# 12
informativo sbm • ano 4 / 2011
A revista do
Microbiologista.
ISSN 1982-1301
www.sbmicrobiologia.org.br
26º Congresso Brasileiro de Microbiologia
Data: 02/10/2011 à 06/10/2011.
Local: Rafain Palace Hotel e Convention Center
Foz do Iguaçu, PR – Brasil.
1º Prêmio Jovem
Microbiologista 2011
A Sociedade Brasileira de Microbiologia (SBM) e a OXOID e Remel convidam os
microbiologistas, com título de doutor obtido nos últimos três anos anteriores à data de
início do 26º Congresso Brasileiro de Microbiologia (02/10/2011), a participarem do Prêmio Jovem Microbiologista 2011, uma oportunidade ímpar de se destacar e deixar sua
marca no meio científico. Visando a maior integração entre os países latino-americanos,
a SBM abre as inscrições para jovens microbiologistas dos países membros da ALAM
(Associação Latino Americana de Microbiologia). Ao primeiro colocado será concedido
um prêmio em dinheiro em valor a ser definido. O prêmio será entregue durante a sessão de encerramento do 26º Congresso Brasileiro de Microbiologia. Os demais classificados receberão um certificado de participação.
Patrocinador Oficial
1 - INSCRIÇÕES
da revista Brazilian Journal of Microbiology . Os trabalhos que não estiverem de acor-
A inscrição ao Prêmio Jovem Microbiologista 2011 é isenta de taxa e pode ser realizada
do com essas especificações serão automaticamente desconsiderados sem qualquer
até 01/07/2011. Poderão inscrever-se recém-doutores que tenham defendido a tese nos
comunicado ao participante.
últimos três anos anteriores à data de início do 26º Congresso Brasileiro de Microbiologia. O candidato deverá estar inscrito no 26º Congresso Brasileiro de Microbiologia e
3 - APRESENTAÇÃO E SELEÇÃO
deverá submeter apenas um trabalho. O comprovante de inscrição no 26º CBM deverá
A Comissão Científica, designada pela Diretoria da SBM, selecionará cinco trabalhos.
ser enviado para a Secretaria da SBM ao endereço Av. Prof. Lineu Prestes, 2415, Bu-
Os trabalhos selecionados deverão ficar expostos, na forma de painéis, durante o 26º
tantã. CEP 05508-000, São Paulo, SP, juntamente com o trabalho, Currículo Lattes e
Congresso Brasileiro de Microbiologia, em local a ser designado pela Comissão Organi-
documento da comissão de pós-graduação da instituição, declarando a data da defesa
zadora. Os autores serão convidados para apresentação pública desses trabalhos, em
da tese e o título recebido. A documentação submetida não será devolvida.
sessão do 26º Congresso Brasileiro de Microbiologia. O tempo de apresentação oral
será de 20 minutos, perante Comissão Julgadora, composta por três membros, indicada
2 - TRABALHO
pela Diretoria da SBM. Não serão aceitos recursos quanto ao mérito das decisões das
O trabalho, de responsabilidade do recém-doutor, deverá ser encaminhado na forma
comissões de seleção e julgadora.
de paper, tendo como modelo o periódico Brazilian Journal of Microbiology, em três
vias, acompanhado do respectivo arquivo gravado em CD-Rom. O texto deverá ser
4 - PRESCRIÇÃO DO DIREITO AO PRÊMIO
redigido em inglês e ter, no máximo, 10 páginas (incluindo tabelas e figuras) for-
Caso o prêmio não seja solicitado no prazo de 1 ano contado a partir da data da pre-
matadas em fonte Arial, tamanho 12, espaçamento de 1,5 entrelinhas, formato A4,
miação que acontecerá durante o 26º Congresso Brasileiro de Microbiologia o mesmo
margens 2 cm (esquerda, direita, superior e inferior) em editor de texto Microsoft
perderá o direito de recebê-lo. A comissão avaliadora terá poderes para decidir as situ-
Word. As citações bibliográficas deverão ser apresentadas de acordo com as normas
ações em que nenhum trabalho merece receber o prêmio.
26º Congresso Brasileiro de Microbiologia
2 a 6 de Outubro de 2011
Rafain Palace Hotel e Convention Center
Foz do Iguaçu - Paraná
EDITAL DO CONCURSO PARA
OBTENÇÃO DO TÍTULO
DE ESPECIALISTA EM
MICROBIOLOGIA TEMICRO 2011.
1. Apresentação
O Presidente da Sociedade Brasileira de Microbiologia,
Adalberto Pessoa Junior, e o Secretário Geral, Carla Taddei de
Castro Neves, no uso de suas atribuições legais, farão realizar
Concurso para Obtenção do Título de Especialista em Microbiologia-TEMICRO, no dia 03 de outubro de 2011, regulamentado
pelo presente Edital.
O Título de Especialista em Microbiologia terá validade por 5
(cinco) anos, devendo ser renovado de acordo com as normas
estabelecidas pela Comissão Nacional de Titulação SBM.
2. Das inscrições
2.1. A inscrição do candidato implicará o conhecimento e a
tácita aceitação das normas e condições estabelecidas neste
Edital, em relação às quais não poderá alegar desconhecimento.
2.2. As inscrições serão recebidas no período de 02 de fevereiro a 29 de julho de 2011, por via eletrônica www.sbmicrobiologia.org.br/26cbm.
2.3. O candidato deverá efetuar o pagamento da taxa de inscrição no valor de R$ 390,00 além da inscrição no 26º Congresso
Brasileiro de Microbiologia.
As Especialidades
É importante esclarecer que as especialidades regulamentadas são profissionais, isto é, são especialidades no campo
do exercício profissional do microbiologista. Foram regulamentadas algumas que se configuraram como mais definidas e
consensuais.
A Saber:
Microbiologia Ambiental
Microbiologia de Alimentos
Microbiologia Industrial
Microbiologia Clínica
Deve ser destacado que o título de especialista em microbiologia é uma referência sobre a qualificação do profissional, não
se constituindo condição obrigatória para o exercício da profissão.
Podem solicitar o título de Especialista os Biólogos, Biomédicos, Farmacêuticos, Médicos, Médicos Veterinários e outros
profissionais que tenham atuação em uma das áreas da Microbiologia, desde que preencham alguns dos pré-requisitos abaixo
relacionados:
I – Das Inscrições:
1. O candidato deverá ser associado da Sociedade Brasileira
de Microbiologia (SBM) tendo quitado o ano vigente;
2. O candidato deverá ter nível superior e cinco anos de experiência profissional comprovada na área após a graduação
OU carga horária mínima de 1.200 horas de estágio em microbiologia comprovadas depois de formado;
3. Estar inscrito no 26º Congresso Brasileiro de Microbiologia
4. Pagar a taxa estabelecida pela SBM;
5. O candidato deverá ter uma carta de apresentação e três
indicações de associados da SBM;
6. O certificado terá validade por cinco anos.
II – Documentos necessários para Inscrição:
1. Preencher a ficha de inscrição do 26º Congresso Brasileiro
de Microbiologia;
2. Durante o processo de inscrição no 26º CBM efetuar a matrícula no CONCURSO PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE
ESPECIALISTA EM MICROBIOLOGIA
Enviar para a SBM via correio curriculum vitae documentado, que deverá ser confeccionado de acordo com a “Plataforma
Lattes” , histórico escolar e carteira ou comprovante de trabalho
e uma fotografia recente 3x4;
Sociedade Brasileira de Microbiologia
ICB III - SBM - Dep. de Microbiologia
Av. Prof. Lineu Prestes, 2415
Cidade Universitária
05508-000 São Paulo, SP - Brasil
Tel: (+5511) 3813-9647/3037-7095
III – Pontuação dos Títulos e Atividades:
1. Para obtenção do título o candidato deverá atingir média
final = 7,0;
Provas – 90%
Títulos – 10%
IIIa – Provas
Prova escrita: será composta de questões de múltipla escolha e dissertativas sendo que 60% do conteúdo deverá versar
sobre Microbiologia Geral e 40% sobre Microbiologia Específica
da área de especialização escolhida.
Prova Prática: Versará sobre temas específicos da área de
especialização escolhida
Critérios a serem utilizados na avaliação do CV para OBTENÇÃO do Título de Especialista
OBS: Os documentos referentes às atividades pontuadas
deverão ser enviados organizadamente, agrupados por atividade. Caberá à SBM, através da Comissão de Titulação, proceder
a pontuação estabelecida nos itens acima discriminados, para
cada candidato, ação essa que será executada antes da realização da prova.
Outrossim, a comprovação de títulos e atividades constantes
do currículo devem somar no mínimo 10 pontos nos últimos 5
anos para a aprovação da inscrição no concurso.
TÍTULOS
Exigências
Doutor na área
escolhida,
Programa regular credenciado pela CAPES
Pontuação
5
Mestre na área
escolhida
Programa regular credenciado pela CAPES
3
Especialização na
área escolhida
Deverão ter carga horária mínima de 720 horas, considerando-se as horasaulas e os trabalhos de campo, experimental, de estudo e monografia, bem
como deverão atender às exigências do Conselho Federal de Educação e
deverão ser reconhecidos pela SBM
Liderança técnica
Liderança técnica em Laboratórios de Microbiologia nos últimos 10 anos
1,5
1 ponto a cada 2 anos de
atividade (máximo 5 pontos)
Atividade Docente
Atividade Docente em Microbiologia nos últimos 10 anos
1 ponto a cada 2 anos de
atividade (máximo 5 pontos)
Artigos científicos
Artigo científico em Microbiologia na área escolhida, publicados em revistas
indexadas no ISI e/ou PubMed, como autor ou co-autor nos últimos 5 anos
1 ponto por artigo (máximo 5
pontos)
Apresentação em
Congresso
Trabalhos científicos em Microbiologia, apresentados em Congressos
reconhecidos pela SBM, como autor ou co-autor
Cursos de
aperfeiçoamento
Em microbiologia nos últimos 5 anos, carga horária mínima de 180 horas,
reconhecido pela SBM
Cursos de
atualização
Em microbiologia nos últimos 5 anos, , reconhecido pela SBM. Abaixo de 36
horas de atualização nos últimos cinco anos não será pontuado
Estágio em microbiologia
Período mínimo de 480 h consecutivas, nos últimos cinco anos
Máximo de 1 ponto
Eventos
Participação em Congresso de Microbiologia e afins nos últimos 5 anos.
Somente eventos reconhecidos pela SBM serão pontuados (veja anexo).
Eventos não reconhecidos serão julgados pela comissão
0,2 por evento
(Máximo de 1 ponto)
Eventos
Participação ativa como palestrante em Congressos de Microbiologia nos
últimos 5 anos
0,2 por evento
(Máximo de 1 ponto)
0,2 por apresentado
(máximo 1 pontos)
1 ponto
36 - 72 h 0,5; 73 - 109 h 1.0;
>110 h 1,5
(máximo 1,5 ponto)
O título terá validade por cinco anos. Para revalidação, o solicitante deverá encaminhar CV circunstanciado à SBM. A avaliação será feita pela Comissão de Titulação pela análise e pontuação do CV. Pontuação mínima exigida será de 10 pontos.
Editorial
Índice
Prezado
Microbiologista,
Ciência in Foco
É com grande satisfação que iniciamos, com esse número, o quarto ano
da Revista Microbiologia in Foco. Continuamos com os objetivos iniciais
selecionando temas abrangentes e de interesse na divulgação da Microbiologia.
No período, foram publicados 62 artigos, incluindo esse volume, abrangendo diversos temas relacionados à microbiologia, além de noticiais e outros
informes de interesse dos leitores.
Voltamos a enfatizar que esperamos e contamos com a colaboração ativa
dos leitores sugerindo temas e encaminhando artigos para publicação. Infelizmente, não temos recebido muitas sugestões por parte da comunidade
científica e gostaríamos de deixar claro que os editores estão ansiosos por
uma participação mais ativa dos colegas.
Esperamos que comunidade de microbiologistas continue a colaborar ativamente para que essa iniciativa possa alcançar o objetivo de divulgar a
microbiologia nos mais diversos setores da comunidade brasileira.
Lembramos que a revista é de informação e divulgação e é composta de
várias seções:
Seção 1: Ciência in foco: artigos de informação sobre temas relevantes
Seção 2: Resenhas: comentários sobre livros
Seção 3: Resumos comentados de trabalhos científicos relevantes
Seção 4: Homenagem a profissionais com destaque na fundação da SBM
e no desenvolvimento da Microbiologia
Seção 5: Ensino em Microbiologia
Seção 6: Departamento in Foco: Departamentos em destaque: Noticias de
interesse da Microbiologia
Seção 7: Leitor in Foco: espaço aberto ao leitor
Seção 8: Empresas in Foco - Informes publicitários: espaço destinado a
empresas
Agradecemos a todos que colaboraram com a edição número 12 da revista
Microbiologia in Foco e contamos com a colaboração dos colegas para
futuros artigos.
Conferência e Mesa Redonda:
•Carbapenemases. . . . . . . . . . . . . . 8
•MALDI-TOF ICMS na
Microbiologia Clínica:
Porquê começar a usar?. . . . . 10
BIOSSÍNTESE E ATIVIDADE
DE BACTERIOCINAS, E
MECANISMOS BACTERIANOS DE
AUTOIMUNIDADE. . . . . . . . . . . . . . . 11
O Potencial de bactérias
promotoras do crescimento
vegetal para o aumento da
tolerância de plantas aos
estresses abióticos. . . . . . . . . . 17
GENÉTICA DE CIANOTOXINAS . . . . 24
Aquecimento Ôhmico: Novos
desafios no tratamento
térmico de materiais. . . . . . . . . . 36
A síndrome hemolítica
urêmica (SHU) e a busca de uma
estratégia de controle para a
doença. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
SBM In Foco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
Expediente
SBM in Foco
Revista da Sociedade Brasileira
de Microbiologia
Ano 4, nº 12
São Paulo: SBM, 2011
Periodicidade Trimestral
Adalberto Pessoa Junior
Presidente
Agenda In Foco . . . . . . . . . . . . . . . 50
Marina B. Martinez
Editora
Carlos P. Taborda
Editor
Curso de Especialização
e Aperfeiçoamento em
Microbiologia . . . . . . . . . . . . . . . . 51
Editores:
Carlos P. Taborda e Marina B. Martinez
Tiragem:
2000 exemplares - Circulação Nacional
Distribuição gratuita para sócios SBM
Impressão:
Vox Editora Ltda.
(11) 3871-7300
Diagramação:
Hermano Design Editorial
[email protected]
Responsabilidade autoral:
Todos os artigos assinados são de
responsabilidade dos respectivos autores
Responsabilidade editorial:
Tífani Luri N. Hanashiro
7
Conferência e Mesa Redonda
Tópicos apresentados no
II Simpósio Internacional
de Microbiologia Clínica
Conferência
Dia: 30 de setembro de 2010
Hora: 18:00 às 19:00
Sala: 01
Carbapenemases
Karen Bush
Indiana University - USA
Carbapenemases representam um dos grupos
mais versátil de b-lactamases [1]. Essas enzimas
são notáveis por sua capacidade de hidrolisar carbapenens, a b-lactâmicos com maior espectro de
atividade antibacteriana. Além disso, a maioria das
carbapenemases pode hidrolisar praticamente todas
as penicilinas e cefalosporinas, e geralmente não são
afetadas pelos inibidores de b-lactamase disponíveis
comercialmente. Carbapenemases são encontrados
principalmente em organismos Gram-negativos, mas
também são codificados no cromossomo de várias
Bacillus spp. Gram-positivas, incluindo Bacillus cereus e Bacillus anthracis [2].
Carbapenemases se dividem em duas categorias
principais. O primeiro grupo de enzimas das classes
moleculares A e D podem utilizar a serina como sítio
ativo de aminoácidos que está diretamente envolvida na hidrólise de b-lactâmicos. O segundo grupo de
carbapenemase é definido pelo metalo-b-lactamases
(MBLs), enzimas que contêm pelo menos um átomo
de zinco cataliticamente ativa. MBLs são caracterizados por um mecanismo de hidrólise que envolve
aminoácidos específicos que agem como ligantes de
zinco que diferem ligeiramente entre os subgrupos
de MBLs [1]. Essas enzimas podem ter o mesmo amplo espectro de hidrólise como a serina carbapenemases, com uma notável exceção em que MBLs não
hidrolisam monobactam (aztreonam). Eles também
não respondem à inibição pelos inibidores disponíveis na b-lactamase, mas são inibidas por agentes
como o EDTA que quelata o zinco do sítio ativo.
8
Entre as carbapenemases mais importantes estão
as serina b-lactamases da classe A que podem ser
inibida pelo ácido clavulânico e tazobactam em ensaios enzimaticos isolados. Estas enzimas começaram a ser identificados no início de 1980 em isolados
clínicos individuais, mas não foram a causa da extensa epidemias de doenças infecciosas. Alguns poucos
isolados produtores de enzimas SME-1 e SME-2 começaram a aparecer em meados da década de 1990
em diversas localizações geográficas, mas nunca foram um problema clínico principal, como todas as serina carbapenemases, que nesse momento apareceu
como enzimas cromossomicamente codificadas que
eram espécie-específicos [1]. É interessante notar
que várias serina carbapenemases foram identificadas de amostras de microrganismos isoladas de rios
no meio dos Estados Unidos [3].
Na sequência de relatos de plasmídeo que codificam enzimas KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase) a menos de 10 anos atrás [1], o papel
da serina carbapenemases na clínica mudou drasticamente. Estas enzimas surgiram na costa leste
dos Estados Unidos, foram transferidos para Israel e
França, e já se tornaram um fator importante na disseminação global de Klebsiella multi-resistente [4], o
aparecimento nos hospitais brasileiros ocorreu entre
2005-2006 [5-6]. Estas serina carbapenemases KPC
são facilmente transferidos entre as Enterobacteriaceae e também estão sendo identificados em bactérias não fermentadoras, como a Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter sp. [7]. Os genes que codifi-
cam essas enzimas são facilmente encontrados em
transposons transmissíveis que normalmente, carregam outros determinantes de resistência, resultando
em grande resistência as infecções nosocomiais.
Apesar de algumas epidemias parecerem ser devido à distribuição clonal da mesma linhagem, outras
epidemias, podem ser rastreadas pela transmissão
de um transposon dominante, que é encontrado em
várias espécies [8].
Pensou-se, em um determinado momento, que as
metalo-b-lactamases eram um menor fator de resistência, mesmo após IMP-1 MBL ser identificada como
uma enzima codificada por plasmídeo em 1990. As
MBLs quase sempre aparecem em organismos que
codificam pelo menos uma outra b-lactamase com
perfis de substrato que se sobrepõem ao perfil MBL.
A principal familia de MBL incluie as familias IMP e
VIM que hoje somam mais de 50 enzimas [9]. Essas
enzimas têm se espalhado por todo o mundo, com
problemas particularmente notado no Sul da Europa
[10] e na América do Sul [11]. No Brasil, as enzimas
IMP-1 e SPM-1 (São Paulo metalo-b-lactamases)
são MBLs predominantemente identificadas [12]. Recentemente, outra MBL geograficamente localizada,
chamada de Nova Delhi metalo-b-lactamases (NDM1), foi identificada em bactérias entéricas e P. aeruginosa, e é a causa de grandes surtos na Índia, bem
como em pacientes indianos que viajam para lugares
como Austrália, Reino Unido e Estados Unidos [13].
