MICROBIOLIZAÇÃO DE SEMENTES DE MILHO 1
JUNGES, Emanuele ²; BASTOS, Bruna ³; PEDROSO, Janaine Voll 4; SANTOS,
Ricardo Feliciano ³; PEDROSO, Daniele Cardoso 2; MULLER, Juceli 2 ;
MACHADO, Rodrigo Tascheto5; MUNIZ, Marlove Fátima Brião 6
1
Trabalho de Pesquisa _UFSM
PPGA (UFSM), Santa Maria, RS, Brasil
3
Curso de Agronomia (UFSM), Santa Maria, RS, Brasil
4
Curso de Engenharia Florestal (UFSM), Santa Maria, RS, Brasil
5
PPGEA (UFSM), Santa Maria, RS, Brasil
6
Professora DFS/CCR (UFSM), Santa Maria, RS, Brasil
2
E-mail: [email protected]; [email protected]; [email protected];
[email protected]; [email protected]; [email protected];
[email protected]; [email protected].
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da microbiolização de sementes com
Trichoderma spp. e Bacillus sp. sobre o desempenho fisiológico de sementes de milho. A
microbiolização das sementes foi realizada em meio BDA + manitol (- 0,7 MPa), sobre o qual foram
previamente repicados os organismos e em cada placa foram distribuídas 100 sementes de milho
desinfestadas. Quando houve protrusão radicular na primeira semente, as demais foram retiradas e
secas em ambiente de laboratório por 48 h. Foi realizado um tratamento com fungicida químico e um
tratamento testemunha. Foram avaliadas variáveis de sanidade, germinação, e vigor. Foi realizada
ANOVA e as médias comparadas pelo teste de Scott-Knott, em nível de 5% de probabilidade de erro.
Trichoderma spp. proporcionou controle de patógenos associados, porém prejudicou a germinação e
o vigor das plantulas. Bacillus subtilis não interferiu na sanidade e germinação, porém favoreceu o
desenvolvimento radicular das plântulas de milho.
Palavras-chave: Zea mays; Controle Biológico; Trichoderma spp.; Bacillus sp.
1. INTRODUÇÃO
As sementes podem atuar como disseminadoras de fungos, bactérias, vírus e
nematóides, além de introduzir doenças em novas áreas e suas consequências
epidemiológicas (NEERGAARD, 1979). Além da importância do uso de sementes
saudáveis, também é necessário que esses propágulos tenham boa capacidade germinativa
e produzam plântulas vigorosas, garantindo um adequado estabelecimento da população de
plantas. Nesse sentido, a microbiolização de sementes oferece resultados promissores na
manutenção da qualidade, com redução da utilização de insumos químicos, que causam
1
malefícios para o ambiente e/ou para organismos não alvos.
O
condicionamento
osmótico
(restrição
hídrica,
hidrocondicionamento
ou
osmocondicionamento) vem sendo utilizado para melhorar o desempenho de sementes de
diferentes espécies vegetais (HÖLBIG et al., 2010; HÖLBIG et al., 2011) e para inoculação
de patógenos intensificando a infecção sem comprometer as características germinativas
das sementes (DEUNER et al., 2011; SOUSA, et al., 2008). A associação do
condicionamento osmótico com a microbiolização pode promover sinergia dos benefícios de
ambas às técnicas.
2. MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizadas sementes da variedade de milho de polinização aberta “Sertanejo”,
proveniente do banco de sementes da Associação dos Agricultores Guardiões de Semente
de Milho Crioulo do município de Ibarama, RS. Foi avaliada a microbiolização das sementes
com produtos biológicos comerciais à base de agente fúngico (Trichoderma spp.) e de
agente bacteriano (Bacillus sp.).
O primeiro tratamento (T1) foi composto pela microbiolização de Trichoderma spp.,
acrescido de restrição hídrica. Inicialmente, foi determinado o restritor e o potencial hídrico
ótimo para o crescimento de Trichoderma spp. Para a escolha do restritor, utilizou-se meio
de cultura BDA (batata, dextrose e ágar), acrescido dos solutos manitol, NaCl e KCl,
separadamente, e em diferentes potenciais hídricos: 0,0 -0,6, -0,7, -0,8 e -0,9 MPa (Tabela
1) que foram vertidos em placas de petri de 7 cm (Coutinho et al., 2001). No centro das
placas, contendo os diferentes meios de cultura, foram repicados discos de 12 mm de
diâmetro contendo micélio de Trichoderma spp. isolado do produto comercial Agrotrich®
plus. As placas foram incubadas em câmara de crescimento com fotofase de 12 h e
temperatura de 25 ºC por cinco dias. Foi determinado o crescimento das colônias, a partir do
disco de 12 mm, em quatro medidas diametralmente opostas. Foram utilizadas quatro
placas por tratamento, constituindo as repetições, que foram distribuídas em delineamento
inteiramente casualizado.
