UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INDUÇÃO DO ESTRESSE DO RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO
CELULAR PELO VACCINIA VIRUS: MODULAÇÃO DA VIA UPR
DURANTE A INFECÇÃO VIRAL
THIAGO LIMA LEÃO
Dissertação de Mestrado apresentado ao Programa de
Pós-Graduação do Departamento de Microbiologia,
Instituto de Ciências Biológicas da Universidade
Federal de Minas Gerais, como requisito necessário à
formação como Mestre em Microbiologia.
Orientação: Prof. Dr. Flávio Guimarães da Fonseca
Co-orientação: M. Sc. Bárbara Resende Quinan
Belo Horizonte
Outubro de 2013
INDUÇÃO DO ESTRESSE DO RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO
CELULAR PELO VACCINIA VIRUS: MODULAÇÃO DA VIA UPR
DURANTE A INFECÇÃO VIRAL
THIAGO LIMA LEÃO
Belo Horizonte
Outubro de 2013
iii
“A MENTE QUE SE ABRE A UMA NOVA IDÉIA JAMAIS
RETORNA AO SEU TAMANHO ORIGINAL”.
Albert Einstein
iv
Dedico esse trabalho a minha avó Zuleika (in
memorian) por todo o seu amor e suporte
v
AGRADECIMENTOS
Ao professor Flávio Guimarães da Fonseca, pela oportunidade, por confiar, apoiar e por sua
competência, dedicação e disponibilidade em orientar este trabalho.
À doutoranda Bárbara Resende Quinan, pela orientação, colaboração e confiança.
Ao professor Aristóbolo Mendes da Silva, pela confiança, por sua imprescindível colaboração
que tornou esse trabalho possivel, pela paciência nos ensinamentos e pela orientação com
empenho e disposição.
Aos doutores Gabriel Magno de Almeida, Marco Antônio Campos e Viviane Gouvêia pela
participação na avaliação desta dissertação.
À minha companheira Fábiola, por todo amor e dedicação.
A todos do laboratório de Virologia Básica e Aplicada pelas oportunas e relevantes
contribuições e pelos ensinamentos ao longo desse trabalho.
Aos alunos de pós-graduação e graduação do Instituto de Ciências Biológicas (ICB) da
UFMG, Mariana, Patrícia, Rodrigo e Fernando; à funcionária Tânia Mara, meu muito
obrigado pela receptividade e ajuda constante.
À Universidade Federal de Minas Gerais, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de
Microbiologia.
Aos docentes e funcionários da Universidade Federal de Minas Gerais, Instituto de Ciências
Biológicas.
À minha família por me apoiar e ajudar a tornar o meu sonho possível, em especial minha
mãe.
A todos que contribuíram direta ou indiretamente para a execução deste trabalho, meu muito
obrigado!
vi
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS .................................................................................................................................. VIII
LISTA DE TABELAS .................................................................................................................................... X
LISTA DE ABREVIATURAS ...................................................................................................................... XI
RESUMO ..................................................................................................................................................... XVI
I – INTRODUÇÃO ........................................................................................................................................18
1.1 – O RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO E SUAS VIAS DE ATIVAÇÃO DE RESPOSTA AO ESTRESSE CELULAR ........... 18
1.2 – SENSORES DO ESTRESSE DO RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO ....................................................................... 23
1.2.1 – Proteína Cinase Dependente de Inositol - IRE1 ............................................................................... 23
1.2.2 – Proteína Cinase Residente no Reticulo Endoplasmático semelhante à PKR – PERK ...................... 26
1.2.3 – Fator de Transcrição 6 – ATF-6 ....................................................................................................... 28
1.3 – CINÉTICA DA ATIVAÇÃO DOS SENSORES DA UPR ..................................................................................... 29
1.4 – VIA UPR E INFECÇÕES VIRAIS .................................................................................................................. 30
1.5 – FAMÍLIA POXVIRIDAE................................................................................................................................ 32
1.6 – MVA (VÍRUS VACCINIA ANKARA MODIFICADO) ..................................................................................... 38
1.7 – RESPOSTA IMUNE INATA DO HOSPEDEIRO À INFECÇÃO POR VACV ........................................................... 40
1.8 – LUCIFERASE DE VAGA-LUMES .................................................................................................................. 42
II – JUSTIFICATIVA ...................................................................................................................................44
III – OBJETIVOS .........................................................................................................................................46
OBJETIVO GERAL ............................................................................................................................................... 46
OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................................................................... 46
IV – METODOLOGIA .................................................................................................................................47
4.1 – ESTRATÉGIA DE TRABALHO ...................................................................................................................... 47
4.2 – AMOSTRAS VIRAIS RECOMBINANTES (RMVA) ......................................................................................... 48
4.2.1 – Origem dos Vírus rMVA ................................................................................................................... 48
4.2.2 – Iniciadores ........................................................................................................................................ 49
4.2.3 – Sequenciamento (SANGER et al., 1977; Dye Enamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing Kit for
MegaBace – GE Healthcare) ........................................................................................................................ 50
4.2.4 – Análise das Sequências Nucleotídicas .............................................................................................. 51
4.2.5 – Produção de Células Fibroblásticas de Embriões de Galinha (CEFs) ............................................ 51
4.2.6 – Repique Celular ................................................................................................................................ 53
4.2.7 – Seleção dos Vírus Recombinantes .................................................................................................... 53
4.2.8 – Amplificação dos Vírus Recombinantes ............................................................................................ 54
4.2.9 – Detecção do Gene para a Proteína Recombinante Luciferase ......................................................... 55
4.2.10 – Purificação Viral ............................................................................................................................ 56
4.2.11 – Titulação Viral ................................................................................................................................ 57
4.2.12 – Detecção do mRNA para a proteína Luciferase ............................................................................. 58
4.2.13 – Células Fibroblásticas de Embriões de Camundongo (MEFs) ...................................................... 59
4.2.14 – Extração de Proteínas Totais (WCE).............................................................................................. 60
4.2.15 – Quantificação das proteínas (Método de Bradford) ....................................................................... 60
vii
4.2.16 – Fracionamento de proteínas em gel de poliacrilamida/SDS-PAGE ............................................... 61
4.2.17 – Ensaios de Western-blot ................................................................................................................. 61
4.2.18 – Plasmídio pGL3 control vector ....................................................................................................... 62
4.2.19 – Obtenção dos plasmídio em pequena escala (Mini-preparações de DNA plasmidial) ................... 63
4.2.20 – Ensaios de atividade da proteína repórter Luciferase .................................................................... 64
4.3 – ANÁLISE DA OCORRÊNCIA DE ESTRESSE DO RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO (RE) ........................................ 65
4.3.1 – RT-PCR-RFLP .................................................................................................................................. 65
V – RESULTADOS .......................................................................................................................................67
5.1 – SEQUENCIAMENTO E ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS PLW44-HASS-LUC E PLW44-LUC .............................. 67
5.2 – PRODUÇÃO DOS VÍRUS RECOMBINANTES .................................................................................................. 70
5.3 – DETECÇÃO DO GENE PARA A PROTEÍNA LUCIFERASE ............................................................................... 71
5.4 – DETECÇÃO DO MRNA PARA A PROTEÍNA LUCIFERASE.............................................................................. 72
5.5 – DETECÇÃO DA EXPRESSÃO DA PROTEÍNA LUCIFERASE .............................................................................. 72
5.6 – AVALIAÇÃO DOS NÍVEIS DE EXPRESSÃO DA PROTEÍNA LUCIFERASE .......................................................... 73
5.7 – ANÁLISE DO PROCESSAMENTO DO FATOR DE TRANSCRIÇÃO XBP-1 DURANTE INFECÇÃO PELOS MVA
RECOMBINANTES ............................................................................................................................................... 75
5.8 – ANÁLISE DO PROCESSAMENTO DO FATOR DE TRANSCRIÇÃO XBP-1 DURANTE INFECÇÃO PELOS VACVS . 76
5.9 – EFEITO DA INFECÇÃO POR VACV SOBRE O PROCESSAMENTO DO FATOR DE TRANSCRIÇÃO XBP-1 .......... 77
VI – DISCUSSÃO ..........................................................................................................................................79
VII – CONCLUSÕES ....................................................................................................................................82
VIII – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...............................................................................................83
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Estresse do RE e funções da UPR.
Figura 2 – Mecanismo de ação dos três principais braços da via UPR.
Figura 3 – Múltipla via pró-apoptótica proveniente do RE.
Figura 4 – Via de sinalização IRE1.
Figura 5 – Modelo de controle traducional pela sequência líder do ATF4.
Figura 6 – Via de sinalização ATF6.
Figura 7 – Cinética da sinalização UPR e decisões de destino celular.
Figura 8 – Sequência temporal da ativação da via UPR.
Figura 9 – Morfologia do vírus Vaccínia.
Figura 10 – Representação esquemática da replicação do DNA do VACV.
Figura 11 – Ciclo de Multiplicação dos Poxvírus.
Figura 12 – Representação esquemática que ilustra a diferença básica entre o vírus
intracelular maduro e o vírus extracelular envelopado.
Figura 13 – Representação esquemática da entrada das partículas IMV e EEV na célula
hospedeira.
Figura 14 – Deleções ocorridas no genoma do vírus VACV-ANK que culminaram na
formação do vírus MVA.
Figura 15 – Peptídeo sinal HASS.
Figura 16 – Representação esquemática que ilustra a retirada dos embriões dos ovos. Além
disso, é mostrada também a posição do corte e os órgãos a serem retirados.
Figura 17 – Representação esquemática do plasmídeo pGL3-Control Vector.
Figura 18 – Alinhamento entre a sequência do gene da Luciferase clonado no pLW44 e a
sequência controle EF090416.1.
ix
Figura 19 – Alinhamento entre a sequência do gene da Luciferase, adicionado do peptídeo
sinal HASS, clonado no plasmídeo pLW44, e a sequência controle EF090416.1.
Figura 20 – Rodadas de seleção dos vírus recombinantes.
Figura 21 – Amplificação do DNA codificador para a proteína Luciferase com os iniciadores
pLW44-F e pLW44-R.
Figura 22 – Amplificação do DNA codificador para a proteína Luciferase com os iniciadores
pLW44-F e pLW44-R
Figura 23 – Amplificação do DNA codificador para a proteína Luciferase com os iniciadores
Luc-int-F e Luc-int-R
Figura 24 – PCR Aninhada. Amplificação do DNA codificador para a proteína Luciferase
com os iniciadores pLW44-F e pLW44-R seguido de amplificação com os iniciadores Lucint-F e Luc-int-R
Figura 25 – Amplificação do cDNA codificador para a proteína Luciferase com os
iniciadores Luc-int-F e Luc-int-R
Figura 26 – Detecção da proteína Luciferase
Figura 27 – Análise do polimorfismo dos fragmentos de restrição do DNA (PCR-RFLP) de
células infectadas com os rMVAs.
Figura 28 – Análise do polimorfismo dos fragmentos de restrição do DNA (PCR-RFLP) de
células infectadas com diferentes linhagens de VACV
Figura 29 – Análise do polimorfismo dos fragmentos de restrição do DNA (PCR-RFLP) de
células infectadas com VACV e tratadas com indutor de estresse do RE
x
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Iniciadores e suas respectivas sequências para amplificação do gene da Luciferase
e ou analise do inserto.
Tabela 2 – Análise da atividade enzimatica da luciferase em CEFs após 48 horas de infecção
e ou transfecção.
xi
LISTA DE ABREVIATURAS
ºC
Graus Celsius
µL
Microlitros
µg
Microgramas
AIP1
ASK1-interacting protein-1
APCs
Células apresentadoras de antígenos
ASFV
African Swine Fever Virus
ASK1
Apoptosis signal–regulating kinase 1
ATF
Activating transcription factor
b-ZIP
zíper de leucina e a região básica da proteína que é responsável pela
ligação no DNA
BAK
Bcl-2 homologous antagonist/killer
BAX
Bcl-2-associated X protein
Bcl-2
B-cell lymphoma 2
BI-1
ER membrane protein Bax inhibitor-1
Bim
Bcl-2-like protein 11
BiP
Binding immunoglobulin protein
bp
Pares de bases
BSA
Soro Albumina Bovina
C/EBPζ
CCAAT/enhancer binding protein Zeta
Ca2+
Cátions divalentes de cálcio
CASPASE
Cysteine-dependent Aspartate-Specific Proteases
CEFs
Chicken Embryo Fibroblasts
CO2
Dióxido de Carbono
cm2
Centímetro quadrado
xii
CEV
Vírus envelopado associado às células
CHOP
CCAAT-Enhancer-Binding Protein Homologous Protein
D-MEM
Meio de Eagle modificado por Dulbecco
DDIT3
DNA damage-inducible transcript 3
DMSO
Dimetilsulfóxido
DNA
Ácido desoxiribonucléico
DO
Densidade óptica
dNTP
Desoxiribonuleotídeo trifosfatado
E. coli
Escherichia coli
EcoRI
Enzima de restrição produzida pelo microrganismo Escherichia coli
EDTA
Ácido etilenodiaminotetracético
EEV
Vírus extracelular envelopado
eIF
Fator de iniciação da Tradução de Eucariotos
eIF2AK3
Eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 3
ERAD
Sistema de degradação associado ao Retículo Endoplasmático
ERK
Cinase regulada por sinal Extracelular
ERN1
ER to nucleus signalling 1
FADD
Fas-associated protein with death domain
GADD
Growth arrest- and DNA damage-inducible gene
GFP
Proteína verde fluorescente
GRP
Proteínas regulas por Glicose
H
Horas
H2O
Água
HA
Hemaglutinina
HIV
Vírus da imunodeficiência humana
Hind III
Enzima de restrição produzida pelo microrganismo Haemophilus
influenza
xiii
HSP
Proteína do Choque Térmico
IκB
Inhibitor of kappa B
ICB
Instituto de Ciências Biológicas
ICTV
International Committee on Taxonomy of Viruses
IKK
Inhibitor of kappa B Kinase
IMV
Vírus intracelular maduro
IP-10
Interferon-gamma-inducible protein 10
IPS-1
Estimulador do promotor de interferon-β 1
IRE1
Proteína Cinase dependente de Inositol
JNK
c-Jun N-terminal Kinase
kb
Quilobases
kDa
Quilodaltons
LB
Meio Luria-Bertani
Luc
Luciferase
LVBA
Laboratório de Virologia Básica e Aplicada
LVC
Laboratório de Virologia Comparada
m.o.i
Multiplicidade de infecção
MCS
Múltiplo sítio de clonagem
MCP-1
Proteína monócito quimioatraente 1
MDA-5
Proteína do gene associado a diferenciação do melanoma 5
MEM
Meio mínimo essencial de Eagle
mg
Miligramas
MHC
Complexo principal de histocompatibilidade
mH5
Promotor modificado do vírus Vaccínia do tipo tardio/precoce
MIP-1beta
Macrophage inflammatory protein 1-beta
mL
Mililitros
xiv
mM
Milimolar
mRNA
RNA mensageiro
MVA
Vírus Vaccínia Ankara Modificado
MyD88
Fator de diferenciação mielóide 88
NALP3
NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3
NCK
non-catalytic region of tyrosine kinase adaptor protein 1
NFκB
nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells
ng
Nanogramas
nm
Nanômetros
nt
Nucleotídeos
ORF
Janela aberta de Leitura
p/v
Percentagem peso/volume
PAR-4
Prostate apoptosis response-4
PARC
Pulmonary and activation-regulated chemokine
PBS
Solução salina fosfatada e tamponada
PCR
Reação em cadeia pela polimerase
PDI
Protein disulfide isomerase
PERK
PKR-like endoplasmic reticulum kinase
PFU
Unidade formadora de placa
PKR
Protein kinase R
PP2A
Protein phosphatase 2
PstI
Enzima de restrição produzida pelo microrganismo Providencia stuartii
PTP-1B
Protein-tyrosine phosphatase 1B
RACK1
Receptor for activated C kinase 1
RE
Retículo endoplasmático
RIDD
Regulated IRE1 dependent decay
xv
rpm
Revoluções por minuto
rMVA
MVA recombinante
RNA
Ácido ribonucléico
rVAC
VACV recombinante
S1P
Site-1 Protease
S2P
Site-2 Protease
SDF – 1alfa
Stromal cell-derived factor-1alpha
SalI
Enzima de restrição produzida pelo microrganismo Streptomyces albus
SFB
Soro fetal bovino
SIV
Vírus da imunodeficiência de Símios
SmaI
Enzima de restrição produzida pelo microrganismo Serratia marcescens
TBK1
TANK-binding kinase 1
TCD4+
Células T auxiliares
TCD8+
Células T citotóxicas
TGN
Trans-Golgi network
TLR
Receptor do tipo toll
TRAF2
TNF-R–associated factor-2
UFC
Unidade formadora de colônia
UFMG
Universidade Federal de Minas Gerais
UPR
Resposta a proteínas mal formadas
V
Volts
VACV
Vírus Vaccínia
VARV
Vírus Varíola
XBP-1
X-box binding protein 1
xvi
RESUMO
A via UPR (do inglês Unfolded Protein Response) é uma resposta celular ao acúmulo de
proteínas desenoveladas no lúmen do retículo endoplasmático, induzida por uma variedade de
estímulos externos e internos, incluindo acúmulo de proteínas mal formadas. Vírus como o
Vaccinia Virus induz às células hospedeiras produzirem grandes quantidades de proteínas
virais que sofrem glicosilação e outras modificações pós-traducionais no retículo
endoplasmático, podendo assim, sobrepujar a capacidade da organela e consequentemente
ativarem a via UPR da qual a via dependente de IRE1 é a mais conservada. O presente
trabalho teve como objetivo avaliar se a produção excessiva de proteínas recombinantes
direcionadas ao retículo endoplasmático, geradas a partir do vetor vacinal MVA, poderia
desencadear a via de sinalização UPR e afetar negativamente a produção destas proteínas.
Vírus MVA recombinante expressando a proteína luciferase endereçada ou não ao retículo
endoplasmático foram gerados e fibroblastos murinos selvagens ou deficientes para PERK
foram infectados por diferentes intervalos de tempo. Foi extraído o RNA total dessas células e
feito ensaios de RT-PCR-RFLP para avaliar o perfil de processamento do fator de transcrição
XBP-1. Os resultados sugerem que proteína recombinante está sendo produzida pelos vetores
virais MVA. Adicionalmente os resultados sugerem que a via UPR é modulada pelos MVA
recombinantes. Além disso, os dados mostram que, vírus MVA selvagens, bem como
Vaccínia-WR são capazes de modular a sinalização via IRE1 mesmo na presença
concomitante de um forte indutor de estresse do retículo endoplasmático. Assim concluiu-se
que a inibição do processamento de XBP1, representa uma estratégia viral de modulação da
resposta celular ao estresse não descrita anteriormente nos poxvírus.