O mais preocupante são os relatos de isolados contendo uma serina carbapenemase e uma MBL como
visto na Grécia [14]. Se esses isolados tornaram-se
amplamente disseminado, o futuro de antibióticos blactâmicos ficará dependente de terapia combinada,
que inclui vários b-lactâmicos e inibidores de b-lactamases.
Referencias
1. Queenan AM, Bush K: Carbapenemases: the versatile beta-lactamases. Clinical Microbiology Reviews 2007, 20:440-458.
10. Giske CG, Libisch B, Colinon C, Scoulica E, Pagani L, Fuzi M, Kronvall G, Rossolini GM: Establishing clonal relationships between VIM1-like metallo-beta-lactamase-producing Pseudomonas aeruginosa
2. Materon IC, Queenan AM, Koehler TM, Bush K, Palzkill T: Biochemical characterization of beta-lactamases Bla1 and Bla2 from Bacillus
anthracis. Antimicrobial Agents & Chemotherapy 2003, 47:2040-2042.
strains from four European countries by multilocus sequence ty-
3. Aubron C, Poirel L, Ash RJ, Nordmann P: Carbapenemase-producing
Enterobacteriaceae, US rivers. . Emerg. Infect. Dis. 2005, 11:260-264.
11. Tognim MCB, Gales AC, Penteado AP, Silbert S, Sader HS: Dissemi-
4. Hawser SP, Bouchillon SK, Hoban DJ, Hackel M, Johnson JL, Badal
RE: Klebsiella pneumoniae isolates possessing KPC beta-lactamase in Israel, Puerto Rico, Colombia and Greece. International Journal
of Antimicrobial Agents 2009, 34:384-385.
5. Monteiro J, Santos AF, Asensi MD, Peirano G, Gales AC: First report
of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae strains in Brazil. Antimicrobial Agents & Chemotherapy 2009, 53:333-334.
6. Pavez M, Mamizuka EM, Lincopan N: Early dissemination of KPC2-producing Klebsiella pneumoniae strains in Brazil. Antimicrobial
Agents & Chemotherapy 2009, 53:2702.
7. Robledo IE, Aquino EE, Sante MI, Santana JL, Otero DM, Leon CF,
Vazquez GJ: Detection of KPC in Acinetobacter spp. in Puerto Rico.
Antimicrobial Agents & Chemotherapy 2010, 54:1354-1357.
8. Naas T, Cuzon G, Villegas MV, Lartigue MF, Quinn JP, Nordmann P:
Genetic structures at the origin of acquisition of the beta-lactamase
bla KPC gene. Antimicrobial Agents & Chemotherapy 2008, 52:12571263.
9. Jacoby GA, Bush K: Amino acid sequences for TEM, SHV and OXA
extended-spectrum and inhibitor resistant b-lactamases. Edited by:
Lahey Clinic; 2010.
ping. Journal of Clinical Microbiology 2006, 44:4309-4315.
nation of IMP-1 metallo- beta -lactamase-producing Acinetobacter
species in a Brazilian teaching hospital. Infection Control & Hospital
Epidemiology 2006, 27:742-747.
12. Wirth FW, Picoli SU, Cantarelli VV, Goncalves AL, Brust FR, Santos
LM, Barreto MF: Metallo-beta-lactamase-producing Pseudomonas
aeruginosa in two hospitals from southern Brazil. Brazilian Journal
of Infectious Diseases 2009, 13:170-172.
13. Yong D, Toleman MA, Giske CG, Cho HS, Sundman K, Lee K,
Walsh TR: Characterization of a new metallo-beta-lactamase gene,
bla(NDM-1), and a novel erythromycin esterase gene carried on a
unique genetic structure in Klebsiella pneumoniae sequence type
14 from India. Antimicrobial Agents & Chemotherapy 2009, 53:50465054.
14. Pournaras S, Poulou A, Voulgari E, Vrioni G, Kristo I, Tsakris A: Detection of the new metallo-b-lactamase VIM-19 along with KPC-2,
CMY-2 and CTX-M-15 in Klebsiella pneumoniae. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2010, 65:1604-1607.
9
Mesa Redonda
Dia: 01 de Outrubro de 2010
Hora: 16:30 às 18:00
Sala: 03
MALDI-TOF ICMS
na Microbiologia
Clínica: Porquê
começar a usar?
Cledir Santos e Nelson Lima
IBB - Centro de Engenharia Biológica, Micoteca da Universidade do Minho,
Universidade do Minho, Campus de Gualtar, 4710-057 Braga, Portugal
[email protected]; [email protected].
Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation – Time
Of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) é uma
técnica físico-química robusta para a análise de moléculas orgânicas. Esta técnica tem dado um grande
contributo para o conhecimento científico a cerca da
identificação dos microrganismos, sendo já utilizada
como uma ferramenta eficaz para testes rápidos de
análises clínicas em hospitais e centros de saúde.
Neste caso, o interesse da técnica em questão é a
análise da célula intacta microbiana, onde o espectro gerado é interpretado como um fingerprint celular.
Esta abordagem é designada por MALDI-TOF IC (Intact Cell) MS. Em MALDI-TOF ICMS, uma pequena
quantidade da amostra do material biológico (cerca
de 50 µg) é transferida directamente da placa de cultura para a placa de MALDI-TOF e recoberta por uma
matriz orgânica em solução aquosa e acidificada.
Sendo a acidez do meio fundamental para a extracção proteica óptima. Depois de evaporada a fase líquida, obtém-se um material cristalizado, necessário
à ionização das moléculas. As amostras são, então,
submetidas a um sistema de vácuo e irradiadas por
um laser pulsado de nitrogénio a 337 nm. Esta irradia-
10
ção conduz à ionização suave das moléculas, onde
a matriz orgânica previne a fragmentação molecular.
A nuvem de iões gerada durante a ionização é acelerada para dentro do tubo “TOF”, onde esses iões
são separados de acordo com os seus tempos de
voos individuais. O tempo de voo de cada ião ocorre
em função da razão massa/carga (m/z) e os espectros finais são obtidos numa escala de 2 a 20 kDa.
Finalmente, os espectros são tratados numa base de
dados contendo espectros teóricos e experimentais
para as diferentes espécies de microrganismos. A
presente técnica é bastante robusta na identificação
microbiana até ao nível de espécie. Contudo, em alguns casos, é possível a diferenciação de microrganismos até ao nível de estirpe. O MALDI-TOF ICMS
tem-se mostrado como sendo de grande relevância
para a investigação em microbiologia clínica, dado
tratar-se de uma técnica simples, económica, rápida (~ 2 min/amostra) e de elevada eficácia. Neste
contexto, a identificação microbiana por esta técnica
apresenta-se, ainda, como a ponta de um iceberg,
ficando aqui a questão: MALDI-TOF ICMS na microbiologia clínica: Porquê começar a usar?
Ciência in Foco
BIOSSÍNTESE E ATIVIDADE
DE BACTERIOCINAS, E
MECANISMOS BACTERIANOS
DE AUTOIMUNIDADE
Marcela Motta Drechsel
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Instituto de Agronomia, Departamento de Fitotecnia, Seropédica, RJ - Brasil.
Stefan Schwab, Marcia Soares Vidal, José Ivo Baldani
Embrapa Agrobiologia, Laboratório de Genética e Bioquímica, Seropédica, RJ - Brasil.
Introdução
Atualmente, na agricultura, a utilização crescente de agroquímicos com
fungicidas, pesticidas e herbicidas têm
preocupado cada vez mais a sociedade
devido aos aspectos econômicos e ambientais. O controle biológico vem nesse
ambito como uma alternativa ecologicamente viável no ramo da fitopatologia.
O controle biológico por organismos
antagonistas pode se dar por diferentes
formas sendo que as principais são: antibiose, competição, parasitismo, interferência nos mecanismos de virulência
do patógeno e indução de resistência
na planta (Strange, 2003). Em relação a
antibiose, os microrganismos antagonistas possuem a capacidade de sintetizar
muitos compostos antimicrobianos. Dentre eles estão a produção de antibióticos
(fenazinas, acetilfloroglucinol, oomicina,
antranilatos), bacteriocinas, sideróforos
e outros compostos voláteis.
As bacteriocinas são compostos
produzidos por bactérias que inibem ou
matam outras bactérias sendo estas na
maioria das vezes filogeneticamente re-
lacionadas com as produtoras (James et
al., 1996). Apesar de haver grande diversidade de bacteriocina, a maioria delas
apresenta características em comum.
Elas geralmente apresentam alto peso
molecular e uma ação anti-microbiana
que interfere na parede celular do organismo alvo de diversas formas, podendo
inibir a biossíntese da parede celular ou
ocasionando a formação de poros na
mesma, resultando assim a morte celular (Jack et al., 1995). Diferentemente de
outros compostos antibacterianos produzidos por bactérias, as bacteriocinas se
caracterizam por sua ação letal primária,
sua inativação por tripsina e resistência
a pH 2 (Klaenhammer, 1988).
Bacteriocinas em
bactérias gram-positivas
Classificação
As bacteriocinas produzidas pelas
bactérias gram-positivas são geralmente catiônicas, anfifílicas e de tamanho
que varia de 2 a 6 kDa (van Kraaij et al.,
1999). As bactérias gram-positivas mais
conhecidas como sendo produtoras de
bacteriocinas são as bactérias produtoras de ácido lático (LAB) que atuam na
conservação de carnes e produtos lácteos. Segundo Klaenhammer (1993), as
bacteriocinas produzidas por bactérias
gram-positivas estão distribuídas em 4
diferentes classes. Em geral, na classe
I encontram-se os lantibióticos que são
pequenos peptídeos (19 a 38 resíduos
de aminoácidos), termoestáveis de baixo
peso molecular (< 5 kDa) e que apresentam em sua composição aminoácidos de
lantionina e ß-metil-lantionina (Guder et
al., 2000). A classe II caracteriza-se por
apresentar bacteriocinas com tamanho
de 30 a 60 aminoácidos, termoestáveis,
de peso molecular menor que 10 kDa e
que não contenham a lantionina como
aminoácido. As bacteriocinas da classe
III caracterizam-se por apresentar peptídeos termolábeis extremamente sensíveis ao calor e de alto peso molecular (>
30 kDa). Já na classe IV encontram-se
grandes complexos peptídicos contendo
carboidrato ou lipídio em sua estrutura
(Riley, 1998).
11
Biossíntese
A síntese de bacteriocina geralmente
envolve quatro genes distintos, que geralmente se localizam em um só operon. O
primeiro é o responsável pela síntese de
um pré-peptídio ou pré-bacteriocina. O
segundo gene é responsável pela síntese
de uma proteína que confere imunidade a
bacteriocina por ela produzida. O terceiro
que codifica proteínas do transporte ABC
que exportam a bacteriocina e, por fim, o
quarto gene ainda tem uma função pouco
conhecida, mas se sabe que ele codifica
uma proteína acessória que embora não
pertença ao transporte ABC, se faz necessária para a exportação (Nes et al., 1996).
As bacteriocinas são sintetizadas,
primeiramente, na forma de pré-peptídeos ou pré-bacteriocinas biologicamente
inativos. Esses pré-peptídeos contêm
uma seqüência guia N-terminal de 18 a
27 aminoácidos, apresentando 2 glicinas. Este precursor é transportado à superfície celular durante a fase de crescimento exponencial e catalisado na forma
ativa. O transportador contém uma porção proteolítica N-terminal, responsável
pela clivagem do peptídeo guia, além
de uma porção C-terminal responsável
pela hidrólise do ATP e fornecimento de
energia (Aucher et al., 2005). A função
da seqüência guia na pré-bacteriocina é
de evitar que a bacteriocina seja biologicamente ativa dentro da célula produtora
e servir como sinal de reconhecimento
para o sistema de transporte que envolve as proteínas do transporte ABC e a
proteína acessório (Nes et al, 1996). Segundo Moll et al. (1999), as duas glicinas
presentes na seqüência de aminoácidos
são as responsáveis pelo reconhecimento da pré-bacteriocina no sistema
de transporte. Após o reconhecimento
do pré-peptídio, a seqüência de aminoácidos é removida, e a bacteriocina, excretada da célula. (Ennahar et al., 2000)
O sistema responsável pela regulação
da produção de bacteriocinas é composto
por três componentes: um peptídeo indutor (ferormônio ou fator de ativação),
uma histidina quinase transmembrana
(proteína receptora do fator de ativação)
e uma proteína reguladora de resposta
(Nes & Eijsink, 1999). O peptídeo indutor
é produzido no ribossomo como pré-peptídeo que é clivado e secretado no meio
externo pelo transportador. Quando este
atinge uma certa concentração no meio
extracelular, a histidina quinase transmembranar é ativada fosforilando assim a
Figura 1: Representação esquemática da biosíntese e regulação da
bacteriocina da classe II. Adaptação de Drider et al., 2006.
12
proteína reguladora de resposta. A proteína reguladora, uma vez fosforilada, ativa
a transcrição da bacteriocina iniciando
assim um feedback positivo (Drider et al.,
2006) (Figura 1).
Mecanismos de ação
Estudos revelam que muitas das
bacteriocinas produzidas pelas bactérias gram-positivas como os lantibióticos
atuam a nível de membrana plasmática
(Montville & Chen, 1998). Estas bacteriocinas permeabilizam a membrana plasmática por meio da formação de poros
ocasionando assim desbalanço iônico e
do fluxo de íons fosfato. Com isso há a
dissipação da força protômica (PMF) que
está envolvida diretamente com a síntese
de ATP, fosforilação das proteínas, síntese e rotação dos flagelos e transporte de
proteínas (Rosa & Franco, 2002). Com
a dissipação da força protônica, 98,9%
de ATP é hidrolisado. O transporte ativo
de aminoácidos cessa e os aminoácidos
de reserva são liberados da célula pelos
poros formados. Esse distúrbio primário
talvez gere outras desordens como lise
celular. (Garcerá et al., 1993). A formação
dos poros pela bacteriocina se dá pelas
interações eletrostáticas entre a carga
positiva e os resíduos polares da bacteriocina com os fosfolipídios aniônicos
presentes na membrana plasmática das
células alvo (Abee et al., 1995).
Em relação a formação dos poros
as bacteriocinas podem atuar de duas
formas distintas. Elas diferem quanto
a forma de inserção da bacteriocina na
membrana da célula-alvo. No modelo
Barrel-stave, a bacteriocina se liga como
monômero na membrana citoplasmática,
inserindo-se na bicamada lipídica e se
agregando lateralmente para a formação
do poro (Moll et al., 1999). No modelo
Wedge-like a formação do poro se dá
pela atuação local da bicamada lipídica.
Quando a bacteriocina se liga a membrana plasmática, esta apenas entra em
contacto com a parte hidrofílica e não
com a parte hidrofóbica (Figura 2).
Mecanismos de auto-proteção pelas bactérias produtoras
de bacteriocinas
As bactérias produtoras de bacteriocinas possuem a capacidade de se
auto-defender contra seus agentes an-
timicrobianos uma vez que estes são
sintetizados em uma forma não ativa
dentro da célula. Como já dito anteriormente, o pré-peptídeo formado possui
uma seqüência guia N-terminal que
além de tornar a bacteriocina inativa ainda serve como reconhecimento para as
proteínas de transporte. Os sistemas de
secreções das bacteriocinas contribuem
para a auto-defesa da célula produtora.
Estes transportadores do tipo ABC utilizam ATP para secretar a bacteriocina
através da membrana. Nos estudos de
Haverstein et al., 1995 foi observado que
as proteínas de transporte ABC que excretam bacteriocina possuem um domínio proteolítico em sua região N-terminal
que realizam duas funções. Uma delas é
a remoção da seqüência terminal da prébacteriocina e a outra é sua subseqüente translocação através da membrana
plasmática. Com isto o sistema de transporte impede que a bacteriocina madura
permaneça no citoplasma.
Como já descrito anteriormente, no
mesmo operon, além do gene da síntese
da pré-bacteriocina e do transportador,
está localizado o gene que codifica uma
proteína de imunidade (Moll et al., 1999).
Esta proteína confere às células produtoras uma alta resistência as bacteriocinas
por elas sintetizadas. Cada bacteriocina
apresenta a sua própria proteína que lhe
confere imunidade, e esta é expressa
concomitantemente com a bacteriocina.
As proteínas de imunidade permanecem no espaço intracelular e se ligam a
proteínas de membrana da célula produtora, impedindo a atuação da bacteriocina (Figura 4) (Nascimento et al., 2008).
O mecanismo de ação destas proteínas ainda não foi claramente elucidado.
Atualmente se sabe que as proteínas de
imunidade das células gram-positivas
se encontram no citoplasma (Dayem et
al., 1996). Alguns autores sugerem que
o domínio C-terminal da bacteriocina é
reconhecido pelo domínio C-terminal da
proteína de imunidade. De acordo com
este modelo, a bacteriocina e a proteína de imunidade estão localizadas de
lados opostos da membrana plasmática
não parecendo haver um contato direto
entre as duas moléculas (Fimland et al.,
2005). Ou seja, a própria membrana ou
algum componente específico ainda não
conhecido parece desempenhar um pa-
Figura 2: Formação de poros membranares ocasionados por bacteriocinas
Onde: a letra A representa o modelo Barrel-stave e B o modelo Wedge-like
Fonte : Moll et al., 1999
Figura 4: Mecanismo de biossíntese, regulação e imunidade de bacteriocinas
produzidas por bactérias gram-positivas. Fonte: Nascimento et al., 2008.
pel crucial como mediador no reconhecimento entre a bacteriocina e a proteína
de imunidade. A princípio, a proteína de
imunidade poderia interagir com o poro
formado pela bacteriocina bloqueando-o
(Drider et al., 2006). Outra possibilidade
seria a proteína de imunidade interagir
com receptores para bacteriocinas e
inibir diretamente ou indiretamente sua
ação por meio da alteração da conformação do receptor (Venema et al, 1994).
Bacteriocinas em
bactérias gramnegativas
Classificação
Geralmente as bacteriocinas das
bactérias gram-negativas são maiores
que as das gram-positivas. Porém seu
tamanho varia de cerca de 10kDa a 20
kDa. Dentre as bacteriocinas mais conhecidas estão a colicina, a microcina
13
Ciência in Foco
e a piocina. Das bacteriocinas produzidas pelas bactérias Gram-negativas,
as colicinas da bactéria Escherichia
coli é a mais estudada (Lazdunski,
1988). Elas possuem alto peso molecular (acima de 20 kDa) e seus genes
se localizam geralmente em plasmídeos. As colicinas tem por característica
inibir o crescimento de bactérias que
são estreitamente relacionadas filogeneticamente com a E. coli e o gênero
Salmonella (Braun et al., 1994). As colicinas têm sido amplamente estudadas
e são utilizadas como modelo no estudo
dos mecanismos de síntese, ação e regulação das bacteriocinas (Braun et al.,
1994). As microcinas se caracterizam
por serem termoestáveis, resistentes a
certas proteinases, hidrofóbicas, resistentes em pH baixo e por possuir baixo
peso molecular (menos que 10 kDa). É
sintetizada principalmente por bactérias
do gênero Enterobacteriaceae (Gillor
et al., 2005). Outro grande grupo de
bacteriocinas produzidas por bactérias
gram-negativas é o da piocina. O gênero Pseudomonas representa seu maior
produtor sendo que até 90% das estir-
Figura 3 : Modo de ação da colicina A. Onde: OM = membrana externa, IM =
membrana interna, PG = peptideoglicanos, P = espaço periplasmático. 1: Colicina com seus três domínios, 2: Domínio RB se liga ao receptor (BtuB) e se
desdobra. O domínio C entra na porina OmpF. 3: O domínio T interagem com a
proteína TolB que não pode mais interagir com a proteína PAL. 4: O domínio C
penetra na membrana interna formando o poro. (Fonte: Cursino et al., 2002).