Após a escolha do restritor, foi determinado o potencial hídrico ótimo para a
germinação de sementes de milho. Para isso, o soluto manitol, determinado no ensaio
anterior como ideal para o crescimento de Trichoderma spp., foi testado em diferentes
potenciais hídricos (0,0 -0,6, -0,7, -0,8 e -0,9) sobre a germinação de sementes de milho
(Tabela 2). Em cada placa, com os diferentes potenciais, foram colocadas 100 sementes de
milho previamente desinfestadas. As sementes permaneceram incubadas em câmara de
2
crescimento, com fotofase de 12 h e temperatura de 25 ºC, até que houvesse protrusão
radicular na primeira semente. Em seguida, todas as sementes foram retiradas e secas em
ambiente de laboratório por 48 h, quando foi instalado o teste de germinação em rolo. Para
cada potencial testado foram utilizadas 200 sementes, separadas em oito repetições de 25.
Os rolos contendo as sementes foram mantidos em germinador, com fotofase de 12 h e
temperatura de 25 ºC, por quatro dias, quando foi realizada a primeira contagem de
germinação e, aos sete dias de incubação foram determinados os percentuais de
germinação, plântulas anormais e sementes mortas.
Assim, para a aplicação do tratamento, Trichoderma spp. foi isolado do produto
comercial Agrotrich® plus para meio de cultura BDA, acrescido de soluto manitol no potencial
-0,7 MPa. As placas foram incubadas por 10 dias, para que o fungo colonizasse todo o meio
e esporulasse abundantemente. Em cada placa, foram acomodadas 100 sementes de milho
previamente desinfestadas e incubadas em germinador, com fotofase de 12 h e temperatura
de 25ºC, até que uma semente apresentasse o início de protrusão radicular, o que ocorreu
72h após a incubação, e as demais sementes foram removidas do meio e colocadas a
secar, sobre papel filtro, em condições de laboratório por 48 h.
No tratamento 2 (T2), cuja microbiolização foi realizada com Bacillus subtilis, utilizouse o meio de cultura BDA acrescido do soluto manitol no potencial -0,7 MPa. Foi aplicado
sobre cada placa 1 mL do produto comercial Rhizoliptus®, à base do organismo. As placas
foram incubadas por 48h para que a bactéria atingisse o máximo crescimento. Decorrido
este período, foram acomodadas 100 sementes de milho previamente desinfestadas em
cada placa, e estas foram acondicionadas em germinador, com fotofase de 12 h e
temperatura de 25ºC, até que uma semente apresentasse o início de protrusão radicular, o
que ocorreu 72h após a incubação, e as demais sementes foram removidas do meio e
colocadas a secar, sobre papel filtro, em condições de laboratório por 48 h.
O tratamento 3 (T3) consistiu da aplicação do fungicida químico Captan SC (120
i.a.g/100 kg sementes previamente desinfestadas) diluídos em calda de tratamento de 1%
do peso das sementes.
O tratamento 4 (T4), trata-se do tratamento testemunha, cujas sementes foram
apenas desinfestadas.
Para avaliação do desempenho das sementes, submetidas aos diferentes
tratamentos, foram mensuradas variáveis referentes à sanidade, à germinação e vigor.
Para a mensuração das variáveis referentes à sanidade, para cada tratamento, foram
utilizadas 200 sementes divididas em oito repetições de 25 sementes, colocadas em caixas
3
"gerbox", previamente desinfestadas com álcool 70% e hipoclorito de sódio a 1%, contendo
duas folhas de papel filtro esterilizado, umedecidas com o herbicida 2,4-D a 0,5% para inibir
a germinação. Após este procedimento, as sementes foram incubadas a 25 ºC, com fotofase
de 12 h, durante cinco dias e analisadas, com o auxílio de microscópio estereoscópico e
óptico, para a observação das estruturas morfológicas dos fungos, os quais foram
identificados ao nível de gênero com o auxílio de bibliografia especializada (BARNET e
HUNTER, 1972), determinando-se o percentual de incidência de cada gênero fúngico.
Para a mensuração das variáveis referentes à germinação, foram utilizadas 200
sementes para cada tratamento, divididas em oito repetições de 25 sementes, semeadas
em rolo de papel filtro umedecido com água destilada na proporção de 2,5 vezes a massa
seca do papel. Os rolos, contendo as sementes, foram mantidos em germinador, a 25 ºC e
fotofase de 12 h. Foram realizadas duas contagens, aos quatro e sete dias conforme as
Regras para Análise de Sementes (BRASIL, 2009), sendo avaliadas na primeira contagem
as plântulas normais de cada repetição, de onde foram separadas, aleatoriamente, dez
plântulas e medido o comprimento da parte aérea e da raiz. Aos sete dias de incubação,
obteve-se o percentual de germinação em cada tratamento de acordo com as Regras para
Análise de Sementes (BRASIL, 2009).