Palavras-chave: Vírus Vaccínia, estresse do retículo endoplasmático, vetores virais
recombinantes, vírus MVA, UPR, IRE1-XBP1
xvii
ABSTRACT
The unfolded protein response (UPR) is a cellular response to accumulation of unfolded
proteins in the lumen of the endoplasmic reticulum (ER), induced by a variety of external and
internal stimuli, including accumulation of misfolded proteins. Viruses such as Vaccinia Virus
(VACV) induce host cells to produce large quantities of viral proteins, many of which
undergo glycosylation and other modifications in the ER. This large protein input can
overwhelm the work capacity of the organelle and consequently activate the UPR of which the
inositol-requiring enzyme 1 (IRE1)-dependent pathway is the most conserved component. The
aim of this work was to evaluate if the excessive production of recombinant proteins directed
to ER, generated from the MVA vector, could trigger the UPR signaling pathway and
negatively affect the production of these proteins. Recombinant MVA expressing the protein
luciferase addressed or not to ER, were generated and MEFs wild-type or PERK-KO were
infected. At different hours post infection, total RNA was extracted and RT-PCR-RFLP tests
performed to assess the transcription factor XBP-1 splicing pattern. The results suggest that
recombinant protein is being produced by viral vectors. Addictionaly, the data suggest that
the UPR signaling pathway is modulated by rMVAs. Moreover, MVA wild-type and VACVWR affected IRE1in the same way, even in the presence of ER stress inducers. We concluded
that IRE1 inhibition represents a previously undescribed poxvirus strategy to modulate
cellular stress response.
Key-Words: Vaccinia virus, ER stress, recombinant viral vectors, MVA, UPR, IRE1-XBP1
18
I – INTRODUÇÃO
1.1 – O Retículo Endoplasmático e suas vias de ativação de resposta ao estresse
celular
Grande parte das proteínas sintetizadas por uma célula eucariótica é destinada às vias
endo/exocíticas. Para tal, essas proteínas possuem uma sequência sinal marcando-as para
translocação do citoplasma para o lúmen do reticulo endoplasmático (RE). A síntese de
proteínas com a sequência sinal ocorre em ribossomos aderidos à membrana do RE e a
sequência sinal ajuda a direcionar o ribossomo à membrana do RE (NELSON & COX, 2005,
ALBERTS et al., 2002). O lúmen do RE é um ambiente único, que contém a maior
concentração de íons Ca2+ dentro da célula devido ao transporte ativo de íons de Ca2+ por
cálcio ATPases. O lúmen do RE quando comparado ao citossol é um ambiente oxidativo,
fundamental para a formação de pontes dissulfídicas nas proteínas em maturação permitindo a
estabilização da estrutura protéica. Devido às proteínas serem translocadas como cadeias
polipeptídicas não dobradas, o lúmen do RE possui uma infinidade de chaperonas cálciodependentes, lectinas, foldases e glucosidases que auxiliam na formação de pontes
dissulfídicas e glicosilação (somente de glicoproteínas) permitindo o dobramento e montagem
correta das proteínas.
O RE é uma organela multifuncional, que, além de garantir a estrutura correta das
proteínas, possui um papel chave na síntese de lipídeos, esteróis e na manutenção do cálcio
intracelular (FAGONE & JACKOWSKI, 2009). Desta forma, o RE é sensível a perturbações
na homeostase celular que são desencadeadas por diferentes tipos de estresse, podendo ser de
origem endógena ou exógena, e incluem, por exemplo, danos químicos, mutações gênicas,
insuficiência de nutrientes, diferenciação celular e também infecções por diferentes patógenos
(WALTER & RON, 2011; ZHANG & WANG, 2012.). Essas perturbações podem causar
alterações na estrutura das proteínas nascentes levando ao acúmulo de proteínas mal dobradas
no RE, uma condição denominada estresse do RE (Figura 1) (RON & WALTER, 2007).
19
Figura 1: Estresse do RE e funções da UPR. Perturbações a homeostase do RE causam sobrecarga de
proteínas desdobradas ou mal dobradas no lúmen do RE, uma condição denominada estresse do RE,
desencadeando a UPR. A UPR pode ser induzida por agentes químicos farmacológicos como tunicamicina,
tapsigargina, homocisteína, agentes redutor-oxidantes, bem como agentes antiinflamatórios não esteróides,
que impõem o estresse sobre o RE por causarem vigorosa síntese de proteínas, desequilíbrio do potencial
redox e de Ca+, e a inibição de modificações nas proteínas ou transporte para o complexo de Golgi. Em
células de mamíferos, estresse do RE também ocorre em muitas circunstâncias, tais como carência nutritiva,
processos de desenvolvimento, mutação genética, bem como insultos patogênicos. O exemplo mais
conhecido de estresse do RE decorrentes de mutação genética são doenças causadas por mal dobramento
protéico em humanos. Relatos recentes têm indicado em plantas, uma estreita ligação entre o UPR e
estímulos ambientais, tais como calor, o sal, e estresse, bem como ataque viral, embora os mecanismos
subjacentes sejam em grande parte ainda desconhecidos. O objetivo da indução UPR é de restaurar as
funções do RE e aliviar o estresse exercido sobre o RE. Além disso, o UPR também elimina proteínas mal
formadas citotóxicas, que são deslocadas pela membrana RE para sofrerem ubiquitinação (Ub) e degradação
mediada pelo proteassoma através de uma via conhecida como ERAD. No entanto, se a homeostase ou
função do RE não puder ser re-estabelecida, será ativado pela UPR uma via de morte celular programada,
supostamente para proteger o organismo de células que exibem proteínas mal dobradas, fato ainda não
confirmado em plantas. Fonte: Adaptado ZHANG & WANG, 2012
Nas células eucarióticas, essa condição é detectada por diferentes sensores residentes
na membrana do RE, os quais desencadeiam uma via de transdução de sinal que induzem a
expressão de chaperonas e foldases, componentes do sistema de degradação associado ao RE
(ERAD), além de aumentar a síntese de fosfolipídios, causando um aumento do volume da
organela de forma a contribuir para a recuperação da homeostase. A ativação coordenada dos
sensores constitui uma resposta específica ao estresse do RE, a qual foi denominada de
resposta a proteínas mal formadas ou UPR (do inglês Unfolded Protein Response) (Figura 2)
(NELSON & COX, 2005; XU et al. 2005; HUSSAIN & RAMAIAH, 2007; RUTKOWSKI &
KAUFMAN, 2004).
20
Figura 2: Mecanismo de ação dos três principais braços da via UPR. Acúmulo de proteína mal dobradas
dentro do lumen desencadeia UPR. Existem, pelo menos, três principais sensores de estresse na membrana
do RE: IRE1, PERK e ATF6. Em células com estresse do RE, IRE1 é autofosforilada, levando a ativação de
seu domínio endoribonuclease. Esta atividade medeia o processamento do mRNA codificador para XBP1,
que é um fator de transcrição que regula positivamente a expressão de muitos genes essenciais da UPR
envolvidos no dobramento e controle de qualidade de proteínas, além de regular a biogênese do RE/Golgi.
IRE1 ativo se liga a proteína adaptadora TRAF2, desencadeando ativação de JNK, que pode participar do
regulamento de autofagia e apoptose. Em alternativa, PERK ativo, fosforila o fator iniciador eIF2α e inibe a
tradução, diminuindo a síntese de proteínas e a sobrecarga de proteínas mal dobradas no RE. Além disso,
este evento permite a tradução específica de ATF4, um fator de transcrição que induz a expressão de genes
envolvidos no metabolismo de aminoácidos, resposta antioxidante e reguladores da apoptose incluindo
CHOP. Uma terceira via da UPR é mediada pelo ATF6, uma proteína transmembrana do RE tipo II
codificada por um fator transcricional com zíper de leucina. Após indução de estresse do RE, ATF6 é
processado, aumentando a expressão de algumas chaperonas do RE e genes relacionados ao ERAD. Na parte
inferior, são indicados as funções celulares abrangidas por cada ramo de sinalização da via UPR. Fonte:
adaptado de HETZ & GLIMCHER, 2009
A UPR pode ser encontrada desde organismos bem simples como as leveduras, até
organismos muito complexos como os mamíferos (MORI, 2009). Todos os eucariotos
compartilham mecanismos similares para lidarem com o estresse do RE, tais como o aumento
da expressão de chaperonas responsáveis pelo redobramento de proteínas e proteases
destinadas a degradar proteínas irreversivelmente desenoveladas. De qualquer forma,
diferentes aspectos são elaborados ou conservados dentre os diferentes organismos. Por
exemplo, em leveduras, o aumento dos níveis de proteínas desenoveladas leva a ativação de
um sensor que resulta na produção de um fator de transcrição, ativando a expressão de
21
chaperonas. Todos os metazoários possuem ainda um mecanismo adicional para lidar com o
estresse no retículo endoplasmático: a atenuação da tradução através da inibição da formação
de um complexo entre as duas subunidades ribossomais (BERNALES, PAPA, WAGNER,
2006). De forma bastante similar, as células de mamíferos podem aumentar os níveis de
chaperonas através de fatores de transcrição produzidos como resultado da ativação de uma
proteína homóloga à encontrada na via UPR de leveduras, a primeira a ser caracterizada.
Do ponto de vista evolutivo, simultaneamente ao aumento da complexidade dos
organismos houve também um incremento na via UPR, que passou a contar com um maior
número de moléculas e a influenciar um maior número de mecanismos celulares. Inicialmente
o restabelecimento da homeostase celular foi vinculado ao controle transcricional de genes e
posteriormente a via UPR passou a contar também com alternativas de controle traducional,
sendo que em mamíferos estas duas vias de controle são bastante estabelecidas e estudadas
(MORI, 2009)
Um paradoxo da via UPR é que ela leva a uma resposta com ativação simultânea de
vias de sobrevivência e pró-apoptóticas da célula (Figura 3) (WOEHLBIER & HETZ, 2011).
A primeira descoberta e mais bem caracterizada das vias pró-apoptóticas é a produção do
fator de transcrição CCAAT-Enhancer-Binding Protein Homologous Protein (CHOP)
também conhecido como Growth Arrest and DNA Damage Inducible Gene 153 (GADD153),
DNA-damage-inducible transcript 3 (DDIT3) e C/EBPζ que é regulada por todos os braços da
via UPR (OYADOMARI & MORI, 2004; HUSSAIN & RAMAIAH, 2007; XU et al. 2005).
O mecanismo pelo qual CHOP leva à morte celular ainda não está bem esclarecido, no
entanto, foi demonstrado que CHOP leva a repressão da transcrição de proteínas supressoras
de apoptose da família Bcl-2 (B Cell Lymphoma 2) e regula positivamente a síntese de
membros da família de receptores TNF (do inglês, Tumor Necrosis Factor) que contenham o
domínio de morte (XU et al. 2005; NISHITOH, 2012). A produção da proteína CHOP
“flutua” ao longo do tempo, sendo robustamente induzida na fase inicial após a exposição das
células aos fármacos, seguido de um declínio nos níveis de CHOP enquanto persiste a
regulação positiva de chaperonas. Em contrapartida à atividade pró-apoptótica, foi sugerido
que CHOP ativa a transcrição de GADD34, que interage com proteína fosfatase I para
catalisar desfosforilação eIF2α restabelecendo a síntese de proteínas e a homeostase celular
(HOSOI & OSAWA, 2010; RUTKOWSKI et al., 2006).
22
A adaptação celular ao estresse é resultado da estável regulação positiva da proteína de
78kDa regulada por glicose, GRP78, uma chaperona molecular residente no lúmen do RE que
também é conhecida como Binding Protein (BiP) ou heat shock 70 kDa protein 5 (HSPA5),
bem como outras proteínas que estão envolvidas em aliviar o estresse de dobramento de
proteínas no RE, incluindo GRP94, ERp57, calreticulina, calnexina PDI (do inglês, protein
disulfide isomerase) e p58IPK. Contudo, estudos feitos por Rutkowski e colaboradores (2006)
sugerem que de forma geral, o fator determinante para a adaptação das células é a composição
de proteínas, não havendo grande influência da expressão genômica. Além disso, sugerem que
as proteínas ATF4, CHOP e GADD34 formam uma rede integrada capaz de converter um
gradiente linear de estresse em um sinal binário de vida ou morte (RUTKOWSKI et al. 2006;
NISHITOH, 2012; TAKAYANAGI et al. 2013). Outros eventos pró-apoptóticos são
iniciados pela via UPR, incluindo a fosforilação de c-Jun N-terminal Kinase (JNK), clivagem
de caspases (cysteine-dependent aspartate-specific proteases) específicas do RE, ativação de
p53 e perda da homeostase de cálcio celular (Figura 3) (XU et al. 2005; HUSSAIN &
RAMAIAH, 2007; HE, 2006; TABAS & RON, 2011).
Figura 3: Múltipla via próapoptótica proveniente do
RE. Caspase-12 é uma
proteína localizada no RE
que é ativada em resposta ao
estresse e pode levar a
clivagem de caspase-3,
idependente da participação
da mitocôndria. Sinais proapoptoticos também são
enviados através da indução
de CHOP, que é uma
proteína a jusante tanto da
via mediada por PERK
quanto a via ATF6 da UPR.
Fonte:
Rutkowski
&
Kaufman, 2004.
A UPR também pode ativar a via do fator de transcrição NF-κB (nuclear factor kappalight-chain-enhancer of activated B cells), através da supressão da transcrição de IκB
(inhibitor of kappa B) por mecanismos que envolvem a PERK (do inglês, PKR-like
Endoplasmic Reticulum Kinase), resultando na regulação de mediadores inflamatórios, como
interleucina-6 e TNF-α (DENG et al., 2004).
23
1.2 – Sensores do Estresse do Retículo Endoplasmático
Quando a capacidade do RE é sobrecarregada, a via UPR é ativada. Esta ativação
pode ser resultado de diferentes condições fisiológicas como diferenciação e desenvolvimento
de células especializadas com alta taxa de secreção de proteínas como as células pancreáticas
e os linfócitos B, condições metabólicas alteradas, mutação em genes codificantes para
proteínas da via endo/exocítica, bem como infecção por determinados patógenos. Além disso,
algumas intervenções experimentais sabidamente induzem a via UPR, tais como inibição da
N-glicosilação no retículo endoplasmático, depleção dos estoques intracelulares de cálcio,
estresse redutor, inibição do proteassoma ou ainda expressão de proteínas mutantes que
saturam a capacidade de dobramento do retículo endoplasmático (Figura 1) (WALTER &
RON, 2011).
Existem três proteínas residentes no retículo endoplasmático que são responsáveis por
“policiar" o estresse do RE e são os principais sinalizadores da via UPR: a Proteína Cinase
dependente de Inositol (Inositol-requiring Transmembrane Kinase and Endonuclease, ou
IRE1), a Proteína Cinase Residente no RE semelhante à PKR (PERK) e o Fator de
Transcrição com zíper de leucina ATF6 (Activating Transcription Factor 6) (Figura 2)
(MARCINIAK & RON, 2006).
Essas moléculas são mantidas inativadas pela ligação da principal e mais abundante
chaperona do RE, BiP/GRP78 no domínio luminal desses sensores (SHEN et al., 2005; LI et
al., 2008).
1.2.1 – Proteína Cinase Dependente de Inositol - IRE1
IRE1 ou, ERN1 (do inglês, Endoplasmic Reticulum to Nucleus signaling 1), é uma
glicoproteína transmembrana do tipo I, ubiquamente expressa, com um domínio voltado para
o lúmen do RE sensível à polipeptídeos mal-formados através de reconhecimento dos
mesmos. Possui uma parte voltada para o citoplasma com um domínio cinase e um domínio
com homologia a ribonuclease (RNase) L. Em condições normais, IRE1 está associada ao BiP
que a mantêm em um estado inativo, quando proteínas mal-formadas acumulam no RE, elas
podem sequestrar a chaperona BiP/GRP78 ou se ligar diretamente a monômeros de IRE1
(GARDNER & WALTER, 2011; HETZ & GLIMCHER, 2009) resultando na oligomerização
e trans-autofosforilação dos domínios cinase justapostos, isso, promove uma mudança
24
conformacional que ativa alostericamente a atividade endonucleásica no lúmen da cisterna
reticular (RON & WALTER, 2007; KORENNYKH et al. 2011).
A ativação do domínio endonucleásico, inicia o processamento pós-transcricional do
mRNA do fator de transcrição Hac1 (homólogo a ATF/CREB1) em leveduras (COX &
WALTER, 1996; MORI et al., 1996) ou XBP-1 (X-box binding protein 1) em metazoários
(YOSHIDA et al., 2001; CALFON et al., 2002). O mRNA precursor de Hac1 ou XBP1 é
clivado duas vezes pela IRE1 ativada e um intron de 26 nucleotideos é excisado (HETZ et al.,
2011). Os fragmentos 5’ e 3’ de mRNA são re-ligados produzindo um mRNA que codifica
para um fator de transcrição da família b-ZIP (zíper de leucina e a região básica da proteína
que é responsável pela ligação no DNA) de 41 kDa mais estável e potente, capaz de induzir a
expressão de chaperonas, enzimas modificadoras (principalmente enzimas envolvidas na
degradação associada ao RE – ERAD) e remodelamento de membrana (YOSHIDA et al.,
2001; CALFON et al., 2002; LEE et al., 2003). A função nucleásica da IRE1 também esta
envolvida na degradação de mRNA associados a membrana, processo denominado de
Decaimento regulador dependente de IRE1 (Regulated IRE1 dependent decay, RIDD)
(Figura 4). Essa resposta complementa outros componentes da UPR em reduzir a tradução
global (SCHEUNER & KAUFMAN, 2008). Em adição, o domínio cinase da IRE1 pode se
ligar a proteína adaptadora TRAF2 (tumor necrosis factor receptor-associated factor 2)
levando a ativação de ASK1 (apoptosis signal-regulating kinase 1) e da via de cJun-N
terminal kinase (JNK) (RON & WALTER, 2007; HUSSAIN & RAMAIAH, 2007, LIN et al.,
2007; SCHRÖDER & KAUFMAN, 2006; XU et al., 2005). A cinase JNK fosforila alguns
membros da família de proteínas supressoras de apoptose Bcl-2 e induzem apoptose
dependente de BAX (Bcl-2 associated x protein) (LEI & DAVIS, 2003)
Hetz e colaboradores (2006) demonstraram a capacidade de BAX e outra proteína próapoptótica da família Bcl-2, BAK (do inglês, Bcl-2 homologous antagonist/killer), em se ligar
diretamente a IRE1 (RODRIGUEZ et al., 2012). Essas proteínas foram descritas
anteriormente durante apoptose derivada da mitocôndria. No entanto, recentemente foi
demonstrado que BAX é translocada não só para a mitocôndria, mas também para a
membrana do RE durante o estresse prolongado do RE. Uma vez translocada, BAX
permeabiliza a membrana e causa a translocação de proteinas do lúmen do RE para o citossol
(WANG et al., 2011). Nesse contexto, BiP, uma proteína do lúmen do RE com funções antiapoptóticas, quando presente no citossol, é translocada para a membrana plasmática onde se
25
torna um receptor indutor de apoptose por PAR-4 (Prostate Apoptosis Response-4) (WANG
et al., 2011) que é capaz de ativar a via extrínseca da cascata através de FADD, caspase-8 e
caspase-3 (BURIKHANOV et al., 2009).