14
pes da espécie Pseudomonas aeroginosa sintetiza pelo menos uma piocina
Uma característica que difiere as piocinas das colicinas é que os genes que
sintetizam as piocinas são encontrados
exclusivamente em cromossomos e não
em plasmídios (Riley & Gordon, 1992).
Biossíntese
A maioria dos artigos que abordam
a síntese de bacteriocinas em bactérias gram-negativas faz referência a
produção das colicinas. Os genes que
codificam as colicinas são encontrados
em plasmídios denominados pCol de
Escherichia coli (Braun et al., 1994).
Nestes plasmídios, são encontrados os
genes estruturais (que codifica a colicina
propriamente dita (col ou cea)), o gene
que codifica uma proteína de imunidade
e o gene que codifica uma proteína de
transporte para a liberação da colicina
no meio. O gene para a colicina e o de
sua liberação geralmente constituem um
único operon. Em condições normais, a
transcrição do operon é reprimido pela
ligação da proteína repressora LexA
(Cursino et al., 2002).
A produção da colicina é induzida
pela presença de agentes que danificam
o DNA ou por fatores ambientais como o
aumento da densidade populacional ou
falta de nutrientes. Quando as bactérias
produtoras são expostas a irraidação UV
a colicina é produzida em grande escala
(James et al., 1996). O fator responsável
por esta indução é o “sistema SOS de
reparo do DNA” que causa a ativação da
proteinase RecA que inativa a proteína
LexA desbloqueando a síntese da colicina (Spangler et al., 1985). Quando o sistema SOS é induzido, a colicina se acumula dentro da célula e sua exportação
só inicia quando esta se encontra em
uma grande concentração no citoplasma
bacteriano. Pela ação da proteína de
transporte, a membrana externa começa a ficar permeável permitindo assim
a liberação de proteínas de baixo peso
molecular, o que inclui as colicinas. Em
algumas bactérias, o aumento na permeabilidade da membrana externa acarreta
na lise parcial das células ocasionando a
morte das células produtoras. Desta forma, a produção de colicina é conhecida
como um fenômeno “suicida” (Alonso et
al., 2000).
Ciência in Foco
Mecanismos de ação
No caso das colicinas, estas possuem
a capacidade de ocasionar a morte celular
de bactérias sensíveis por três diferentes
formas. A principal delas, como acontece
nas bactérias gram-positivas, é a formação de poros na membrana plasmática,
resultando na despolarização membranar
(Smarda & Smajs, 1998). Este mecanismo é melhor entendido quando se observa a figura 3. Na figura, observa-se que a
colicina, neste caso a colicina A, possui
três domínios distintos. Um domínio responsável pela ligação com receptores das
células alvos (RB), um domínio responsável pela translocação da proteína (T) e um
domínio responsável pela ação da colicina propriamente dita (C). Primeiramente,
a colicina se liga a um receptor específico na membrana externa da célula alvo
(BtuB). Após o reconhecimento e ligação
com este receptor, a colicina então é desdobrada, permitindo a translocação do
domínio T para dentro de uma proteína
porina (OmpF). Dentro da membrana externa, o domínio T reagem com a proteína
TonB. A proteína TonB ligada ao domínio
T não pode mais interagir com a proteína
de membrana PAL. Quando esta ligação
não ocorre há uma desestabilização local
dos peptideoglicanos que permite que o
domínio A entre na membrana interna da
célula alvo e forme o poro. Com a formação dos poros, o gradiente eletroquímico
transmembranar é interrompido e ocorre
um efluxo de fosfato e potássio para fora
da célula o que diminui os níveis de ATP
citoplasmáticos (Lazdunski et al., 2000).
Outra forma, porém bem menos freqüente, é quando a colicina atua como nuclease podendo atuar diretamente contra o
DNA cromossomal da célula alvo atuando
como uma endonuclease. A colicina também pode atuar degradando a parede celular e inibindo a síntese de peptideoglicanos e mureína (Smarda & Smajs, 1998).
Mecanismos de auto-proteção pelas bactérias produtoras
de bacteriocinas
As bactérias produtoras de colicinas
possuem um mecanismo de proteção
contra as bacteriocinas que produzem.
O mecanismo com o qual as bactérias
produtoras se defendem contra a colicina produzida dentro de sua própria célula ainda não é bem conhecido (Alonso
et al., 2000). A proteína de imunidade
(imm) e a colicina são transcritas no
mesmo plasmídeo. Ao contrário da colicina, a proteína de imunidade é constantemente produzida não tendo necessidade de nenhuma indução. A proteína
de imunidade confere resistência contra
a colicina que as próprias células produzem mas não contra colicinas heterólogas mesmo que estas possuam o mesmo mecanismo de ação e seqüências
similares (Cascales et al., 2007). Ao contrário das bactericinas produzidas pelas
bactérias gram-positivas, as colicinas já
são sintetizadas em sua forma ativa e
não como pré-peptídeo. Entretanto, Cascalet et al. (2007) citam que a proteína
de imunidade é apenas necessária para
proteger a célula quando a bacteriocina
encontra no meio extracelular, uma vez
que a colicina dentro da célula é incapaz
de formar o poro devido a polaridade do
potencial transmembranar no interior da
célula ser oposto ao necessário para
a formação do poro. Experimentos de
Goldman et al., (1985) demonstram que
esta proteína se localiza possivelmente
na membrana interna. A proteína de imunidade reconhece o domínio C-terminal
da colicina. A proteína de imunidade interage então diretamente com o domínio
C responsável pela a formação de poro
na colicina na membrana interna (Cascales et al., 2007). De fato, a proteína de
imunidade não evita que a colicina se ligue aos receptores mas sim impede que
o poro se forme ou bloqueando-o caso
haja a formação do mesmo.
Referências
Abee, T.; Krockel, L.; Hill, C. (1995). Bacteriocins: modes of action and potentials in food
preservation and control of food poisoning.
International Journal of Food Microbiology, 28
(2), 169-85.
Alonso, G.; Vílchez, G.; Lemoine, V.R. (2000).
How bacteria protect themselves against
channel-forming colicins, International Microbiology 3 (2), 81–88.
Aucher, W.; Lacombe, C.; Héquet, A.; Frère,
J.; Berjeaud, J.M. (2005). Influence of amino
acid substitutions in the leader peptide on
maturation and secretion of mesentericin
Y105 by Leuconostoc mesenteroides. Journal
of Bacteriology 187 (6), 2218-2223.
Braun, V.; Pilsl, H.; Gross, P. (1994). Colicins:
structures, modes of action, transfer through
membranes, and evolution, Archives of Microbiology 161 (3), 199-206.
Cascales, E.; Buchanan, S.K.; Duche, D.;
Kleanthous, C.; Lloube`s, R.; Postle, K.; Riley, M.; Slatin, S.; Cavard, D. (2007). Colicin
Biology, Microbiology and Molecular Biology
Reviews 71 (1), 158–229.
Cursino, L.; Smarda, J.; Souza, E.C.; Nascimento, A.M.A. (2002). Recent Updated Aspects of Colicins of Enterobacteriaceae, Brazilian Journal of Microbiology 33 (3), 185-195.
Dayem, M.A.; Fleury, Y.; Devilliers, G.; Chaboisseau, E.; Girard, R.; Nicolas, P.; Delfour,
A. (1996). The putative immunity protein of
the Grampositive bacteria Leuconostoc mesenteroides is preferentially located in the
cytoplasm compartment. FEMS Microbiology
Letters 138, (2-3), 251–259.
Drider, D.; Fimland, G.; Héchard, Y.; McMULLEN, L.M.; Prévost, H. (2006). The Continuing
Story of Class IIa Bacteriocins. Microbiology and Molecular Biology Reviews 70 (2),
564–582.
Ennahar, S.; Sashihara, T.; Sonomoto, K.;
Ishizaki, A. (2000). Class IIa bacteriocins: biosynthesis, structure and activity. FEMS Microbiology Reviews 24 (1), 85-106.
Fimland, G.; Johnsen, L.; Dalhus, B.; NissenMeyer, J. (2005). Pediocin like antimicrobial
peptides (class IIa bacteriocins) and their immunity proteins: biosynthesis, structure and
mode of action. Journal of Peptide Science 11
(11), 688–696.
Garcerá, M.J.G.; Elferink, M.G.L., Driessen,
A.J.M.; Konings, W.N. (1993). In vitro poreforming activity of the lantibiotic nisin role of
proton motive force and lipid composition.
European. Journal of. Biochemistry 212 (2),
417-422.
Gillor, O.; Nigro, L.M.; Riley, M.A. (2005). Genetically engineered bacteriocins and their potential as the next generation of antimicrobials.
Current Pharmaceutical Design 11 (8), 1-9.
Goldman, K.; Suit, J.L.; Kayalar, C. (1985).
Identification of the plasmid-encoded immunity protein for colicin E1 in the inner membrane of Escherichia coli. FEBS Letters 190
(2), 319–323.
Guder, A.; Wiedemann, I.; Sahl, H. G. (2000).
Posttranslationally modified bacteriocins - the
lantibiotics. Biopolymers 55 (1), 62–73.
15
Ciência in Foco
Haverstein, L.S.; Diep, D.B.; Nes, I.F. (1995).
A family of bacteriocina ABC transporters carries out proteolytic processing of their substrates concomitant with export. Molecular
Microbiology 16 (2), 229–240.
Jack R.W, Tagg JR, Ray B. (1995). Bacteriocins of gram-positive bacteria. Microbioogy.
Review 59 (2), 171–200.
James, R.; Kleanthous, C.; Moore, G.R.
(1996). The biology of E colicins: paradigms
and paradoxes. Microbiology 142 (7), 15691580.
Klaenhammer T.R. (1988). Bacteriocins of
lactic acid bacteria. Biochimistry .70 (3),
337–349.
Klaenhammer, T.R. (1993). Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria. EMS
Microbiological Review 12 (1-3), 39-85.
Lazdunski, C.J. (1988). Pore-forming colicins:
synthesis, extracellular release, mode of action, immunity. Biochimistry 70 (9), 1291–
1296.
Lazdunski, C.; Bouveret, E.; Rigal, A.; Journet, L.; Lloubès, R.; bénédetti, H. (2000). Colicin import into Escherichia coli cells requires
16
the proximity of the inner membranes and others factors. International Journal of Medical
Microbiology 290 (4-5), 337-344.
Riley, M.A. (1998). Molecular mechanisms of
bacteriocin evolution. Annual. Review of Genetics, 32, 255-278.
Moll, G.N., Konings, W.N., Driessen, A.J.M.
(1999). Bacteriocins mechanism of membrane insertion and pore formation. Antonie
van Leeuwenhoek 76 (1-4), 185-198.
Riley, M.A.; Gordon, D.M. (1992). A survey of
Col plasmids in natural isolates of Escherichia
coli and an investigation into the stability of
Col-plasmid lineages. Journal of General Microbiology 138(7), 1345-1352.
Montville, T.J., Chen, Y. (1998). Mechanistic
action of pediocin and nisin: recent progress
and unresolved questions. Applied. Microbiology and Biotechnology 50 (5), 511-519.
Rosa, C.M.; Franco, B.D.G.M. (2002). Bacteriocinas de bactérias láticas, ConSCIENTIAE
SAÚDE 1 (09-15), 9-15.
Nascimento, M.S.; Moreno, I.; Kuaye, AY.
(2008). Bacteriocina em alimentos: uma revisão. Brazilian Journal of Food Technology 11
(2), 120-127.
Nes, I.F.; Diep, D.P.; Havarstein, L.S.; Brurberg, M.B., Eijsink, V., Holo, H. (1996). Biosynthesis of bacteriocins in lactic acid bacteria.
Antonie van Leeuwenhoek 70 (2-4), 113- 128.
Nes, I.F.; Eijsink, V.G.H. (1999). Regulation
of group II peptide bacteriocin synthesis by
quorum-sensing mechanisms. In: Dunny,
G.M.; Winans, S.C. (eds). Cell-cell signalling
in bacteria. Washinton: American Society for
Microbiology, p.175-192.
Šmarda, J.; Smajs, D. (1998) Colicins--exocellular lethal proteins of Escherichia coli.
Folia Microbiologica 43 (6), 563-582.
Strange, R.N. (2003) Introduction to Plant Pathology, ed. John Wiley & Sons, 464p.
van Kraaij, C.; de Vos, W.M.; Siezen, R.J;
Kuipers, O.P. (1999). Lantibiotics: biosynthesis, mode of action and applications. Natural
Product Report .16 (5), 575-587.
Venema, K.; Haverkort, R.E.; Abee, T.; Haandrikman, A.J.; Leenhouts, K.J.; de Leij, L.;
Venema, G.; Kok, J. (1994). Mode of action of
LciA, the lactococcin A immunity protein, Molecular Microbiology 14 (3), 521–532.
Ciência in Foco
O Potencial de bactérias
promotoras do
crescimento vegetal
para o aumento da
tolerância de plantas
aos estresses abióticos
Patrícia Gonçalves Galvão
Patrícia Gonçalves Galvão - Aluna de doutorado do curso de pós-graduação em fitotecnia da UFRRJ
(Universidade Federal Rural do Rio de janeiro) - Rio de janeiro, Brasil
Jean Luiz Simões-Araújo
Jean Luiz Simões de Araújo - Pesquisador Embrapa Agrobiologia
(rodovia Br 465, km7 - Seropédica, RJ. cep: 23890-000)
Marcia Soares Vidal
Marcia Soares Vidal - Pesquisadora Embrapa Agrobiologia
(rodovia Br 465, km7 - Seropédica, RJ. cep: 23890-000)
José Ivo Baldani
José Ivo Baldani - Pesquisador Embrapa Agrobiologia
(rodovia Br 465, km7 - Seropédica, RJ. cep: 23890-000)
1. Introdução
As bactérias promotoras do crescimento vegetal (PGPB) colonizam a rizosfera e o interior dos tecidos de muitas
espécies de plantas, podendo causar
efeitos benéficos a elas, como o aumento do crescimento vegetal (KLOEPPER
et al., 2004). Como as PGPBs interagem
com as plantas e afetam a fisiologia e
metabolismo vegetal ainda não está
totalmente esclarecido. Existem muitas
pesquisas relacionadas com os efeitos
das PGPBs quando utilizadas como
agentes de controle biológico, entretanto, poucos trabalhos foram publicados
enfatizando o papel das PGPB como
promotoras de tolerância aos estresses
ambientais (ZHUANG, et al., 2007).
Os estresses ambientais são os
principais fatores limitantes para a
produtividade agrícola no mundo inteiro
(CHERRY, 1987). Esses estresses di-
minuem o rendimento das culturas em
até 50 – 80% (BRAY et al., 2000) e também representam um obstáculos para
a introdução de plantas cultivadas em
áreas onde o cultivo não é adequado. O
estresse é definido como uma influência
fora da faixa normal de controle homeostático de um determinado genótipo.
Sempre que a tolerância ao estresse for
excedida, os mecanismos de resposta
são ativados (LERNER, 1999) e quando
17
o estresse for controlado, gera-se um
novo estado fisiológico e a homeostase
é restabelecida. Quando não existir mais
a condição de estresse, a planta pode
retornar ao estado original ou um novo
estado fisiológico pode ser estabelecido
(AMZALLAG, 1999). Os estresses abióticos para as plantas incluem temperaturas altas e baixas (SUNG et al., 2003),
salinidade (HASEGAWA et al., 2000),
seca (ZHU, 2002), alagamento (DAT et
al., 2004), luz ultravioleta (STRATMANN,
2003), poluição do ar (ozônio) (LANGEBARTELS et al., 2002), a presença de
metais pesados (SCHUTZENDUBEL &
POLLE, 2002) e a deficiência ou excesso de nutrientes (STEVENSON & COLE,
1999).
1. Pgpb induzem o
aumento da tolerância
das plantas a diferentes
estresses abióticos
1.1. Aumento da tolerância
de plantas à salinidade
A salinidade dos solos em regiões
áridas é um fator que frequentemente limita a produção agrícola. Sob condições
de alta salinidade, as plantas exibem um
decréscimo na absorção de água e uma
subseqüente redução na taxa de crescimento das folhas, que resulta em uma
restrição na capacidade fotossintética
(MUNNS, 2002).
Sob condições de estresse, o nível
de etileno endógeno das plantas regula a homeostase vegetal, resultando na
redução de raízes e parte aérea (GLICK
et al., 2007). Como pode ser observado
na Figura 1, a biossíntese do etileno se
inicia a partir do ciclo da metionina, onde
S-adenosil-metionina (AdoMet) é convertido a 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) através da ação da enzima
ACC sintase. Posteriormente, o ACC é
utilizado como substrato da ACC oxidase, que através de uma reação com consumo de oxigênio produz o etileno (TAIZ
& ZEIGER, 2009). A enzima ACC sintase
é regulada por vários sinais, dentre eles
o próprio etileno, alguns fatores ambientais e a auxina (ETESAMI et al., 2009).
Glick et al. (1998) propôs um modelo
através do qual as PGPBs poderiam diminuir os níveis de etileno nas plantas.
Neste modelo, em resposta ao triptofano ou outras moléculas exsudadas
pelas raízes, as bactérias sintetizariam
AIA que seria utilizado pela planta. Este
AIA, em conjunto com aquele produzido
pelo vegetal, estimularia a proliferação
celular ou induziria a transcrição de
ACC sintase, aumentando a produção
de ACC. Algumas dessas moléculas de
ACC seriam absorvidas pelas bactérias
(PENROSE et al., 2001) e clivadas pela
ação da enzima ACC deaminase (Figura 1). Essa enzima, descoberta em
1978 (HONMA & SHIMOMURA, 1978),
compete com a ACC oxidase e catalisa
a clivagem do ACC a a-cetobutirato e
amônia, que é utilizada como fonte de
nitrogênio por essas bactérias (GLICK
et al., 1998). Consequentemente, essa
degradação diminui os níveis de etileno
produzidos pelas plantas. Esta redução,
em combinação com a ação de auxinas
- que podem ser produzidas pelo mesmo
microrganismo - causa um efeito consi-
Figura 1: Provável rota biossintética do etileno em plantas e a ação da enzima
ACC deaminase de bactérias (adaptado de TAIZ & ZEIGER, 2009).
18
derável no crescimento e desenvolvimento de raízes.