Posteriormente, foi realizada a análise de variância por meio do teste F a 5 % de
probabilidade de erro, calculado o coeficiente de variação, e as diferenças entre as médias
foram comparadas por meio do teste de Scott-Knott, em nível de 5% de probabilidade de
erro, usando o aplicativo estatístico SASM-Agri (CANTERI et al., 2001).
3. RESULTADOS E DISCUSSÕES
O crescimento micelial de Trichoderma spp. não foi influenciado pelo restritor Manitol
nos potenciais -0,6, -0,7, -0,8 MPa, sendo que apenas o potencial mais restritivo, -0,9 MPa,
limitou o crescimento do fungo (Tabela 1). O restritor KCl, nos potenciais -0,6 e -0,8 MPa,
também não foi limitante para o crescimento de Trichoderma spp. Os demais potenciais de
KCl, e todos de NaCl, prejudicaram o desenvolvimento do fungo. Segundo Machado et al.
(2004), a utilização de manitol nos potenciais hídricos de -0,4, -0,6, -0.8, -1,0 MPa, não
prejudicou o crescimento micelial dos fungos Colletotrichum gossypii, C. gossypii var.
cephalosporioides, Botryodiplodia theobromae e Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum.
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Tabela 1. Crescimento micelial de Trichoderma spp. exposto à diferentes restritores e potenciais
hídricos (MPa) e coeficiente de variação (CV%).
Restritor TEST
Potencial
0,0
(1)
-------- Manitol --------0,6
-0,7
-0,8
---------- KCl ----------
-0,9
-0,6
-0,7
-0,8
-0,9
---------- NaCl ----------0,6
-0,7
-0,8
-0,9
Média
31,9a* 31,8a 32,9a 31,0a 28,4c 32,1a 29,6b 31,3a 29,2b 29,7b 23,5d 27,6c 27,8c
CV%
4,29
(1)
TEST = Testemunha.
* Médias com mesma letra na linha não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a 5% de
probabilidade de erro.
Os potenciais -0,6, -0,7, -0,8, -0,9 MPa de manitol foram todos semelhantes entre si
e superiores à testemunha (0,0 MPa) para primeira contagem de germinação e número de
sementes germinadas e apresentaram menor número de plântulas anormais (Tabela 2).
Entretanto, o menor número de sementes mortas ocorreu no potencial -0,7, apesar de não
ter diferido dos potenciais superiores e da testemunha. Devido ao incremento de
desempenho proporcionado pelos potenciais em relação à testemunha e ao menor número
de sementes mortas, determinou-se o potencial -0,7 MPa em meio de cultura BDA como o
ideal para proceder o condicionamento osmótico de sementes de milho.
Tabela 2. Resultados (%) das avaliações de primeira contagem de germinação, sementes
germinadas, sementes mortas e plântulas anormais em sementes hidrocondicionadas em meio de
cultura BDA acrescido do soluto manitol em diferentes potenciais e coeficiente de variação (CV%).
Tratamento Primeira contagem Sementes Germinadas Sementes Mortas Plântulas Anormais
0,0
10,00 b
52,50 b
12,00 a
27,50 a
- 0,6
18,75 a
72,00 a
13,50 a
11,00 b
- 0,7
18,25 a
78,50 a
05,50 a
11,50 b
- 0,8
18,75 a
78,00 a
08,00 a
09,00 b
- 0,9
18,00 a
76,50 a
08,50 a
10,50 b
CV%
22,52
17,63
66,24
73,23
* Médias com mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a 5% de
probabilidade de erro.
5
Na avaliação da sanidade (Tabela 3) foi observada a incidência de três gêneros
fúngicos, Trichoderma spp, Fusarium sp. e Penicillium sp. Trichoderma spp, que foi
inoculado em um dos tratamentos, apresentando 100% de incidência neste. Por se tratar de
um organismo benéfico sua ocorrência é desejada. O fungicida químico demonstrou não ser
seletivo impedindo o desenvolvimento deste fungo. O fungo patogênico Fusarium sp. foi
favorecido pelos tratamentos com Bacillus subtilis e tratamento químico. A baixa incidência
de fungos pode ter reduzido a competição e favorecido o desenvolvimento deste patógeno,
que se caracteriza pela infecção dos tecidos internos da semente. No tratamento com
Trichoderma spp as sementes apresentaram boa colonização do organismo benéfico e
como consequencia controle do patógeno. Já sobre Penicillium sp. um fungo com
desenvolvimento externo na semente, a microbiolização com Trichoderma spp foi efetiva no
controle, tendo desempenho igual ao fungicida químico. Já Bacillus subtilis não demonstrou
potencial de controle, igualando-se à testemunha.
