparentemente
não alterou a sua solubilidade.
47
46
O-CMQS LOTE 2
O-CMQSB F
O-CMQSB G
QUANTIDADE DE TC (µg)
45
44
43
42
41
40
39
38
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
CONCENTRAÇÃO (mg/mL)
Figura 37: Perfil da solubilidade em relação à concentração de TC e dos polímeros O-CMQS
Lote 2, O-CMQSB F e G em meio ácido, leitura em 242 nm, volume de 5 mL.
98
5.7 Perfil de Dissolução do Fármaco Triancinolona in vitro
A ciência dos polímeros tem sido o eixo principal para o desenvolvimento de
novos sistemas de liberação de fármacos nas últimas décadas. Avanços futuros no
estudo dos polímeros deverão considerar as modificações das propriedades
químicas e físicas. Novas combinações de copolímeros com objetivos e
componentes que podem liberar uma ampla variedade de agentes bioativos poderão
se utilizados (PILLAI; PANCHAGNULA, 2001). Além disso, novos processos de
fabricação e manipulação como marcadores moleculares (ALLENDER et al., 2000),
tecnologia de fluido supercrítico (GHADERI; ARTURSSON; CARLFORS, 2000) e
engenharia em escala nanométrica têm promovido uma verdadeira revolução na
forma, desenvolvimento e eficiência dos sistemas de liberação de fármacos à base
de polímeros.
Geralmente, a cinética de liberação de fármacos em micelas poliméricas é
afetada por vários fatores como tamanho de partícula, composição do bloco, peso
molecular, concentração e taxa de degradação (KIM et al., 2000). O mecanismo de
liberação pode ser dividido em difusão controlada, degradação controlada ou uma
mistura deles (SIEPMANN; PEPPAS, 2001; ZULEGER; LIPPOLD, 2001).
O comportamento da liberação do fármaco das dispersões O-CMQSB F/TC e
O-CMQS/TC foram estudados com o objetivo de comparar o efeito dos substituintes
hidrofóbicos no processo de liberação da TC. A escolha do polímero O-CMQSB F,
apesar de não dissolver tanta TC quanto o derivado benzilado O-CMQSB G, deu-se
primeiro pela sua disponibilidade e, em segundo lugar, porque ele também
apresentava boa capacidade de dissolução da TC, o suficiente para a obtenção os
dados para a realização dos cálculos e interpretação dos resultados.
Na Figura 38 é mostrada a quantidade de TC liberada das formulações em
diferentes tempos. A diferença na quantidade de TC liberada está relacionada com a
solubilidade de TC na solução. Para a O-CMQS e água a solução foi previamente
centrifugada antes de colocar dentro das membranas de diálise.
99
14
O-CMQSB F + Tc
TC Pura
O-CMQS Lote 2 + Tc
MASSA DE TC LIBERADA
12
10
8
6
4
2
0
-200
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
TEMPO (min)
Figura 38: Perfil de difusão da TC pela membrana de diálise, nas diferentes formulações, TC
pura, com O-CMQS e com O-CMQTSB F em PBS (pH 7,4 solução 0,01 mol/L) em temperatura
ambiente.
100
TC LIBERADA (%)
80
60
40
20
O-CMQSB F + TC
TC
O-CMQS Lote 2 + TC
0
-200
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
TEMPO (MIN)
Figura 39: Perfil de difusão da TC, pela membrana de diálise, nas diferentes formulações, TC
pura, com O-CMQS e O-CMQTSB F em PBS (pH 7,4 solução 0,01 mol/L) em temperatura ambiente.
Pode ser observado que existe diferença no t50% para a liberação de TC em
meio aquoso ou na dispersão do polímero anfifílico. Essa disparidade pode estar
relacionada com a solubilidade da TC no meio de liberação e não diretamente com a
interação fármaco polímero.
100
Este comportamento difere daquele relatados por Zhu e colaboradores (2006)
no estudo de sistema Camptotecina/O-CMQS e gatifloxacina/O-CMQS. Em ambos
os casos o perfil de liberação do fármaco das soluções polimérica foi influenciado
pela presença do polímero, quando comparado com as soluções aquosa do
fármaco. Em ambos os casos o t50% foi praticamente o dobro quando nas soluções
contando o polímero se comparado com a solução na ausência do polímero.
A introdução de cadeia alquílica (grupos linolil) na O-CMQS retardou a
liberação da adriamicina, sendo que após 72 horas apenas 37 % do fármaco tinha
sido liberado em meio básico, por outro lado a liberação do fármaco em meio
aquoso ocorreu em 3 horas (LIU et al., 2007a). Em geral a liberação de fármaco
incorporada em sistemas hidrofóbicos depende da solubilidade e difusão do
fármaco.
No caso onde não há degradação enzimática do polímero a difusão é
considerada o principal mecanismo de liberação.
Com o perfil de liberação da TC, foi possível aplicar o modelo do coeficiente
de difusão mostrado na Equação 9 (p. 62). Com auxilio do gráfico de Ln[(1-Mt)/M∞]
em função do tempo, mostrado na Figura 40, foi possível calcular o coeficiente de
difusão da TC nas diferentes soluções que também são mostrados na Tabela 9.
Conforme pode ser observado, não existe diferença significativa nos coeficientes de
difusão da TC nas diferentes soluções.
101
1
ln(1-Mt/M0)
O-CMQSB F + TC
TC
O-CMQS Lote 2 + TC
0,36788
0
100
200
300
400
500
TEMPO (min)
Figura 40: Perfil de difusão da TC, pela membrana de diálise, nas diferentes formulações, TC
pura, com O-CMQS e O-CMQTSB F em PBS (pH 7,4 solução 0,01 mol/L) em temperatura ambiente.
Este comportamento observado na Figura 40, indicando que não há interação
forte entre o polímero e o fármaco, difere daquele relatado por Zhu e colaboradores
(2006), no caso da camptotencina/O-CMQS, no qual o coeficiente de difusão foi
aproximadamente a metade quando comparado com a solução aquosa. Segundo os
autores a formação do complexo fármaco: polímero justifica a liberação mais lenta
do fármaco quando comparado com o fármaco sozinho.
Tabela 9: Difusão da TC através da membrana de diálise, parâmetros de liberação e coeficientes de
difusão.
t50%
teq
F eq (%)
Coeficiente Difusão
(min)
(min)
O-CMQS Lote 2 + TC
248
1500
100
6,41 x 10-9
O-CMQSB F + TC
407
1320
100
4,24 x 10-9
TC
410
1500
100
5,09 x 10-9
(pela membrana)
O comportamento de liberação da TC nos diferentes sistemas foi avaliado
segundo o modelo de cinética de liberação de Higuchi onde foi aplicada a Equação
10 (p. 61). A partir da obtenção dos dados foi possível construir o gráfico mostrado
na Figura 41.
102
100
O-CMQSB F + TC
TC
O-CMQS Lote 2 + TC
TC liberada (%)
80
60
40
20
0
0
5
10
15
tempo (min)
1/2
20
25
Figura 41: Perfil de difusão da TC, pela membrana de diálise, nas diferentes formulações, TC
pura, com O-CMQS e O-CMQTSB F (Modelo de Higuchi) em PBS (pH 7,4 solução 0,01 mol/L), leitura
em 242 nm, em temperatura ambiente.
Como pode ser observado nos parâmetros das cinéticas de liberação, Tabela
10, o modelo escolhido foi adequado aos dados experimentais, mostrado pelo valor
do coeficiente de correlação linear. Estes resultados indicam que a liberação da TC,
para o meio receptor é controlada por difusão através da membrana.