Mayak et al. (2004a) realizaram um
estudo de inoculação com a bactéria
Achromobacter piechaudii, isolada da
rizosfera de Lycium shawii crescida no
leito seco de um rio na região de Arava
em Israel. Em um dos tratamentos, duas
semanas após a germinação de plântulas de tomate (Solanum lycopersicum
L.), aplicou-se uma suspensão da bactéria A. piechaudii ARV8 e irrigou-se com
solução de NaCl (207 mM). Nos tratamentos controles, não houve inoculação
bacteriana e as plântulas foram irrigadas
apenas com água ou com solução de
NaCl (207 mM). Após cinco semanas
de cultivo, os autores observaram uma
redução no teor de etileno e consequentemente, um aumento de até 66%
no crescimento de plântulas de tomate
(Solanum lycopersicum L.) expostas à
alta concentração salina e inoculadas
com bactéria, quando comparadas com
as plântulas expostas à alta concentração de sal, mas sem inoculação. Esses
resultados sugerem que a enzima ACC
deaminase da bactéria foi funcional.
Na ausência de contato físico com as
raízes das plantas, algumas estirpes de
PGPBs, emitem compostos orgânicos
voláteis (VOC) que induzem a promoção do crescimento vegetal (RYU et al.,
2003; 2004). Bacillus subtilis GB03 produzem os VOCs, 3-hidroxi-2-butanona e
2,3-butanodiol, compostos determinantes
na indução da tolerância ao estresse por
essa bactéria (ZHANG et al., 2008). Esse
dado foi confirmado em um estudo recente realizado por ZHANG et al. (2008),
onde os autores observaram a indução de
tolerância a estresse salino em plantas de
Arabidopsis após a inoculação da bactéria B. subtilis GB03. Além disso, mutantes
dessa bactéria defectivas na produção
de 3-hidroxi-2-butanona e 2,3-butanodiol
não foram capazes de promover o crescimento vegetal, sob condições de estresse. Neste caso, o mecanismo relacionado
ao aumento da tolerância das plantas
ao estresse salino parece envolver o
transportador HKT1 (High Affinity K+ Na+
Transporter 1) HKT1 é um transportador
de Na+ (RUS et al., 2004que parece ajustar os níveis deste íon de modo diferencial, dependendo do tecido vegetal: nas
raízes, ele regula o influxo de Na+ (RUS et
al., 2001), enquanto que, nos tecidos da
parte aérea ele recupera Na+ do xilema,
facilitando a recirculação deste íon da
parte aérea para a raiz (DAVENPORT et
al., 2007). Sob alta concentração de sal
no solo, os VOCs bacterianos induzem
uma redução na expressão de HKT1 em
raízes, diminuindo a captação de Na+, enquanto que, nos tecidos da parte aérea, a
expressão do HKT1 é aumentada, o que ,
mantém baixo os níveis de Na+, mantendo e sustentando a recirculação deste íon
em toda a planta. Essa regulação foi comprovada após a exposição de um mutante
de Arabidopsis defectivo na produção
de HKT1 (athkt1) aos VOCs 3-hidroxi-2butanona e 2,3-butanodiol emitidos por
B. subtilis GB03. Essa exposição resultou
em fenótipos vegetais típicos de estresse
salino, como o nanismo, e levou a uma
inibição do crescimento das plântulas
(ZHANG et al., 2008).
Em estudos com Arabidopsis, verificou-se que mais de 25 VOCs bacterianos têm capacidade de alterar a expressão de aproximadamente 600 genes.
Dentre esses genes, observou-se uma
redução na transcrição do transportador
HKT1 em raízes (FARAG et al., 2006),
mais uma evidência que a percepção vegetal dos VOCs bacterianos causa uma
regulação específica de HKT1, o que
pode controlar a homeostase de Na+ sob
o estresse salino.
Yildirim e colaboradores (2008) avaliaram a alteração no peso fresco e seco
de raiz e parte aérea, percentual de emergência, teor de clorofila, número de folhas
por planta, conteúdo relativo de água na
folha e composição iônica das folhas, pro-
movidos pelas bactérias Staphylococcus
kloosii EY37 e Kocuria erythromyxa EY43
em plantas de rabanete (Raphanus sativus l.) submetidas a estresse salino. Nos
controles, sem inoculação, o tratamento
com sal diminuiu significativamente todos os parâmetros avaliados, entretanto,
os tratamentos inoculados com EY37 e
EY43, sob condições de estresse salino,
apresentaram um aumento em todos os
caracteres avaliados.
A composição iônica das folhas das
plantas de rabanete avaliadas neste estudo foi afetada significativamente pela
salinidade e pelas inoculações bacterianas. Todos os elementos analisados
decaíram substancialmente após o tratamento com a solução salina, exceto o
Na e o Cl que aumentaram consideravelmente. Portanto, a inoculação de EY37
e EY43 sob condições de salinidade,
ameniza os efeitos deletérios do estresse salino na nutrição e nos parâmetros
de crescimento de plantas de rabanete.
1.2. Aumento da tolerância
de plantas à seca
As previsões ambientais indicam um
aumento do aquecimento global nas
próximas décadas e um aumento dos
períodos de seca certamente acompanharão esse fenômeno. O estresse
causado por essa deficiência hídrica limita o crescimento e a produtividade de
diversas culturas, particularmente nas
regiões áridas e semi-áridas (KRAMER
& BOYER, 1995). O desenvolvimento de
cultivares mais tolerantes a períodos de
déficit hídrico, bem como o desenvolvimento de tecnologias que auxiliem as
plantas a tolerar períodos prolongados
de estiagem, serão essenciais para a
manutenção da produtividade agrícola
brasileira e mundial (HERRMANN & HUTCHINSON, 2005).
As respostas da planta aos estresses causados pela alta concentração
salina e pela seca são muito similares e
envolvem um grande número de mudanças metabólicas e fisiológicas; entanto,
grande parte dessas alterações não foram totalmente caracterizadas. Essas
mudanças tem com objetivo manter o
crescimento e a reprodução do vegetal,
e dependem da severidade, da duração
e da natureza do estresse, além do genótipo e do estágio de desenvolvimento
da planta. Dentre as modificações nos
mecanismos morfológicos, podemos
citar o movimento e a abscisão das
folhas, aumento da pilosidade foliar e
uma maior razão raiz: parte aérea (SUSILUOTO & BERNINGER, 2007). Esses
mecanismos visam evitar a perda de
água pelas folhas e aumentar a área
de solo explorada pelas raízes, com o
objetivo de captar mais água e nutrientes. Os mecanismos fisiológicos mais
alterados em condições de seca são a
as propriedades hidráulicas da raiz. Sob
condições de déficit hídrico moderado, a
condutividade hidráulica das raízes aumenta visando a captação de mais água
do solo (SIEMENS & ZWIAZEK, 2004).
Para tal, as plantas realizam o ajuste
osmótico, através do acúmulo de açúcar ou outras substâncias compatíveis,
como: prolinas, glicinas, manitol e sorbitol, que ajuda a manter o turgor das células. Diversas plantas transgênicas que
super-produzem tais solutos mostraram
maior tolerância à seca (CHINNUSAMY
et al., 2005). Porém, sob condições mais
severas de seca, a condutividade hidráulica das raízes decresce a fim de evitar
a perda de água pelos tecidos radiculares. Essas mudanças na condutividade
hidráulica também estão relacionadas
com a abundância de aquaporinas, canais protéicos presentes nas membranas, que facilitam a passagem de água
a favor do gradiente osmótico (AROCA
et al., 2006). Outros mecanismos fisiológicos alterados sob condições de déficit
hídrico são a transpiração e a condutância nas folhas, que diminuem e, em algumas circunstâncias, a eficiência no uso
da água, que aumenta (TAMBUSSI et
al., 2007). Com esse aumento na eficiência do uso da água ocorre uma redução
no volume de água necessário para produzir a mesma quantidade de biomassa
vegetal, um mecanismo importante para
manter o crescimento vegetal sob condições de limitação de água.
Esses mecanismos que permitem
que as plantas lidem com o déficit hídrico
são regulados através de mudanças na
expressão gênica. Os genes regulados
pela seca podem ser divididos em dois
grupos: genes funcionais, que incluem
aqueles que codificam para transportadores, enzimas detoxificadoras, e chaperonas; e genes reguladores, que co-
19
dificam para fatores de transcrição, proteínas quinases ou fosfatases e enzimas
envolvidas na biossíntese de hormônios
(SHINOZAKI & YAMAGUCHI-SHINOZAKI, 2007). A expressão da maioria
desses genes é regulada pelo ácido
abscísico (ABA) (ZHU, 2002). O ABA é
o hormônio vegetal mais envolvido na
resposta à seca (LEUNG & GIRAUDAT,
1998), sendo um ótimo candidato a mensageiro secundário na mediação entre o
sinal ambiental e as respostas moleculares, fisiológicas e/ou morfológicas no
vegetal. O déficit de água promove um
grande aumento dos níveis endógenos
de ABA em todos os órgãos da planta,
promovendo o fechamento estomático
e limitando a perda de água através da
transpiração (ZHU, 2002).
Naturalmente, as plantas interagem
com diversas PGPBs que induzem o
aumento da tolerância aos estresses
abióticos, como a seca. Em experimentos de campo, sob condições de déficit
hídrico, plantas de sorgo inoculadas com
Azospirillum apresentaram um aumento
de 15-18% no rendimento de grãos
quando comparado com as plantas não
inoculadas (SARIG et al., 1988). As
plantas inoculadas apresentaram maior
teor de água e potencial hídrico além de
possuírem menores temperaturas nas
suas folhas, quando comparado com as
plantas-controles. Por outro lado, a inoculação de Azospirillum em três espécies diferentes de cactos transplantados
em solos de deserto aumentou a taxa de
sobrevivência e desenvolvimento das
plantas (BASHAN et al., 1999).
Timmusk e Wagner (1999) mostraram que a inoculação de Paenibacillus
polymyxa aumentou a tolerância de Arabidopsis thaliana à seca. Além disso, a
transcrição do gene RAB18 (Responsive to Abscisic acid 18) foi quatro vezes
maior nas plantas inoculadas com P.
polymyxa quando comparadas às plantas-controles. A expressão desse gene é
amplamente mediada pelo ácido abscísico e induzida sob condições de déficit
hídrico. A super-expressão deste gene
resulta em um aumento da tolerância à
desidratação; entretanto, os mecanismos detalhados deste efeito ainda não
são totalmente conhecidos. É possível,
que o produto deste gene funcione como
moléculas protetoras do tipo chapero-
20
nas, combatendo danos celulares.
Sob condições de déficit hídrico,
ocorre um aumento na produção de
espécies reativas de oxigênio (ROS Reactive Oxygen Species) nos tecidos
vegetais (SHVALEVA et al., 2006). Os
compostos antioxidantes mais conhecidos e estudados são o ascorbato e a glutationa, porém algumas enzimas, como
as catalases, superóxido dismutases e
aquelas presentes no ciclo ascorbatoglutationa também agem removendo
ROS gerados durante situações de seca
(WU et al., 2006).
Em estudo de inoculação realizado
por Mayak et al. (2004b), utilizando a
bactéria Achromobacter piechaudii, observaram uma redução no teor de etileno e consequentemente, um aumento
no peso seco de plântulas de tomate
(Solanum lycopersicum L.) e pimenta
(Capsicum annuum L.) submetidas ao
déficit hídrico. Neste experimento, após
uma semana de plantio, a suspensão
bacteriana foi inoculada e a irrigação foi
interrompida 21 dias após a germinação
e retomada 33 dias depois.
O nível de etileno endógeno determina a redução de raízes e parte aérea.
Entretanto, a degradação do precursor
do etileno, o ACC, através da enzima
bacteriana ACC deaminase o nível de
etileno pode ser reduzido e a planta
recupera o crescimento normal mesmo
sob condições de estresse (JACOBSON
et al., 1994). Portanto, os resultados obtidos por Mayak et al. (2004b) sugerem
que a enzima ACC deaminase da bactéria A. piechaudii foi efetiva na alteração
dos níveis de etileno vegetal.
1.3. Aumento da tolerância
de plantas a alagamentos
Períodos de alagamentos podem
ocorrer diversas vezes durante uma
estação e podem durar de um dois dias
ou até algumas semanas. Durante este
período, o ambiente em torno da raiz rapidamente se torna anaeróbico, causando a indução da expressão da enzima
ACC sintase, o que resulta no acúmulo
de ACC nos tecidos radiculares (ELSE
& JACKSON, 1998). Sob outros tipos
de estresse, uma porção significativa do
ACC recém-sintetizado pode ser convertida em etileno nas raízes; entretanto,
isso não é possível sob condições de
alagamento, uma vez que a enzima ACC
oxidase, necessita de oxigênio para catalisar essa reação (Figura 1). O ACC
acumulado é, então, transportado para a
parte aérea, onde encontra um ambiente
aeróbico e o etileno pode ser produzido.
O aumento do nível deste fitormônio
causa epinastia, clorose das folhas, necrose e redução na produção de frutos.
Quando as plantas alagadas são
tratadas com PGPBs produtoras da enzima ACC deaminase, uma concentração muito inferior de ACC se acumula
nas raízes. Conseqüentemente, ocorre
uma redução significativa dos danos que
seriam causados à planta pelo etileno
recém-sintetizado.
1.4. Aumento da tolerância
de plantas a solos de baixa fertilidade
Obter os nutrientes dos solos em
concentrações adequadas é outro estresse abiótico que as plantas estão freqüentemente submetidas. Normalmente,
os nutrientes fósforo (P) e ferro (Fe)
estão muito abundantes nos solos, porém, a maioria encontra-se sob a forma
insolúvel, indisponível para as plantas
(STEVENSON & COLE, 1999).
Algumas PGPBs tem se mostrado
eficiente em melhorar a nutrição vegetal
disponibilizando nutrientes específicos
para as plantas, principalmente fósforo e ferro, através da solubilização de
fosfatos inorgânicos e da produção de
sideróforos, respectivamente (PODILE
& KISHORE, 2006), reduzindo, desta
forma, a necessidade e da aplicação de
fertilizantes.
A solubilização de fosfatos inorgânicos pelas PGPBs pode ocorrer através
da liberação de ácidos orgânicos, como
ácido lático, glicólico, cítrico, acético,
glucônico, málico, oxálico, succínico e
tartárico, dentre outros (KUCEY et al.,
1989), que acidificam o solo e liberam
íons solúveis monobásicos (H2PO4-)
e dibásicos (HPO4-2). Com a geração
destes íons, aumenta a forma disponível de fósforo para as plantas, e conseqüentemente amplia a sua captação
pelas mesmas (GYANESHWAR et al.,
2002). Cerca de 30 a 50% do total do
fósforo presente nos solos esta sob a
forma orgânica, que pode ser mineralizada por fosfatases ácidas e alcali-
nas das PGPBs, tornando-a disponível
para as plantas como fosfato solúvel
(GYANESHWAR et al., 2002). Vários
microrganismos estão envolvidos nesses processos, mas as bactérias se
destacam com o maior potencial para
obtenção de fosfatos solúveis, sendo
cerca de 40% das bactérias culturáveis
capazes de solubilizar P (SPAEPEN, et
al., 2009), onde os principais gêneros
são Pseudomonas, Bacillus, Rhizobium, Burkholderia, Achromobacter,
Microccocus, Aereobacter e Flavobacterium (VESSEY, 2003).As bactérias
também desenvolveram uma estratégia para uma captação mais eficiente
de Fe através da produção e secreção
de compostos orgânicos quelantes de
ferro, chamados sideróforos (do grego:
sideros, ferro e foros, transportador)
(BUYER et al., 1993). Essas moléculas
atuam do lado externo da membrana
celular, capturando moléculas de ferro
Fe+3 em solução e ligando-se especificamente aos receptores do complexo
localizados na membrana, por onde são
absorvidos e disponibilizam o ferro absorvido para o metabolismo microbiano
ou para o crescimento dos vegetais
(RAAIJMAKERS et al. 1995). A biossíntese e os mecanismos de captação
de ferro através dos sideróforos foram
intensivamente estudados em diferentes espécies de Pseudomonas, sendo
esse gênero a maior produtora dentre
as bactérias Gram negativas (DAVID
et al., 2005). Um mutante de P. fluorescens com sua produção de sideróforos
17 vezes superior à normal, apresentou
um aumento na colonização e na promoção do crescimento de feijão-mungo
(Vigna radiata) (KATIYAR & GOEL,
2004). O tratamento de sementes de
milho com as estirpes produtoras de
sideróforos Pseudomonas spp. GRP3A,
PRS9 e P. chlororaphis, promoveu o aumento na germinação, no comprimento
de raízes e parte aérea e no peso seco
das plântulas de milho (SHARMA & JOHRI, 2003).
Além de aumentar a disponibilidade
de nutrientes para as plantas através da
solubilização de fosfato e da produção de
sideróforos, as PGPBs também afetam
diretamente a habilidade dos vegetais em
adquirirem esses nutrientes do solo. Esse
processo se dá através de diversos meca-
nismos, dentre eles, a produção de substâncias - como os fitormônios - que promovem aumento do crescimento de raízes
laterais e pêlos radiculares (BAREA et al.,
1976) ampliando o volume de solo exploradas pelas raízes e, conseqüentemente,
a capacidade de captação de nutrientes.
2. perspectivas e
Considerações finais
Naturalmente, as plantas estão freqüentemente expostas a múltiplos estresses, e a sua capacidade de resposta
a esses estresses determina a sua sobrevivência. A partir de diversos resultados de pesquisas disponíveis podemos
destacar que o uso de PGPBs visando
aumentar a capacidade de tolerância
das plantas a esses estresses é uma
estratégia promissora para manutenção
dos níveis de produtividade mesmo em
condições ambientais adversas. Por
outro lado, devido aos efeitos benéficos
exercidos pelas PGPBs, diversos estudos estão testando a utilização dessas
bactérias como inoculantes visando à
conservação de produtividade mesmo
com reduzida aplicação de fertilizantes
(YANG et al., 2009).
3. Referências
Bibliográficas
AMZALLAG, G.N. Plant evolution: toward an
adaptive theory. In H.R. Lerner, (ed.) Plant
responses to environmental stresses: from
phytohormones to genome reorganization. M.
Dekker, New York, p.171-245, 1999.
AROCA, R. A.; FERRANTE, P.; VERNIERI, M.
J.; CHRISPEEL, S. Drought, abscisic acid and
transpiration rate effects on the regulation of
PIP aquaporin gene expression and abundance in Phaseolus vulgaris plants. Ann Bot, v.
98, p. 1301-1310, 2006.
BAREA, J. M.; NAVARRO, E.; MONTOYA,
E. Production of plant-growth regulators by
rhizosphere phosphate-solubilizing bacteria.
Journal of Applied Bacteriology, v. 40,
p.129-134, 1976.
BASHAN, Y.; ROJAS, A.; PUENTE, M.E.
Improved establishment and development of
three cactus species inoculated with Azospirillum brasilense transplanted into disturbed
urban desert soil. Canadian Journal of Microbiology, v. 45, p. 441-451, 1999.
BRAY, E.A.; BAILEY-SERRES, J.; WERETILNYK, E. Responses to abiotic stresses. In
Buchanan, B.B.; Gruissem, W.; Jones, R.L.
(Eds) Biochemistry & Molecular biology of
plants, American Society of Plant Physiologists, Rockville, p.1158-1203, 2000.
BRAY, E.A. Molecular responses to water deficit.
Plant Physiology, v.103, p. 1035-1040, 1993.
BUYER, J.S.; KRATZKE, M.G.; SIKORA,
L.J. A Method for detection of pseudobactin,
the siderophore produced by a plant-growthpromoting Pseudomonas strain, in the barley
rhizosphere. Applied and Environmental
Microbiology, v. 59, n. 3, p. 677-681, 1993.