Tabela 3. Incidência (%) de fungos na avaliação da sanidade das sementes microbiolizadas com
Trichoderma spp., Bacillus subtilis e tratadas com fungicida químico e sem tratamento.
Sanidade
Tratamentos
Trichoderma sp. (%)
Fusarium sp. (%)
Penicillium sp. (%)
Trichoderma spp
100,0 a
1,0 d
2,0 b
Bacillus subtilis
16,0 b
51,5 a
37,0 a
Químico
0,0 c
36,5 b
7,0 b
Testemunha
1,5 c
25,5 c
30,0 a
CV (%)
18,9
26,0
43,8
* Médias com mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a 5% de
probabilidade de erro.
A microbiolização das sementes com Trichoderma spp prejudicou a germinação e a
primeira contagem das sementes (Tabela 4) possivelmente pelo comportamento saprofítico
do fungo, utilizando a semente como fonte de nutrição. Machado et al., (2004) verificaram
que a inoculação de patógenos em sementes de algodão com potenciais acima de -0,6 MPa
provocaram a morte das sementes, provavelmente como conseqüência do maior nível de
potencial de inóculo determinado pelo maior tempo de exposição das sementes aos
patógenos. Bacillus subtilis e o fungicida químico não interferiram a germinação, porém na
avaliação da primeira contagem todos os tratamentos foram inferiores ào fungicida químico.
6
Tabela 4. Germinação (%) e primeira contagem (%) de sementes microbiolizadas com Trichoderma
spp., Bacillus subtilis e tratadas com fungicida químico e sem tratamento.
Tratamentos
Germinação (%)
Primeira contagem (%)
Trichoderma spp
59,5 b
48,0 c
Bacillus subtilis
74,0 a
51,5 c
Químico
82,0 a
76,5 a
Testemunha
81,0 a
62,5 b
CV (%)
10,9
17,5
* Médias com mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a 5% de
probabilidade de erro.
Todos os tratamentos favoreceram o crescimento de parte aérea das plântulas
(Figura 1). O crescimento radicular foi favorecido pelo fungicida químico e pela
microbiolização com Bacillus subtilis. Já Trichoderma spp não promoveu crescimento
radicular. Contrariando os resultados encontrados por Resende et al., (2004), que
verificaram que sementes de milho inoculadas com Trichoderma harzianum resultaram em
plantas com maior acúmulo de matéria seca nas raízes.
Figura 1. Comprimento de parte aérea (cm) e raiz (cm) de plântulas oriundas de sementes
microbiolizadas com Trichoderma spp. (T1), Bacillus subtilis (T2), tratadas com fungicida químico (T3)
e sem tratamento (T4). * Médias com mesma letra minúsculas e mesmas letras maiúsculas não
diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade de erro.
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4. CONCLUSÃO
•
A microbiolização de sementes de milho com Trichoderma spp proporciona controle
de patógenos associados, porém prejudica a germinação.
•
Bacillus subtilis não interferiu na sanidade e germinação de sementes de milho
porém, favoreceu o desenvolvimento radicular das plântulas.
•
Outras técnicas de microbiolização, além do uso da restrição hídrica, podem
potencializar os benefícios.
REFERÊNCIAS
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241p.
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SNDA/DNDV/CLAV, 2009. 398p.
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V.1, N.2, p.18-24. 2001.
DEUNER, C.C. et al. Inoculação de Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens em sementes
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HOLBIG, L.S.; BAUDET, L.; VILLELA, F.A. Hidrocondicionamento de sementes de cebola. Revista
Brasileira de Sementes, v.33, n.1, p.171-176, 2011.
HOLBIG, L.S. et al. Recobrimento de sementes de cenoura osmocondicionadas. Revista Brasileira de
Sementes, v.32, n.4, p.22-28, 2010.
MACHADO, J.C.; et al. Uso da restrição hídrica na inoculação de fungos em sementes de algodoeiro
(Gossypium hirsutum). Revista Brasileira de Sementes, v.26, n.1, p.62-67 2004.
NEERGAARD, P. Seed pathology, v. 1. Ed.McMillan. London: 1979. 839 p.
RESENDE, M.L.; et al. Inoculação de sementes de milho utilizando o Trichoderma harzianum como
promotor de crescimento. Ciência e Agrotecnologia, v.28, n.4, p.793-798, 2004.
8
SOUSA, M.V et al. A. Métodos de inoculação e efeitos de Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum em
sementes de algodoeiro. Tropical Plant Pathology, v.33, n.1, p.41-48, 2008.
9