Tabela 10: Parâmetros da cinética de Liberação de TC segundo o modelo de Higuchi.
K (% min1/2)
R
O-CMQSB F + TC
2,78
0,9961
TC
2,23
0,9920
O-CMQS Lote 2 + TC
2,28
0,9877
Outra observação importante é que não existe diferença significativa na
constante de velocidade de liberação entre os diferentes meios de dissolução do
fármaco, mostrando que a presença do polímero provoca pouca alteração no
comportamento de liberação.
Os resultados encontrados neste trabalho também foram observados por
Aiedeh e colaboradores (2005) utilizando derivados de quitosana contendo ftalato,
ou seja, a presença dos anéis aromáticos não provocou alterações na velocidade de
103
liberação da dexametasona quando comparado com o derivado succinato de
quitosana.
Outro resultado observado na Tabela 10 é o comportamento de liberação da
TC em solução aquosa, para o meio receptor. Pode ser observado que a liberação
ocorreu numa velocidade menor quando comparado com a dispersão polimérica.
Este comportamento também foi relatado por Aiedeh e colaboradores (2005) quando
estudaram sistemas poliméricos contendo derivados da quitosana e dexametasona.
Os autores atribuíram este fato à baixa solubilidade do fármaco em água (80 mg/L).
Outros estudos também são relatados no qual a liberação do fármaco da Ocarboximetilquitosana depende da natureza do fármaco em estudo. Segundo o
observado por Zhu e colaboradores (2006, 2007) o mesmo polímero foi utilizado
para preparar dispersões poliméricas contendo camptotencina e gatifloxacina, nas
mesmas condições experimentais, resultou em comportamentos distintos. A
dispersão polimérica retardou a liberação da camptotencina, entretanto não
provocou qualquer alteração no comportamento da gatifloxaxina.
Com o objetivo de esclarecer o tipo de interação entre a TC e os polímeros foi
realizado um estudo da espectroscopia na região do ultravioleta da dispersão
polímero/TC nos diferentes valores de pH. Neste estudo foi escolhido o derivado
anfifílico O-CMQSB F. Conforme mostrado no item solubilidade, o polímero é solúvel
na faixa de pH 2 a 5 e 8 a 12, insolúvel em 7 e levemente solúvel em pH 6,0. No
caso o sistema da dispersão dos TC/O-CMQSB F na concentração 1,0 mg/mL de
polímero e 1 mg TC mostrou-se solúvel em toda a faixa de pH estudada, incluindo o
pH 7,0 no qual era insolúvel.
Conforme observado na Figura 42 aparentemente não existe diferença nos
espectros da TC sozinha, da O-CMQSB F e as dispersões TC/O-CMQSB F. Nos
espectros não ocorre o deslocamento da banda de absorção característica da TC,
na presença do polímero, também não ocorre a formação de uma nova banda de
absorção, comportamento típico da alteração provocada pela interação entre
fármaco e polímero. Recentemente, Zhu e colaboradores (2007) relataram o
deslocamento da banda de absorção da gatifloxacina dispersada na Ocarboximetilquitosana, atribuída pelos autores a formação do complexo entre o
polímero e o fármaco.
104
1,2
Absorbancia (u.a)
1,0
0,8
O-CMQSB F
TC
pH 9
pH 8
pH 7
pH 6
pH 5
pH 4
0,6
0,4
0,2
0,0
200
300
400
500
600
700
800
Comprimento de onda (nm)
Figura 42: Perfil de absorção no UV/visível do derivado O-CMQSB F e TC em diferentes
valores de pH em dispersão em água.
Outro experimento utilizado foi a interação entre o fármaco e o polímero foi
comparar a tensão superficial das dispersões polimérica com e sem o fármaco.
Na Figura 43 é mostrado o efeito da presença da TC na dispersão dos
derivados anfifílicos sobre o comportamento da tensão superficial. A adição de TC
provoca a redução das propriedades tensoativas dos dois derivados anfifílicos. Os
valores da tensão superficial na concentração de 1 mg/mL ficou muito próxima dos
valores para a água.
Este comportamento também foi observado para o sistema hidrofóbico
pululana/docetaxel (HENNI-SILHODI et al., 2007), entretanto a perda das
propriedades tensoativas não foi tão acentuada quanto às observadas no presente
sistema. Segundo os autores, o comportamento foi atribuído à dissolução da
docetaxel tanto na parte hidrofóbica quanto na parte hidrofílica do polímero.
No caso da interação entre a TC e o polímero, o comportamento seria
diferente, ou seja, não ocorreria alteração no comportamento da tensão superficial
conforme relatado para o sistema hidrofóbico pululana/benzofenona (HENNISILHODI et al., 2007).
105
76,5
76,0
75,5
TENSÃO SUPERFICIAL (mN/m)
75,0
74,5
74,0
73,5
73,0
72,5
72,0
71,5
71,0
70,5
70,0
O-CMQSB F
O-CMQSB G
TC/O-CMQSB F
TC/O-CMQSB G
0,01
0,1
1
CONCENTRAÇÃO (mg/mL)
Figura 43: Tensão superficial dos derivados O-CMQSB F e O-CMQSB G puros e com a TC
incorporada em diferentes concentrações.
A partir destes resultados é possível concluir que não existe uma forte
interação entre o fármaco e o polímero, como por exemplo, a formação de
complexo. Aparentemente, o fármaco está dissolvido na parte hidrofóbica do
polímero, quando o derivado anfifílico está dissolvido em água, semelhante ao que
ocorre na dissolução de fármacos em micela. Este comportamento foi relatado por
Liu e colaboradores (2006) no estudo da incorporação do ibuprofeno em derivados
da quitosana contendo grupos hexanoil em sua estrutura.
Na Figura 44 é mostrada a interação entre os derivados anfifílicos da OCMQS e a TC em meio aquoso. A parte hidrofílica do polímero fica mais exposta às
moléculas de água, enquanto a parte hidrofóbica fica voltada para o interior do
sistema. Como a TC é praticamente insolúvel em meio aquoso, e esta
preferencialmente próxima as regiões hidrofóbicas do polímero (anéis aromáticos).
106
H2O
HOOCH2OH2C
O
NH 2
H
O
CH 2OH
H2O
OH
CH 2OH
O
O
HOOCH2OH2C
O
NH 2
H
HOOCH2OH2C
O
HO
H
H
NH2
CH 2OCH 2COOH
H
CH 2
CH 2
OH
H2O
O
NH
O
H2O
H
H
HO
NH
HO
NH 2
HO
NH2
HO
O
O
O
O
O
CH 2OH
HO
NH 2
H
O
CH 2OH
O
H
O
NH2
OH
O
NH
OH
H
CH 2
CH2
NH
H
O
OH2
CH 2OCH2COOH
H
H2O
OH
NH2
O
CH 2OH
H
NH2
O
H
O
H2O
H2O
H2O
O
CH 2OH
HO
H
NH 2
O
OH
CH 2OCH2COOH
HO
NH2
O
OH
HOOCH2OH2C
O
O
CH 2OH
O
O
CH 2OCH 2COOH
O
H2O
H
OH
NH 2
O
H2O
CH 2OH
O
O
Figura 44: Esquema simplificado das interações entre a TC e o derivado O-CMQSB.