CHERRY, J. H. Environmental stress in plants:
biochemical and physiological mechanisms.
Springer-Verlag, New York, 1987.
CHINNUSAMY, V.; JAGENDORF, A.; ZHU,
J-K. Understanding and improving salt tolerance in plants. Crop Science, v. 45, p. 437448, 2005.
DAT, J.F.; CAPELLI, N.; FOLZER, H.; BOURGEADE, P.; BADOT, P.M. Sensing and signalling during plant flooding. Plant Physiology
and Biochemistry, v. 42, p. 273-282, 2004.
DAVENPORT, R.J.; MUÑOZ-MAYOR, A.; JHA,
D.; ESSAH, P.A.; RUS, A.; TESTER, M. The
Na+ transporter AtHKT1 controls retrieval of Na+
from the xylem in Arabidopsis. Plant, Cell and
Environment, v. 30, p. 497-507, 2007.
DAVID, C.; HERVE, C.; NICOLAS, F.; ISABELLE, S.J.; MOHAMED, A.; FRANC, P.
The crystal structure of the pyoverdine outer
membrane receptor FpyA from Pseudomonas
aeruginosa at 3.6A resolution. Journal of Molecular Biology, v. 347, p.121-134, 2005.
DREW, M. C. Oxygen deficiency and root metabolism: injury and acclimation under hypoxia
and anoxia. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, v. 48, p.
223-250, 1997.
ELSE, M.A.; JACKSON, M.B. Transport of
1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC)
in the transpiration stream of tomato (Lycopersicon esculentum) in relation to foliar ethylene
production and petiole epinasty. Australian
Journal of Plant Physiology, v. 25, p. 453458, 1998.
ETESAMI, H.; ALIKHANI, H. A.; AKBARI, A. A.
Evaluation of plant growth hormones production
(IAA) ability by Iranian soils rhizobial strains and
effects of superior strains application on wheat
21
growth indexes. World Applied Sciences Journal, v.6, n. 11, p.1576-1584, 2009.
FARAG, M. A.; RYU, C. M.; SUMNER, L. W.;
PARÉ P. W.. Profiling of rhizobacterial emissions
reveals prospective inducers of growth promotion and induced systemic resistance in plants.
Phytochemistry, v. 67, p. 2262-2268, 2006.
GLICK, B.R.; PENROSE, D.M.; LI, J., A model for the lowering of plant ethylene concentrations by plant growth promoting bacteria.
Journal of Theoretical Biology. v. 190, p.
63-68, 1998.
GLICK, B.R.; TODOROVIC, B.; CZARNY, J.;
CHENG, Z.Y.; DUAN, J.; MCCONKEY, B. Promotion of plant growth by bacterial ACC deaminase. Critical Reviews in Plant Sciences,
v. 26, p. 227-242, 2007.
GYANESHWAR, P.; KUMAR, G. N.; PAREKH,
L. J.; POOLE, P.S. Role of soil microorganisms in improving P nutrition of plants. Plant
and Soil, v. 245, p. 83-93, 2002.
HASEGAWA, P.M.; BRESSAN, R.A.; ZHU,
J-K.; BOHNERT, H.J. Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, v. 51, p. 463-499, 2000.
HERRMANN, S.M.; HUTCHINSON, C.F. The
changing contexts of the desertification debate. Journal of Arid Environments, v. 63, n. 3,
p,538-555, 2005.
HONMA, M. & SHIMOMURA, T.; Metabolism
of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid.
Agriculture and Biological Chemistry, v.
42, p. 1825-1831, 1978.
IBA, K. Acclimative response to temperature
stress in higher plants: approaches of gene
engineering for temperature tolerance. Annual Review of Plant Physiology, v. 53, p.
225-245, 2002.
JACOBSON, C.B.; PASTERNAK, J.J.; GLICK,
B.R. Partial purification and characterization
of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase from the plant growth promoting rhizobacterium Pseudomonas putida GR12–2.
Canadian Journal of Microbiology, v. 40,
p.1019-1025, 1994.
KATIYAR, V.; GOEL, R. Siderophore-mediated plant growth promotion at low temperature
by mutant of fluorescent pseudomonad. Plant
Growth Regulation, v. 42, p. 239-244, 2004.
22
KLOEPPER, J. W.; RYU, C. M.; ZHANG, S.
Induced systemic resistance and promotion of
plant growth by Bacillus spp. Phytopathology
v.94, p.1259-1266, 2004.
KRAMER, P.J.; BOYER, J.S. Evolution and
agriculture. In: KRAMER, P. J. & BOYER, J.
S. (Eds.). Water relations of plants and soils.
San Diego : Academic, p. 377-404, 1995.
response relationships in biological control of
Fusarium wilt of radish by Pseudomonas spp.
Phytopathology, v. 85, p. 1075-1081, 1995.
RODRIGUEZ, H.; FRAGA, R. Phosphate solubilizing bacteria and their role in plant growth promotion. Biotechnology advances, v.
17, p. 319-339, 1999.
KUCEY, R.M.N.; JANZEN, H.H.; LEGGETT,
M.E. Microbially mediated increases in plantavailable phosphorus. Advances in Agronomy, v. 42, p. 199-227, 1989.
RUS, A.; LEE, B.H.; MUNOZ-MAYOR, A.;
SHARKHUU, A.; MIURA, K.; ZHU, J. K.;
BRESSAN R.A.; HASEGAWA P. M. AtHKT1
facilitates Na+ homeostasis and K+ nutrition
in planta. Plant Physiology, v. 136, p. 25002511, 2004.
LANGEBARTELS, C.; WOHLGEMUTH, H.;
KSCHIESCHAN, S.; GRUN, S.; SANDERMANN, H. Oxidative burst and cell death in
ozone-exposed plants. Plant Physiology and
Biochemistry, v. 40, p. 567-575, 2002.
RYU, C.-M.; FARAG, M. A.; HU, C.-H.; REDDY, M. S.; KLOEPPER, J. W.; PARE, P. W.
Bacterial volatiles induce systemic resistance
in Arabidopsis. Plant Physiology, v. 134,
p.1017-1026, 2004.
LERNER, H.R. (ed) Plant Responses to Environmental Stresses. From Phytohormones to
Genome Reorganization. Marcel Dekker, New
York, 1999.
RYU, C-M.; FARAG, M.A.; HU, C-H.; REDDY,
M. S.; WEI, H.X.; PARE, P.W.; KLOEPPER,
J.W. Bacterial volatiles promote growth in Arabidopsis. PNAS, v. 100, p. 4927-4932, 2003.
LEUNG, J.; GIRAUDAT, J. Abscisic acid signal
transduction. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, v. 49,
p. 199-222, 1998.
SARIG, S.; BLUM, A.; OKON, Y. Improvement
of the water status and yield of fieldgrown
grain sorghum (Sorghum bicolor) by inoculation with Azospirillum brasilense. Journal
of Agricultural Science, v.110, p. 271-277,
1988.
MAYAK, S.; TIROSH, T.; GLICK, B.R. Plant
growth-promoting bacteria confer resistance
in tomato plants to salt stress. Plant Physiology and Biochemistry, v. 42, p. 565-572,
2004a
MAYAK, S.; TIROSH, T.; GLICK, B.R. Plant
growth-promoting bacteria that confer resistance to water stress in tomatoes and
peppers. Plant Science, v. 166, p. 525-530,
2004b.
MUNNS, R. Comparative physiology of salt
and water stress. Plant, Cell and Environment, v. 25, p. 239-250, 2002.
PENROSE, D.M.; MOFFAT, B.A.; GLICK, B.R.
Determination of 1-aminocycopropane-1-carboxylic acid (ACC) to assess the effects of
ACC deaminase-containing bacteria on roots
of canola seedlings. Canadian Journal of Microbiology, v. 47, p. 77-80, 2001.
PODILE, A.R. & KISHORE, G.K. Plant growth-promoting rhizobacteria. In: GNANAMANICKAM, S. S. Plant-Associated Bacteria,
Springer. p. 195–230, 2006.
RAAIJMAKERS, J.M.; LEEMAN, M.; VAN
OORSCHOT, M.M.P.; VAN DER SLUIS, I.;
SCHIPPERS, B.; BAKKER, P.A.H.M. Dose
SCHUTZENDUBEL, A.; POLLE, A. Plant responses to abiotic stresses: heavy metalinduced oxidative stress and protection by mycorrhization. Journal of Experimental Botany,
v. 53, p.1351-1365, 2002.
SHARMA, A.; JOHRI, B.N. Growth promoting
influence of siderophore-producing Pseudomonas strains GRP3A and PRS9 in maize
(Zea mays L.) under iron limiting conditions.
Microbiological Research, v. 158, p. 243248, 2003.
SHINOZAKI K.; YAMAGUCHI-SHINOZAKI
K. Gene networks involved in drought stress
response and tolerance. Journal of Experimental Botany, v. 58, n. 2, p. 221-227, 2007.
SHVALEVA, A. L.; SILVA, F. C. E.; BREIA, E.;
JOUVE, L.; HAUSMAN, J. F.; MAROCO, J. P.;
RODRIGUES, M. L.; PEREIRA, J. S.; CHAVES, M. Metabolic responses to water deficit
in two Eucalyptus globus clones with contrasting drought sensitivity. Tree Physiology v. 26,
p.239-248, 2006.
SIEMENS, J. A. & ZWIAZEK, J. J. Changes in
root water flow properties of solution culture-gro-
wn trembling aspen (Populus tremuloides) seedlings under different intensities of water-deficit
stress. Physiol. Plant. v.121, p. 44–49, 2004.
SPAEPEN, S.; VANDERLEYDEN, J.; OKON,
Y.; Plant Growth-Promoting Actions of Rhizobacteria. In VAN LOON, L. C. (ed) Advances
in Botanical Research, Burlington: Academic
Press, v. 51, p. 283-320, 2009.
STEVENSON, F. J. & COLE, M. A. Cycles of
soil: carbon, nitrogen, phosporus, sulfur and
micronutrients. New York, John Wiley & Sons,
427p, 1999.
STRATMANN, J. Ultraviolet-B radiation coopts defense signaling pathways. Trends in
Plant Science, v. 8, p. 526-533, 2003.
drought responses in Eucalyptus microtheca.
Silva Fenn, v. 41, p. 221-233, 2007.
resource-based view. In: Industrial Marketing
Management, v. 35, p. 493-504, 2005.
TAIZ, L.; ZEIGER, E. Fisiologia vegetal. 3. ed.
Porto Alegre: Artmed, 2009. 719p.
YANG. J.; KLOEPPER. J.W.; RYU, C-M. Rhizosphere bacteria help plants tolerate abiotic
stress. Trends in Plant Science, v.14, n. 1,
p.1-4, 2009.
TAMBUSSI, E.A.; BORT, J.; ARAUS, J.L. Water use efficiency in C3 cereals under Mediterranean conditions: a review of physiological
aspects. Annals of Applied Biology, v. 150, p.
307-321, 2007.
TIMMUSK, S.; WAGNER, E. G. H. The plantgrowth-promoting rhizobacterium Paenibacillus polymyxa induces changes in Arabidopsis
thaliana gene expression: a possible connection between biotic and abiotic stress responses. Molecular Plant-Microbe Interactions, v.
12, p. 951-959, 1999.
SUNG, D-Y.; KAPLAN, F.; LEE, K-J.; GUY,
C.L. Acquired tolerance to temperature extremes. Trends in Plant Science, v. 8, p.
179-187, 2003.
VESSEY, J.K. Plant growth promoting rhizobacteria as biofertilizers. Plant Soil, v. 255, p.
571-586, 2003.
SUSILUOTO, S.; BERNINGER, F. Interactions
between morphological and physiological
WU, F.; YENIYURT, S.; KIM, D.; CAVUSGIL, S.
The impact of information technology on supply chain capabilities and firm performance: a
YILDIRIM, E.; TURAN, M.; DONMEZ, M.F.
Mitigation of salt stress in radish (Raphanus
Sativus l.) by plant growth promoting rhizobacteria. Biotechnological Letters, v. 13, n.
5, p. 3933-3943, 2008.
ZHANG, H.; KIM, M-S.; SUN, Y.; DOWD, S.
E.; SHI, H.; PARÉ, P. W. Soil Bacteria Confer Plant Salt Tolerance by Tissue-Specific
Regulation of the Sodium Transporter HKT1.
Molecular Plant-Microbe Interactions, v. 21,
n. 6, p. 737-744, 2008.
ZHU, J-K; Salt and drought stress signal
transduction in plants. Annual Review of
Plant Physiology, v. 53, p. 247-273, 2002.
ZHUANG, X.; CHEN, J.; SHIM, H.; BAI, Z.
New advances in plant growth-promoting rhizobacteria for bioremediation. Environment
International, v. 33, p. 406-413, 2007.
23
Ciência in Foco
GENÉTICA DE CIANOTOXINAS
Marli Fátima Fiore
Universidade de São Paulo, Divisão de Produtividade
Agroindustrial e Alimentos, Piracicaba, SP - Brasil.
Danillo Oliveira Alvarenga e Maria Estela Silva-Stenico
Universidade de São Paulo, Centro de Energia
Nuclear na Agricultura, Piracicaba, SP - Brasil
Introdução
Cianotoxinas são biotoxinas, produzidas por diversos gêneros de cianobactérias, altamente tóxicas para humanos
e outros animais. A ingestão dessas toxinas pode ser pelo consumo de águas
ou alimentos contaminados. De acordo
com o seu efeito biológico elas são classificadas como: hepatotoxinas (microcistinas e nodularinas), neurotoxinas
(saxitoxinas, anatoxina-a, anatoxinaa(S) e homoanatoxina-a), citotoxinas
(cilindrospermopsina), toxinas irritantes
e gastrointestinais (aplisiatoxina, debromoaplisiatoxina e lyngbyatoxina), endotoxinas lipopolissacarídicas e outras
cianotoxinas cujos perfis toxicológicos
e ecotoxicológicos são ainda parcialmente conhecidos (microviridinas J e o
aminoácido BMAA, i.e., β-N-metilaminoL-alanina).
Microcistina, saxitoxina, anatoxina-a
e anatoxina-a(S) já foram encontradas
em isolados de cianobactérias que colonizam diversos ambientes brasileiros
(Figura 1). A maioria dessas cianotoxinas é formada por substâncias de estrutura peptídica, as quais são elaboradas
por um mecanismo enzimático paralelo
à síntese proteica. Trata-se da síntese
não-ribossômica de peptídeos (Figura 2), uma via biossintética bastante utilizada por microrganismos na produção
24
de antibióticos e toxinas (Marahiel et al.,
1997; von Döhren et al., 1997). A síntese
não-ribossômica utiliza uma grande variedade de substratos, muitos dos quais
são aminoácidos não-proteicos, hidroxiácidos e substâncias policetônicas,
especialmente elaborados para serem
incorporados na estrutura peptídica. Portanto, na estrutura de uma mesma toxina
observa-se ligações peptídicas, funções
cetônicas, insaturações e funções aromáticas. A biossíntese microbiana de
peptídeos não-ribossomais é catalisada
por enzimas conhecidas como peptídeo
sintetase não-ribossômica (NRPS, do
inglês “non-ribosomal peptide synthetase”) e policetídeo sintase tipo I (PKS, do
inglês “polyketide synthase”). Estas enzimas são caracterizadas por um arranjo
modular dos genes que as codificam e
contem sequências altamente conservadas. Na biossíntese das cianotoxinas
os genes de NRPSs e PKSs geralmente
estão agrupados. Durante a última década, as vias biossintéticas de quatro
cianotoxinas foram geneticamente e quimicamente elucidadas. A primeira cianotoxina a ter o seu agrupamento gênico
descrito foi a microcistina, em 2000, e
este foi também o primeiro agrupamento
complexo de metabólito a ser completamente sequenciado em cianobactéria (Tillett et al., 2000). Em seguida, os
agrupamentos gênicos da nodularina
(Moffitt & Neilan, 2004), cilindrospermopsina (Mihali et al., 2008) e saxitoxina
(Kellmann et al., 2008a) foram identificados. A síntese de saxitoxina é a primeira
via de alcaloide não terpênico descrita
em bactérias. Portanto, este artigo descreve por ordem cronológica de elucidação os quatros agrupamentos gênicos
de cianotoxinas, que por mutação ou por
predição funcional, foram demonstrados
ser necessários para a produção desses
notáveis metabólitos produzidos pela
Figura 1. Cianobactérias isoladas de diversos biomas brasileiros. A) Microcystis aeruginosa; B) Anabaena crassa; C) Cylindrospermopsis raciborskii; D)
Nodularia sp.
Figura 2. Ilustração esquemática das vias biossintéticas ribossômica e nãoribossômica de peptídeos.
síntese não-ribossômica.
Microcistinas
Microcistinas são heptapeptídeos
cíclicos com massa molecular variando
geralmente entre 800 e 1100 Da, cujo
mecanismo tóxico é a inibição específica das proteínas fosfatases da família serina/treonina, especialmente as
fosfatases tipo 1 (PP1) e 2A (PP2A) de
células procarióticas. As microcistinas
acumulam-se em células do fígado de
vertebrados devido ao transporte ativo
por meio de um transportador de ânion
orgânico não específico altamente expresso (sistema de transporte carreador
de ácido biliar). A morte dos animais
vertebrados é na maior parte das vezes
consequência do dano severo no fígado,
que começa com a desorganização do
citoesqueleto e pode incluir inchamento
celular, ruptura celular, peroxidação de
lipídeos, perda da integridade da membrana, danos no DNA, apoptose, necrose, hemorragia intra-hepática e enfim,
morte por choque hemorrágico. A DL50
da microcistina-LR, a isoforma mais comum, determinada em camundongos foi
de 50 µg/kg de massa corporal (Krishnamurthy et al., 1986), enquanto que foi
necessário 600 µg/kg de massa corporal
da isoforma rara microcistina-RR para
produzir o mesmo efeito letal (Watanabe
et al., 1988).
Bioensaios realizados nos anos 50
com células coletadas em florações com
predominância de Microcystis aeruginosa mostraram a presença de uma toxina
que causava sérios danos ao fígado dos
animais testados (Hughes et al., 1958).
Essa toxina foi isolada e identificada no
ano seguinte em uma cultura de M. aeruginosa (Bishop et al., 1959). Entretanto,
somente em 1984 sua estrutura química
foi elucidada (Botes et al., 1984). Até o
momento, representantes dos gêneros
Microcystis, Phormidium, Planktothrix,
Anabaena, Nostoc, Hapalosiphon e Fischerella, foram identificados como produtores de microcistinas. Existem aproximadamente 90 variantes estruturais de
microcistina descritas, as quais possuem
em comum a estrutura cíclica D-Ala-L-XD-MeAsp-L-Z-Adda-D-Glu-Mdha, onde
Adda é o ácido 3-amino-9-metoxi-26,8-trimetil-10-fenil-4,6-decadienóico, DMeAsp é o ácido 3-metil-aspártico, Mdha
é N-metildeidroalanina e L-X e L-Z são
posições de aminoácidos variáveis que
contribuem para as diferentes isoformas
(Honkanen et al., 1990; Rinehart et al.,
1994). A produção de várias isoformas
de microcistinas por uma única linhagem de Microcystis é comum. Embora
várias isoformas de microcistinas possam ser produzidas ao mesmo tempo, a
microcistina-LR, uma das mais tóxicas,
é a que tem sido mais estudada. Assim
sendo, os estudos moleculares visando
identificar os genes biossintéticos de cianotoxinas foram iniciados com a espécie
M. aeruginosa, produtora de microcistina-LR. Em 1996, um estudo utilizando os
oligonucleotídeos iniciadores degenerados coreI e coreII (Borchert et al., 1992),
construídos para amplificar sequências
do domínio de adenilação da NRPS,
iniciou a busca de sequências homólogas em linhagens tóxicas e não tóxicas
de M. aeruginosa (Meiβner et al., 1996).