Lúmen do RE
Citoplasma
Figura 4: Sinalização via IRE1. A sinalização por IRE1α em mamíferos é iniciada pela formação de uma
plataforma complexa de proteínas na membrana do RE, denominada por Hetz & Glimcher (2009) como o
UPRosome, onde múltiplos fatores se agrupam e modulam sua atividade. Por exemplo, ativação de IRE1α
exige a ligação de proteínas acessórias, tais como BAX, BAK, AIP1, e talvez proteínas BH3-only como
PUMA e BIM (a jusante de BAX/BAK) além da atividade do ER-located phosphatase PTP-1B. Sob
estresse crônico ou prolongado do RE, a sinalização por IRE1α é regulada negativamente e a proteína BI-1
localizada no RE é envolvida na inativação de IRE1α, ao passo que a ligação de HSP90 diminui sua
renovação. Além do mais, IRE1α quando ativa, inicia uma variedade de sinalizações através da ligação de
TRAF2 e talvez outras proteínas adaptadoras. Esses eventos desencadeiam a ativação de cinases
ASK1/JNK, ERK, e p38, que podem regular apoptose e autofagia. IRE1α sequestra IKK e induz a
sinalização via NF-κB. Em adição, uma atividade não especifica da RNase foi descrita para IRE1α em
moscas. IRE1α em sua forma inativa interage com componentes da maquinaria ERAD podendo regular
esse processo e, também moduladores da ERK como NCK. Para simplificar, a figura separa os
componentes que controlam ativação/inativação de IRE1α em relação ao processamento do mRNA de
XBP1 (I), e os componentes relacionados a regulação de outras braços de sinalização (II), e esta separação
gráfica dos complexos não reflete uma dissociação temporal entre I e II. As proteínas que ligam a IRE1α
inativa são mostradas em escala de cores cinza, as que regula sua ativação e o processamento do mRNA de
XBP em azul e as que controlam outros vias de sinalização, em amarelo. Fonte: adaptado de HETZ &
GLIMCHER, 2009
26
1.2.2 – Proteína Cinase Residente no Reticulo Endoplasmático semelhante à
PKR – PERK
PERK também conhecida como eIF2AK3,
compartilha com IRE1 várias
características na sua estrutura e ativação, no entanto, falta-lhe o domínio com atividade
endorribonuclease (HARDING et al., 1999). Semelhante a sinalização por IRE-1, a
dissociação de BiP ligada a PERK permite PERK
oligomerizar e ser ativada por
autofosforilação (Figura 2). O dímero de PERK ativada é capaz de reconhecer e fosforilar a
subunidade alfa do fator de iniciação da tradução em eucariotos (eIF2α) no resíduo de serina
51, que inibe a troca do nucleotídeo GDP por GTP feita pelo complexo pentamérico eIF2B e
consequentemente atenua a tradução de mRNAs. eIF2 é uma proteína G heterotrimérica
(PER’ERY & MATHEW, 2007), se liga ao GTP e ao RNA transportador (tRNA)
“carregando” um aminoácido de metionina (Met-tRNAiMet) para a formação do complexo
ternário (eIF2-GTP-Met-tRNAiMet). O complexo ternário interage com a subunidade menor do
ribossoma (40S) e seus fatores protéicos associados (eIF1A e eIF3) para a formação do
complexo de pré iniciação (43S) necessário para o inicio da síntese do polipeptídeo. O
complexo de pré iniciação se liga ao mRNA ativado que está associado a fatores protéicos
(proteína de ligação à cauda poli-A – PABP, eIF4G e o complexo eIF4F). No passo seguinte,
esse complexo escaneia o mRNA na direção 5’ para a 3’ até reconhecer o códon de iniciação
(AUG) resultando na liberação do eIF1 permitindo a hidrólise do GTP ligado ao eIF2,
liberando fosfato inorgânico, o que diminui a afinidade do eIF2 pelo Met-tRNAiMet. Após
esse evento a subunidade maior do ribossoma (60S) se junta, para formar o complexo de
iniciação (80S). Em consequência os fatores protéicos (eIF2, eIF3, eIF5) são liberados, sendo
o eIF2 liberado na forma de eIF2-GDP (guanosina difosfato). Para reciclar o eIF2 liberado e
para que o mesmo participe novamente do início da tradução é necessário que GDP seja
substituído por um nucleotídeo GTP, o que exige a participação de outro fator de iniciação da
tradução, o eIF2B, que também é um fator de troca de nucleotídeo de guanina. Fosforilação
da subunidade α do eIF2 no resíduo de serina 51 leva a uma associação forte entre o fator
eIF2B e o eIF2α-P, que impede a troca dos nucleotídeos GDP por GTP catalisada pelo eIF2B
(JACKSON et al., 2010).
Devido a quantidade limitada de eIF2B, a fosforilação de uma fração do pool de eIF2
presente nas células, pode ter um efeito relativamente grande na tradução, sequestrando o
27
eIF2B, o que dificulta a troca de nucleotídeos e leva inibição da tradução (PER’ERY &
MATHEW, 2007)
A fosforilação de eIF2α regula positivamente a tradução do fator de transcrição 4
(ATF-4), que por sua vez induz a transcrição de CHOP, GADD34, ATF-3 e genes envolvidos
no transporte de aminoácidos, biossíntese de glutationa e resistência ao estresse oxidativo.
(HUSSAIN & RAMAIAH, 2007; LEE et al., 2010)
Na ausência de estresse do RE, a maioria dos ribossomos estão comprometidos na
tradução de múltiplas janelas abertas de leitura a montante do códon de iniciação (uORFs) do
ATF-4 na porção 5' do mRNA e, não chegam a ORF do ATF-4. Após o estresse do RE,
grandes quantidades de eIF2α é fosforilada e permitem que os ribossomos "deslizem" através
das uORFs, aumentando a probabilidade atingirem a ORF do ATF-4, levando a sua tradução
(Figura 5) (RASHEVA & DOMINGOS, 2009).
Figura 5: Modelo de controle traducional pela sequência líder do ATF4. O mRNA de ATF4 é ilustrado
como uma linha reta com duas janelas abertas de leituras a montante (uORFs) 1 e 2 na sequência líder 5’,
representado por retângulos. O sombreamento da pequena subunidade ribossomal indica a associação do eIF2GTP com Met-tRNAiMet. A uORF1 próxima a 5’ é um elemento positivo que facilita o escaneamento feito pelo
ribossomo e reiniciação a jusante na região codificadora no mRNA de ATF4. Quando eIF2-GTP é abundante
em células não estressadas, ribossomos escaneiam a jusante da uORF1 e reiniciam na próxima região
codificadora, a uORF2, um elemento inibitório que bloqueia a expressão de ATF4. Em condições de estresse, a
fosforilação do eIF2 que é acompanhada da redução dos níveis de eIF2-GTP aumentando o tempo necessário
do escaneamento feito pelo ribossomo para tornar-se competente para reiniciar a tradução. Este atraso permite a
que os ribossomos escaneiem através da uORF2 inibitória e em vez disso reinicie na região codificadora de
ATF4. FONTE: Adaptado de YOUSEFI, I. 2011.
Ativação de PERK ocorre de forma reversível, permitindo a recuperação da tradução
de mRNAs após o estresse do RE, que em caso contrario, poderiam causar danos permanentes
à célula. Durante estágios tardios da via UPR, a proteína HSP40 p58IPK co-chaperona é
28
regulada positivamente pelo fator de transcrição ATF6, a fim de inibir atividade da cinase
PERK, isso ocorre pela ligação da co-chaperona p58IPK no domínio cinase da enzima PERK.
1.2.3 – Fator de Transcrição 6 – ATF-6
O ATF-6 é uma proteína transmembrana tipo II no RE com seu domínio aminoterminal que contém um motivo transcricional bZIP, voltado para o citoplasma. Diferente da
PERK e IRE-1a o ATF-6 possui na porção carboxi-terminal que esta voltada para o lúmen do
ER, sinais de localização do aparato Golgi que são mascarados por BiP/GRP78. Em resposta
ao estresse ER, a liberação de BiP/GRP78 facilita a translocação do ATF-6 para o Golgi onde
é clivado pelas proteases sítio 1 (S1P) e sítio 2 (S2P) para produzir um dominio aminoterminal ativo de 50 kDa (N-ATF6/p50ATF6) que é translocado para o núcleo onde induz a
síntese de chaperonas, enzimas modificadoras e CHOP (Figura 6) (HUSSAIN &
RAMAIAH, 2007; SHEN et al., 2005).
Figura 6: Via de sinalização ATF6. Em células não estressadas, ATF6 reside na membrana do RE. É
translocado para o Golgi durante o estresse do RE por um mecanismo que envolve Trombospondinas.
No aparato de golgi essa proteína é submetida a clivagens por proteases (S1P e S2P) presentes na
organela para liberar um porção efetora da proteína (ATF6f) no citossol. Depois entra no núcleo o induz
a expressão de uma serie de genes alvos da via UPR. Alguns vírus animais são capazes de ativar
seletivamente a via do ATF6 para a sua replicação. FONTE: modificado de ZHANG & WANG, 2012.
29
1.3 – Cinética da Ativação dos sensores da UPR
Ativação dos sensores UPR, teoricamente dispara quatro ondas de respostas ao longo
do tempo para restaurar a homeostase no RE e, em seguida, altera programas adaptativos para
a indução de apoptose a fim de eliminar células irreversivelmente danificadas (Figura 7): (i)
uma resposta imediata para diminuir a carga de proteínas na RE; (ii) uma resposta
transcricional controlando o aumento da expressão de genes alvos da UPR relacionados ao
dobramento e controle de qualidade; (iii) uma fase de transição; e (iv) uma fase final que
aumenta a expressão de genes pró-apoptóticos específicos.
Figura 7: Cinética da sinalização UPR e decisões de destino celular. Durante o curso do
estresse do RE, ocorre uma dinâmica modulação da sinalização de IRE1. Vários reguladores
associam-se ao IRE1 para regular a sua atividade em termos de cinética, amplitude e
especificidade dos tecidos. A interação com PTP1B, AIP1, HSP72, BAX e BAK, aumentam a
amplitude da sinalização por IRE1α. Após estresse prolongado, IRE1 retorna a um estado latente,
um processo modulado pela interação com BI-1 e, possivelmente com a fosfatase alcalina PP2A
em complexo com RACK1. Fonte: adaptado de WOEHLBIER & HETZ, 2011.
30
A via UPR é um mecanismo tempo-dependente e os componentes da mesma são
ativados de maneira sequencial diante das condições fisiológicas de estresse no retículo
endoplasmático (Figura 8).
Figura 8: Sequência temporal da
ativação da via UPR. Inicialmente a
via UPR atua no controle traducional
através de PERK inibindo a síntese de
novas proteínas e posteriormente, não
sendo este mecanismo capaz de
restabelecer a homeostase celular,
desencadeia-se uma fase de controle
transcricional
mediado
por
ATF6/IRE1, que tem como principal
função promover a indução da
expressão de XBP-1. Não sendo estes
mecanismos
suficientes
no
restabelecimento
da
homeostase
celular, ativa-se um processo de
degradação de proteínas desenoveladas
através de proteassomos, denominada
via ERAD. FONTE: BORSA, M.
2012.
1.4 – Via UPR e Infecções Virais
No curso de uma infecção produtiva os vírus induzem as células hospedeiras a
produzir grandes quantidades de proteínas virais, e diferente de eucariotos e procariotos, os
vírus não possuem chaperonas como as proteínas do choque térmico (HSPs) e contam
somente com as HSPs do hospedeiro para o dobramento das proteínas virais. Além disso,
muitas proteínas virais sofrem glicosilação e outras modificações no RE, causando estresse ao
ER e consequente ativação da UPR. Algumas consequências da UPR tais como expressão de
chaperonas e regulação do metabolismo podem ser úteis à replicação viral. No entanto, a
atenuação de síntese de proteína e apoptose não é conducente com a máxima replicação viral.
Por isso muitos vírus desenvolveram mecanismos diferentes de ativar seletivamente parte da
UPR para aliviar o estresse do RE (HOOPER, HIGHTOWER, HOOPER, 2012).
Vários estudos utilizando como modelo de infecção por diferentes vírus de mamíferos
incluindo membros das famílias Arenaviridae, Asfaviridae, Bunyaviridae, Caliciviridae,
31
Coronaviridae,
Flaviviridae,
Herpesviridae,
Orthomyxoviridae,
Paramyxoviridae,
Picornaviridae, Reoviridae, Retroviridae, Togaviridae, etc; demonstraram alguma modulação
da UPR. Todos são capazes de interferir com a sinalização de ao menos um dos braços da via
UPR (PASQUAL, G. et al. 2011; GALINDO, I. et al. 2012; VERSTEEG, G. A. et al. 2007;
PEÑA & HARRIS, 2011; BURNETT, H. F. et al. 2012; ZAMBRANO, J. L. et al., 2012;
BORSA, M. 2012; BARRY, G. et al., 2012). No entanto, como os sensores da UPR
reconhecem a infecção viral para ativar a via ainda não está completamente esclarecido. Um
estudo conduzido por Sung e colaboradores (2009) usando o coronavírus SARS, identificou
um proteína acessória do SARS-CoV (proteína 8ab) capaz de ligar diretamente ao domínio
luminal de ATF6. A expressão ectópica da proteína 8ab em células de mamíferos induz a
proteólise de ATF6 e translocação do RE para o núcleo (SUNG et al., 2009). Esse achado
sugere que talvez os vírus explorem suas próprias proteínas para modular diretamente a via
UPR.
Dentre os herpesviridae, umas das famílias virais mais estudadas nesse contexto,
foram identificadas várias proteínas capazes de interferir com a via UPR. Vírus como EpsteinBarr (EBV), infectam linfócitos B, células secretoras profissionais que precisam de um bom
funcionamento do RE e dependem fortemente da via UPR. Uma estratégia usada para garantir
a replicação viral é ativar a via UPR de maneira dose dependente da síntese de uma proteína
viral, a proteína latente de membrana 1 (LMP-1) que mimetiza o receptor CD40, induz a
expressão de NF-κB e culmina na ativação de IRE1, PERK e ATF6 (LEE & SUGDEN,
2008). Citomegalovírus (CMV), outro membro da família herpesviridae, possui uma
estratégia totalmente diferente da utilizada pelos EBV, os CMVs possuem proteínas virais
capazes de interagir com IRE1 e regular negativamente sua atividade, sendo que a expressão
de uma dessas proteínas (M50) é capaz de induzir uma redução nos níveis de expressão desse
sensor (STAHL et al., 2013). Diminuindo a expressão de IRE1 os CMVs podem evitar
respostas celulares que provavelmente são prejudiciais para replicação desses vírus.
Os membros da família Flaviviridae, como o Dengue vírus, também utilizam
difirentes estratégias para modular a UPR. Os dengue vírus (DENV) ativam de maneira
espécie especifica diferentes membros da via UPR e, no caso especifico dos DENV-2, a
ativação dos sensores da via é sequencial e ocorre em sincrônia com o estágio da infecção
viral permitindo que a célula hospedeira se adapte ao estresse causado pela infecção e
previnindo a ativação de eventos pró-apoptóticos (PEÑA & HARRIS, 2011).
32
Além do trabalho feito por Galindo e colaboradores (2012) para avaliar a relação da
UPR com a infecção pelo vírus da peste suína Africana (ASFV), pouco ou nenhum esforço foi
feito para investigar esta relação entre outras famílias de vírus de DNA fita dupla que
replicam no citoplasma. Em seu trabalho eles demonstraram uma ativação da via UPR, em
especifico o sensor ATF6 e caspase-12, aumento na expressão de chaperonas do RE como
calreticulina, calnexina, PDI, mas não de BiP e ERp57. Além disso, observaram um aumento
na expressão de GADD34, que pode explicar o fato de não haver atenuação da tradução
protéica nem acumulo de CHOP, também foi observada uma diminuição de uXBP-1 sendo
sua forma processada não detectada (GALINDO et al., 2012). A modulação da UPR e
indução da apoptose deve ser vantajoso para esses vírus, uma vez que esses processos
bloqueiam os efeitos prejudiciais a infecção enquanto mantêm os benéficos. Supõe-se que os
membros da família Poxviridae também sejam capazes de modular a via UPR uma vez que
esses possuem proteínas inibidoras de da proteína cinase R (PKR) e possivelmente PERK, no
entanto, essa capacidade nunca foi testada. Jindal & Young (1992) mostraram que a durante a
infecção pelo vírus Vaccínia, as proteínas da família Hsp70 tem papel crucial no dobramento
das proteínas virais e altos níveis de expressão de proteínas Hsp70 são detectados, mas não de
membros da família Hsp90 e Hsp60.
1.5 – Família Poxviridae
A família Poxviridae é constituída por duas subfamílias e treze gêneros de complexos
vírus de DNA que infectam células de vertebrados e invertebrados. A subfamília
Chordopoxvirinae, que consiste em dez gêneros: Avipoxvirus, Capripoxvirus, Cervidpoxvirus.