6 CONCLUSÕES
Neste trabalho, a síntese de derivados anfifílicos da O-CMQS foi realizada
com êxito, especialmente quando foi empregado um fármaco/modelo a triancinolona,
no estudo de aumento de solubilidade de fármacos pouco solúveis em água.
Os derivados O-CMQS foram sintetizados produzindo dois lotes: O-CMQS
Lote 01 e O-CMQS Lote 02, que serviram de material de partida para a síntese dos
derivados benzilados, obtidos através do método homogêneo.
Diferentes relações molares de benzaldeído foram usadas para a síntese dos
derivados benzilados. Na maioria das sínteses foi observada uma relação entre a
quantidade de benzaldeído utilizado na síntese e o grau de substituição dos
derivados anfifílicos.
Em relação a solubilidade dos polímeros sintetizados observou-se que em
todas as amostras em pH 7,0 os derivados são insolúveis. A introdução dos grupos
hidrofóbicos praticamente não altera a solubilidade dos derivados.
A respeito da viscosidade intrínseca, os Lotes 01 e 02 da O-CMQS não
diferem muito entre si, pois o grau de carboximetilação (GC) dos dois lotes foram
muito próximos. Para aos derivados benzilados, em relação a viscosidade intrínseca,
foi possível observar que não existe uma relação entre o GS dos derivados
anfifílicos e a viscosidade intrínseca. O aumento na concentração de NaCl provoca a
diminuição da viscosidade da O-CMQS, indicando que o polímero mantém as
propriedades de um polieletrólito.
O aumento na concentração de polímero melhora a solubilidade do Sudan III
independentemente do polímero utilizado. O pH ácido favorece a solubilidade
quando comparado com pH básico.
Em relação a citotoxicidade, estudos com culturas de células com tempos
mais prolongados devem ser realizados para complementar os dados obtidos para
culturas de curto prazo e averiguar através dos mesmos parâmetros o
comportamento celular desta linhagem. Os resultados obtidos com as duas
metodologias empregadas (o teste com o corante MTT e com o vermelho neutro)
mostram que os derivados testados são biocompatíveis.
A influência das reações de modificação química sobre as propriedades do
polímero também foi verificada em termos de tensão superficial de suas soluções
108
aquosas com bons resultados. Para os derivados O-CMQSB G, O-CMQSB F e OCMQSB C ocorreu uma queda acentuada na tensão superficial quando na
concentração de 1,0 mg/mL. A queda é atribuída a concentração de agregação
crítica. O valor encontrado neste trabalho é 20 vezes maior do que da concentração
de agregação crítica encontrada na literatura. A introdução de substituintes
hidrofóbicos fez os derivados obtidos se tornarem polímeros anfifílicos que podem
diminuir a tensão superficial.
Os derivados anfifílicos O-CMQSB G, O-CMQSB F promoveram um aumento
significativo da solubilidade da TC quando comparado com a solubilidade em água,
uma vez que os valores correspondem a 360 mg/L e 230 mg/L, respectivamente.
Não existe diferença significativa entre os coeficientes de difusão, pela
membrana de diálise, da TC em meio aquoso ou nas dispersões poliméricas,
indicando que não há interação forte entre o polímero e o fármaco.
O modelo de Higuchi escolhido foi adequado aos dados experimentais,
mostrado pelo valor do coeficiente de correlação linear. Estes resultados indicam
que a liberação da TC, para o meio receptor, é controlada por difusão. O
comportamento de liberação da TC em solução aquosa, para o meio receptor, pode
ser observado. Em relação à liberação ocorre numa velocidade menor quando
comparado com a solução polimérica.
A partir destes resultados e dos observados no estudo da dissolução da TC
nas dispersões polimérica é possível concluir que não existe uma forte interação
entre o fármaco e o polímero, como por exemplo, a formação de complexo.
Aparentemente, o fármaco está dissolvido na parte hidrofóbica do polímero, quando
o derivado anfifílico está dissolvido em água.
A metodologia experimental empregada para a obtenção dos derivados
estudados mostrou-se adequada, proporcionando derivados solúveis em água.
O estudo de polímeros anfifílicos solúveis em água tem sido de muito
interesse. Nossa pesquisa foi direcionada para a síntese e avaliação das
propriedades em solução de polímeros hidrofobicamente modificados, os quais são
caracterizados pela presença de sítios hidrófobos, pela alta atividade superficial e
pelo acentuado aumento da viscosidade de soluções aquosas. Resultados estes que
foram obtidos com índices animadores, possibilitando uma segunda etapa da
pesquisa.
109
A partir destes derivados solúveis em água foi possível obter resultados inovadores
no estudo da solubilidade de fármacos pouco solúveis em água, especialmente para
o fármaco triancinolona.
110
REFERÊNCIAS
AÇIKGÖZ, M.; KAS, H.S.; ORMAN, M.; HINCAL, A. A. Chitosan microspheres of
diclofenac sodium: I. application of factorial design and evaluation of release kinetics.
J. Microencaps., n. 13, p.141, 1996.
ADAMSON, A. W.; GAST, A. P. Physical Chemistry of Surface. 6th. ed. New York:
Wiley-Interscience, 1997. p. 39-41.
AIEDEH, K. M.; TAHA, M. O.; AL-HIARI, Y.; BUSTANJI, Y.; ALKHATIB, H. S. Effect
of ionic crosslinking on the drug release properties of chitosan diacetate matrices. J.
Pharm. Scie., v. 96, p. 38 – 43, 2006.
AKIYAMA, E.; KASHIMOTO, A.; HOTTA, H.; KITSUKI, T. Thickening properties and
emulsification mechanisms of new derivatives of polysaccharide in aqueous solution
2. The effect of the substitution ratio of hydrophobic/hydrophilic moieties. J. Colloid
Interface Sci., v. 300, p. 141, 2006.
ALLEN JUNIOR, L. V.; POPOVICH, N. G.; ANSEL, H. C. Formas Farmacêuticas e
Sistemas de Liberação de Fármacos. 8d. Porto Alegre: Artmed, 2007. 775p.
ALLENDER, C. J.; RICHARDSON, C.; WOODHOUSE, B.; HEARD, C. M.; BRAIN, K.
R. Pharmaceutical applications for molecularly imprinted polymers. Int. J. Pharm., v.
195, p. 39-43, 2000.
ANGELOVA, N.; HUNKELER, D. Rationalizing the design of polymeric biomaterials.
Trends Biotechnol., v. 17, p. 409-421, 1999.
ARGILLIER. J. F.; AUDIBERT. A.; LECOURTIER. J.; MOAN. M.; ROSSEAU. L.
Solution and adsorption properties of hydrophobically associating water-soluble
polyacrylamides. Colloids Surf. B, v. 113, p. 247-257, 1996.
AULTON, M. E. Pharmaceutics: The Science of Dosage Form Design, 1988.
775p.
BABAK, V. G.; DESBRIERES, J.; TIKHONOV, V. E. Dynamic surface tension and
dilational viscoelasticity of adsorption layer of a hydrophobically modified chitosan.
Colloids Surf. A, v. 255, p. 119-130, 2005.
BADE, M. L. Structure and isolation of native animal chitins. In: Biopolymers
Utilizing Nature´s Advanced Materials. Symposium at the Fifth Chemical Congress
of North America, Cancun: American Chemical Society. Nov, 1997.
BANAT, I. M. Dimeric and oligomeric surfactants. Behavior at interfaces and in
aqueous solution: a review. Biofutur., v. 44, p. 198-200, 2000.