Como resultado obteve-se um fragmento
de DNA de aproximadamente 200 pares
de bases (pb) que mostrou significante
similaridade com regiões correspondentes de genes de NRPSs. Em seguida,
regiões de DNA adjacentes a esse fragmento foram isoladas e sequenciadas a
partir da construção de uma biblioteca
genômica da linhagem tóxica M. aeruginosa HUB524. Assim, foi possível isolar um fragmento de DNA de 2.982 pb,
denominado mapep1, que mostrou alta
identidade com um módulo completo de
NRPS, o qual hibridizou exclusivamente
com DNAs de linhagens produtoras de
hepatotoxinas. Dois iniciadores específicos para amplificar esse fragmento de
DNA foram construídos e testados em
linhagens tóxicas e não tóxicas de Microcystis. Os resultados mostraram que
entre as linhagens testadas somente as
tóxicas continham o segmento de DNA
de interesse, sugerindo o envolvimento
dessa região codificadora de peptídeos
sintetases na produção de microcistinas
(Dittmann et al., 1996). Esses autores
também sequenciaram mais regiões em
ambas as extremidades do fragmento de
DNA mapep1 e observaram que a M. aeruginosa HUB524 apresentava mais de
um módulo de NRPS. Para comprovar
o envolvimento dessa região na produção de microcistinas, foi produzido um
mutante da M. aeruginosa PCC7806
por meio da inserção de um cassete de
resistência a cloranfenicol na sequência
mapep1, o que inativou a NRPS nesta
cianobactéria (Dittmann et al., 1997). A
análise desse mutante mostrou que ele
era incapaz de produzir microcistinas,
comprovando o envolvimento da NRPS
na biossíntese destas toxinas. Esses
autores denominaram os dois genes de
NRPS caracterizados parcialmente de
mcyA e mcyB. O cassete de resistência
ao antibiótico na linhagem mutante foi
introduzido no domínio de adenilação
do mcyB. Como nenhuma variante de
25
microcistina foi produzida por esse mutante, sendo que a linhagem selvagem
era capaz de sintetizar várias isoformas,
sugeriu-se que esse módulo de NRPS
não tinha uma alta especificidade para
substrato, sendo possivelmente um dos
responsáveis pela introdução de aminoácidos variáveis. Em seguida, foi desenvolvido um conjunto de oligonucleotídeos iniciadores (FAA/RAA) tendo como
alvo uma região menos conservada do
domínio de adenilação do mcyB, o qual
foi específico o suficiente para amplificar
fragmentos de genes da microcistina de
um número razoável de cianobactérias
produtoras destas toxinas (Neilan et al.,
1999). O fragmento de DNA de 758 pb
obtido com esse conjunto de iniciadores foi utilizado para selecionar dentro
de uma biblioteca λ Zap de M. aeruginosa PCC7806 um clone contendo um
fragmento de 7 kb do agrupamento de
genes denominado mcy (Tillett et al.,
2000). O restante da sequência do mcy
foi obtido por esses autores utilizando a
abordagem ‘walking PCR’. No total, 63,6
kb do agrupamento mcy e regiões adjacentes foram isolados da M. aeruginosa
PCC7806. Dessa forma o agrupamento
mcy de 55 kb localizado no cromossomo foi inteiramente identificado. Esse
agrupamento gênico contém 10 genes
(mcyA-mcyJ) (Figura 3), organizados
em dois operons transcritos em direção
oposta, mcyA-C e mcyD-J. O maior dos
dois operons, mcyD-J, codifica uma PKS
modular (McyD), duas enzimas híbridas
contendo módulos NRPS e PKS (McyE
e McyG), e enzimas complementares
(McyJ, F e I) e de transporte (McyH) da
toxina. O menor operon, mcyA-C, codifica três NRPSs (McyA-C).
As análises de bioinformática e a
similaridade com enzimas análogas indicaram que a formação do Adda supostamente envolve enzimas codificadas por
mcyD-mcyG e mcyJ (Figura 3). A enzima
híbrida NRPS/PKS, McyG, constitui o
primeiro passo na biossíntese do Adda.
A hipótese inicial era de que o módulo
NRPS da McyG ativava o fenilacetato,
no entanto, posteriormente, a caracterização bioquímica do didomínio A-PCP
(Adenilação – proteína carreadora de
peptidila), localizado no N-terminal da
McyG, revelou que fenilpropanoides variados são preferencialmente ativados
26
Figura 3. Agrupamento gênico de hepatotoxinas de algumas cianobactérias.
(Adaptado de Dittman & Börnen, 2005).
e ligados na PCP (Hicks et al., 2006).
Após a ativação, a unidade iniciadora fenilpropanoide é estendida por várias etapas de alongamento do malonil-CoA e,
subsequentemente, modificada pela Cmetilação, redução e desidratação, tudo
catalisado pelos módulos PKS das enzimas McyD, McyE e McyG. O domínio da
aminotransferase da McyE, então, converte o policetídeo em um β-aminoácido
na etapa final da biossíntese do Adda.
O módulo NRPS da segunda enzima híbrida PKS/NRPS, McyE, supõe-se estar
envolvido na ativação e condensação da
D-Glu com o Adda.
O gene mcyF foi originalmente predito como codificador de uma glutamato
racemase, responsável pela epimerização do resíduo de L-Glu da microcistina
(Tillett et al., 2000). Um estudo subsequente (Sielaff et al., 2003) confirmou
essa teoria, e propiciou evidências de
que McyF atua exclusivamente como
uma aspartato racemase. Esses autores propuseram que o resíduo de D-Glu
é fornecido por uma racemase L-Glu
localizada fora do agrupamento gênico
mcy. Experimentos de mutagênese em
Planktothrix agardhii mostraram que a
produção do Adda também envolve uma
etapa de O-metilação catalisada pela
suposta enzima complementar monofuncional, McyJ (Christiansen et al., 2003).
As enzimas restantes da via biossintética da microcistina (NRPSs) estão supostamente envolvidas na ativação específica, modificação e condensação do
substrato aminoácido da cadeia peptídica linear, a qual é então ciclizada para
produzir microcistina. Primeiramente,
McyA adiciona L-Ser na cadeia crescente, seguida pela adição de D-Ala. Esta
etapa é seguida pela adição dos resíduos de L-Leu e D-MeAsp (McyB), seguida
pela adição de L-Arg (McyC), e posterior
ciclização e liberação do produto peptídeo final (Figura 4).
A outra enzima, a 2-hidroxi-ácido
desidrogenase, McyI, está supostamente envolvida na produção de D-metilaspartato na posição três da estrutura cíclica da microcistina pela conversão do
3-metilmalato em 3-metiloxalacetato.
Em seguida, uma aspartato aminotransferase converte 3-metiloxalacetato em
metilaspartato (Pearson et al., 2007).
Um gene transportador ABC, mcyH,
acredita-se estar envolvido no transporte da microcistina (Pearson et al.,
2004). Esse gene pode ser responsável
Figura 4. Via biossintética da microcistina-LR. (Adaptado de Tillett et al., 2000).
pela localização da toxina no tilacoide
(Shi et al., 1995; Young et al., 2005)
ou pela extrusão da toxina sob certas
condições de crescimento, incluindo a
exposição à luz alta e vermelha (Kaebernick et al., 2000).
Posteriormente, os agrupamentos
gênicos envolvidos na produção de
microcistina em Planktothrix agardhii
CYA126/8 (Christiansen et al. 2003) e
Anabaena 90 (Rouhiainen et al., 2004)
foram relatados (Figura 4). A comparação desses agrupamentos gênicos
responsáveis pela produção de microcistinas nos três diferentes gêneros
de cianobactéria, ou seja, Microcystis,
Planktothrix e Anabaena, mostrou que
a maioria dos genes estava numa ordem diferente, nem todos os genes
estavam presentes nos três organismos e a identidade entre os genes foi
baixa. Isso indica que há necessidade
de caracterizar esses genes para cada
organismo.
Nodularina
Nodularina é um pentapeptídeo cíclico
com estrutura química similar à microcistina. Nodularina difere da microcistina pela
falta do aminoácido D-Ala e do X, além de
ter o resíduo Mdhb (N-metil-deidrobutirino) no lugar de Mdha. Assim, a estrutura
da nodularina (D-MeAsp-L-Arg-Adda-DGlu-Mdhb) é menor, apresentando massa
molecular de 824 Da. O grupo funcional
Adda, que é o principal responsável pela
toxicidade da microcistina, está também
presente na nodularina e, portanto, o seu
mecanismo de lesão e patologia do fígado é similar aos da microcistina, principalmente induzindo à hepatotoxicidade. A
nodularina, portanto, também atua como
inibidor das proteínas fosfatases da família serina/treonina, especialmente as
fosfatases tipo 1 (PP1) e 2A (PP2A) de
células eucarióticas. A DL50 intraperitoneal
em camundongos varia entre 50 a 200
µg/kg de massa corpórea (Rinehart et
al., 1994).
O primeiro relato na literatura científica de intoxicações em animais causados por Nodularia spumigena é de 1878
e ocorreu na Austrália (Francis, 1878).
Entretanto, somente após mais de 100
anos a toxina nodularina produzida por
uma floração de N. spumigena da Nova
Zelândia foi identificada e sua estrutura química elucidada (Rinehart et al.,
1988). Essa toxina é encontrada somente em algumas linhagens de cianobactérias do gênero Nodularia e, no Brasil,
uma linhagem não tóxica desse gênero
foi isolada recentemente pela primeira
vez de um riacho próximo a Ouro Preto,
MG (Rosane Aguiar, UFV, comunicação
pessoal). Atualmente, existem menos
de 10 variantes de nodularina descritas.
Em 1999 as primeiras sequências
gênicas responsáveis pela produção
de nodularina foram descritas (Neilan
et al., 1999). Os produtos de PCR foram obtidos utilizando DNA genômico
da N. spumigena PCC73104 tóxica e
27
Figura 5. Via biossintética da nodularina. (Adaptado de Moffitt & Neilan, 2004).
oligonucleotídeos iniciadores degenerados (MRF2/MTR), construídos para
NRPS, e também com o conjunto FAA/
RAA, construído a partir de uma região
do mcyB de Microcystis. Concluiu-se
que essa cianobactéria continha genes
de NRPS, o que era previsto, uma vez
que nodularina possui estrutura química semelhante à das microcistinas.
Sequências de genes codificadores de
NRPSs e PKSs de nodularina foram obtidas posteriormente e mostraram alta
similaridade com sequências dos genes
mcyC e mcyD, respectivamente, de microcistinas (Moffitt & Neilan, 2001). Em
2004, o agrupamento gênico, nda, da
biossíntese de nodularina da N. spumigena NSOR10 foi sequenciado e caracterizado (Moffitt & Neilan, 2004). A região
de 48 kb do genoma é constituído por
nove genes (ndaA-I) transcritos de uma
região promotora regulatória bidirecional (Figura 3). Enquanto a maioria dos
genes nda tem similaridade com genes
28
do agrupamento mcy, a sua disposição
está mais próxima da norma de colinearidade da via NRPS que prevê que a
ordem dos processos catalíticos envolvidos na biossíntese de um metabólito
não-ribossomal é geralmente o mesmo
que a ordem dos genes que codificam
as suas enzimas catalíticas (Kleinkauf &
von Döhren et al., 1996).
A via proposta para a biossíntese de
nodularina é semelhante ao de microcistina. As atribuições funcionais das enzimas
foram baseadas em análises de bioinformática e similaridade com as enzimas
de microcistina. A cadeia lateral Adda é
produzida via uma NRPS/PKS híbrida a
partir do substrato fenilacetato e várias
extensões do malonil-CoA (NdaC, NdaD
e NdaF) (Figura 5). O módulo NRPS do
NRPS/PKS híbrido, NdaF, subsequentemente adiciona D-Glu na cadeia crescente. Duas enzimas NRPS, NdaA e NdaB,
completa o pentapeptídeo cíclico, adicionando os resíduos de aminoácidos finais,
L–Thr, D–MeAsp e L–Arg. Os módulos
NRPS responsáveis pela ativação do
D–Ala e D–Leu em mcy (McyA e McyB)
estão ausentes na nda, pois nodularina
não possui estas porções. As proteínas
NRPS e PKS requerem modificação
pós-traducional por uma fosfopanteteinil transferase (PPT). A PPT necessária
para ativação das proteínas Nda não está
agrupada com os outros genes nda e em
N. spumigena NSOR10 ela foi identificada utilizando PCR degenerado e subsequente caracterização enzimática funcional (Copp et al., 2007).
O agrupamento nda também codifica
várias supostas enzimas complementares monofuncionais que podem desempenhar papel na modificação e transporte de nodularina. O gene ndaE codifica
uma O-metiltransferase, ndaG codifica
uma suposta L-Asp/L-Glu racemase e
ndaI codifica um transportador ABC. Ainda dentro do agrupamento nda também
foi encontrado um gene codificante de
uma enzima similar à D-3-fosfoglicerato
desidrogenase, NdaH, que compartilha
71% de identidade com McyI. É provável, portanto, que NdaH esteja envolvida
na produção de D-MeAsp (Pearson et
al., 2007).
Cilindrospermopsina
A cilindrospermopsina é um alcaloide
que contém uma porção guanidino central funcional e uma hidroximetil uracila
ligada a um esqueleto de carbono tricíclico, com massa molecular de 415 Da.
Essa toxina tem efeitos hepatotóxicos,
citotóxicos e neurotóxicos, além de ser
um potencial carcinogênico. A toxicidade
de cilindrospermopsina é mediada pela
inibição da glutationa da síntese proteica
e do citocromo P450, sendo que nos mamíferos, o envenenamento pode causar
danos no fígado, rim, baço, coração e
outros órgãos.
Essa toxina foi identificada pela primeira vez em 1979 quando 148 indígenas da Ilha de Palm em Queensland,
Austrália, foram hospitalizados com
sintomas de hepatoenterite após a ingestão de água da represa Solomon,
sendo este incidente associado com a
presença de floração de Cylindrospermopsis raciborskii (Hawkins et al., 1985).
Posteriormente, a estrutura dessa toxina
foi identificada e ela recebeu o nome
de cilindrospermopsina (Ohtani et al.,
1992). Desde então, além de representantes do gênero Cylindrospermopsis,
a cilindrospermopsina já foi encontrada
em linhagens dos gêneros Aphanizomenon, Umezakia, Raphidiopsis, Anabaena
e Lyngbya.
Em 2000, foi proposto que guanidinoacetato era o substrato inicial para
a enzima PKS, sendo que sucessivas
adições de cinco unidades intactas de
acetato na guanidinoacetato e reações
complementares, tais como C-metilação,
sulfotransferência e ciclização completavam a biossíntese da cilindrospermopsina (Burgoyne et al., 2000). Em 2002, três
genes, aoaA, aoaB e aoaC, supostamente envolvidos na biossíntese de cilindrospermopsina foram identificados em
Aphanizomenon ovalisporum, os quais
codificavam as enzimas amidinotransferase, NRPS/PKS híbrida e PKS, respectivamente (Shalev-Alon et al., 2002). Em
2008, o agrupamento gênico da biossíntese da cilindrospermopsina (cyr) da C.
raciborskii AWT205 foi completamente
sequenciado (Mihali et al., 2008). Esse
agrupamento possui 43 kb e contém 15
genes que codificam todas as funções
necessárias para a biossíntese, regulação e exportação da toxina (Figura 6). O
primeiro passo na formação do esqueleto de carbono da cilindrospermopsina
envolve a síntese de guanidinoacetato
pela transamidinação da glicina (Figura
7). Uma amidinotransferase codificada
pelo gene cyrA, transfere um grupo guanidino da arginina para a glicina formando guanidinoacetato. Na segunda etapa,
uma NRPS/PKS híbrida codificada pelo
gene cyrB ativa o guanidinoacetato, que
é então transferido, via PCP, para o domínio β-cetossintase (KS). O domínio
aciltransferase (AT) da CyrB ativa o malonil-CoA e liga-o à proteína carreadora
de acila (ACP). Em seguida, no domínio
KS, ocorre uma reação de condensação
entre o guanidinoacetato ativado e o
malonil-CoA. O domínio da metiltransferase (MT) identificado em CyrB realiza a
metilação do C-13. A CyrB contém dois
módulos de redução, cetorredutase (KR)
e desidratase (DH). Essas duas reações
combinadas reduzem o grupo ceto a
uma hidroxila, seguido pela eliminação
de H2O, resultando em uma dupla liga-
Figura 6. Agrupamento gênico da cilindrospermopsina.
(Adaptado de Mihali et al., 2008).
ção entre C-13 e C-14. Um ataque nucleofílico do grupo amidino no N-19 na
recém formada ligação dupla entre C-13
e C-14, ocorre via a reação de adição de
Michael. A ciclização segue as regras de
Baldwin para o fechamento do anel (Baldwin et al., 1977), resultando na formação do primeiro anel da cilindrospermopsina. Essa reação pode ser espontânea
e não exigir a catálise enzimática, pois é
energeticamente favorável.
A terceira etapa da biossíntese da cilindrospermopsina envolve o gene cyrC,
que codifica uma PKS com domínios KS,
AT, KR e ACP. A ação desses domínios
resulta no alongamento da cadeia crescente por um acetato via ativação do
malonil-CoA pelo domínio AT, sua transferência para o ACP e condensação no
domínio KS com o produto da CyrB. A
cadeia alongada é ligada ao ACP da
CyrC e o domínio KR reduz o grupo
ceto a um grupo hidroxila no C-12. Em
seguida à catálise da enzima CyrC está
a CyrD, uma enzima PKS. A ação desse
módulo PKS no produto da CyrC resulta
na adição de um acetato e redução do
grupo ceto no C-10 a uma hidroxila e
desidratação de uma dupla ligação entre
C-9 e C-10. Essa dupla ligação é o sítio
de um ataque nucleofílico pelo amidino
grupo N-19 via outra reação de adição
de Michael que também segue as regras
de Baldwin para o fechamento do anel,
resultando na formação do segundo anel
da cilindrospermopsina. O intermediário
produzido por CyrD é o substrato para
CyrE (etapa 5). A enzima PKS, CyrE,
catalisa a adição de um acetato e a formação de uma dupla ligação entre C-7
e C-8. Essa dupla ligação é atacada por
N-18 via uma reação de adição de Michael, ocorrendo a terceira ciclização. O
gene cyrF codifica o último módulo PKS,
contendo apenas uma KS, AT e ACP. A
enzima CyrF atua no produto da CyrE e
alonga a cadeia pela adição de um acetato, deixando C-4 e C-6 não reduzidos.