Crocodylidpoxvirus,
Leporipoxvirus,
Molluscipoxvirus,
Orthopoxvirus,
Parapoxvirus,
Suinopoxvirus e Yatapoxvirus (ICTV, 2013) e a subfamília Entomopoxvirinae que é divida
em três gêneros baseados no inseto hospedeiro em que foram isolados: Alphaentomopoxvirus,
Betaentomopoxvirus e Gammaentomopoxvirus. No entanto, análises completas das sequências
sugerem mudanças na classificação de alguns indivíduos do gênero Betaentomopoxvirus,
colocando-os em gêneros separados (MOSS, 2007; DAMON, 2007).
Dentro do gênero Orthopoxvirus encontram-se os vírus Varíola (VARV), Vaccinia
(VACV) e Cowpox. O VARV é o agente etiológico da varíola, doença que flagelou a
população humana até a sua “erradicação” no final da década de 70, quando foram feitas
33
grandes campanhas mundiais de vacinação organizadas pela OMS (Organização Mundial de
Saúde). O VACV é o agente etiológico da vaccínia bovina e foi o principal vírus utilizado na
campanha de vacinação contra o VARV (LEFKOWITZ et al., 2006; WEYER, 2009) O
último caso de ocorrência natural de varíola foi reportado no ano de 1977, tendo dois outros
casos ligados a laboratório em 1978 (DAMON, 2007). Já no caso dos VACV, surtos
zoonóticos da doeça causada por esses vírus foram relatados no Brasil (ABRAHÃO, J. S. et
al., 2009; TRINDADE et al., 2009) e um modelo hipotético para o ciclo de transmissão
desses vírus foi proposto baseado no fato desses estarem circulando entre animais silvestres,
peridomesticos e animais domesticados em diversos estados do país (DA FONSECA, F. G. et
al., 2011)
Os vírus Vaccínia (VACV), assim como todos os outros poxvírus, são vírus grandes e
complexos, que infectam animais (cerca de 400 x 240 x 200 nm) (PRESCOTT et al., 2002;
SMITH, 2007). São vírus cujo genoma é constituído por DNA de fita dupla, linear, cujo
tamanho varia de 130.000 pb até mais de 300.000 pb, e que apresentam alças terminais e
repetições invertidas (MOSS, 2007). O DNA está associado com proteínas e contido no cerne,
uma estrutura central formada como um disco bicôncavo e cercado por uma membrana. Dois
corpos elípticos ou laterais ficam entre o cerne e a membrana externa, que é composto por
uma membrana coberta por uma série de túbulos (Figura 9) (PRESCOTT et al., 2002
MURPHY, 1999). Os principais componentes dos poxvírus são proteínas, lipídeos e DNA
sendo que cada um deles contribui com, respectivamente, 90%, 5% e 3,2% do peso seco. Os
componentes lipídicos do VACV são predominantemente colesterol e fosfolipídeos, sendo o
carboidrato um componente encontrado nos vírus extracelulares envelopados (EEVs) como
parte das glicoproteínas. Também podem ser encontrados vestígios de RNA, porém, seu
significado ainda é incerto (MOSS, 2007).
34
Figura 9 – Morfologia do Vaccinia virus. (a) Diagrama da estrutura do Vaccinia. (b) Micrografia do vírus
mostrando claramente o nucleóide (x200.000). (c) Estrutura superficial do Vaccinia. Uma micrografia
eletrônica de varredura de quatro vírus mostrando a matriz espessa de fibras de superfície (x150.000).
Fonte: adaptado de PRESCOTT et al., 2002.
O processo de multiplicação dos poxvírus inicia-se com um contato da partícula viral
com a superfície celular, e sua posterior penetração na célula. O cerne viral é liberado no
citoplasma e, é transportado por microtúbulos para o interior da célula em regiões próximas
ao núcleo. Entre as várias enzimas encontradas no interior da partícula dos poxvírus existe
uma RNA-polimerase viral que transcreve cerca da metade do genoma viral em mRNAs
precoces. Esses RNAs são transcritos no interior do cerne do vírus e, a seguir, liberados no
citoplasma (MURRAY & ROSENTHAL, 2006). Os mRNAs precoces do VACV são
detectados dentro de 20 minutos após a infecção e acumulam em níveis máximos em 1-2
horas (MOSS, 2007).
Dos 50 polipeptídeos encontrados no cerne viral, 30 são enzimas, das quais pelo
menos metade são diretamente envolvidas na biossíntese de mRNAs precoces. Como as
enzimas necessárias são contidas no interior do cerne viral, a transcrição precoce não é
afetada por inibidores da síntese protéica (SMITH, 2007).
Os promotores dos genes do VACV são pequenos (~30pb) e ricos em A+T exatamente
como os promotores encontrados nos genes do hospedeiro, no entanto, os promotores virais
não são reconhecidos pela RNA polimerase II das células do hospedeiro, assim como a RNA
polimerase do VACV não reconhece os promotores das células hospedeiras (SMITH, 2007).
A replicação do DNA viral ocorre no citoplasma (PRESCOTT et al., 2002) em áreas
distintas, que aparecem como “fábricas” ou corpúsculos de inclusão em micrografias
eletrônicas (KATSAFANAS & MOSS, 2007). Num modelo proposto, a replicação começaria
com a introdução de um corte em uma das fitas de DNA perto das alças terminais. O
35
desdobramento da alça permite que a DNA polimerase copie a alça e faça a extensão ate o
final do molde. Então, as duas fitas separadas e as cópias de DNA recém produzidas se
dobram novamente em alças permitindo que a DNA polimerase continue a extensão da cópia
de todo o genoma, podendo formar moléculas concateméricas. Em seguida essas moléculas
são clivadas por nucleases específicas em monômeros como mostrado na figura 10, que são
empacotados em novos vírus (SMITH, 2007). Cabe ressaltar que este modelo ainda não foi
demonstrado experimentalmente. Por outro lado, a existência de uma primase viral sugere que
outras formas de replicação do DNA devem ser consideradas (DE SILVA et al. 2007).
Figura 10 – Representação esquemática da replicação do DNA do VACV. A molécula de dsDNA linear
com alças terminais é clivada perto de uma alça permitindo a extensão até ao final do modelo. Após a
renaturação da alça terminal, a extensão continua a produzir o DNA em moléculas concataméricas
intermediárias que são clivadas em monômeros com a mesma unidade de comprimento. O DNA recém
sintetizado é mostrado em vermelho e o DNA molde em preto. Fonte: adaptado de SMITH, 2007.
36
Em células sincronicamente infectadas com o VACV, a replicação do DNA começa 1
a 2 horas após a infecção e resulta na geração de 10.000 cópias do genoma por célula, das
quais metade é finalmente empacotada dentro de partículas virais (MOSS, 2007). O ciclo
reprodutivo completo nos poxvírus leva cerca de 24 horas (Figura 11). (PRESCOTT et al.,
2002).
Figura 11 – Ciclo de multiplicação dos poxvírus. Inicia-se com a adsorção viral seguido de fusão à membrana
plasmática e liberação do nucleocapsídeo no citoplasma. Ocorre a transcrição de genes precoces que induzem o
desnudamento secundário e consequente replicação do DNA. Durante e após a replicação do DNA, ocorre a
transcrição dos genes intermediários e tardios. Por fim, ocorre a morfogênese das partículas virais e aquisição de
membranas. As partículas recém formadas podem permanecer dentro da célula, aderidas à membrana plasmática
ou serem liberadas para o meio extracelular ou permanecem associadas à célula. Fonte: McFADDEN, 2005.
37
Estudos de como os poxvírus penetram nas células hospedeiras são complicados
devido à existência de múltiplas formas infecciosas que podem usar diferentes receptores
celulares e proteínas virais. No entanto, o DNA viral isolado é incapaz de causar infecção.
Sabe-se que os vírus envelopados extracelulares (EEVs) e os relacionados vírus envelopados
associados às células (CEVs) constituem partículas importantes para a difusão célula-célula,
sendo que ocorre a formação de caudas de actina para auxiliar os vírus CEVs nesse processo.
Já os vírus intracelulares maduros (IMVs) são partículas que são liberadas através do processo
de lise celular (MOSS, 2007; SMITH, 2007). Recentemente foi demonstrado que as formas
IMVs também podem entrar na célula através de endocitose mediada por receptor ou
macropinocitose (MERCER et al. 2010).
Os vírus EEVs e IMVs, ambos formas infecciosas que se desenvolvem no curso de
uma infecção, diferem-se somente porque o EEV é uma partícula de IMV envolvida por um
envelope lipídico derivado do “trans-Golgi network” (TGN) ou dos endossomos. Esse
envelope, adquirido durante a morfogênese e modificado pela inclusão de diversas proteínas
virais e celulares, está ausente nas partículas de IMVs (Figura 12).
Figura 12 – Representação esquemática que ilustra a diferença básica entre o vírus intracelular maduro e o
vírus extracelular envelopado. Fonte: adaptado de SMITH, 2007.
A entrada dos IMVs na célula hospedeira ocorre por um processo relativamente
simples porque são envolvidos por apenas um envelope lipídico. Assim, o cerne viral pode
entrar no citosol logo após a fusão da membrana do vírus com a membrana plasmática. Já a
entrada dos EEVs exige que um de seus envelopes lipídicos seja retirado por um mecanismo
não fusogênico que necessita de moléculas específicas na superfície da célula e do vírus
(SMITH, 2007). Esses diferentes processos de infecção celular são ilustrados na figura 13.
38
Figura 13 – Representação esquemática da entrada das partículas IMV e EEV na célula hospedeira. As
partículas de IMV se ligam ao um receptor na superfície celular não identificado e se fundem com a
membrana plasmática permitindo a liberação do cerne viral no citoplasma. A partícula EEV liga-se a
superfície celular e glicosaminoglicanos medeiam a disruptura não fusogênica da membrana externa do EEV.
O IMV interno em seguida liga-se a superfície da célula e entra como uma partícula de IMV. Fonte: adaptado
de SMITH, 2007.
O VACV tem a habilidade de interromper a produção de proteínas da célula
hospedeira após a infecção (MURRAY & ROSENTHAL, 2006) de tal forma, que os recursos
celulares podem ser quase completamente utilizados para a produção de proteínas virais e
proteínas recombinantes associadas ao vírus. As enzimas responsáveis pela síntese de mRNAs
virais são todas fornecidas pelo próprio vírus, que traz para o citoplasma celular uma RNA
polimerase dependente de DNA para a transcrição de genes virais e recombinantes (SMITH,
2007). Dentre as enzimas da maquinaria de transcrição fornecida pelo vírus incluem-se uma
enzima capping, uma poli A polimerase, fatores de iniciação e terminação da transcrição
precoce (inicial). Os mRNAs são poliadenilados e possuem uma extremidade metilada na
região 5’ (SMITH, 2007).
1.6 – MVA (Vírus Vaccinia Ankara Modificado)
O uso bem sucedido do VACV, no programa mundial de erradicação da varíola em
conjunto com o desenvolvimento de estratégias de geração eficiente de vírus Vaccinia
recombinantes (rVACV) expressando proteínas exógenas, aumentou o potencial do uso de
vetores derivados de poxvírus como delivery systems (sistemas de veiculação) em programas
de vacinação (RAMIREZ et al., 2000). O vírus MVA é derivado da linhagem de VACV
isolado na cidade de Ankara, Turquia. O MVA foi produzido por atenuação desta linhagem de
VACV de Ankara através de passagens seriadas em células primárias de embriões de galinha
(CEFs), resultando em deleções no genoma da amostra viral, tornando-a pouco virulenta e
39
capaz de atender à demanda da época que se configurava na produção de uma vacina segura
contra a Varíola (RAMIREZ et al., 2000).
Análises do genoma feitas por Meyer et al. (1991) e Antoine et al. (1998),
identificaram seis regiões principais de deleções (Figura 14) e os genes oriundos da amostra
parental (cerca de 15% do genoma parental viral, 30.000 pb), perdidos durante o curso da
atenuação com mais de 570 passagens em cultura de células (ANTOINE et al., 1998). Isso
tornou o MVA inapto a multiplicar produtivamente na maioria das células originárias de
mamíferos. No entanto, em CEFs, o MVA consegue multiplicar-se eficientemente
(AUSUBEL et al., 2003). Além disso, de acordo com Garber et al. (2009), rMVA também
multiplicam-se em títulos elevados em CEFs.
Figura 14 – Deleções ocorridas no genoma do vírus VACV-ANK que culminaram na formação do vírus
MVA. As seis regiões de deleção ocorrem principalmente em regiões pouco conservadas entre os poxvírus e
estão relacionadas à redução do espectro de hospedeiros e à evasão do sistema imune. Fonte: adaptado de
McFADDEN 2005.
O defeito replicativo do MVA em células humanas, bem como na maioria das outras
células de mamíferos, ocorre no final da morfogênese, mais precisamente como resultado de
um bloqueio na maturação do vírus, sem alteração na produção de proteínas precoces e tardias
(SUTTER & MOSS, 1992). Apesar dessa incapacidade de multiplicar em muitas células de
mamíferos, os MVAs possuem todas as vantagens dos poxvírus para utilização como vetores
de expressão em eucariotos, incluindo-se sua enorme capacidade de acomodar DNA exógeno
em seu genoma (até 25 Kb) bem como a expressão de altos níveis de proteínas, até mesmo de
proteínas recombinantes, capacidade de induzir resposta imune celular e humoral e conferir
40
proteção por longos períodos (GEIBEN-LYNN et al., 2008; DREXLER et al., 2004;
GRANDPRE et al., 2009).
Vários pesquisadores demonstraram a eficiência do uso de rMVA expressando
proteínas virais, tumorais ou de parasitos para indução de imunidade protetora (RAMIREZ et
al., 2000), mesmo que parcial, contra HIV (GUDMUNDSDOTTER et al. 2009; EARL et al.
2009), SIV (OURMANOV et al., 2009), AHSV (CHIAM et al., 2009), Influenza A/H5N1
(KREIJTZ et al., 2009), Dengue (MEN et al., 2000), raiva (ERTL, 2009), malária
(HUTCHINGS et al., 2007; PRIEUR et al., 2003), M. tuberculosis (TCHILIAN et al., 2009) e
melanoma (GREINER et al., 2006) usando diferentes regimes de imunização com dose e
reforço homólogo ou heterólogo e diferentes rotas de administração dos vírus recombinantes.
Apesar dos bons resultados utilizando vírus rMVA para imunização em diferentes
protocolos (GRANDPRE et al., 2009), estudos de interações intracelulares do hospedeiro com
o vírus rMVA, podem aumentar o sucesso dessa ferramenta molecular em induzir imunidade
protetora em mamíferos.
1.7 – Resposta imune inata do hospedeiro à infecção por VACV
A imunidade inata desempenha papel importante nas infecções microbianas, e uma
característica chave dessa resposta imune é sua capacidade de reconhecer uma variedade de
microorganismos, sinais de estresse e de dano celular por meio de receptores de
reconhecimento de padrão (PRRs). Esses receptores presentes em vários tipos celulares
podem estar na superfície, ancorados a membrana citoplasmática, em vesículas endossomais
e/ou no citoplasma sendo capazes de ativar essas células gerando uma potente resposta imune
(ABBAS, 2008). Os PRRs reconhecem padrões moleculares invariantes compartilhados por
vários microorganismos e que de forma geral, não estão presentes em mamíferos (ex: dsRNA,
ilhas CpG não metilados, peptídeos derivados de proteínas bacteriana contendo NFormilmetionil, açúcares ricos em manose, etc.). A ativação desses PRRs desencadeia uma
cascata de sinalização que resulta na síntese de proteínas envolvidas com a resposta imune e
processos inflamatórios. Os genes codificadores de tais receptores [ex: receptores do tipo toll
– TLR, receptores do tipo NOD – NLR (do inglês nucleotide oligomerization domain like
receptor), proteína cinase dependente de RNA de fita-dupla – PKR, etc.] não sofrem rearranjo
41
gênico tal como ocorre com os genes codificadores de receptores de linfócitos T e B, o que
limita o repertório de especificidade (MOGENSEN, 2009; ABBAS, 2008; GOLDSBY et al.,
2002; GARCÍA et al., 2006; GARCÍA et al., 2007; WILKINS & GALE Jr, 2010;
UNTERHOLZNER & BOWIE, 2007).
Existem 7 tipos de receptores TLR envolvidos na resposta imune contra vírus
(FINBERG et al., 2007). Delaloye e colaboradores (2009), demonstraram, mais
especificamente que o MVA induz uma resposta imune inata forte, sendo em macrófagos,
coordenada pelos receptores TLR-2 e TLR-6 dependente do fator de diferenciação mielóide
88 (TLR-2-TLR-6-MyD88), pela proteína do gene associado a diferenciação do melanoma 5
dependente de estimulador do promotor de interferon-β 1 (MDA-5-IPS-1) e pela via do
complexo molecular multimérico NALP3 inflamossomo, que é formado por NALP3, ASC
(Apoptosis-associated Speck-like protein containing a CARD) e pro-caspase 1 promovendo
uma regulação do padrão de citocinas, quimiocinas e interferons (DELALOYE et al., 2009).
No caso de células dendríticas plasmocitóides a ativação é realizada pelo receptor TLR-8MyD88 (MARTINEZ et al., 2010). O perfil de citocinas, quimiocinas e interferons pode
variar dependendo do tipo celular infectado (DELALOYE et al., 2009).
Os VACVs têm a capacidade de interromper a apresentação de antígenos restritos as
moléculas de MHC II (principal complexo de histocompatibilidade de classe II) em células
profissionais em apresentação de antígenos (APCs), essa capacidade depende do tempo de
infecção e do título viral (LI et al., 2005). Moléculas de MHC I são expressas em altos níveis
basais em células não infectadas, normalmente, tem sua expressão aumentada nessas células
quando essas são infectadas por MVA com uma baixa multiplicidade de infecção (m.o.i =
0,05) e diminuem sua expressão quando infectadas com altas doses (m.o.i = 5) (NÖRDER et
al. 2010).
Ensaios feitos por microarranjos de DNA revelaram que infecções de células humanas
pelo MVA levam a um aumento na expressão de genes do hospedeiro capazes de acentuar a
resposta imune específica (GUERRA et al., 2004). Em vários tipos celulares infectados com
o vírus MVA foi observado a ativação da via de sinalização do fator de transcrição NF-κB
(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), sendo dependente da
ativação da PKR por dsRNA (LYNCH et al., 2009), mesmo o vírus expressando genes
inibidores da PKR (genes K3L e E3L) (LANGLAND & JACOBS, 2002). A ativação da PKR
42
ocorre por dsRNAs gerados pela transcrição convergente de genes precoces, intermediários
ou tardios durante infecção pelo MVA (MYSKIW et al., 2011). Estudos mostraram que a
ativação da PKR ocorre durante a fase precoce ou intermediária de transcrição de genes virais
e somente na ausência do produto do gene K1L, outro inibidor da PKR, que é truncado no
genoma do MVA (WILLIS et al., 2011). Alem disso, espécies de RNA gerados durante a
infecção pelo MVA, ativam a via apoptótica da célula dependente da PKR.