BAXTER, L. C.; FRAUCHIGER, V.; TEXTOR, M.; AP GWYNN, I.; RICHARDS, R.
111
G. Fibroblast and osteoblast adhesion and morphology on calcium phosphate
surfaces. Eur. Cell. Mater., v. 4, p. 1-17, 2002.
BEAKE, B. D.; LING, J. S. G.; LEGGETT, G. J. Scanning force microscopy
investigation of poly(ethylene terephthalate) modified by argon plasma treatment. J.
Mater. Chem., v. 8, p. 1735–1742, 1998.
BRESOLIN, T. M. B.; RODRIGUES, C. A.; ANDREAZZA, I. F.; LUCINDA, R. M.;
ANDREAZZA, R. C. S.; FREITAS, R. A.; MOURÃO, S. C. Sistemas de Liberação de
Fármacos. In: CECHINEL, FILHO, V.; BRESOLIN, T. M. B. Ciências Farmacêuticas
– Contribuição ao Desenvolvimento de Novos Fármacos e Medicamentos. Itajaí:
UNIVALI, 2003. p. 192-214.
BOGNOLO, G. Surface tension. Colloids Surf., A, v. 41, p. 152, 1999.
BOOBIS, A.; THOMAS, S.; RAWLINS, M.;WILKINS, M. Glucocorticoids and the
genesis of depression illness. In: DOLLERY, C. The Drugs. Edinborough: Churchill
Livingstone, 1999. 165p.
BOSCH, S. W.; LANGE, B. O.; NEUBERT, M.; PAZ, G. Corticosteroid, immune
suppression, and psychosis. Curr. Psychic. Rep., v. 93, p. 221801, 2004.
BRUNETTE, D. M.; CHEHROUDI, B. The effects of the surface topography of
micromachined titanium substrata on cell behavior in vitro and in vivo. J.
Biomec. Engineering-Transac. Asme, v. 121, n.1, p. 49-57, 1999.
BUGAMELLLI, F.; RAGGI, M. A.; ORIENTI, I.; ZECHI, V. Use of chitosan for
sustained release preparations of water soluble drugs. Arch Pharm. Pharm. Pharm.
Med. Chem., n. 331, p. 133, 1998.
CANDAU, F.; SELB, J. Hydrophobically-modified polyacrylamides prepared by
micellar polymerization. Coll. Inter. Scie., v.79, p. 149-172, 1999.
CASU, B.; GENNARO, U. A conductimetric method for the determination of sulphate
and carboxyl groups in heparin and other mucopolysaccharides. Carbohydr. Res.,
v. 39, p. 168-176, 1975.
CHALETET, C.; DAMOUR, O.; DOMARD, A. Inflence of the degree of acetylation on
some biological properties of chitosan films. Biomaterials, v. 22, p. 261-268, 2001.
CHANDY, T.; SHARMA, C. P. Chitosan matrix for oral sustained delivery of ampicilin.
Biomaterials, v. 12, n. 12, p. 123-131, 1993.
CHAPEKAR, M. S. Tissue engineering: challenges and opportunities. J. Biomed.
Mater. Res., v. 53, n. 6, p. 617-20. 2000.
CHAUVETEAU, G.; LECOURTIER, J. Propagation of Polymer Slugs through
Adsorbent Porous Media. In: STAHL, G.; SCHULZ, D. N. Water-Soluble Polymers
for Petroleum Recovery. New York: Plenum Press, 1988. p.93-95.
112
CHEN, X.; PARK, H. Chemical characteristics of O-carboxymethylchitosans related
to the preparation conditions. Carbohydr. Polym., v. 53, n. 4, p. 355-359, 2003.
CHEN, L.; DU, Y.; TIAN, Z.; SUN, L. Effect of the degree of deacetylation and the
substitution of carboxymethyl chitosan on its aggregation behavior. J. Polym. Sci.
Part. B, v.43, p. 296-305, 2005.
CHEN, X.; LIU, S. Q.; DU, Y. M.; PENG, H.; SUN, L. P. Carboxymethyl-chitosan
protects rabbit chondrocytes from interleukin-1 -induced apoptosis. Eur. J. Pharm.,
v. 54, p. 1-8, 2006.
COSTA, T. H. C.; FEITOR, M. C.; ALVES JR.; C., FREIRE, P. B.; BEZERRA, C. M.
Effects of gas composition during plasma modification of polyester fabrics. J. Mater.
Process. Technology, v. 173, p. 40–43, 2006.
DAMIANI, D.; KUPERMAN, H.; DICHTCHEKENIAN, V.; DELLA MANNA, T.;
SETIAN, N. Análise crítica da altura final de crianças em uso de glicocorticóides.
Pediatria, v. 1, p. 71-82, 2001.
DEBRASSI, A. Preparação de matrizes anfifílicas utilizando a O-carboximetil
quitosana para posterior aplicação como sistema de liberação de fármacos.
2008. 58 f. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação) – Curso de Farmácia,
Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2008.
DESAI, J. D.; BANAT, I. M. Surface tension and ionic strength. Microbiol. Mol. Biol.
Rev., v. 47, p. 61, 1997.
DESHMUKH, R. R.; BHAT, N. V. The mechanism of adhesion and printability of
plasma processed PET films. Mater. Res. Innovations., v. 7 p. 283–290, 2003.
DORAI, R.; KUSHNER, M. J. A model for plasma modification of polypropylene using
atmospheric pressure discharges. J. Physics D: applied Physics, v. 36, p. 666-685,
2003.
DUCHE YNE, S.; RADIN, S.; REILLY, G.; BHARGAVE, G.; LEBOY, P. S.
Osteogenic effects of bioactive glass on bone marrow stromal. J. Biomed. Mater.
Res. Part A, v. 73A, p. 21-29, 2005.
DUREJA, H.; TIWARY, A. K.; GUPTA, S. Simulation of skin permeability in chitosan
membranes. Int. J. Pharm. , v. 1, n. 213, n. 1-2, p.193-198, 2001.
ESQUENET, P.; TERECH, F.; BOUE, E.; BUHLER, R. Structural and rheological
properties of hydrophobically modified polysaccharide associative networks.
Langmuir, v. 20, p. 3583-3592, 2004.
FARMACOPÉIA BRASILEIRA. 4. ed. São Paulo: Atheneu, 1988.
FELT, O.; BURI, P.; GURNY, R. Chitosan: A unique polysaccharide for drug delivery
Drug. Dev. Ind. Pharm., v. 24, p. 979-993, 1998.
113
FREEPONS, D. Enhancing food production with chitosan seed-coating technology.
In: Biopolymers Utilizing Nature´s Advanced Materials. Symposium at the Fifth
Chemical Congress of North America, Cancun: American Chemical Society. Nov,
1997.
GAUCHER, G.; DUFRESNE, M.; SANT, V. P.; KANG, N.; MAYSINGER, D.;
LEROUX, J-C. Block copolymer micelles: preparation, characterization and
application in drug delivery. J. Control. Release, v. 109, p. 169-188, 2005.
GE, H. C.; LUO, D. K. Preparation of carboxymethyl chitosan in aqueous solution
under microwave irradiation. Carbohydr. Res., v. 340, p. 1351-1356, 2005.
GILL, M. Direct cell contact screening for materials and devices. Med. Device Diagn.
Ind., v. 4, p. 72-76, 1982.
GOTTLIEB, H. E.; KOTLYAR, V.; NUDELMAN, A. NMR Chemical shifts of common
laboratory solvents as trace impurities. J. Org. Chem., v.62, p. 7512-7515, 1997.