A etapa 7 envolve a formação do anel
uracila, o qual é crucial para a toxicidade da cilindrospermopsina. Essa etapa
consiste de duas enzimas CyrG e CyrH
que são mais semelhantes às enzimas
da família amido-hidrolases/ureases/
di-hidro-orotases, cujos membros catalisam a formação e clivagem de ligações
N-C. Essas enzimas transferem um se-
29
gundo grupo guanidino de uma molécula
doadora, tal como a arginina ou ureia,
para C-6 e C-4 da cilindrospermopsina
resultando na formação do anel uracila.
A primeira reação consiste na formação
de uma ligação covalente entre o N do
doador guanidino e C-6 da cilindrospermopsina, seguida pela eliminação de
H2O, formando uma dupla ligação entre
C-5 e C-6. A segunda reação catalisa a
formação de uma ligação entre o segundo N do doador guanidino e C-4 da cilindrospermopsina, concomitantemente
com a quebra da ligação tioéster entre
a ACP da CyrF e cilindrospermopsina,
causando a liberação da molécula do
complexo enzimático. A terceira reação
catalisa a clivagem do grupo guanidino
de uma molécula doadora outra que não
ureia. A ação de CyrG e CyrH na formação do anel uracila em cilindrospermopsina descreve uma nova via de biossíntese de pirimidina.
A sulfatação da cilindrospermopsina no C-12 é provavelmente realizada
pela ação de uma sulfotransferase. O
gene cyrJ codifica uma proteína que é
muito semelhante à 3´fosfoadenosina5’-fosfossulfato (PAPS) sulfotransferasedependente. Enzimas similares foram
recentemente relacionadas com a sulfatação de outras cianotoxinas (Kellmann
et al., 2008a). O agrupamento gênico
da cilindrospermopsina também codifica uma adenilsulfato quinase (ASK), ou
seja, CyrN. ASKs são enzimas que catalisam a formação de PAPS, que é o doador de sulfato para as sulfotransferases.
A CyrJ sulfata a cilindrospermopsina no
C-12 enquanto a CyrN cria o “pool” de
PAPS requerido para essa reação. A
reação final complementar é realizada
pela CyrI, a qual supostamente catalisa
a hidroxilação de C-7, um resíduo que,
juntamente com o anel de uracila, confere a toxicidade da cilindrospermopsina.
O agrupamento gênico da cilindrospermopsina contém ainda o gene cyrK,
cujo produto se assemelha à enzima
MATE (multidrogas e extrusão de substâncias tóxicas) da família de NorM.
CyrK poderia, então, funcionar como
uma transportadora de cilindrospermopsina, com base nessa similaridade e na
sua localização central no agrupamento.
Outro gene encontrado na extremidade
3’ da cilindrospermopsina é o cyrO. Ele
30
Figura 7. Via biossintética da cilindrospermopsina.
(Adaptado de Mihali et al., 2008).
codifica uma proteína hipotética que
apresenta similaridade com as proteínas
repetitivas WD, as quais têm diversos
papéis regulatórios e de transdução de
sinais. CyrO também pode ter um papel
importante na regulação da transcrição
e na ligação do DNA. Ela também tem
similaridade com proteínas da família
AAA, que frequentemente desempenham funções semelhantes às chaperonas e ajudam na montagem, operação
ou desmontagem de complexos proteicos. Outras suposições sobre o papel da
CyrO são prejudicadas devido à baixa
similaridade de sequência com outras
proteínas dos bancos de dados.
Saxitoxinas
As saxitoxinas são alcaloides, de
baixa massa molecular (menor que 500
Da), que atuam como potentes bloqueadores de canais de sódio voltagemdependente, presentes nas membranas
de células neuronais (Kao & Levinson,
1986). Elas podem ainda bloquear canais de cálcio (Su et al., 2004) e também
prolongar o bloqueio dos canais de potássio nas células musculares do coração (Wang et al., 2003). Assim, as saxitoxinas impedem a propagação normal
dos impulsos nervosos nos músculos,
causando paralisia e podem causar a
morte por meio de parada respiratória e
asfixia (Carmichael, 1994). A DL50 intraperitoneal em camundongos foi determinada como sendo de 10 µg/kg de massa
corporal (Halstead & Schantz, 1984) enquanto que a morte de humanos ocorreu
após ingestão de 1 mg da toxina (Evans,
1969). As saxitoxinas têm afetado os
humanos por muitos anos via o fenômeno conhecido como envenenamento paralisante por mariscos (“Paralytic
Shellfish Poisoning” – PSP), intoxicação
mediada por moluscos, tais como amêijoas, ostras, assim como alguns crustáceos e peixes (Llewellyn, 2006). Numa
estimativa anual global, as saxitoxinas
foram responsáveis por 2.000 casos de
envenenamento, com uma mortalidade
de 15% (Hallegraeff, 1995). Saxitoxina é
2.000 vezes mais tóxica que cianeto de
sódio e 100 vezes mais venenosa que
estricnina (Wang et al., 2003).
O nome saxitoxina é derivado de um
gênero de amêijoa-amarela do Alasca, a
Saxidomus giganteus, que apresentava
níveis recorrentes de contaminação e de
onde a toxina foi purificada pela primeira vez (Schantz et al., 1957). Posteriormente, verificou-se que essa toxina era
produzida por dinoflagelados marinhos
(Schantz et al., 1966) e no final dos anos
60, por cianobactérias (Jackim & Gentile,
1968; Sawyer et al., 1968). A elucidação
de sua estrutura por cristalografia de
raio-X ocorreu há mais de 35 anos por
dois grupos de pesquisa independentes
(Bordner et al., 1975; Schantz et al.,
1975). A saxitoxina é um alcaloide tetrahidropurina com dois grupos guanidínicos que pode sofrer substituições em várias posições resultando na síntese natural de mais de 30 variantes (Llewellyn,
2006). As variantes pertencem ao grupo
de carbamoil ou carbamatos (saxitoxinas, neossaxitoxinas, goniautoxinas
1-4), N-sulfocarbamoil (goniautoxinas 5
e 6, C 1-4) e decarbamoil, como também algumas modificações resultantes
de sulfatação nas posições R2 e R3.
Além de vários dinoflagelados marinhos
(Llewellyn, 2006), a produção de saxitoxinas foi encontrada em representantes de cianobactérias filamentosas dos
gêneros Anabaena, Aphanizomenon,
Oscillatoria, Trichodesmium, Cylindrospermopsis, Lyngbya e Planktothrix/
Limnothrix. Até o momento, a única cianobactéria unicelular conhecida por pro-
duzir saxitoxina é a linhagem brasileira
M. aeruginosa SPC777, que foi isolada
do reservatório da Billings em São Paulo
(Sant’Anna et al., 2010).
Nos anos 80, estudos sobre a via
biossintética da saxitoxina foram iniciados e mostraram que a síntese dessa
toxina envolvia a condensação de um
aminoácido em ácido carboxílico via a
condensação de Claisen (ocorrida entre
o C-2 de arginina e o C-1 de acetato),
transferência de amidino, heterociclização não convencional e O-carbamoilação (Shimizu et al., 1984; Shimizu
1986a; 1986b). A primeira reação, a
condensação de Claisen, entre arginina
e acetato, é a mais incomum. As condensações tipo Claisen são raras em aminoácidos, mas ocorrem, por exemplo, na
biossíntese de porfirinas (tetrapirroles),
biotina e arfamenina AB e na conversão
entre glicina, serina e treonina (Alexander et al., 1994). Essa via proposta para
a biossíntese de saxitoxina sugeriu o envolvimento de enzimas com atividades
catalíticas da aminotransferase classe
II, amidinotransferase, metiltransferase
dependente de SAM (S-adenosilmetionina), hidroxilases e O-carbamoiltransferase (OCTase). A OCTase é uma enzima
que também está envolvida na produção
de fatores de nodulação (Jabbouri et al.,
1998) e antibióticos (Coque et al., 1995).
Em 2007 um estudo realizado in vitro
confirmou que arginina, acetil-CoA, SAM
e carbamoil fosfato eram precursores da
biossíntese de saxitoxina, sustentando
o envolvimento de uma O-carbamoiltransferase (Kellmann & Neilan, 2007). A
função da enzima OCTase é de transferir
um grupo carbamoil da carbamoilfosfato
para a cadeia lateral hidroximetil do precursor da saxitoxina, sendo, portanto,
uma das enzimas chaves na biossíntese
de saxitoxina. Em seguida, foi desenhado um conjunto de oligonucleotídeos iniciadores degenerados (NOD-F/NOD-R)
baseando-se nas regiões conservadas
do gene codificador da enzima O-carbamoiltransferase encontrado no genoma
de cinco cianobactérias (Crocosphera
watsonii WH8501, Prochlorococcus marinus MED4, Prochlorococcus marinus
MIT9312, Synechocystis sp. PCC6803
e Trichodesmium erythraeum IMS101)
(Kellmann et al., 2008b). Esses iniciadores foram testados em quatro cianobac-
térias produtoras de saxitoxina, ou seja,
Anabaena circinalis AWQC131C, Aphanizomenon flos-aquae NH-5, Cylindrospermopsis raciborskii T3 e Lyngbya wollei. O gene amplificado foi denominado
sxtI e sua sequência completa existente
nas quatro cianobactérias tóxicas foi
obtida usando PCR mediada com adaptador. As quatro sequências completas
do gene sxtI foram usadas na construção de um conjunto de iniciadores não
degenerados (Sxt1-F/Sxt1-R). Esses
iniciadores foram testados em 28 cianobactérias e verificou-se que somente as
produtoras de saxitoxinas foram amplificadas, demonstrando a especificidade
dos mesmos.
Dando continuidade a esses estudos,
a sequência presumível completa do
agrupamento dos genes da biossíntese
de saxitoxina foi obtida usando a técnica
de “walking PCR” no genoma da cianobactéria C. raciborskii T3, tendo como
ponto de partida o gene sxtI (Kellmann
et al., 2008a). Nessa cianobactéria, a
qual foi isolada da represa Billings em
São Paulo, o agrupamento gênico sxt
(Figura 8c) é codificado por mais de 35
kb e a análise comparativa da sequência atribuiu 30 funções catalíticas para
26 proteínas. Análise de bioinformática
desse agrupamento gênico, juntamente
com a identificação de novos intermediários biossintéticos propiciaram a revisão
da via biossintética da saxitoxina previamente proposta por Shimizu e colaboradores (Figura 9). A primeira revisão envolveu a reação catalisada pela condensação de Claisen da enzima SxtA, a qual
inicia a biossíntese da toxina SXT. Essa
enzima, um novo tipo de PKS, contém
quatro domínios catalíticos com atividades preditas de metiltransferases SAMdependentes (SxtA1), GCN-5 relacionadas com N-acetiltransferases – GNAT
(SxtA2), ACP (SxtA3) e aminotransferases classe II (SxtA4). A sequência de
reações previstas da SxtA, baseada na
sua estrutura primária, é catalisar o carreamento da ACP no acetato da acetilCoA, seguida pela metilação da acetilACP, convertendo-a em propionil-ACP
e subsequente condensação de Claisen
entre o propionil-ACP e a arginina. O
suposto produto da SxtA é, portanto,
4-amino-3-oxo-guanidinoheptano, designado substância A’. Posteriormente,
31
Figura 8. Agrupamento gênico da saxitoxina. A. Aphanizomenon sp. NH-5, B.
Anabaena circinalis AWQC131C, C. Cylindrospermopsis raciborskii T3. Os
segmentos A-E indicam os fragmentos gênicos homólogos nas três linhagens
(Adaptado de Mihali et al., 2009).
a enzima SxtG, uma amidinotransferase,
transfere um grupo amidino da arginina
para o primeiro intermediário, o α-amino
grupo A, produzindo 4,7-diguanidino-3oxo-heptano (designado substância B’).
O primeiro heterociclo é, então, formado
pela citidina deaminase, SxtB, a qual
catalisa uma condensação do tipo retroaldol na conversão da substância B’
para substância C’. A suposta enzima
esterol dessaturase, SxtD, presume-se
que seja responsável por introduzir uma
dupla ligação entre C-1 e C-5 da C’, resultando na mudança do 1,2-H entre C-5
e C-6 (substância D’). Em seguida, uma
α-cetoglutarato dioxigenase-dependente, SxtS, realiza a epoxidação consecutiva da nova dupla ligação, a qual é aberta
para um aldeído com concomitante formação de dois heterociclos. O aldeído
de cadeia lateral é, então, reduzido a
32
um álcool pela desidrogenase de cadeia
curta, SxtU, formando a substância E’.
Em seguida, duas enzimas semelhantes
às fenilpropionatos dioxigenases, SxtH e
SxtT, realizam a hidroxilação consecutiva de C-12, convertendo a substância E’
em dcSTX (decarbamoilsaxitoxina). Essas oxigenases terminais requerem regeneração após cada ciclo catalítico por
uma redutase/oxigenase. Essa função é
realizada pela succinato desidrogenase
(SxtV) e ferredoxina (SxtW), utilizando
succinato como um doador de elétrons.
Nessa via, succinato pode ser fornecido
por SxtS, que converte α-cetoglutarato à
succinato durante a reação de epoxidação. Finalmente, a enzima O-carbamoiltransferase, SxtI, catalisa a transferência
de um grupo carbamoil da carbamoilfosfato para a hidroxila livre do C-13, formando a saxitoxina. Adjacente ao gene
sxtI estão dois genes sxtJ e sxtK de funções desconhecidas. Embora genes similares a esses dois estejam disponíveis
em bancos de dados, nenhum deles foi
caracterizado funcionalmente.
Além das enzimas da biossíntese da
saxitoxina, o agrupamento sxt codifica
uma série de genes com funções diferentes e desconhecidas. Duas enzimas
identificadas podem estar envolvidas na
conversão de análogos de STX. A SxtN
supõe-se atuar como uma sulfotransferase convertendo STX e GTX-2/3 em
GTX-5 e C-1/2, respectivamente, e a
SxtO, uma adenililsulfato quinase, está
envolvida na formação de PAPS, um
doador de grupo sulfato. A enzima cefalosporina hidroxilase, SxtX, foi detectada
apenas em linhagens capazes de produzir os análogos N-1 hidroxilado de STX,
tal como neoSXT, e sua função predita
Figura 9. Via biossintética da saxitoxina. (Adaptado de Mihali et al., 2009).
correspondeu a N-1-hidroxilase. Análogos descarbamoilados de STX podem
ser produzidos por enzimas adjacentes
à SxtI, carbamoiltransferase, que apresentam ampla especificidade de substrato, processando tanto o precursor carbamoilado como o descarbamoilado da
STX, ou alternativamente, pela clivagem
hidrolítica da porção carbamoil da STX
ou de seus precursores. A SxtL, uma
GDSL lipase, pressupõe-se ter a função
de realizar a clivagem hidrolítica do grupo carbamoil em análogos de STX.
Os genes sxtF e sxtM codificam enzimas MATE, as quais, provavelmente,
estão envolvidas na exportação de SXT.
Já os genes sxtY e sxtZ, relacionados
com as enzimas Phou (reguladora da
absorção de fosfato) e OmpR (reguladora de uma variedade de metabolismos,
incluindo nitrogênio e equilíbrio osmótico), respectivamente, e também com
dois componentes sensores da histidina
quinase, sugerem que a produção de
SXT é regulada ao nível transcricional
em resposta à disponibilidade de fosfato, bem como outros fatores ambientais.
Agrupamentos gênicos similares ao
sxt da C. raciborskii T3 foram descritos
recentemente para Anabaena circinalis
AWQC131C isolada da Austrália e Aphanizomenon sp. NH-5 isolada dos Estados
Unidos (Figuras 8b e 8a, respectivamente) (Mihali et al., 2009). Eles são ligeiramente menores do que o de C. raciborskii T3, tendo aproximadamente 28 kb. A
topologia de todos os três agrupamentos
sxt é também variada, o que sugere a
ocorrência de eventos de transposição
múltiplos ao longo da evolução da biossíntese de saxitoxina nas cianobactérias.
Considerações Finais
As cianobactérias são uma fonte rica
de produtos bioativos naturais, incluindo
toxinas e outros cianopeptídeos. Um
grande número des­sas substâncias são
peptídeos. Devido às suas extraordinárias características estruturais, a biossíntese desses peptídeos não pode ser
atribuída à via ribossômica. Ao invés disso, estas substâncias são sintetizadas
pela via não-ribossômica. Ainda há uma
escassez de conhecimento sobre as funções fisiológicas e mecanismos que regulam a produção de cianotoxinas. Com
os recentes avanços na biologia molecular, as vias biossintéticas de algumas
cianotoxinas já foram elucidadas. Assim,
existe agora uma oportunidade única
para estudar a regulação da síntese das
toxinas em um nível molecular.
Referências
bibliográficas
Alexander, F.W.; Sandmeier, E.; Mehta, P.K.;
Christen, P. (1994). Evolutionary relationships
among pyridoxal-5’-phosphate-dependent enzymes. Regio-specific alpha, beta and gamma
families. Eur. J. Biochem. 219, 953-960.
33
Baldwin, J.E.; Thomas, R.C.; Kruse, L.I.;
Silberman, L. (1977). Rules for ring closure: ring formation by conjugate addition
of oxygen nucleophiles. J. Org. Chem. 42,
3846–3852.
Bishop, C.T.; Anet, E.F.L.J.; Gorham, P.R.
(1959). Isolation and identification of the pastdeath factor in Microcystis aeruginosa NRC-1.
Can. J. Biochem. Physiol. 37, 453-471.
Borchert, S.; Patil, S.S.; Marahiel, M.A.
(1992). Identification of putative multifunctional peptide synthetase genes using highly
conserved oligonucleotide sequences derived
from known synthetases. FEMS Microb. Lett.
92, 175-180.
Bordner, J.; Thiessen, W.E.; Bates, H.A.;
Rapoport, H. (1975). Structure of a crystalline
derivative of saxitoxin. Structure of saxitoxin.
J. Am. Chem. Soc. 97, 6008-6012.
Botes, D.P.; Tuinman, A.A.; Wesels, P.L.; Vijoen, C.C.; Kruger, H.; Williams, D.H.; Santikarn, S.; Smoth, S.; Hammond, S.J. (1984).
The structure of cyanoginosin-LA, a cyclic
heptapeptide toxin from the cyanobacterium
Microcystis aeruginosa. J. Chem. Soc. 1,
2311-2318.
Burgoyne, D.L.; Hemscheidt, T.K.; Moore,
R.E.; Runnegar, M.T.C. (2000). Biosynthesis
of cylindrospermopsin. J. Org. Chem. 65, 152156.
Carmichael, W.W. (1994). The toxins of cyanobacteria. Sci. Am. 270, 64-72.
Christiansen, G.; Fastner, J.; Erhard, M.;
Borner, T.; Dittmann, E. (2003). Microcystin
biosynthesis in Planktothrix: genes, evolution,
and manipulation. J. Bacteriol. 185, 564-572.
Copp, J.N.; Roberts, A.A.; Marahiel, M.A.;
Neilan, B.A. (2007). Characterization of
PPTNs, a cyanobacterial phosphopantetheinyl transferase from Nodularia spumigena
NSOR10. J. Bacteriol. 189, 3133-3139.
Coque, J.J.; Perez-Llarena, F.J.; Enguita, F.J.; Fuente, J.L.; Martin, J.F.; Liras, P.