Outra proteína viral sabidamente envolvida na inibição da via do fator de transcrição
NF-κB é a glicoproteína M2L, expressa precocemente durante o ciclo de multiplicação viral e
localizada no RE (HINTHONG et al., 2008).
Várias vias de transdução de sinais, ativadas durante uma infecção pelo MVA já foram
identificadas, entre elas incluem a ativação de ERK 1/2, JNK, IRF3, IRF7 (interferon
regulatory factor) e STAT-1 (Fator de transcrição Transdutor de sinais e ativador de
transcrição 1) (DELALOYE et al. 2009). Hu e colaboradores mostraram que a ativação da via
de sinalização pela cinase JNK (c-Jun amino-terminal cinase) é importante para a ativação da
PKR (HU et al., 2008). Em um estudo recente, foi demonstrado à habilidade do complexo
DNA-PK, formado por Ku70, Ku 80 e DNA-PKcs, em intensificar a reposta imune inata
dependente de IRF3 através da molécula adaptadora TBK1 (TANK-binding kinase 1)
(FERGUSON et al. 2012). O sensoreamento de DNA pelo complexo DNA-PK é inibido pela
proteína viral C16 que interage com o heterodímero de Ku e N2 que impede o processo
desencadeado por essa via (PETERS et al., 2013).
Dentre as estratégias que os VACV usam para evadir de respostas do hospedeiro a
infecção, destaca-se a expressão de proteínas virais com homologia a família Bcl-2, tais como
A46, A52, B14, C1, F1, K7, N1 e N2 (GONZALES & ESTEBAN, 2010; SMITH et al.,
2013) que atuam de forma não redundante em diferentes pontos das cascatas de sinalizações
da resposta imune inata.
1.8 – Luciferase de Vaga-Lumes
Luciferase é o nome genérico dado para uma família de enzimas que catalisam reações
bioquímicas a partir do substrato luciferina com o objetivo de emitir bioluminescência. Essas
proteínas compartilham entre si, sequências de nucleotídeos homólogas e que ocorrem em
43
procariotos, fungos, dinoflagelados, radiolários e em aproximadamente setecentos gêneros de
animais marinhos do reino Metazoa. A reação catalisada pela enzima luciferase oriunda do
vaga-lume Photinus pyralis usa ATP como co-fator e, é caracterizada pela formação de um
complexo enzima luciferil-adenilato, na presença do íon magnésio divalente (Mg2+) e,
consequente liberação de uma molécula de fosfato inorgânico ou pirofosfato (PPi).
Posteriormente, o complexo sofre descarboxilação oxidativa, o que produz Adenosina
Monofosfato (AMP), CO2
(g),
oxiluciferina e luz, além de reconstituir a luciferase. A luz é
emitida devido à conversão de energia química, durante a oxidação do substrato, a um estado
energético excitado o suficiente para emitir um fóton durante o retorno ao estado energético
inicial (CONTI et al, 1996). A reação é bastante eficiente já que é liberado aproximadamente
um fóton para cada molécula de luciferina oxidada. A luz produzida apresenta quantum de
0,88, possui cor verde amarelada e comprimento de onda de 560 nm em um potencial
hidrogeniônico (pH) entre 7,5 e 8,5 (DE WET et al, 1986).
A luciferase tem sido amplamente utilizada como gene ou proteína repórter no campo
da pesquisa científica, em estudos de biologia celular e molecular. Dentre esses estudos
destacam-se a construção de um virus recombinante Vaccinia WR expressando tal gene,
usado para seguir a infecção viral em tecidos (RODRIGUEZ et al, 1988). Também já foi
usado para monitorar em tempo real, por imagens da bioluminescência, a via biossitética
secretora em células de mamíferos usando um plasmídios contendo a sequência codificante
para a Gaussia Luciferase (BHAUMIK & GAMBHIR, 2002 ; SUZUKI et al., 2007).
44
II – JUSTIFICATIVA
É esperado que haja ativação da via UPR por vírus pertencentes a todas as famílias
virais conhecidas, em função da maior demanda por dobramento de proteínas derivadas
justamente da produção de proteínas virais durante uma infecção produtiva. Porém, também é
esperado que os vírus normalmente interfiram na ativação dessa via a fim de evitar que a
mesma culmine no processo de apoptose (RUTKOWSKI et al., 2006; HE, 2006). Dessa
forma, diante de infecções virais a via UPR pode ser apenas parcialmente ativada, apresentar
componentes funcionalmente inibidos ou ainda um padrão de ativação de proteínas
sincronizado com o estágio do ciclo de replicação do vírus invasor (ZHANG & WANG,
2012; HOOPER, HIGHTOWER, HOOPER, 2012).
Pesquisas conduzidas no Laboratório de Virologia Básica e Aplicada (ICB/UFMG)
buscam desenvolver vacinas utilizando vírus recombinantes tendo o vírus MVA como
plataforma, já que ele consiste em um dos sistemas de expressão mais versáteis para o uso em
eucariotos, com diversas aplicações na biologia molecular, sendo capaz de expressar grandes
quantidades do gene exógeno (GEIBEN-LYNN et al., 2008). Após o seu uso com sucesso,
durante a campanha de erradicação da Varíola, o MVA se tornou um forte candidato como
sistema de veiculação de antígenos em substituição às vacinas convencionais. Dessa forma,
muitos ensaios clínicos usando o MVA como vetor vacinal foram conduzidos e agora a sua
segurança é bem documentada.
Contudo, uma melhor compreensão da interação vírus-hospedeiro permitirá que
façamos modificações no vetor MVA que levem a maiores chances de sucesso como vetor
vacinal. Dessa forma, o objetivo deste trabalho é contribuir com a linha de pesquisa do nosso
grupo no sentido de entender a relação da UPR com a infecção por VACV que pode interferir
na eficiência de produção de proteínas recombinantes pelo sistema MVA e com isso, tentar
aperfeiçoar nossa ferramenta molecular usada no desenvolvimento de vacinas.
Além disso, o conhecimento dessas refinadas estratégias usadas pelo MVA para
controlar a via UPR, levam a uma nova e otimista perspectiva de que esses vírus ou proteínas
codificadas por ele possam eventualmente ser utilizados na terapêutica de patologias
45
neurodegenerativas, doenças auto-imunes, tumores, aterosclerose, entre outras doenças
crônicas.
46
III – OBJETIVOS
Objetivo Geral
O presente trabalho tem como objetivo geral investigar o impacto da ativação da via
UPR da célula hospedeira na eficiência da expressão de antígenos exógenos produzidos por
vetores recombinantes poxvirais.
Objetivos Específicos
- Gerar, por meio de recombinação homóloga os vírus MVA recombinantes
expressando a proteína Luciferase endereçada ou não ao retículo endoplasmático;
- Determinar a expressão da proteína recombinante Luciferase através de ensaios de
Western Blot;
- Avaliar a ativação de IRE1 durante a infecção pelos rMVAs, através de ensaios de
PCR-RFLP do fator de trascrição XBP-1, em células selvagens ou deficientes para PERK.
47
IV – METODOLOGIA
4.1 – Estratégia de Trabalho
48
4.2 – Amostras Virais Recombinantes (rMVA)
4.2.1 – Origem dos Vírus rMVA
O vírus MVA selvagem foi gentilmente cedido pelo Dr. Bernard Moss (Laboratory of
Viral Diseases, NIAID, National Institutes of Health – NIH, EUA), na passagem número 581.
Desde então, o vírus é rotineiramente multiplicado, purificado e titulado em CEFs no
laboratório.
Os vírus rMVA-GFP-Luc e rMVA-GFP-HASS-Luc foram gerados, através recombinação
homóloga em CEFs infectadas com vírus MVA selvagem e transfectadas com um dos
plasmídios de transferência (pLW44/HASS-Luc ou pLW44/Luc) (SANTOS e DA
FONSECA, 2010 – dados não publicados) construídos como parte do projeto de iniciação
científica do estudante Vinícius Cotta dos Santos no Laboratório de Virologia Comparada
(atual Laboratório de virologia Básica e Aplicada – LVBA).
O plasmídio pLW-44 vem sendo utilizado por vários pesquisadores para a construção
de MVAs recombinantes (BISHT et al.; 2004). O plasmídio de transferência pLW-44 (5028
pb) foi originalmente construído por Linda Wyatt (National Institute of Health), à partir do
vetor de clonagem pGEM-4z (2746 pb). O pLW-44 possui, além do esqueleto estrutural do
plasmídio pGEM-4z, duas regiões flanqueadoras (MVA flanco 1 e MVA flanco 2), um
promotor tardio do vírus Vaccinia, p11, que se localiza logo após a região flanqueadora 1 e
que controla a expressão do gene que codifica para a proteína GFP, uma região MCS
(múltiplos sítios de clonagem, do inglês multiple cloning sites) que possui locais de clivagem
para as enzimas de restrição SmaI, SalI e PstI, onde podem ser clonados possíveis genes de
interesse, e um promotor forte, mH5 (precoce/tardio em tandem), do Vaccinia vírus, que
controla a expressão dos genes inseridos nesta região MCS.
As regiões flanqueadoras MVA 1 e 2, presentes no pLW44, são homólogas á uma
região existente no vírus MVA denominada de sítio de deleção III. Essa similaridade permite
a recombinação homóloga entre as regiões de flanco presentes no plasmídio e as regiões
geneticamente homólogas presentes no vírus, dirigindo o cassete de expressão contendo o
gene exógeno para esse lócus.
Santos e Da Fonseca (2010) clonaram o gene da luciferase no MCS do pLW44 e,
também clonaram o gene da Luciferase acrescido de um peptídeo sinal de endereçamento ao
49
RE, HASS (Hemagglutinin Secretion Signal) (Figura 15), proveniente do Influenza A virus
H3N2, gerando dois plasmídios de transferência. O peptídeo sinal está localizado junto à
sequencia da proteína hemaglutinina no genoma do H3N2 e tem sido utilizado com sucesso
na construção de outros vetores recombinantes (DE ANDRADE et al., 2007; RESENDE et
al., 2008).
MKTIIALSYIFCLVFA
Figura 15: Peptídeo Sinal HASS. Sequência de aminoácidos do sinal de endereçamento proveniente do
Influenza A virus H3N2.
Além de construir os plasmídios de transferência, em seu trabalho, Santos e Da
Fonseca (2010) iniciaram a construção dos vírus MVA-GFP-Luc e MVA-GFP-HASS-Luc,
dando início ao processo de seleção dos vírus recombinantes com auxílio da expressão de
GFP, com intuito de isolar os vírus MVA recombinantes dos vírus selvagens. No entanto, a
obtenção dos vírus recombinantes não foi concluída. Assim, em continuidade ao projeto
iniciado anteriormente, foi concluída a seleção, amplificação, purificação e titulação dos vírus
recombinantes e posterior análise do estresse do retículo endoplasmático em células
infectadas com esses vírus.
4.2.2 – Iniciadores
Para a amplificação do gene da Luciferase foram utilizados os mesmos iniciadores
externos (EXT-Luc-F-SalI, EXT-Luc-HASS-F-SalI e EXT-Luc-R-PstI) desenhados por
SANTOS & da FONSECA (2010) e foram baseados em sequências depositadas no Genbank.
Em um dos iniciadores senso foram adicionados os códons do peptídeo sinal de
endereçamento ao RE, HASS. Vale a pena ressaltar que sítios de restrição para as enzimas
SalI e PstI foram acrescentados para que a clonagem no plasmídeo de transferência, pLW44,
pudesse ocorrer. Para que o sequenciamento fosse completo, foram construídos iniciadores
internos (INT-Luc-F e INT-Luc-R) que amplificam a região central do gene (TABELA 1).
Além disso, iniciadores (pLW44-F e pLW44-R) específicos para as regiões flanqueadoras
presentes no plasmídeo receptor pLW44, também foram utilizados na detecção e
sequenciamento desse gene.
50
TABELA 1 – Iniciadores e suas respectivas sequências para amplificação do gene da
Luciferase e ou analise do inserto.
Iniciadores
Sequência de nucleotídeos (5’ 3’)
GGGGTCGACATGGAAGACGCCAAAAAC
EXT-Luc-F-SalI
EXT-Luc-HASSF-SalI
GGGGTCGACATGGAAGACGCCAAAAAC
GGGGTCGACATGAAGACTATCATTGCTTTGAGCTACATTTTCTGTCTGGTTTTCG
CCGAAGACGCCAAAAAC
EXT-Luc-R-PstI
GGGCTGCAGTTACAATTTGGACTTTCCG
INT-Luc-F
TCACATCTCATCTACCTCCCG
INT-Luc-R
GTAGCCATCCATCCT TGT CA
pLW44-F
CCCGACAACCACTACCTGAG
pLW44-R
TGGGCTCCTTATACCAAGC
Em vermelho está o sitio de restrição para a enzima SalI; em azul para a enzima PstI; em verde está a sequência do peptídeo
sinal HASS.
4.2.3 – Sequenciamento (SANGER et al., 1977; Dye Enamic ET Dye
Terminator Cycle Sequencing Kit for MegaBace – GE Healthcare)
Foram sequenciados os plasmídios de transferência usados na geração dos rMVAS. O
sequenciamento foi realizado em sequenciador automático capilar Mega Bace1000 (GE
HEALTHCARE), através do método de dideoxi (SANGER et al., 1977). Foi utilizado o Kit
DYEnamic TM ET Dye Terminator (MegaBACETM), seguindo as instruções do fabricante.
Cerca de 300 ng de cada plasmídio e 5 pmol de iniciadores internos senso ou antisenso (Tabela 1) foram utilizados em cada reação de sequenciamento. Essa reação foi feita em
placa de 96 poços, em Termociclador Eppendorf 96-well Mastercycler® epgradient e nas
seguintes condições: desnaturação inicial a 95°C por 2 segundos, seguida de 36 ciclos de 25
segundos a 95ºC, 15 segundos a 50ºC e 3 minutos a 60ºC. As reações foram submetidas à
precipitação com acetato de amônio e lavadas com etanol de acordo com as instruções do Kit
DYEnamic
TM
ET Dye Terminator, para eliminação dos dideoxinucleotídios marcados não
incorporados, e, finalmente, o DNA foi homogeneizado em tampão de amostra.
51
4.2.4 – Análise das Sequências Nucleotídicas
Os cromatogramas obtidos foram analisados com o auxílio da plataforma
“Electropherogram
quality analysis”
(http://asparagin.cenargen.embrapa.br/phph/).
Tal
plataforma analisa as seqüências geradas pelo seqüenciador automático atribuindo a cada uma
delas valores de qualidade, que são determinados pelo programa Phred. As seqüências
referentes aos vetores são retiradas e a seqüência consenso é feita por meio do programa
CAP3 Sequence Assembly Program (HUANG e MADAN, 1999; http://pbil.univlyon1.fr/cap3.php).
De posse da sequência consenso, análises manuais foram realizadas com o objetivo de
verificar se o gene para a proteína Luciferase estava em condições adequadas para a
expressão. Para isso, os programas BLAST (Basic Local Alignment Search Tool http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)
e
MultiAlin
(http://bioinfo.genopole-
toulouse.prd.fr/multalin/multalin.html) foram utilizados.
4.2.5 – Produção de Células Fibroblásticas de Embriões de Galinha (CEFs)
Os vírus rMVA foram selecionados e multiplicados em cultivo primário de células de
fibroblasto de embrião de galinha (CEF).
Para a produção do cultivo primário de CEFs, os ovos embrionados com 10 dias de
postura foram higienizados com etanol 70%. Após a higienização, os ovos foram colocados
em uma bandeja com o lado afinado disposto para baixo, e a parte superior da casca do ovo é
quebrada com auxílio de uma pinça. A casca é removida até a linha da câmara de gás e as
membranas foram retiradas expondo o embrião. O embrião foi removido (afastando os outros
anexos) pelo pescoço e colocado em uma placa de petri contendo meio mínimo essencial
autoclavável (MEM – M0769, SIGMA) incompleto, ou seja, sem a adição de soro fetal
bovino (SFB) e suplementado com NaHCO3 a 0,225%, 2 mM L-glutamina, penicilina (100
U/mL), estreptomicina (100 µg/mL) e anfotericina B 0,4%. A cabeça, os membros superiores
e inferiores e os órgãos internos dos embriões (coração, fígado, pulmões) foram retirados com
auxílio de uma tesoura e pinça. Em seguida, os embriões foram transferidos e mantidos em
52
outra placa de petri contendo meio MEM incompleto para liberação do sangue. Os embriões
foram misturados na placa de petri para a liberação da maior quantidade possível de sangue
(Figura 16).
Figura 16 – Representação esquemática que ilustra a retirada dos embriões dos ovos. Além disso, é mostrada
também a posição do corte e os órgãos a serem retirados.
Após esse procedimento, os embriões foram triturados através da passagem da carcaça
por uma seringa de 10 mL, sem agulha, para dentro de um erlenmeyer contendo cerca de 3
mL de solução de tripsina/EDTA (136 mM NaCl; 5 mM KCl; 55 mM glicose; 69 mM
NaHCO3; 0,5 g p/v de tripsina 1:250 -Difco; 0,5 mM EDTA; vermelho de fenol a 1%) por
embrião.
Após um período de incubação a 37°C por 15 minutos sob agitação, a ação da tripsina
era interrompida adicionando-se igual volume de meio MEM com 10% de SFB (CULTILAB,
Brasil), NaHCO3, Penicilina (100 U/mL), Estreptomicina (100 µg/mL), Novamin (40 g/mL) e
antimicótico (Anfotericina B a 0,4%) (meio completo). Em seguida, essa suspensão foi
lentamente filtrada em um béquer com gaze e a solução filtrada centrifugada a 2.500 rpm por
10 minutos (NÜVE - NF 800R rotor RA200) e o sobrenadante descartado. O sedimento de
células, então, foi suspenso em meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM – D7777,
SIGMA) (suplementado com NaHCO3 a 0,225%, 2 mM L-glutamina, penicilina [100 U/mL],
estreptomicina [100 µg/mL] e anfotericina B 0,4% p/v) com 10% de SFB e alíquotas desta
suspensão adicionadas a garrafas de 75 cm2. As garrafas foram incubadas a 37ºC em estufa
com 5% de CO2 (Thermo Scientific Forma® Series II 3111 Water-Jacket CO2 Incubator) até
atingirem uma confluência e os subcultivos feitos por no máximo 2 vezes e em intervalos de
no máximo 3 dias.