GRANT, J. L.; DUNN, D. S.; MCCLURE, D. J. Argon and oxygen sputter etching of
polystyrene, polypropylene, and poly(ethylene terephthalate) thin films. J. Vacuum
Sci. Techn., v. 6, p. 2213-2220, 1988.
GUO, Z. G.; CHEN, R.; XING, R. ; LIU, S.; YU, H.; WANG, P.; LI, C.; LI, P. Novel
derivatives of chitosan and their antifungal activities in vitro. Carbohydr. Res.,
v. 341, p. 351-354, 2006.
GUTERRES, S. S.; FESSI, H.; BARRATT, G.; DEVISSAGUET, J.; PUISIEUX, F.
Pentamidine-loaded poly (D, L-lactide) nanoparticles: physicochemical properties and
stability work. Int. J. Pharm., v. 4, p. 113, 57, 1995.
HAMMAN, J. H.; SCHULTZ, C. M.; KOTZE, A. F. N-trimethyl chitosan chloride:
optimum degree of quaternization for drug absorption enhancement across epithelial
cells. Drug Dev. Ind. Pharm., v. 29, p. 161-172, 2003.
HARPER, H. A. Manual de química fisiológica. 4. ed. Rio de Janeiro:
Atheneu/Guanabara-Koogan, 1997.
HENNI-SILHADI, W.; DEYME, M.; BOISSONNADE, M.; APPEL, M.; LE CERF, D.;
PICTON, L.; ROSILIO, V. Enhancement of the solubility and efficacy of poorly watersoluble drugs by hydrophobically-modified polysaccharide derivatives. Pharm. Res.,
v. 3, p. 1791-1799, 2007.
HENNI, W.; DEYME, M.; STCHAKOVSKY, M.; LE CERF, D.; PICTON, L.; ROSILIO,
V. Aggregation of hydrophobically modified in solution and at the air water interface.
J. Col. Inter. Sci., v. 28, p. 316-324, 2005.
HOOD, P. P.; COTTER, T. P.; COSTELLO, J. F.; SAMPSON, A. P. Effect of
intravenous corticosteroid on ex vivo leukotriene generation by blod leucocytes of
normal and asthmatic patients. Thorax, v. 54, p. 1075-1082, 1999.
114
HOU, W. M.; MIYAZAKI, S.; TAKADA, M.; KOMAI, T. Chitosan and sodium alginate
based bioadhesive tablets for intraoral drug delivery . Chem.Pharm. Bul., n.33,
p.3986, 1985.
HU, S. G.; JOU, M. H.; YANG, M. C. Biocompatibility and antibacterial activity of
chitosan and collagen immobilized poly(3-hydroxybutyric acid-co-3-hydroxyvaleric
acid). Carbohydr. Polym., v. 58, p. 173-179, 2004.
HUGUET, M. L.; GROBOILLOT, A.; NEUFELD, R. J. Hemoglobin encapsulation in
chitosan/calcium alginate beads. J. Appl. Polym. Sci., v.51, p.1427-1432, 1994.
HUGGET, A. C.; SCHILTER, B.; ROBERFROID, M.; ANTIGNAC, E.; KOEMAN, J. H.
Comparative methods of toxicity testing. Food. Chem. Toxic., v. 34, p. 183-92, 1996.
INAGARI, N.; NARUSHIMA, K.; LIM, S. K. Effects of aromatic groups in polymer
chains on plasma surface modification. J. Appl. Polym. Sci., v. 89, p. 96–103, 2003.
INOUE, K.; MACHIDA, Y.; SANAN, T.; NAGAI, T. Investigation of prolonged drug
release from matrix formulations of chitosan. Drug Des. Deliv., n. 4, p. 55, 1989.
INVITTOX/ERGATTE/FRAME. MTT citotoxicity test, 1990.
JACKSON, K.; YOUNG, D.; PANT, S. Drug–excipient interactions and their affect on
absorption. PSTT, v. 3, n. 10, p. 336-345, 2000.
JACOBS, I. C.; MASON, N. S. Polymer delivery systems concepts, in polymeric
delivery systems: properties and applications. Washington, DC: American Chemical
Society, 1993. p.1-17.
JAHAGIRDAR, C. J.; TIWARI, L. B. Study of plasma polymerization of
dichloromethane on cotton and polyester fabrics. J. Appl. Polym. Sci., v. 94, p.
2014–2021, 2004.
JENQUIN, M. R.; MCGINITY, J. W. Characterization of acrylic resin matrix films and
mechanisms of drug-polymer interactions. Int. J. Pharm., v. 101, n. 1, p. 23-34,
1994.
KADNAIM, A.; JANVIKUL, W.; WICHAI, U.; RUTNAKORNPITUK, M. Synthesis and
properties of carboxymethylchitosan hydrogels modified with poly(ester-urethane).
Carb. Polym., v. 23, p. 234-243, 2008.
KARLSEN, A. M.; AABY, K.; SIVERTSEN, H.; BAARDSETH, P.; ELLEKJÆR, M. R.
Instrumental and sensory analysis of fresh Norwegian and imported apples. Food
Chem., n. 10, p. 305-314, 1999.
KATO, Y.; ONISHI, H.; MACHIDA, Y. N-succinyl-chitosan as a drug carrier:
water-insoluble and water-soluble conjugates, Biomaterials, v. 25, p. 907–915,
2004.
KIM , C. S.; KIM, G. Y.; LÜ, C-D.; MOROZUMI, T. Azimuthal angle distribution in
B K*( K )l+l- in the low invariant ml+l- region. Phys. Rev., v.62, p. 034-049, 2000.
115
KUBOTA, N.; TASTUMOTO, N.; SANO, T.; TOYA, K. Polyssaccharides. Carbohydr.
Res., v. 268, p. 324, 2000.
KUMAR, M. N. V.; KUMAR, N. Polymeric controlled drug delivery
systems:perspective issues and opportunities. Drug dev. Ind. Pharm., v. 27, p. 1-30,
2001.
LANDOLL, L. M.; Non ionic polymer surfactans. J. Polym. Sci. Polym. Chem., v. 20,
p. 443-445, 1982.
LEE, K. Y.; PARK, W. H.; HA, W. S. Polyelectrolyte complexes of sodium alginate
with chitosan or its derivatives for microcapsules. J. Appl. Polym. Sci., v. 63, p. 425432, 1996.
LIMA, C. M. Comprimidos de dipirona obtidos por diferentes processos de
granulação: Estudos comparativos das velocidades de dissolução “in vitro”, Rev.
Port. Farm., v. 67, p. 345-357, 1997.
LIU, T-Y.; CHEN, S-Y.; LIN, Y-L.; LIU, D-M. Synthesis and characterization of
amphiphatic carboxymethyl-hexanoyl chitosan hydrogel: water-retention ability and
drug encapsulation. Langmuir, v. 22, p. 9740-9745, 2006.
LIU, C.; FAN, W.; CHEN, X.; LIU, C.; MENG, X.; PARK, H. J. Self-assembled
nanoparticles based on linolei-acid modified carboxymethyl-chitosan as carrier of
adriamcycin (ADR). Cur. Appl. Phys., v. 7, p. 125-129, 2007a.
LIU, Y.; HUANG, K.; PENG, D.; DING, P.; LI, G. Preparation and characterization of
glutaraldehyde cross-linked O-carboxymethylchitosan microspheres for controlled
delivery of pazufloxacin mesilate. Int. J. Biol. Macromol., v. 41, p. 87-93, 2007b.
LOPES, W. A.; FASCIO, M. Esquema para interpretação de espectros de
substâncias orgânicas na região do infravermelho. Quím. Nova, v. 27, n. 4, p. 670673, 2004.
LOPEZ, R. R. A.; LAMIM, R.; FREITAS, R. A.; BURGER, C.; BRESOLIN, T. M. B.
Estudo de toxicidade aguda Oral (Dose Única) de N-carboximetilquitosana. Acta
Farm. Bonaerense, v. 24, n. 2, p. 242-245, 2005.
MACHADO, F. P.; FARIAS, F. P. Efeito da N-carboximetilquitosana sobre os
níveis plasmáticos de triglicerídeos, colesterol total e frações (HDL, LDL e
VLDL-COLESTEROL) e sobre excreção de gordura fecal em ratos adultos.
2003. 111 f. Monografia (Graduação) – Curso de Farmácia, Universidade do Vale do
Itajaí, Itajaí, 2003,
MACLEOD, C. A.; RADKE, C. J. Rheological Analysis and Measurement of
Neutrophil Indentation. A growing drop technique for measuring dynamic interfacial
tension. J. Colloid. Interf. Sci., n. 160, p. 435–448, 1993.
MAJETI, N. V.; KUMAR, R. Characteristics of nano and microparticles as controlled
drug delivery devices. J. Pharm. Pharmaceut. Sci., v. 3, p. 123-129, 2000.
116
MAO, H. Q.; KDAIYALA, I.; LEONG, K. W.; ZHAO, Z.; DANG, W. Biodegradable
polymers: poly (phosphoester)s. In: Encyclopaedia of Controlled Drug Delivery,
New York: Mathowitz E.1999. v. 1, p. 45-60.
MARTINDALE, K. The complete drug reference, XXXII, Pharmaceutical. London:
Parfitt ed.Press, 1999. 1050p.
MATHUR, N. K.; NARANG, C. K. Chitin and chitosan, versatile polysaccharides from
marine animals. J. Chem. Educ., v. 67, n.11, p. 938-942, 1990.
MIRANDA, M. E. S.; RODRIGUES, C. A.; BRESOLIN, T. M. B.; FREITAS, R. A.;
TEIXEIRA, E. Rheological aspects of N-carboxymethylchitosan in diluited solutions.
Alim. Nutr., v. 14, n. 2, p. 141-147, 2003.
MIRANDA, M. E. S.; MARCOLLA, C.; RODRIGUES, C. A.; WILHELM, H. M.;
SIERAKOSKI, M. R.; BRESOLIN, T. M. B.; FREITAS, R. A. Chitosan and Ncarboxymethylchitosan: I. The role of N-carboxymethylation of chitosan um the
thermal stability and dynamic mechanical properties of its films. Polym Int., v. 55, p.
961-969, 2006.
MORENO, R.; MATOS, R.; FEVEREIRO, T. Outcome prediction in intensive care.
Solving the paradox Journal Intensive Care Medicine. Rev. Port. Med. Intensiva, v.
6, p. 1432-1238, 2001.
MUZZARELLI, R. A. A.; TANFANI, F.; EMANUELLE, M.; MARIOTTI, S. N-(carboxy
methylated) Chitosans: Novel Chelating polyampholytes obtained from chitosan
glyoxylate. Carboydr. Res., v. 107, p. 199-214, 1982.
MUZZARELLI, R. A. A.; IIARI, P.; PETRARULO, M. Solubility and structure of Ncarboxymethylchitosan. Int. J. Biol. Macromol., v. 16, p. 177-180, 1994.
MUZZARELLI, R. A. A.; PETER, M. G.; LEY, J. P.; SCHWEIKART, F. Chitinase
inhibitors. Chitin Handbook, Atec, Grottammare, p. 313-320, 1997.
NAYLOR, L. J. Dissolution of steroids in bile salt and lecitin solutions, with references
to bile salt concentrations in the GI tract. Eur. J. Pharm. Biopharm., n. 41, p. 346353, 1995.
NETZ, P. A.; GONZÁLES ORTEGA, G. Fundamentos de físico-química: uma
abordagem conceitual para as ciências farmacêuticas. São Paulo: Artmed, 2002.
p.247-263.
NITSCHKE, M.; PASTORE, G. M. Biostensoativos: Propriedades e aplicações.
Quim. Nova, v. 25, p. 772-776, 2002.
NUNTHANID, J. Effect of heat on characteristics of chitosan film coated on
theophyline tables. Drug Dev. Ind. Pharm., v. 28, n. 8, p. 919-930, 2002.
117
OH, K. T.; BRONICH, T. K.; BROMBERG, L.; HATTON, T. A.; KABANOV, A. V.
Block ionomer complexes as prospective nanocontainers fot drug delivery. J.
Control. Release, v. 115, p. 9-17, 2006.
OLIVEIRA, R. B.; LIMA, E. M. Polímeros na obtenção de sistemas de liberação de
fármacos. Rev. Eletr. Farm., v. 3, n. 1, p. 29-35, 2006.
ORTONA, O.; DERRICO, G.; MANGIAPIA, G.; CICCARELLI, D. The aggregative
behavuior of hydrophobically modified chitosans with substitution degree in aqueous
solution. Carbohydr. Polym., v. , p. 419-425, 2008.
PAN, H.; JIANG, H. L.; CHEN, W. L. Interaction of dermal fibroblasts with electrospun
composite polymer scaffolds prepared from dextran and poly lactide-coglycolide.
Biomaterials, v. 27, n. 17, p. 3209-3220, 2006.
PANG, H. T.; CHEN, X. G.; PARK, H. J.; CHA, D. S.; KENNEDY, J. F. Preparation
and rheological properties of deoxycholate-chitosan and carboxymethyl-chitosan in a
aqueous systems. Carbohydr. Polym., v. 69, p. 419-425, 2007.
PEESAN, M.; SIRIVAT, A.; SUPAPHOL, P.; RUJIRANIT, R. Dilute solution properties
of hexanoyl chitosan in chloroform dichloromethane and tetrahydrofuran. Carbohydr.
Polym., v. 64, p. 175-183, 2006.
PEIT, F.; ILLIOPOULOS, I.; AUDEBERT, R.; SZONYL, S. Polymerizable Surfactants
and Micellar Polymers Bearing Fluorocarbon Hydrophobic Chains Based on Styrene.
Langmuir, v. 13, p. 4229, 1997.
PEIT-AGNELY, F.; ILLIOPOULOS, I.; ZANA, R. Hydrophobically modified sodium
polyacrylates in aqueous solutions: associationa mechanism and characterization of
the aggregates by fluorescence probing. Langmuir, v. 16, p. 9921-9927, 2000.
PETER, M. G. Applications and environmental aspects of chitin and chitosan. JMS.
Pure Appl. Chem., v. 32, n. 4, p. 629-640, 1995.
PILLAI, O.; PANCHAGNULA, R. Polymers in drug delivery. Curr. Opin. Chem. Biol.,
v. 5, p. 447-451, 2001.
POLK, A.; AMSDEM, B.; YAO, K. D.; PENG, T.; GOOSEN, M. F. A. Bioadhesive
polymers as platforms for oral controlled drug delivery, II: synthesis and evaluation of
some swelling water insoluble bioadhesive polymers. Pharm. sci., n. 83, p.178,
1994.