53
4.2.6 – Repique Celular
As garrafas contendo células (CEFs) produzidas, como descrito no item 4.2.5, eram
repicadas por no máximo 2 vezes, para garantir a manutenção de culturas celulares viáveis
para os experimentos de infecção viral.
O meio DMEM nas garrafas era descartado, e a monocamada lavada com solução
salina fosfatada e tamponada (PBS) 1X (1,5 mM NaCl; 40 mM Na2HPO4; 20 mM KH2PO4;
pH 7,2). Em seguida, cerca de 5 mL de solução de tripsina/EDTA (136 mM NaCl; 5 mM
KCl; 55 mM glicose; 69 mM NaHCO3; 0,5 g p/v de tripsina 1:250 -Difco; 0,5 mM EDTA;
vermelho de fenol a 1%) era adicionada às garrafas de 75 cm2 para soltar completamente a
monocamada celular. A ação da tripsina é neutralizada com PBS contendo 10% SFB.
A suspensão celular era transferida para um tubo Falcon de 50 mL e centrifugada
durante 5 minutos a 3.500 rpm (NÜVE - NF 800R rotor RA200). O sobrenadante era
descartado e o sedimento de células suspenso em meio DMEM completo (DMEM – D7777,
SIGMA) (suplementado com NaHCO3 a 0,225%, 2 mM L-glutamina, penicilina [100 U/mL],
estreptomicina [100 µg/mL] e anfotericina B 0,4% p/v) com 10% de SFB. Em cada garrafa
foi colocado até 5 mL da suspensão celular (dependendo da quantidade de células obtidas),
sendo ainda adicionado mais 10 mL de meio DMEM completo (suplementado com NaHCO3
a 0,225%, 2 mM L-glutamina, penicilina [100 U/mL], estreptomicina [100 µg/mL] e
anfotericina B 0,4% p/v) com 10% de SFB. Em seguida, as garrafas foram incubadas em
estufa de CO2 (Thermo Scientific Forma® Series II 3111 Water-Jacket CO2 Incubator) à 37 ºC
durante 48 horas.
4.2.7 – Seleção dos Vírus Recombinantes
Os vírus MVA recombinantes foram selecionados por sucessivos ensaios de
purificação de placa. Para isso, 500 μL de cada amostra eram submetidos a três ciclos de
sonicação em banho de gelo e utilizados para infectar monocamadas de CEFs em placas de 6
cavidades, sendo um poço reservado para controle de célula, no qual eram acrescentados 500
μL de DMEM (DMEM – D7777, SIGMA) (suplementado com NaHCO3 a 0,225%, 2 mM L-
54
glutamina, penicilina [100 U/mL], estreptomicina [100 µg/mL] e anfotericina B 0,4% p/v)
com 2,5% de SFB. Diferentes diluições das amostras de vírus selecionadas eram feitas e
utilizadas para infectar CEFs em sucessivas passagens das amostras virais para obter clones
cada vez mais isolados. A adsorção era executada a 37o C em atmosfera de 5% de CO2 (Heal
Force® HF160W Water-Jacketed CO2 Incubator) com homogeneização constante durante 1
hora. Em seguida, as monocamadas eram lavadas com solução salina tamponada com fosfato
(PBS) 1X (1,5 mM NaCl, 40 mM Na2HPO4, 20 mM KH2PO4, pH 7,2) e adicionada uma
solução contendo agarose 1% e meio MEM 1X (GIBCO) suplementado com 2,5% de SFB,
antibióticos e glutamina. As placas eram novamente incubadas (Heal Force® HF160W WaterJacketed CO2 Incubator) a 37oC em atmosfera contendo 5% de CO2 por 48 horas. Após esse
período, as células eram observadas ao microscópio de fluorescência (Microscópio invertido
Olympus IX71) para visualização de focos de fluorescência verde nas monocamadas, devido à
expressão do gene da GFP. Nos locais em que foram detectados focos de fluorescência, as
células eram coletadas com auxílio de ponteiras e transferidas para tubos de microcentrífuga
contendo 500 μL de DMEM (DMEM – D7777, SIGMA) completo com 2,5% de SFB. Essa
suspensão era congelada e descongelada três vezes em refrigerador -70oC e banho maria a
37oC, respectivamente, para lise das células infectadas e liberação do vírus. Finalmente, ela
era armazenada a -80oC.
4.2.8 – Amplificação dos Vírus Recombinantes
As suspensões virais obtidas no processo de seleção foram congeladas e descongeladas
por três vezes a -80oC e em banho de água a 37oC, respectivamente, e submetidas a três
ciclos de sonicação em banho de gelo para prosseguir com a amplificação viral. Os clones dos
vírus rMVA-GFP-Luc e rMVA-GFP-HASS-Luc selecionados foram amplificados por meio
de passagens seguidas em placas de 12 e 6 cavidades e em garrafas de 25 cm2, 75 cm2 e 150
cm2 para se obter um título viral adequado. Em cada recipiente utilizado para amplificação os
volumes das soluções e reagentes foram diferentes. Basicamente, fizemos diluições das
amostras de vírus selecionadas e utilizamos para infectar CEFs. A adsorção ocorreu em meio
DMEM (DMEM – D7777, SIGMA) completo (suplementado com NaHCO3 a 0,225%, 2 mM
L-glutamina, penicilina [100 U/mL], estreptomicina [100 µg/mL] e anfotericina B 0,4% p/v)
com 2,5% de SFB a 37oC com homogeneização constante de 1 hora em atmosfera de 5% de
CO2 (Heal Force® HF160W Water-Jacketed CO2 Incubator). Após isso, foi adicionado um
55
volume específico de DMEM (DMEM – D7777, SIGMA) completo com 2,5% de SFB e as
placas/garrafas deixadas nas mesmas condições por mais 48 horas. Posteriormente o conteúdo
foi raspado, centrifugado e o sedimento ressuspendido em DMEM completo com 2,5% de
SFB.
4.2.9 – Detecção do Gene para a Proteína Recombinante Luciferase
Para detectar o gene para a proteína Luciferase no vírus recombinante, monocamadas
de CEF em placas de 6 cavidades foram infectadas com 500 µL do vírus MVA-GFP-Luc ou
MVA-GFP-HASS-Luc. Uma cavidade de cada placa foi reservada para controle de células,
sendo acrescentado 500 µL de meio DMEM (DMEM – D7777, SIGMA) completo com 2,5%
de SFB. A adsorção foi executada a 37°C, em uma atmosfera de 5% de CO2 (Heal Force®
HF160W Water-Jacketed CO2 Incubator) e com homogeneização constante durante 1 hora.
Após a adsorção, as monocamadas de células foram lavadas, duas vezes, com PBS 1X e, em
seguida, adicionado, em cada cavidade, 2 mL de meio DMEM completo com 2,5% de SFB.
As placas foram incubadas a 37°C, em uma atmosfera de 5% de CO2 por 48 horas (Heal
Force® HF160W Water-Jacketed CO2 Incubator).
Após as 48 horas, as monocamadas de células foram raspadas, com o auxílio de
raspadores de silicone, e as soluções resultantes, centrifugadas por 2 minutos a 14.000 rpm
(microcentrifuga Eppendorf 5415R). Os sedimentos foram suspensos em 250 µL de meio
DMEM completo e as suspensões virais obtidas, utilizadas para a extração de DNA.
A extração de DNA foi realizada adicionando 250 µL de fenol-clorofórmio-álcool
isoamílico (PCI) na proporção de 25:24:1 nas amostras previamente aquecidas a 99°C por 15
minutos. Após 20 minutos, as amostras foram centrifugadas a 13.000 rpm por 15 minutos à
4°C (microcentrifuga Eppendorf 5415R). Os sobrenadantes foram coletados e adicionado
10% do volume de acetato de sódio 3M pH 5,5 e 2,5 vezes o volume de etanol absoluto. As
amostras foram novamente centrifugadas a 13.000 rpm por 20 minutos à 4°C
(microcentrifuga Eppendorf 5415R) e o sedimento lavado com etanol 70% por duas vezes.
Após as lavagens, o sedimento foi suspenso em 30 µL de H2O. O DNA obtido foi
quantificado por espectrofotometria (espectrofotômetro ND-1000, NanoDrop, EUA) e a sua
integridade verificada por eletroforese em gel de agarose 0.8%.
56
Os DNAs acima foram utilizados como molde em reações de PCR. Nessas reações
utilizamos 2 L da DNA das amostras virais; 0,6 L de MgCl2 (25 mM); 2 L de tampão
10X (500 mM KCl , Triton X100 a 1%, 100 mM Tris pH 8,3); 0,2 L de enzima Taq
polimerase 8 (3 U/L); 0,2 L de iniciador senso (10 M); 0,2 L de iniciador anti-senso (10
M); 0,4 L de dNTPs (10 mM) e H2O até o volume final de 20 L.
Os ciclos de amplificação ocorreram da seguinte forma: desnaturação inicial a 95°C
por 2 minutos, seguida de 30 ciclos de desnaturação a 95°C por 1 minuto; pareamento a 55°C
por 30 segundos; extensão a 72°C por 3 minutos; e um passo final de extensão a 72°C por 10
minutos.
Os produtos amplificados, juntamente com um marcador de tamanho molecular, foram
fracionados por eletroforese em gel de agarose 1% em TBE 1X (89 mM Tris base, 89 mM
ácido bórico, 2 mM EDTA pH 8), acrescido de 0,5 g/mL de brometo de etídio a um
potencial elétrico constante de 100 V. Os géis foram visualizados em transiluminador
ultravioleta e fotografados.
Após a detecção do gene para a proteína Luciferase, não foram conduzidos
experimentos para o sequenciamento do mesmo, uma vez que inserido no genoma viral,
pouco provável de ocorrer mutações de sentido trocado ou sem sentido já que esses vírus
possuem mecanismos de reparo de DNA (GAMMON & EVANS, 2009).
4.2.10 – Purificação Viral
Os sedimentos virais obtidos da amplificação (item 4.2.6) foram descongelados e
transferidos para um tubo Falcon de 50 mL.
Os sedimentos foram suspensos em 8,0mL de Tris-HCL (10 mM, pH 8,0),
homogeneizados no vortex e centrifugados a 2.500 rpm por 15 minutos à 4 ºC (NÜVE - NF
800R rotor RA200). O sobrenadante foi coletado e transferido para um tubo Falcon deixado
em banho de gelo. O sedimento obtido foi suspenso em 10 mL de Solução de Lise (MgCl210-3
M, Tris-HCL 10-2 pH 7,6, KCl 10-2 M) e deixado no gelo por 10 minutos. Após os 10
minutos, o sedimento foi homogeneizado em Douncer (homogenizador de vidro)
(aproximadamente 60 manipulações). O sobrenadante foi coletado e misturado ao anterior.
57
O sedimento foi suspenso em 8,0 mL de Solução de Lise e deixado por 10 minutos em
banho de gelo. Após os 10 minutos, o sedimento foi homogeneizado em Douncer
(aproximadamente 60 manipulações). O fluido foi coletado e centrifugado a 2.500 rpm por 15
minutos à 4 ºC (NÜVE - NF 800R rotor RA200). O sobrenadante foi coletado e misturado aos
anteriores, mantidos em banho de gelo. Quantidade final: 8,0 mL sobrenadante Tris-HCl + 10
mL sobrenadante Solução de Lise + 8,0 mL sobrenadante Solução de Lise = 26 mL.
Em um tubo de centrífuga contendo aproximadamente 10 mL do colchão de Sacarose
36% foi adicionada a suspensão viral (26 mL) lentamente pelas bordas do tubo. Os tubos
foram equilibrados e centrifugados a 14.000 rpm por 2 horas à 4 ºC (ultracentrífuga Sorvall
OTD-Combi rotor AH629).
4.2.11 – Titulação Viral
A suspensão viral foi inicialmente submetida à sonicação em banho de gelo em 3
ciclos de 30 segundos, com intervalos de 30 segundos entre cada ciclo. Foram feitas diluições
seriadas dessa suspensão em meio MEM incompleto, sendo utilizados 500 µL de cada
diluição para infectar as respectivas monocamadas de CEF em uma placa de 6 cavidades. Um
poço da placa foi reservado para controle de célula, sendo acrescentados 500 µL de MEM
incompleto. A adsorção foi feita a 37°C, em uma atmosfera de 5% de CO2 e com
homogeneização constante durante 1 hora. Em seguida, as monocamadas de células foram
lavadas com PBS 1X e acrescentados 2 mL de MEM contendo SFB a 2,5% em cada poço. A
placa era incubada a 37°C em uma atmosfera de 5% de CO2 por 48 horas. Assim, após 2 dias
de infecção, as placas foram analisadas no microscópio de fluorescência (Microscópio
invertido Olympus IX71), onde focos de fluorescência verde fluorescente foram contados.
O título viral, número de unidades virais formadoras de placas (UFP) por mL, será
expresso pelo número médio de focos verdes observados nos poços com a maior diluição
onde esses focos forem observados e o numero de focos será multiplicando pelo inverso da
diluição por mL, e pelo fator de correção para 1 ml.
58
4.2.12 – Detecção do mRNA para a proteína Luciferase
Para detectar o mRNA para a proteína Luciferase sintetizada pelo vírus recombinante,
monocamadas de CEF foram infectadas com uma m.o.i. de 10 e as placas foram incubadas a
37°C, em uma atmosfera de 5% de CO2 por 24 horas.
Após as 24 horas, as monocamadas de células foram raspadas, com o auxílio de
raspadores de silicone, e as soluções resultantes foram centrifugadas por 2 minutos a
14.000 rpm (microcentrifuga Eppendorf 5415R). Os sedimentos foram suspensos com 250 µL
de meio MEM completo e as suspensões virais obtidas foram utilizadas para a extração de
RNA.
O RNA foi extraído adicionando 750 µL de TRIzol® (Invitrogen) às suspensões virais
e incubando as misturas por 5 minutos à temperatura ambiente. As amostras foram
centrifugadas a 13.000 rpm por 10 minutos a 4ºC (microcentrifuga Eppendorf 5415R) e os
sobrenadantes foram coletados, adicionados 250 μL de clorofórmio e incubados por 10
minutos a temperatura ambiente. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 13.000 rpm
por 15 minutos a 4ºC (microcentrifuga Eppendorf 5415R). Após separação das fases, a fase
aquosa foi transferida para microtubos contendo 500 μL de isopropanol, as misturas foram
cuidadosamente homogeneizadas, por inversão, e incubadas por 10 minutos a temperatura
ambiente. Em seguida, para precipitação do RNA total, os microtubos foram centrifugados a
14.000 rpm por 10 minutos a 4ºC (microcentrifuga Eppendorf 5415R). Os sobrenadantes
foram desprezados e os sedimentos foram lavados com etanol 70% por duas vezes. Os
sedimentos de RNA obtidos foram suspensos em 20 L de H2O e quantificados por
espectrofotometria (espectrofotômetro ND-1000, NanoDrop, EUA).
As reações de transcrição reversa foram realizadas em termociclador Gradient
Thermal Cycler (Biocycler MJ96+/MJ96G), sendo que 5 g do RNA juntamente com 20
pmol do iniciador oligo-dT15 foram inicialmente incubados a 70°C por 5 minutos e, em
seguida, a 4°C por mais 5 minutos. Posteriormente, foram adicionados 4 L de tampão da
enzima ImProm-IITM 5X (Promega); 2,4 L de MgCl2 (25 mM); 1 L de dNTPs (10 mM);
0,5 L RNAsin (Ribonuclease Inhibitor – Promega) (40 U/L); 1 L de transcriptase reversa
ImProm-IITM (Promega) e H2O DEPC até o volume final de 20 L. As reações foram
mantidas a 25°C por 5 minutos, a 42°C por 60 minutos e, a seguir, a 70°C por 15 minutos.
59
Alíquotas dos cDNAs obtidos foram, então, submetidos à amplificação por PCR e o restante
estocado a -20°C.
As reações de PCR foram realizadas da mesma forma que no item 4.2.9. Os produtos
obtidos foram separados em gel de agarose 1% em TBE 1X, acrescido de 0,5 µg/mL de
brometo de etídio a um potencial elétrico constante de 100 V. Os géis foram visualizados em
transiluminador ultravioleta e fotografados.
4.2.13 – Células Fibroblásticas de Embriões de Camundongo (MEFs)
Fibroblastos congelados, de embrião de camundongo selvagem ou deficiente para
PERK foram cedidos gentilmente pelo Prof. Aristóbolo Mendes da Silva (Departamento de
Morfologia, ICB/UFMG). Essas células foram obtidas de embriões desses camundongos com
13.5 dias e, imortalizadas com o antígeno T grande do vírus símio SV-40 (RON &
HARDING, 2003).
MEFs-WT (5ª passagem) e MEFs-PERK-KO (21ª passagem) foram descongeladas em
banho-maria a 37° C, imediatamente após o descongelamento as células foram transferidas
para garrafas T25 com 5 mL de meio completo contendo 10% SFB e incubadas a 37° C com
atmosfera úmida e contendo 5% de CO2 (Thermo Scientific Forma® Series II 3111 WaterJacket CO2 Incubator) até atingir mais de 90% de confluência (cerca de 24 a 48 horas).
Após atingir a confluência almejada, o meio foi descartado e as células lavada 3 vezes
com PBS 1X. Então 1 mL de solução de tripsina foi adicionada para soltar completamente a
monocamada celular. A ação da tripsina foi neutralizada com DMEM contendo 10% SFB e a
suspensão celular transferida para um tubo Falcon de 50 mL e centrifugada durante 5 minutos
a 3.500 rpm (NÜVE - NF 800R rotor RA200). O sobrenadante, descartado e o sedimento de
células suspenso em meio DMEM completo com 10% de SFB. Em garrafas T75, foi colocado
a suspensão celular e meio DMEM completo com 10% de SFB para um volume final de 15
mL. Em seguida, as garrafas foram incubadas em estufa de CO2 à 37 ºC até atingir mais de
90% de confluência (cerca de 24 a 48 horas). Novamente as células foram repicadas e
transferidas para garrafas T150 e incubadas sobre as mesmas condições. Após 48 horas de
incubação foi adicionado 5 mL de solução de tripsina e a ação da tripsina foi neutralizada
com DMEM contendo 10% SFB, a suspensão celular foi transferida para um tubo Falcon de
50 mL e centrifugada durante 5 minutos a 3.500 rpm. O sobrenadante, descartado e o
60
sedimento de células suspenso em SFB contendo 10% de DMSO. Aliquotas dessa suspensão
foram congeladas a -70° C.