PRABAHARAN, M.; REIS, R. L.; MANO, J. F. Carboxymethyl chitosan-graftphosphatidylethanolamine: Amphiphilic matrices for controlled drug delivery. React.
Funct. Polym., v. 67, p. 43-52, 2007.
QUN, G.; AJUN, W. Effects of molecular weight, degree of acetylation and ionic
strength on surface tension of chitosan in dilute solution. Carbohydr. Polym., v. 64,
p. 29-36, 2006.
118
RABEA, E. I.; BADAWY, M.; ROGGE, T.M.; STEVENS, C.V. Insecticidal and
fungicidal activity of new synthesized chitosan derivatives. Pest. Manage. Sci., v. 61,
n. 10, p. 951-960, 2005.
RAMESH, H. P.; VISWANATHA, S.; THARANATHAN, R. N. Safety evaluation of
formulations containing carboxymethyl derivatives of starch and chitosan in albino
rats. Carbohydr. Polym., v. 58, n. 4, p. 435-441, 2004.
RANG, H. P.; DALE, M. M.; RITTER, J. M. Farmacologia. 5. ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2003. p. 470-478.
RATHKE, T. D.; HUDSON, S. M. Solvent and solvent effects in organic chemistry.
J.M.S. Rev. Macromol. Chem. Phys., v. 34, p. 375, 1994.
RAUEN, T. R.; DEBACHER, N. A.; SIERRA, M. M. S. Tensoatividade de ácidos
húmicos de procedencias distintas. Quím. Nova, v. 25, n. 6, p. 909-913, 2002.
RIDAOUI, H.; JADA, A.; VIDAL, L.; DONNET, J. B. Effect of cationic surfactant and
block copolymer on carbon black particle surface charge and size. Colloids Surf. A,
v. 278, p.149, 2006.
RIOS, M. Polymers for controlled release: formulation follows function. Pharm.
Tecnol., v. 29, n. 6, p. 42-50, 2005.
RODRIGUES, I. R.; FORTE, M. M. C.; AZAMBUJA, D. S.; CASTAGNO, K.;
Synthesis and characterization of hibrid polymeric networks of PVA/QUI. In:
41ºInternational Symposium on Macromolecules 2006. Anais do 41º International
Symposium on Macromolecules 2006.
ROLLER, S.; COVILL, N. The antifungal properties of chitosan in laboratory media
and apple juice. Int. J. Food Microbiol., v. 1, n. 47, p. 67-77, 1999.
ROSENTHAL, A.J. J. Surfactants and interfacial phenomena. Chem., v. 78, p.332334, 2001.
SANDRI, G.; ROSSI, S.; FERRARI, F.; BONFERONI, M. C.; MUZZARELLI, C.;
CARAMELLA, C. Assessment of chitosan derivatives as buccal and vaginal
penetration enhancers, Eur. J. Pharma. Sci., v. 21, p. 351-359, 2004.
SCHIGEMASA, Y.; USUI, H.; MORIMOTO, M.; SAIMOTO, H.; OKAMOTO,Y. ;
MINAMI, S.; SASHINA, H. Applications of chitin and chitosans. Carbohydr. Polym.,
v. 34, p. 237-239, 1999.
SERRANO, M. C.; PAGANI, R.; VALLET-REGI, M.; PENA, J.; RAMILA, A.;
IZQUIERDO, I.; PORTOLES, M. T. In vitro biocompatibility assessment of
poly(epsilon-caprolactone) films using L929 mouse fibroblasts. Biomaterials, v. 25,
n. 25, p. 5603-5611, 2004.
SEYFARTH, F.; SCHLIEMANN, S.; ELSNER, P.; HIPLER, U. C. Antifugal effect of
high- and low-molecular-weight chitosan hydrocholoride, carboxymethyl chitosan,
119
chitosan oligosaccharide and N-acetyl-D-glucosamine against Candida albicans,
Candida krusei and Candida glabrata. Int. J. Pharm., v. 12, p. 45-56, 2007,
SIEPMANN, J.; PEPPAS, N. A. Modeling of drug release from delivery systems
based on hydroxypropyl methylcellulose (HPMC). Adv. Drug Deliv. Rev., v. 48, p.
149-157, 2001.
SIGNINI, R.; CAMPANA FILHO, S. P. Purificação e caracterização de quitosana
comercial. Polímeros: Ciência e Tecnologia, v. 10, p. 63-68, 1998.
SIMON, S.; DUGAST, J. Y.; LE CERF, D.; PICTON, L.; MULLER, G. Amphiphilic
polysaccharides. Evidence for a competition between intra and intermolecular
associations in dilute system. Polym., v. 44, p. 7917-7924, 2003.
SINGLA, A. K.; CHAWLA, M. Chitin and chitosan: some pharmaceutica and
biological aspects – update. J. Pharm. Phamacol., v. 53, p. 1047, 2001.
SILVERSTEIN, R. M.; BASSELER, G. C.; MORRIL, T. C. Identificação
espectrofotométrica de compostos orgânicos. 5. ed. Rio de Janeiro, 1994. 387p.
SRINIVASA, P. C.; BASKARAN, R.; RAMESH, M. N.; PRASHANTH, K. V. H.;
THARANATHAN, R. N. Storage studies of mango packed using biodegradable
chitosan film. Eur. Food Res. Technol., n. 215, p.504-508, 2002.
STORPIRTIS, S.; OLIVEIRA, P. G.; RODRIGUES, D.; MARANHO, D. A equivalência
farmacêutica no contexto da intercambialidade entre medicamentos genéricos e de
referência: bases técnicas e científicas. Rev. Brás. Ciênc. Farm. ,n. 31, p. 1, 1999.
SUDARSHAN, N. R.; HOOVER, D. G.; KNORR, D. G. Antibacterial activities of
chitosans and chitosan oligomers with different molecular weights on spoilage
bacteria isolated from tofu. Food Biotechnol, v. 6, p. 257-272, 1992.
SUI, W.; WANG, S.; CHEN, G.; XU, G. Surface and aggregate properties of an
amphiphilic derivative of carboxymrthylchitosan. Carbohydr. Res., v. 339, p. 1113–
1118, 2004.
SUI, W.; YIN, C.; CHEN, Y.; ZHANG, Z.; KONG, X. Self-assembly of an amphiphilic
derivative of chitosan and micellar solubilization of puerarin. Colloids Surf. B, v. 48,
p. 13–16, 2006.
SUI, W.; WANG, Y.; DONG, S.; CHEN, Y. Preparation and properties of an
amphiphilic derivative of succinyl-chitosan. Colloids Surf. A, v. 316, p.171–175,
2008.
SUN, L.; DU, Y.; FAN, L.; CHEN, X.; YANG, J. Preparation, characterization and
antimicrobial activity of quaternized carboxymethyl chitosan and application as pulpcap. Polym., v. 47, p. 1796-1804, 2006.
120
SYNOWIECKI, J.; AL-KHATEEB, A. Production, properties, and some new
applications of chitin and its derivatives. Crit. Rev. Food Sci. Nutr., n. 43, v. 2, p.
145-171, 2003.
TAYLOR, K. C.; NASR-E1-DIN, H. A. Polymer-improved oil recovery. J. Pet. Sci.
Eng., v. 45, p. 233, 2004.
THANOO, B. C.; SUNNY, M. C.; JAYAKRISHNAN, A. Cross-linked chitosan
microspheres preparation and evoluation as a matrix for the controlled release
pharmaceutics. J. Pharm. Pharmacol., v. 44, p. 283-286, 1991.