4.2.14 – Extração de Proteínas Totais (WCE)
Para extração de proteínas totais de MEFs e CEFs infectadas com os vetores
recombinantes, monocamadas dessas células foram infectadas com diferentes MOI, após 24
horas de incubação a 37° C em uma atmosfera de 5% de CO2, as células foram lavadas em
PBS 1X gelado por duas vezes em seguida foi adicionado tampão de lise para obtenção de
extrato protéico (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, Fluoreto de Sódio 10 mM, Glicerol 10%,
0.1 mM EDTA, 10 mM b-glicerofosfato) contendo inibidores de proteases (PMSF,
Ortovanadato de sódio, Leupeptina, Pepstatina, Aprotinina). A monocamada foi raspada e o
extrato celular bruto transferido para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, incubados no gelo
por 15 minutos, sendo vortexado a cada 5 minutos e finalmente centrifugados
(microcentrifuga Eppendorf 5415R) a 10,000 x g por 20 minutos a 4oC. O sobrenadante foi
coletado e transferido para um novo tudo de microcentrifuga, sendo o sedimento descartado.
Alíquotas de cada extrato foram dosadas em ensaios de Bradford e trinta microgramas de cada
extrato foram fracionados por SDS-PAGE.
4.2.15 – Quantificação das proteínas (Método de Bradford)
O método de Bradford consiste em interação das proteínas com o corante BG-250
presente no reagente de Bradford, que faz com que esse corante absorva fortemente luz a
comprimento de onda de 595nm.
As quantificações foram feitas em placas de 96 poços, na qual a cada poço foram
adicionados 200µL de H2O Mili-Q, 50µL do Reagente de Bradford (BioRad, EUA) e 2µL de
amostra ou dos padrões. A absorbância é medida em leitor de microplacas a 595nm, e os
resultados eram comparados com uma curva padrão de BSA de valores conhecidos (1mg/mL,
0,5mg/mL, 0,25mg/mL, 0,125 mg/mL e 0,0625 mg/mL).
61
4.2.16 – Fracionamento de proteínas em gel de poliacrilamida/SDS-PAGE
O fracionamento de proteínas para uso em ensaios de western-blot e análises da marcação
metabólica foram feitos em gel de poliacrilamida. O gel é composto por duas fases, sendo
uma superior com concentração 3,9% de acrilamida, denominada gel de empilhamento, que
serve para as proteínas alinhem no mesmo nível no gel de eletroforese; e outra inferior com
concentração 10% de acrilamida, chamada gel de separação, na qual as proteínas separaramse de acordo com o seu peso/tamanho molecular.
O gel de separação foi feito adicionando-se água destilada, Tris 1,5M pH 8,8,
Acrilamida/Bis 30%, SDS 20%, APS 10% e TEMED. A mistura era adicionada entre as
placas do kit Mini-Protean® (Bio-Rad) até cerca de 1 cm abaixo de onde se encaixa o pente, e
esperava-se polimerizar. O gel de empilhamento era feito tal como o gel de separação,
mudando somente a concentração dos reagentes para obter o gel numa porcentagem de
acrilamida desejada, e após o preparo, a mistura era adicionada sobre o gel de separação.
Acrescentou-se o pente para formar as canaletas e aguardada a polimerização.
Antes de submetidas, as amostras eram aquecidas a 95ºC por 10 minutos e só então eram
aplicadas no gel juntamente com o tampão de amostra 2X (240mM Tris-HCl pH6,8; 0,8%
SDS; 200mM Beta-mercaptoetanol; 4% glicerol; 0,02% azul de bromofenol). Os géis eram
colocados na cuba do kit Mini-Protean® em tampão de corrida (0,25M Tris; 1,9M Glicina; 1%
SDS) e aplicada uma voltagem de 60V até as bandas se alinharem no limite entre as duas
fases do gel. Em seguida aplicava-se 120V até as bandas chegarem ao final do gel.
4.2.17 – Ensaios de Western-blot
Após o fracionamento, as amostras eram transferidas para membranas de decafluoreto de
polivinil – PVDF (GE Healthcare, Armesham HybondTM-P) durante 1 hora e 30 minutos a um
potencial elétrico constante de 90 V. Em seguida, era realizado o bloqueio para evitar
marcação inespecífica, deixando a membrana por 1 hora à temperatura ambiente ou overnight
a 4°C em tampão de bloqueio 2,5% [ 2,5% (p/v) de leite desnatado em pó em TTBS 1X (50
mM Tris-HCl pH 7,5; 150 mM NaCl e Tween-20 a 0,1%)]. Em seguida as membranas foram
lavadas com tampão de bloqueio 0,5% por três vezes, 10 minutos cada. A marcação com o
anticorpo primário policlonal anti-luc (Promega) foi feita usando diferentes intervalos de
62
tempo, que variaram desde 1 hora à temperatura ambiente a mais de 16 horas a 4°C usando
diluições que foram de 1:200 a 1:10000. Posteriormente, as membranas eram novamente
lavadas com tampão de bloqueio 0,5% por três vezes, 10 minutos cada. A reação com os
anticorpos secundários (anticorpos anti-IgG de cabras conjugados a peroxidase, Abcam®)
ocorreu durante 1 hora à temperatura ambiente e, foi seguida de 3 lavagens com tampão de
bloqueio 0,5%. Por último, as membranas foram reveladas utilizando métodos colorimétricos
(4CN) e quimioluminescentes (Kit ECLTM Plus Western Blotting Detection System, GE
Healthcare). Neste ultimo caso também era utilizado o filme Armesham Hyperfilm ECL (GE
Healthcare), conforme instruções do fabricante.
4.2.18 – Plasmídio pGL3 control vector
O plasmídio pGL3-Control Vector (5256 pb) (Promega) cedido gentilmente pelo prof.
Aristobolo Mendes da Silva foi usado como controle nesse trabalho, fornece uma base para
analises quantitativas de fatores que potencialmente regulam a expressão gênica. Esses fatores
podem ser cis-acting, como os promotores e enhancers ou, trans-acting, como vários fatores
de ligação ao DNA. Os plasmídeos pGL3 possuem como esqueleto o plasmideo pGL2
Luciferase Reporter Vectors, que foi redesenhado para aumentar a expressão e contém uma
região codificadora para Luciferase de vagalume (Photinus pyralis) otimizada para o
monitoramento da atividade transcricional em células eucarioticas transfectadas (Figura 17).
O ensaio desse repórter é rápido, sensível e quantitativo. Em adição, esse contém numerosas
características ajudando na caracterização estrutural das sequências reguladoras.
63
Figura 17: Representação esquemática do plasmídeo pGL3-Control Vector. AmpR: β-lactamase; ori:
origem de replicação bacteriana; luc+: Luciferase; MCS: sítio múltiplo de clonagem
4.2.19 – Obtenção dos plasmídio em pequena escala (Mini-preparações de
DNA plasmidial)
Para amplificação dos plasmídios (pGL3), bactérias gram negativos Escherichia coli da
linhagem XL10-Gold® ultracompetent cells (Stratagene), preparadas de acordo com o
protocolo descrito por SAMBROOK e colaboradores (2001).
Assim, cerca de 2 μL do plasmídeo foram adicionados a 100 μL de bactérias XL10-Gold
quimiocompetentes e imediatamente incubados em banho de gelo por 30 minutos.
Posteriormente, as células foram submetidas à um choque térmico a 42 ºC por 45 segundos e
logo após, colocadas por 2 minutos no gelo novamente. Em seguida, foram adicionados 500
μL de meio Luria-Bertani (LB) sem antibiótico (Bacto-triptona a 1% p/v; extrato de levedura
a 0,5% p/v; 171 mM NaCl) e as bactérias foram incubadas a 37ºC (New Brunswick Scientific
Classic Series C24 incubator/shaker), sob agitação de 250 rpm, por 1 hora (HANAHAN et al.,
1991). A cultura bacteriana resultante foi centrifugada a 14.000 rpm (microcentrifuga
Eppendorf 5415C) por 1 minuto e o sedimento homogeneizado em 100 μL de LB. A
suspensão foi inoculada em placas de Petri contendo LB-ágar (Bacto-triptona a 1% p/v;
extrato de levedura a 0,5% p/v; 171 mM NaCl e 1,5% de ágar) suplementado com ampicilina
64
(100 μg/mL), as placas foram incubadas a 37ºC (Fanem - modelo 051) e o crescimento
bacteriano foi observado após 16 horas (SAMBROOK et al., 2001).
Algumas colônias crescidas nas placas, oriundas do processo de transformação, foram
inoculadas em 1 mL de meio LB 1X contendo ampicilina (100 µg/mL) e incubadas a 37ºC
com agitação de 250 rpm (microcentrifuga Eppendorf 5415C) por aproximadamente 2 horas.
A verificação da presença do inserto foi feita por PCR, na qual 2 µL da cultura bacteriana
foram utilizados como molde em reações com perfil idêntico às descritas no item 4.2.9. Os
produtos amplificados obtidos foram fracionados em gel de agarose 0.8% em TBE 0,5X,
acrescido de 0,5 µg/mL de brometo de etídio a um potencial elétrico constante de 100 V. Os
géis foram visualizados em transiluminador ultravioleta e fotografados. Alíquotas das culturas
identificadas como positivas para a presença do inserto foram congeladas em glicerol a
40% v/v a -70ºC.
Algumas colônias positivas para o gene da luciferase, foram inocluladas em 10 mL de
meio LB 1X contendo ampicilina (100 μg/mL) e incubadas a 37ºC (New Brunswick Scientific
Classic Series C24 incubator/shaker) com agitação de 250 rpm por aproximadamente 16
horas. Após esse período foram feitas alíquotas das culturas que foram congeladas em glicerol
a 40% v/v a -80ºC.
Em seguida, o restante das culturas foi utilizado para obtenção de DNA plasmidial em
pequena escala, empregando-se o Kit Wizard Plus SV Miniprep (Promega-EUA), conforme
instruções do fabricante. O DNA obtido foi quantificado por espectrofotometria
(espectrofotômetro ND-1000, NanoDrop, EUA) e a sua integridade foi verificada por
eletroforese em gel de agarose 0.8% em TBE 0,5X, acrescido de 0,5 μg/mL de brometo de
etídio (Invitrogen) a uma voltagem constante de 80 V. O DNA plasmidial dos vetores foram
estocados a -20ºC.
4.2.20 – Ensaios de atividade da proteína repórter Luciferase
Para analise da atividade da Luciferase, placas de 12 poços monocamadas de células CEFs
foram infectadas com os rMVAs (MVA-HASS-Luc ou MVA-Luc) ou como controle, foram
transfectadas com o plasmídeo pGL3 control vector (Promega). Para isso, 1 mL de uma
solução contendo “complexos de DNA/lipofetamina” foi adicionado a uma cavidade da placa.
Os “complexos de DNA/lipofetamina” foram preparados, misturando uma solução contendo
2 µg de pGL3 control vector e 50 µL de Opti-MEM com uma segunda solução contendo 5 µL
65
de lipofetamina e 50 µL de Opti-MEM, sendo o volume completado para 1 mL com OptiMEM. As células foram cobertas pela solução com os complexos de lipofetamina e incubadas
a 37°C, em uma atmosfera de 5% de CO2 por 5 horas. Após esse período, o meio das células
foi descartado e as mesmas lavadas com PBS, sendo retirado o máximo de solução possível.
Em seguida as células foram lisadas por 15 minutos a TA com 200μl de reporter lysis buffer
1x (Promega) sob homogenização. Após a lise, o lisado foi transferido para um tubo de
microcentrífuga de 1,5 mL e centrifugados a 13.000 rmp por 15 minutos a 4°C. Para o ensaio
da atividade da luciferase, 20 μl do lisado foram adicionados a cada poço de uma placa
FluoroNuncTM de noventa e seis poços, seguido da adição de 40 μL do substrato luciferina de
Photinus pyrallis (reagente LAR II do kit DLR) e homogeneizado por pipetagem. A leitura foi
feita em luminômetro luminômetro (Lumicount Packard BioSciences) pelo programa Reader
(Packard BioSciences) e os resultados expressos em Relative Light Units (RLU). Para a
normalização dos dados, foi quantificado a concetração de proteínas pelo método de Bradford
e dividido os valores de RLU pela concentração de proteínas por μl de lisado.
4.3 – Análise da ocorrência de estresse do retículo endoplasmático (RE)
4.3.1 – RT-PCR-RFLP
Para definir os eventos de sinalização ao nível do estresse do RE desencadeados pelos
vetores recombinantes, foi analisada a atividade da proteína cinase IRE1 investigando o
processamento de seu substrato (XBP-1) e a influencia de PERK sobre esse processo.
IRE1 é uma endonuclease que cliva um intron residual de 26 nucleotídeos presente no
mRNA do fator de transcrição XBP-1 (CALFON et al., 2002). Para avaliar se ocorria ativação
da cinase IRE1, o RNA total era obtido das células e posteriormente transcrito reversamente à
primeira fita de cDNA na presença de oligo-dT15, dNTPs e transcriptase reversa MMLV-RT
(200U, SuperScript III). A reação ocorreu a 42oC por 60 minutos, seguida de inativação da
enzima MMLV-RT a 65oC por 15 minutos. Um décimo da reação de cDNA foi utilizado para
a amplificação por RT-PCR de um segmento de 600-pb do fator de transcrição XBP-1 com os
iniciadores MUXBP-3S (5´-AAACAGAGTAGCAGCGCAGACTGC-3´) e MUXBP-2AS
(5´-GGATCTCTAAAACTAGAGGCTTGGTG-3´) nas seguintes condições: 94oC/4´ seguido
66
de 35 ciclos de 94oC/10”, 68oC/30”, 72oC/30”, e extensão final a 72oC/10’. Finalmente, um
terço do volume da reação de RT-PCR era submetido à digestão enzimática com PstI a 37oC
por 3 horas. No íntron processado de 26 nucleotídeos do mRNA de XBP-1 existe um sítio de
restrição para a enzima PstI. Portanto, a amplificação por PCR de segmentos de XBP1 a partir
de células que sofreram estresse do RE, não continham esta sequência, o que nos permitiu
diferenciar o mRNA de XBP1 processado do não processado, após a digestão enzimática do
produto de PCR com PstI e fracionamento em gel de agarose 1,4%. Como controles positivos
da indução do processamento de XBP-1, utilizamos agentes que causam estresse no RE como
BFA ou DTT nos experimentos.
67
V – RESULTADOS
5.1 – Sequenciamento e Análise das Sequências pLW44-HASS-Luc e
pLW44-Luc
Para verificar se houve mutações na sequência da Luciferase durante o processo de
construção dos plasmídios, os clones desses plasmídios foram sequenciados. Por dificuldades
técnicas no sequenciamento de todo inserto na época da construção, os plasmídios foram
submetidos a novos sequenciamentos após o início da construção dos vírus recombinantes.
Após análise dos cromatogramas, sequências consenso geradas foram avaliadas com o
intuito de verificar se o gene para a proteína Luciferase estava em condições adequadas para a
expressão. As sequências consenso foram alinhadas com a amostra controle EF090416.1,
depositada no banco de dados GenBank. Os resultados dos sequenciamentos nos permitiram
concluir que a amostras apresentavam o gene da Luciferase sem mutações que implicassem
em mudança de aminoácido (FIGURA 18 e 19) e, por isso, teriam plenas condições para
expressar a proteína.
68
FIGURA 18: Alinhamento entre a sequência do gene da Luciferase clonado no
pLW44 e a sequência controle EF090416.1. O alinhamento foi realizado pelo software
´´Multialin´´
disponível
online
em
http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html., e revisado manualmente. Os 1653
nucleotídeos correspondentes ao gene da Luciferase obtiveram 99,33% de similaridade
com a sequência controle EF090416.1. As sequências em comum estão em vermelho
enquanto os nucleotídeos em preto correspondem a sequências ainda não lidas em
sequenciador ou com ausência de similaridade. Os nucleotídeos em azul correspondem a
baixa similaridade. Os pontos (.) indicam falta de identidade e os traços (-) indicam
ausência de reconhecimento de nucleotídeos.
69
FIGURA 19: alinhamento entre a sequência do gene da Luciferase, adicionado do peptídeo
sinal HASS, clonado no plasmídeo pLW44, e a sequência controle EF090416.1. O alinhamento
foi
realizado
pelo
software
´´Multialin´´
disponível
online
em
http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html., e revisado manualmente. Dos 1701
nucleotídeos totais, os primeiros 48 são referentes ao sinal de endereçamento HASS, os 1653
restantes correspondem ao gene da Luciferase e obtiveram praticamente 100% de similaridade com
a sequência controle EF090416.1. As sequências em comum estão em vermelho enquanto os
nucleotídeos em preto correspondem às sequências do plasmídeo pLW44. Em verde estão os
nucleotídeos relativos ao peptídeo sinal HASS. Os pontos (.) indicam falta de identidade. Os
nucleotídeos em azul diferem dos sequenciados.
70
5.2 – Produção dos Vírus Recombinantes
A seleção dos MVA recombinantes ocorre com base na expressão do gene repórter
GFP, uma vez que o MVA e respectivos recombinantes não geram placas de lise em
monocamadas celulares, o que dificultaria a seleção de clones recombinantes na ausência
deste indício marcador. Cabe observar o aumento do tamanho dos clones à medida que as
seleções são realizadas, o que indica a diminuição da competição entre os clones
recombinantes e eventuais contaminantes selvagens.
Na FIGURA 20 estão mostrados os resultados do processo de seleção dos vírus
recombinantes.
A)
B)
Figura 20 – Rodadas de seleção dos vírus recombinantes. Fotografias dos clones coletados
durante as rodadas de seleção dos vírus recombinantes (aumento de 400x, tamanho). Em (A),
fotografias que mostram o crescimento em tamanho de clones do MVA-GFP-Luc obtidos durante as
passagens sucessivas em placa. Em (B), fotografias que mostram o crescimento em tamanho de
clones do MVA-GFP-HASS-Luc semelhante aos obtidos para o vírus sem o peptideo sinal.