THANOU, M.; NIHOT, M. T.; JANSEN, M.; VERHOEF, J. C.; JUNGINGER, H. E.
Mono-N-carboxymethylchitosan (MCC), a polyampholytic chitosan derivative,
enhances the intestinal absorption of low molecular weight heparin across intestinal
epithelia in vitro and in vivo. J. Pharm. Sci., v. 90, n.1, p. 38-46, 2001.
TIEN, C. L.; LACROIX, M.; ISPAS-SZABO, P.; MATEESCU, M. A. N-acylated
chitosan: hydrophobic matrices for controlled drug release. J. Control. Release,
v.13, p. 93, 2003.
TOKURA, S.; TAMURA, H. O-carboxymethyl-chitin concentration in granulocytes
during bone repair. Biomacromolecules, v. 2, n. 2, p. 417-421, 2001.
TOZAKI, H.; KOMOIKE, J.; TADA, C.; MARAYAMA, T.; TERABE, A.; SUZIKI, T.;
YAMAMOTO, A.; MURANISHI, S. Chitosan capsules for colon-specific drug delivery:
Improvement of insulin absorption from the rat colon. J. Pharm., v. 86, p. 1016,
1997.
TOZAKI, H.; ODORIBA, T.; OKADA, N.; FUJITA, T.; TERABE, A.; SUZIKI, T.;
YAMAMOTO, A.; MURANISHI, S. Chtosan capsules for colon-specific drug
delivery:Enhanced localization of 5-aminosalicylic acid in the large intestine
accelerates healing of TNBS-induced colits in rats. J. Control. Realease, v.82, p.
51-61, 2002.
UNITED STATES PHARMACOPEIA. Rockville, Twinbrook Parkway, 1995. v.23
p.1697-99.
VAN KREVELEN, D.W. Properties of polymers: their correlation with chemical
structure; their numerical estimation and prediction from additive group contributions.
3.ed. Amsterdam: Elsevier, 1997. 349p.
VERRIER, S.; BAREILLE, R.; ROVIRA, A.; DARD, M.; AMEDEE, J. Human
osteoprogenitor responses to orthopaedic implant: Mechanism of cell attachment and
cell adhesion. J. Mat. Sci-Mats Med. , v. 7, n. 1, p. 46-51, 1996.
XIONG, J.; TAM, S.; GAN,J. Effect of enzymatic degradation on the release kinetics
of model drug from Pluronic F127/poly(lactic acid) nano-particles. J.Control.
Release, v. 108, p. 263-270, 2005.
121
WANG, Y.; LIU, L. R.; ZHANG, Q. Q. The interaction between bovine serum albumin
and the self-aggregated nanoparticles of cholesterol-modified O-carboxy methyl
chitosan. Polym., v. 48, p. 4135-4142, 2007.
WENZEL, D. G. COSMA, G. N. A quantitative metabolic inhibition test for screnning
toxic compunds with cultured cells. Toxicology, v. 29, p.173-82, 1983.
WILLIAMS, G. M.; DUNKEL, V. C.; RAY, V. A. Cellular systems for toxicity. Ann. N.
Y. Acad. Sci., v. 407, p. 481-484, 1983.
YAHYA, G. O.; HAMAD, E. Z. Viscosity behavior and surface and interfacial activities
of hydrophobically modified water-soluble acrylamide/N-phenyl acrylamide block
copolymers. Lymer, v. 36, p.3705, 1995.
YANG, L.; PAULSON, A.T. Effects of lipids on mechanical and moisture barrier
properties of edible gellan film. Food Chem., v. 33, n. 7, p. 571-578, 2000.
YAO, Z.; ZHANG, C.; PING, Q.; YU, L. A series of novel chitosan derivatives:
Synthesis, characterization and micellar solubulization of paclitaxel. Carbohydr.
Polym., v. 68, p. 781-792, 2007.
YAMAMOTO, A.; TOZAKI, H.; OKADA, N.; FIGITA, T. Colon-specific delivery of
peptide drugs and anti-inflamatory drugs using chitosan capsules. S.T.P. Pharm.
Sci., v. 10, n. 1, p. 23-24, 2000.
YIN, L.; FEI, L.; CUI, F.; TANG, C.; YIN, C. Superporous hydrogels containing
poly(acrylic acid-co-acrylamide)/ O-carboxymethyl chitosan interpenetrating polymer
networks. Biomaterials, v. 28, p.1258–1266, 2007.
YU, S-H.; MI, F-L.; SHYU, S-S.; TSAI, C-H.; PENG, C-K.; LAI, J-Y. Miscibility,
mechanical characteristic and platelet adhesion of 6-Ocarboxymethy
Chitosa/polyurethane semi-IPN membranes. J. Membr. Sci., v. 276, p. 68–80, 2005.
YU, Z.; MCGERVEY, J. D.; JAMIESON, M. A. Methods for investigation of the free
volume in polymers. Russ. Chem. Rev., v. 76, p. 59-78, 2007.
ZHAO, A.; YAO, P.; KANG, C.; YUAN, X.; CHANG, J.; PU, P. Synthesis and
characterization of tat-mediated O-CMC magnetic nanoparticles having anticancer
function. J. Magn. Mater., v. 295, p. 37-43, 2005.
ZHU, A. P.; ZHANG, M.; ZHANG, Z. Surface modification of e PTFE vascular grafts
with O-carboxymethylchitosan. Polym. Int., v. 53, n. 1, p. 15-19, 2004.
ZHU, A.; CHAN-PARK, M. B.; DAI, S.; LI, L. The aggregation of O-carboxymethyl
chitosan in dilute aqueous solution. Colloids Surf. B, v. 43, p. 143-149, 2005a.
ZHU, A. P.; FANG, N.; CHAN-PARK, M. B.; CHAN, V. Interaction between Ocarboxymethylchitosan and dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine bilayer.
Biomaterials, v. 26, p. 6873-6879, 2005b.
122
ZHU, A.; DAI, S.; LI, L.; ZHAO, F. Salt effects on aggregation of O-carboxymethy
lchitosan in aqueous solution. Colloids Surf. A, v. 47, p. 20-28, 2006.
ZHU, A.; LIU, J.; YE, W. Effective loading and controlled release of campthecin by
O-carboxymethylchitosan aggregates. Carbohydr. Polym., v. 63, n. 1, p. 89-96,
2006.
ZHU, A.; CHEN, T. Blood compatibility od surface-engineered poy (ethylene
terephthalate) via o-carboxymethylchitosan. Colloids Surf. A, v. 50, p. 120-125,
2006.
ZHU, A.; JIN, W. ; YUAN, L.; YANG, G.; YU, H.; WU, H. O-carboxymethylchitosanbased novel gatifloxacin delivery system. Carbohydr. Polym., v 68, p. 693-700,
2007.
ZHU, A.; YUAN, L.; LIAO, T. Suspension of nanoparticles Fe2O3 stabilized by
chitosan and O-carboxymethylchitosan. Int. J. Pharm., v. 350, p. 361-368, 2008.
ZHU, Y. Propertiens of polymeric drug delivery prepared by hot-melt extrusion.
2002. Tese (Doutorado)-Faculty of Graduate School of the University of Texas,
Austin, 2002.
ZULEGER, S., LIPPOLD, B. C. Polymer particle erosion controlling drug release. I.
Factors influencing drug release and characterization of the release mechanism. Int.
J. Pharm., v. 217, n. 1-2, p. 139-152, 2001.