71
5.3 – Detecção do Gene para a Proteína Luciferase
Por meio de vários experimentos para extração do DNA e PCR, o gene para a proteína
Luciferase foi detectado em células infectadas com os vírus recombinantes, confirmando, a
presença do inserto no genoma viral (Figura 21 e 22). Estes resultados são representativos de
todos os experimentos feitos para detectar a presença deste inserto no genoma do vírus.
PM pLW44/Luc 1A
1B
1.2
2A
2B
2B
CN
Figura 21: Amplificação do DNA codificador para a proteína Luciferase
com os iniciadores INT-Luc-F e INT-Luc-R. Visualização após fracionamento
eletroforético em gel de agarose 0,8% e TBE 0,5X dos produtos da PCR.
Fotografia com padrão de cores invertida pelo software Image J – version 1.47
(RASBAND, W. – NIH). PM, padrão de tamanho molecular 1Kb Plus DNA
Ladder (Invitrogen); pLW44/Luc, controle positivo; CN, controle negativo; 1A,
1B e 1.2, MVA-GFP-Luc; 2A e 2B, MVA-GFP-HASS-Luc
PM pGL3
CN
1A
1B
1.2
2A
2B
pLW44/Luc
Figura 22: Nested PCR. Amplificação do DNA codificador para a proteína
Luciferase com os iniciadores pLW44-F e pLW44-R seguido de amplificação
com os iniciadores INT-Luc-F e INT-Luc -R. Visualização após fracionamento
eletroforético em gel de agarose 0,8% e TBE 0,5X dos produtos da PCR. PM,
padrão de tamanho molecular 1Kb DNA Ladder (Promega); 1A, 1B e 1.2, MVAGFP-Luc; 2A e 2B, MVA-GFP-HASS-Luc; pLW44/Luc e pGL3, controles
positivos; CN, controle negativo;
72
5.4 – Detecção do mRNA para a proteína Luciferase
Além da detecção do gene para a proteína Luciferase, foi feita a detecção do mRNA
para essa proteína em células infectadas pelos vírus recombinantes, como análise da
confirmação da transcrição dos genes exógenos pelas construções virais. Como observado, as
construções foram capazes de gerar mRNAs específicos para os genes recombinantes
corroborando os dados obtidos a partir do DNA e indicando que a proteína recombinante
Luciferase pode estar sendo expressa (Figura 23).
PM
C+
C- 1A
1B
1.2
2A 2B
pGL3
Figura 23: Amplificação do cDNA codificador para a proteína
Luciferase com os iniciadores INT-Luc -F e INT-Luc-R.
Visualização após fracionamento eletroforético em gel de agarose 0,8%
e TBE 0,5X dos produtos da PCR. PM, padrão de tamanho molecular
1Kb DNA Ladder (Promega); C+, controle positivo correspondente a
infecção com MVA selvagens e transfecção com pLW44/Luc; C-,
controle negativo; 1A, 1B e 1.2, MVA-GFP-Luc; 2A e 2B, MVA-GFPHASS-Luc.
5.5 – Detecção da expressão da proteína Luciferase
Para detectar a expressão da proteína Luciferase, extratos protéicos de células
infectadas com os vírus MVA-GFP-HASS-Luc e MVA-GFP-Luc foram submetidos ao ensaio
de Western Blot.
Inicialmente, foi utilizado um anticorpo comercial da Promega (anticorpo policlonal
contra Luciferase de vagalumes produzido em cabra) como anticorpo primário. No entanto,
73
não foi possível detectar a expressão da protéina Luciferase utilizando esse anticorpo,
inclusive nos controles. Como alternativa para a detecção, os extratos protéicos foram
fracionados em gel de poliacrilamida e o gel corado com azul de coomasie (Figura 24).
Embora a especificidade do método seja prejudicada, neste caso, é possível observar a superexpressão, em células infectadas pelos vírus recombinantes, de uma massa protéica de mesmo
peso molecular daquela observada quando da produção de proteínas direcionadas pela
transfecção de células com o plasmídeo pGL3. Estas massas protéicas têm o tamanho
esperado para a proteína Luciferase (~62kDa) e sugerem que ambas as construções virais
expressam a proteína, assim como as células transfectadas com o plasmídeo controle pGL3
(SHERF & WOOD, 1994).
Figura 24: Detecção da proteína Luciferase. Visualização após
fracionamento eletroforético em gel de poliacrilamida 12% dos extratos
protéicos de células infectadas com os vírus rMVA, transfectadas com o
pGL3 control plasmid ou infectadas com MVA-wt e transfectadas com
o pLW44/Luc (I+T). Fotografia com padrão de cores invertida pelo
software Image J – version 1.47 (RASBAND, W. – NIH). MW, padrão
de tamanho molecular; 1B, MVA-GFP-Luc; 2B, MVA-GFP-HASSLuc.
5.6 – Avaliação dos níveis de expressão da proteína Luciferase
Para detectar os níveis de expressão da proteína Luciferase, extratos protéicos de
células infectadas com diferentes m.o.i dos vírus MVA-GFP-HASS-Luc e MVA-GFP-Luc ou
transfectadas com o plasmídio controle pGL3 foram submetidos a ensaios repórteres que
avaliam a atividade enzimática da proteína luciferase na presença de seu substrato.
Adicionalmente, um extrato obtido de CEFs infectadas com MVA e transfectadas com o
plasmídio de transferência pLW44/Luc também foi usado no ensaio como controle positivo.
74
Demonstrou-se nesse ensaio que a proteína repórter Luciferase foi significativamente
expressa nas células infectadas e com níveis comparáveis aos do controle positivo pGL3
(TABELA 2 e FIGURA 25), o qual possui uma versão modificada do gene Luc (Luc+) capaz
de exercer uma atividade até quatro vezes maior que o gene Luc, dependendo do tipo celular
(SHERF & WOOD, 1994).
TABELA 2 – Análise da atividade enzimatica da luciferase em CEFs após 48 horas de
infecção e ou transfecção.
Amostra
P-Luc
µg/µL
em 20µL
Atividade / µg de
extrato*
pGL3-P
109
1,95
39
2,794872
Células
93
1,49
29,8
3,120805
3414
1,46
29,2
116,9178
HASS
89
1,76
35,2
2,528409
HASS+
67
1,61
32,2
2,080745
LUC
67
1,8
36
1,861111
LUC+
67
1,77
35,4
1,892655
MVA+pLW44/luc
* A captura de fótons foi feita por 3 segundos com o fotomultiplicador de 600V e um ganho de 1. HASS e LUC = m.o.i 1;
HASS+ e LUC+ = m.o.i 10.
Figura 25: Representação gráfica dos dados obitidos na análise da atividade enzimatica da luciferase em
CEFs. Os extratos celulares foram coletados e as atividades das luciferases determinadas pela captura da
luminescência em luminômetro. Os resultados foram normalizados pela razão da atividade da luciferase em relação à
quantidade de proteinas por grama de extrato. pGL3-P: extrato de células transfectadas com o plasmídeo controle;
Células: células não infectadas, mock; HASS: células infectadas com vírus recombinante expressando luciferase
endereçada ao RE com m.o.i 1; HASS+: células infectadas com vírus recombinante m.o.i 10; LUC: células
infectadas com vírus recombinante expressando luciferase sem o peptídio sinal com m.o.i 1; LUC+: células
infectadas com vírus recombinante m.o.i 10.
75
Foi observado uma suposta contaminação no controle celular, no entanto, esse dado
não foi confirmado em microscopia de epifluorescência e, provavelmente é um artefato
causado por excesso de luminescência no poço adjacente ao do controle celular na placa onde
foi realizado o ensaio, devido a super atividade enzimática em células infectadas com MVA e
transfectadas com o plasmídio de transferência pLW44/Luc. A atividade enzimática foi cem
vezes maior que a observada no controle pGL3 (TABELA 2). Isso é devido a expressão da
proteína a partir do plasmídio transferência que possui vantagens sobre a expressão genômica.
5.7 – Análise do processamento do fator de transcrição XBP-1 durante
infecção pelos MVA recombinantes
A fim de avaliar a possível ativação do braço IRE1 da via UPR por VACV e a
influencia do braço PERK sobre o IRE1, foi investigado o processamento do fator de
transcrição XBP-1 das células hospedeiras em diferentes intervalos de tempo após a infecção.
Como esperado, o sobrenadante de cultura (debri) não é capaz de gerar uma resposta contra o
estresse do RE. Além disso, também não ocorrem grandes alterações nos níveis de XBP-1
processado em células MEFs selvagens ou deficientes para PERK infectadas tanto com o
MVA-HASS-LUC quanto com o MVA-LUC em nenhum dos intervalos de infecção
avaliados (FIGURA 27), indicando, nestes casos, que a resposta ao estresse do retículo não é
ativada nestas células. Contrariamente, somente a forma alterada do mRNA (spliced), ocorre
nas células tratadas com indutor específico de estresse (DTT).
76
Figura 27: Análise do polimorfismo dos fragmentos de restrição do DNA (PCR-RFLP) de
células infectadas com os rMVAs. Visualização após fracionamento eletroforético em gel de
agarose 1,4% e TBE 0,5X dos amplicons após digestão com a enzima de restrição PstI. Em A e C,
perfíl de fibroblastos de embrião de camundongo tratados infectados com os vírus recombinantes
expressando luciferase endereçada ou não ao RE. Em B e D, são apresentados os perfís obtidos de
fibroblastos de embrião de camundongo PERK deficientes infectados com os vírus recombinantes
expressando luciferase endereçada ou não ao RE. Mock, controle de células; DTT, controle
positivo usando o agente indutor de estresse Ditiotreitol;
5.8 – Análise do processamento do fator de transcrição XBP-1 durante
infecção pelos VACVs
Os resultados dos experimentos prévios sugerem que os MVA recombinantes possuem
mecanismos de escape dessa resposta ao estresse do RE. Diante disto, conduzimos
experimentos para avaliar se a amostra replicativa VACV-WR, protótipo da família, e o MVA
selvagem também seriam capazes de inibir uma respota de estresse do RE. Como
demonstrado na figura 28, independente da expressão da proteína heteróloga luciferase,
MEFs infectadas com o vírus MVA apresentam o mesmo perfil de processamento do mRNA
do fator de transcrição XBP-1 observado durante a infecção com os vírus recombinantes.
Nessa mesma figura é demonstrado que semelhante aos vírus MVA, a amostra VACV-WR
também não desencadeia o processamento do mRNA de XBP-1 durante o seu ciclo de
infecção em fibroblastos selvagens ou PERK deficientes.
77
PstI
PstI
Figura 28: Análise do polimorfismo dos fragmentos de restrição do DNA (PCR-RFLP) de
células infectadas com diferentes linhagens de VACV. Visualização após fracionamento
eletroforético em gel de agarose 1,4% e TBE 0,5X dos amplicons após digestão com a enzima de
restrição PstI. Mock, controle de células; DTT, Ditiotreitol; WR, Vaccínia Vírus Western Reverse.
5.9 – Efeito da infecção por VACV sobre o processamento do fator de
transcrição XBP-1
Adicionalmente aos experimentos para investigar o processamento do XBP-1 durante
o ciclo de infecção, verificamos a capacidade dos VACV em suprimir o processamento de
XBP-1 em células infectadas, mesmo quando essas são tratadas com agentes indutores de
estresse. Para isso, MEFs WT e deficientes para PERK foram infectadas com os VACVs
(MVA e WR) por um intervalo de 16 horas e tratadas com 10 mM DTT por um período de 3
horas. Como demonstrado na figura 29, foi observado que a infecção por VACVs causa
inibição do processamento do fator XBP-1 em células tratadas com o agente redutor DTT, que
induz significativamente o processamento desse fator de transcrição na ausência de infecção.
78
Figura 29: Análise do polimorfismo dos fragmentos de restrição do DNA (PCR-RFLP) de
células infectadas com VACV e tratadas com indutor de estresse do RE. Visualização após
fracionamento eletroforético em gel de agarose 1,4% e TBE 0,5X dos amplicons após digestão
com a enzima de restrição PstI. Mock, controle de células; DTT, Ditiotreitol; WR, Vaccínia Vírus
Western Reverse.
79
VI – DISCUSSÃO
O presente estudo teve como principal objetivo investigar a interação do vírus MVA
com células hospedeiras principalmente no que tange à via de sinalização UPR. A base
racional do objetivo foi a avaliar se a produção excessiva de proteínas recombinantes
direcionadas ao retículo endoplasmático, geradas a partir do vetor vacinal, poderia
desencadear vias de estresse do RE e afetar negativamente a produção destas proteínas. Para
tal, foram gerados MVAs recombinantes expressando a proteína luciferase de vaga-lume
endereçada ou não ao RE e, sobre o controle de um promotor forte. A formulação destes
diferentes vírus se objetivou, ainda, estabelecer se o endereçamento de proteínas heterólogas
para o RE em construções virais seria capaz de ativar ou inibir mecanismos de resposta ao
estresse relacionados à via de sinalização UPR.
O sequenciamento dos plasmídios pLW44/Luc e pLW44/HASS-Luc mostrou uma
substituição sinônima ocorrida nos nucleotídeos 1364 do clone pLW44 L2.2.3 colônia 3,
todavia não altera a função e estrutura do polipeptídeo final, já que o aminoácido incorporado
continuou sendo uma arginina. As poucas mutações que ocorreram no clone L1.2.3 colônia 1
podem ser devido a erros de alinhamento e, podem ser corrigidas com a análise de toda a
sequência.
A seleção dos vírus recombinante permitiu uma diminuição da competição e forneceu
condições ideais para a expansão dos clones virais. A presença do inserto no genoma viral foi
confirmada por ensaios de PCR, onde foi possível amplificar um fragmento de DNA
correspondente ao gene Luciferase usando diferentes variações da técnica. Em conjunto, os
resultados fornecem uma forte evidência da presença do inserto nas amostras de DNA
purificados de células infectadas com os vírus recombinantes. Além da confirmação da
presença do inserto, foi possível averiguar por meio de RT-PCR que o gene Luc presente no
genoma viral, está sendo transcrito e produzindo mRNAs nessas células.
O perfil eletroforetico de extratos protéicos de células infectadas com os vírus
recombinantes, mostrou a presença de uma banda de peso molecular similar ao esperado para
a proteina Luciferase (~62kDa) e sugere a expressão normal desse polipeptideo. Não foi
possível detectar a proteína Luciferase usando o anticorpo comercial da Promega® (anticorpos
policlonais contra a Luciferase de Vagalumes). Os níveis de expressão da proteína Luciferase
80
foram avaliados por meio de ensaios enzimáticos, onde foi observada a expressão
significativa da proteína exógena com níveis comparáveis aos do controle. Em suma, apesar
da impossibilidade de detecção da proteína recombinante produzida pelo vetor viral MVA
usando anticorpo específico, o conjunto dos dados nos permite concluir que as construções
foram corretamente obtidas.
Uma vez obtido os vírus com sucesso, foi avaliado o processamento do fator de
transcrição XBP-1, molécula que atua a jusante na cascata de sinalização do principal sensor
da via de resposta ao estresse do RE, o IRE1. Este é o membro mais evolutivamente
conservado da via UPR, presente em quase todos os eucariotos (exceto protozoários)
(HOLLIEN, 2013). Nossos resultados indicam, de forma inequívoca e inédita que a via é
modulado pelos rMVAs. Adicionalmente, os resultados mostram que além dos vírus MVA
expressando a proteína luciferase, vírus MVA selvagens, bem como VACV-WR são capazes
de modular a sinalização via esse sensor mesmo na presença concomitante de um forte
indutor de estresse do RE, o DTT. Os VACV assim como todos os poxvírus, são vírus
grandes e complexos que possuem diversas proteínas responsáveis por interferir com
respostas “antivirais” da célula hospedeira capazes de limitar a replicação viral (PRICE et al.,
2013). Como os vírus frequentemente distorcem processos cito-fisiológicos do hospedeiro
para seu próprio benefício é possível que os VACVs ativem mecanismos celulares inibidores
de IRE1, tais como: hiperfosforilação (RUBIO et al., 2011); mudanças conformacionais
(KORENNYKH et al. 2011); degradação mediada por sinoviolina (GAO et al., 2008);
expressão de BI-1 (LISBONA et al., 2009).
Alternativamente ou concomitantemente, é possível que os VACVs, assim como os
CMVs, possuam proteínas que interajam com o sensor e impeça o processamento do fator
XBP-1. No entanto, diferente da infecção por CMVs onde ocorre ativação do eixo IRE1/XBP1 durante os estágios precoces e inibição nos estágios posteriores do ciclo de replicação viral
(STAHL et al., 2013), os VACVs não apresentam processamento de XBP-1 em nenhum
estagio de infecção, mesmo com altos títulos virais. Esse resultado indica que a inibição logo
no inicio do ciclo de replicação pode ser em função da expressão de genes precoces do
VACV.
81
Futuramente, pretendemos averiguar qual(is) proteína viral é responsável por esse
fenótipo e adicionalmente investigar o potencial terapêutico desta(s) nas diversas
enfermidades associadas ao estresse do RE.
82
VII – CONCLUSÕES
Neste estudo fomos capazes de gerar com sucesso vírus recombinantes, baseados na
plataforma MVA, expressando a proteína Luciferase de Vaga-lume endereçadas ou não ao
RE. Apesar de não termos conseguido detectar a proteína com o uso do anticorpo antiluciferase comercial, o conjunto dos dados, incluindo a detecção do mRNA para a proteína
recombinante e também da atividade de Luciferase em células infectadas pelos vetores, nos
permite ser assertivos em relação ao sucesso da obtenção das referidas construções.
Ademais, nossos resultados demonstram que a infecção por rMVA expressando
proteínas heterólogas, independente do endereçamento destas ao RE, não desencadeiam
ativação da via de resposta ao estresse do RE, UPR, em particular o braço IRE1/XBP-1. O
mesmo pode ser dito para MVA selvagens e outros VACV (como o Western Reverse - WR).
Além de não apresentar o braço IRE1/XBP-1 ativado, células infectadas por esses vírus são
capazes de impedir o processamento do fator XBP-1 em condições de estresse. Embora
tenham sido hipotetizados mecanismos de evasão de respostas ao estresse celular, os VACV
nunca foram testados nesse contexto e o nosso estudo é o primeiro a demonstrar esse fenótipo.
Investigações adicionais são necessárias para elucidar o mecanismo pelo qual os vírus
interferem com essa sinalização e compreender todo impacto que o ciclo de infecção dos
VACV causa sobre a ativação dessas vias e vice e versa.
83
VIII – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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