(1995). Characterization of the cmcH genes
of Nocardia lactamdurans and Streptomyces
clavuligerus encoding a functional 3’-hydroxymethylcephem O-carbomoyltransferase for
cephamycin biosynthesis. Gene 162, 21-27.
Dittmann, E.; Börner, T. (2005). Genetic contributions to the risk assessment of microcystin in the environment. Toxicol. Appl. Pharmacol. 203, 192-200.
34
Dittmann, E.; Meiβner, K.; Börner, T. (1996).
Conserved sequences of peptide synthetase
genes in the cyanobacterium Microcystis aeruginosa. Phycologia 35, 62-67.
Dittmann, E.; Neilan, B.A.; Erhard, M.; von
Döhren, H.; Börner, T. (1997). Insertional mutagenesis of a peptide synthetase gene that
is responsible for hepatotoxin production in
the cyanobacterium Microcystis aeruginosa
PCC7806. Mol. Microbiol. 26, 779-787.
Evans, M.H. (1969). Mechanism of saxitoxin
and tetrodotoxin poisoning. Br. Med. Bull. 25,
263-267.
Francis, G. (1878). Poisonous Australian lake.
Nature 18, 11-12.
Hallegraeff, G.M. (1995). Harmful algal
blooms: A global overview. In: Manual on
Harmful Marine Microalgae. Hallegraeff GM,
Anderson DM, Cembella AD (Eds.). UNESCO, Paris, França, pp. 1-22.
Halstead, B.W.; Schantz, E.J. (1984). Paralytic shellfish poisoning. WHO offset Publ.
1-59.
Hawkins, P.R.; Runnegar, M.T.C.; Jackson,
A.R.B.; Falconer, I.R. (1985). Severe hepatotoxicity caused by the tropical cyanobacterium
(blue-green-alga) Cylindrospermopsis-raciborskii (woloszynska) Seenaya and Subba
Raju isolated from a domestic water-supply
reservoir. Appl. Environ. Microbiol. 50, 12921295.
Hicks, L.M.; Moffitt, M.C.; Beer, L.L.; Moore,
B.; Kelleher, N.L. (2006). Structural characterization of in vitro and in vivo intermediates on
the loading module of microcystin synthetase.
ACS Chem. Biol. 1, 93-102.
Honkanen, R.E.; Zwiller, J.; Moore, R.E.; Daily, S.L.; Khatra, B.S.; Dukelow, M.; Boynton,
A.L. (1990). Characterization of microcystinLR, a potent inhibitor of type 1 and type 2A
protein phosphatases. J. Biol. Chem. 265,
19401-19404.
Hughes, E.O.; Gorham, P.R.; Zehnder, A.
(1958). Toxicity of a unialgal culture of Microcystis aeruginosa. Can. J. Microbiol. 4,
225-236.
Jabbouri, S.; Relic, B.; Hanin, M.; Kamalaprija, P.; Burger, U.; Prome, D.; Prome, J.C.;
Broughton, W.J. (1998). noIO and noeI (HsnIII) of Rhizobium sp. NGR234 are involved
in 3-O-carbamoylation and 2-O-methylation of
Nod factors. J. Biol. Chem. 270, 12047-12055.
Jackim, E.; Gentile, J. (1968). Toxins of a
blue-green alga: similarity to saxitoxin. Science 162, 915-916.
Kaebernick, M.; Neilan, B.A.; Borner, T.; Dittmann, E. (2000). Light and the transcriptional response of the microcystin biosynthesis
gene cluster. Appl. Environ. Microbiol. 66,
3387-3392.
Kao, C.Y.; Levinson, S.R. (1986). Tetrodotoxin, saxitoxin, and the molecular biology of the
sodium channel. Ann. N. Y. Acad. Sci. 479,
1-445.
Kellmann, R.; Neilan, B.A. (2007). Biochemical characterization of paralytic shellfish toxin
biosynthesis in vitro. J. Phycol. 43, 497-508.
Kellmann, R.; Mihali, T.K.; Jeon, Y.J.; Pickford,
R.; Pomati, F.; Neilan, B.A. (2008a). Biosynthetic intermediate analysis and functional
homology reveal a saxitoxin gene cluster in
cyanobacteria. Appl. Environ. Microbiol. 74,
4044-4053.
Kellmann, R.; Mihali, T.K.; Neilan, B.A.
(2008b). Identification of a saxitoxin biosynthesis gene with a history of frequent horizontal gene transfer. J. Mol. Evol. 67, 526-538.
Kleinkauf, H.; von Döhren, H.A. (1996). Nonribosomal system of peptide biosynthesis. Eur.
J. Biochem. 236, 335-351.
Krishnamurthy, T.; Carmichael, W.W.; Sarver,
E.W. (1986). Toxic peptides from freshwater
cyanobacteria (blue-green algae). I. Isolation,
purification and characterization of peptides
from Microcystis aeruginosa and Anabaena
flos-aquae. Toxicon 24, 865-873.
Llewellyn, L.E. (2006). Saxitoxin, a toxic marine natural product that targets a multitude of
receptors. Nat. Prod. Rep. 23, 200-222.
Marahiel, M.A.; Stachelhaus, T.; Mootz, H.D.
(1997). Modular peptide synthetases in nonribosomal peptide synthesis. Chem. Rev. 97,
2651-2673.
Meiβner, K.; Dittmann, E.; Börner, T. (1996).
Toxic and non-toxic strains of the cyanobacterium Microcystis aeruginosa contain sequences homologous to peptide synthethase
genes. FEMS Microb. Lett. 135, 295-303.
Mihali, T.K.; Kellmann, R.; Muenchhoff, J.;
Barrow, K.D.; Neilan, B.A. (2008). Characterization of the gene cluster responsible for
cylindrospermopsin biosynthesis. Appl. Environ. Microbiol. 74, 716-722.
Mihali, T.K.; Kellmann, R.; Neilan, B.A. (2009).
Characterization of the paralytic shellfish toxin
biosynthesis gene clusters in Anabaena circinalis AWQC131C and Aphanizomenon sp.
NH-5. BMC Biochem. 10, 8.
Rouhiainen L, Vakkilainen T, Siemer BL, Buikema W, Haselkorn R, Sivonen K. Genes coding for hepatotoxic heptapeptides (Microcystins) in the cyanobacterium Anabaena strain
90. Appl Environ Microbiol, 70:686-692, 2004.
Moffitt, M.C.; Neilan, B.A. (2001). On the presence of peptide synthetase and polyketide
synthase genes in the cyanobacterial genus
Nodularia. FEMS Microbiol. Lett. 196, 207214.
Sant’Anna CL, Carvalho LR, Fiore MF, SilvaStenico ME, Lorenzi AS, Rios FR, Konno K,
Garcia C, Lagos N. Highly toxic Microcystis
aeruginosa strain, isolated from São Paulo
– Brazil, produce hepatotoxins and paralytic
shellfish poison neurotoxins. Neurotox Res,
2010. DOI10.1007/s12640-010-9177-z.
Moffitt, M.C.; Neilan, B.A. (2004). Characterization of the nodularin synthetase gene
cluster and proposed theory of the evolution
of cyanobacterial hepatotoxins. Appl. Environ.
Microbiol. 70, 6353-6362.
Neilan BA, Dittmann E, Rouhiainen L, Bass
RA, Schaub V, Sivonen K, Börner T. Nonribosomal peptide synthesis and toxigenicity
of cyanobacteria. J Bacteriol, 181(13): 40894097, 1999.
Ohtani I, Moore RE, and Runnegar, MTC.
Cylindrospermopsin: a potent hepatotoxin
from the blue-green alga Cylindrospermopsis
raciborskii. J Am Chem Soc, 114:7941–7942,
1992.
Pearson LA, Hisbergues M, Borner T, Dittmann E, Neilan BA. Inactivation of an ABC
transporter gene, mcyH, results in loss of
microcystin production in the cyanobacterium
Microcystis aeruginosa PCC 7806. Appl Environ Microbiol, 70:6370–6378, 2004.
Pearson LA, Barrow KD, Neilan BA. Characterization of the 2-hydroxy-acid dehydrogenase
McyI, encoded within the microcystin biosynthesis gene cluster of Microcystis aeruginosa
PCC7806. J Biol Chem, 282:4681–4692,
2007.
Rinehart KL, Harada K, Namikoshi M, Chen
C, Harvis CA, Munro MHG, Blunt JW, Mulligan PE, Beasley VR, Dahlem AM, Carmicheal
WW. Nodularin, microcystin, and the configuration of Adda. J Am Chem Soc, 110:8557–
8558, 1988.
Sawyer PJ, Gentile JH, Sasner JJ. Demonstration of a toxin from Aphanizomenon flosaquae (L.) Ralfs. Can J Microbiol, 14:11991204, 1968.
Schantz EJ, Mold JD, Stanger DW, Shavel
J, Riel FJ, Bowden, JP, Lynch JM, Wyler
RS, Riegel B, Sommer H. Paralytic shellfish
poison .VI. A procedure for the isolation and
purification of the poison from toxic clam and
mussel tissues. J Am Chem Soc, 79:5230–
5235, 1957.
Schantz EJ, Lynch JM, Vayvada G, Matsumoto K, Rapoport H. The purification and characterization of the poison produced by Gonyaulax catenella in axenic culture. Biochemistry,
5:1191-1195, 1966.
Schantz EJ, Ghazarossian VE, Schnoes HK,
Strong FM, Springer JP, Pezzanite JO, Clardy
J. Structure of saxitoxin. J Am Chem Soc,
97:1238-1239, 1975.
Shalev-Alon G, Sukenik A, Livnah O, Schwarz
R, Kaplan A. 2002. A novel gene encoding
amidinotransferase in the cylindrospermopsin
producing cyanobacterium Aphanizomenon
ovalisporum. FEMS Microbiol Lett, 209:87–
91, 2002.
Shi L, Carmichael WW, Miller I. Immuno-gold
localization of hepatotoxins in cyanobacterial
cells. Arch Microbiol, 163:7–15, 1995.
Shimizu Y. Toxigenesis and biosynthesis
of saxitoxin analogues. Pure Appl Chem,
58:257–62, 1986a.
Shimizu Y. Chemistry and biochemistry of
saxitoxin analogues and tetrodotoxin. Ann N
Y Acad Sci 479: 24-31, 1986b.
Shimizu Y, Norte M, Hori A, Genenah A, Kobayashi M. Biosynthesis of saxitoxin analogs:
the unexpected pathway. J Am Chem Soc,
106:6433-6434, 1984.
Sielaff H, Dittmann E, Tandeau De Marsac
N, Bouchier C, von Dohren H, Borner T,
Schwecke T. The mcyF gene of the microcystin biosynthetic gene cluster from Microcystis
aeruginosa encodes an aspartate racemase.
Biochem J, 373:909–916, 2003.
Su Z, Sheets M, Ishida, H, Li F, Barry WH.
Saxitoxin blocks L-type I Ca. J. Pharmacol
Exp Ther, 308:324–329, 2004.
Tillett D, Dittmann E, Erhard M, von Dohren
H, Borner T, Neilan BA. Structural organization of microcystin biosynthesis in Microcystis
aeruginosa PCC7806: an integrated peptidepolyketide synthetase system. Chem Biol,
7:753–764, 2000.
von Döhren H, Keller U, Vater J, Zocher R.
Multifunctional peptide synthetases. Chem
Rev, 97:2675-2705, 1997.
Wang J, Salata JJ, Bennett PB. Saxitoxin is a
gating modifier of HERG K+ channels. J Gen
Physiol, 121:583–598, 2003.
Watanabe MF, Oishi S, Harda K, Matsuura K,
Kawai H, Suzuki M. Toxins contained in Microcystis species of cyanobacteria (blue-green
algae). Toxicon, 26:1017-1025, 1988.
Young FM, Thomson C, Metcalf JS, Lucocq
JM, Codd GA. Immunogold localisation of microcystins in cryosectioned cells of Microcystis. J Struct Biol, 151:208–214, 2005.
Rinehart KL, Namikoshi M, Choi BM. Structure and biosynthesis of toxins from blue-green
algae (cyanobacteria). J Appl Phycol, 6:159176, 1994.
35
Ciência in Foco
Aquecimento Ôhmico:
Novos desafios no
tratamento térmico de
materiais
Marcos Camargo Knirsch, Carolina Alves dos Santos,
Angela Faustino Jozala, Thereza Christina Vessoni Penna
Universidade de São Paulo, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Departamento
de Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica. Av. Professor Lineu Prestes, 580, Bloco
16. 05508-900, São Paulo, São Paulo, Brasil.
Antonio A. Vicente
IBB - Institute for Biotechnology and Bioengineering, Centre of Biological
Engineering, Universidade do Minho, Braga, Portugal
Introdução
O tratamento térmico de materiais
encontra-se dentre os processos mais
utilizados industrialmente. Na indústria
de alimentos, por exemplo, o tratamento
térmico (por possuir ação letal sobre microorganismos) é o principal procedimento físico de que a tecnologia de alimentos dispõe para aumentar a vida útil dos
alimentos (Ordóñez et al., 2005). Desta
forma, novos métodos de aquecimento
que acarretem em baixo gasto energético
ou em maior eficiência energética continuam a atrair interesse (Palaniappan e
Sastry, 1992). Dentre as tecnologias de
aquecimento emergentes, o aquecimento
ôhmico apresenta-se bastante promissor.
O aquecimento ôhmico (também
conhecido como aquecimento joule,
aquecimento por resistência elétrica,
36
aquecimento direto por resistência elétrica, aquecimento elétrico ou aquecimento eletro-condutivo) é definido como o
processo no qual uma corrente elétrica
transpassa um determinado material
com o objetivo principal de aquecê-lo
(Vicente et al., 2006). Este aquecimento
ocorre através da transformação interna de energia (de energia elétrica para
energia térmica) dentro do material processado (Sastry e Barach, 2000). Desta
forma, o aquecimento ôhmico pode ser
visto como uma tecnologia de geração
interna de energia, e não somente como
um processo de transferência térmica.
Conseqüentemente o processo não
depende da transferência de calor em
interface sólido-líquido ou dentro de um
sólido em um sistema de duas fases.
Na indústria de alimentos o principal
segmento para aplicação da tecnologia
ôhmica é o processamento asséptico,
este é utilizado especialmente para alimentos líquidos, os quais são processados predominantemente por meio de
trocadores de calor. A maioria das tecnologias atualmente aplicadas depende
de fenômenos de condução, convecção
e/ou irradiação para a transferência de
calor. A aplicação destas tecnologias
para alimentos particulados, por exemplo, é limitada pelo tempo requerido
para assegurar o tratamento adequado
do centro de grandes partículas, geralmente causando o processamento excessivo do volume circundante (Vicente
et al., 2006).
O processamento ôhmico permite o
aquecimento de materiais de modo extremamente rápido (em geral variando
de alguns segundos a poucos minutos)
(Sastry, 2005). Permite também, sob
determinadas circunstâncias, o aquecimento de grandes partículas e do
fluido circundante sob velocidades de
aquecimento similares, desta forma torna possível a aplicação de técnicas de
High Temperature Short Time (HTST) e
Ultrahigh Temperature (UHT) em materiais sólidos ou suspensões (Imai et al.,
1995), melhorando assim a qualidade
do produto final e adicionando a estes
maior valor (Castro et al., 2003; Kim et
al., 1996; Parrott, 1992; Vicente et al.,
2006; Tucker, 2004). Este desejável cenário dificilmente é alcançado por meio
de técnicas de processamentos térmicos convencionais (como por exemplo,
o aquecimento por meio de trocadores
de calor, banho de água termo regulado,
etc.) (Lima et al., 1999). Sendo assim,
o processamento “asséptico” de fluidos
contendo partículas e fluidos de alta
viscosidade são considerados as aplicações mais promissoras para o processamento ôhmico na indústria de alimentos
(Palaniappan and Sastry, 2002; Rice,
1995; Wang et al., 2001).
Uma ampla gama de potenciais aplicações futuras existe para o aquecimento ôhmico, incluindo o branqueamento,
evaporação, desidratação, fermentação,
extração (USA-FDA, 2000), esterilização, pasteurização, aquecimento de alimentos pré-ingestão no campo militar ou
aeroespacial em missões de longa duração (Sastry et al., 2009). Entretanto a
maioria destas aplicações ainda espera
por exploração comercial (Sastry, 2005).
O Aquecimento
Ohmico frente a
outras tecnologias
de aquecimento
por radiação
eletromagnética
“A indústria alimentícia recorre ao
emprego de radiações eletromagnéticas com finalidades muito diversas. (...)
Dependendo da energia associada, do
comprimento de onda e da freqüência
da emissão, o efeito decorrente de sua
interação com determinado material é
muito diferente” (Ordóñez et al., 2005).
Dentre as metodologias de tratamento
térmico destacam-se: o aquecimento
por infravermelho, por microondas, dielétrico e ôhmico.
(i) O aquecimento por infravermelho é uma transmissão de calor por radiação, a qual produz determinada vibração nas ligações intra e intermoleculares
dos componentes dos alimentos que se
traduz no incremento da temperatura.
A capacidade de penetração dessa radiação é pequena; por isso, seu efeito
limita-se à superfície, enquanto o restante do alimento é aquecido por condução
ou convecção.
(ii) A energia das microondas converte-se em calor ao ser absorvida pela
matéria. No espectro eletromagnético,
as microondas situam-se entre as ondas
de rádio e a radiação infravermelha. A
interação dessa radiação em determinado material cria uma distorção resultante
do efeito do campo magnético associado
ao elétrico. Na geração de calor por microondas nos alimentos, distinguem-se
fundamentalmente dois mecanismos: a
condução iônica e a rotação de dipolos
(Ordóñez et al., 2005).
O processo de aquecimento por microondas é influenciado por uma série
de parâmetros, tanto do equipamento
como do produto a ser aquecido. Alguns fatores críticos ao processo são:
freqüência e distribuição das ondas no
interior da cavidade de processamento,
conteúdo hídrico, temperatura, parâmetros do produto (incluindo massa, densidade, geometria, espessura), e calor
específico. A distribuição espacial da
absorção das microondas é afetada por
estes parâmetros, o que significa que
velocidades de aquecimento diferentes
serão observadas.
Desta forma, o processamento por
microondas apresenta como principal
obstáculo a não-uniformidade de aquecimento e a imprevisibilidade da localização dos pontos frios, os quais podem
prejudicar a segurança dos alimentos
(Vicente e Castro, 2007; Ordóñez et al.,
2005).
“Ainda que as microondas sejam uma
forma limpa de energia, (...) o aquecimento por microondas implica em gasto
energético elevado. O custo decorrente
do gasto de energia elétrica pode ser
três vezes superior ao consumo energético dos métodos tradicionais. Conseqüentemente, o emprego de microondas deve limitar-se às aplicações que
representem uma vantagem substancial
ou quando seus efeitos não possam ser
obtidos por outros meios” (Ordóñez et
al., 2005).
(iii) “O aquecimento dielétrico é
definido como a calefação de um material isolante elétrico pelas perdas que
se produzem nele quando é submetido
a um campo elétrico alternado. O processo consiste em colocar o produto que
será aquecido (dielétrico) entre duas
placas ou eletrodos paralelos, denominadas placas capacitantes, unidas a um
gerador alternado de alta freqüência e
capacidade. Do mesmo modo que nos
fornos microondas, o calor é gerado por
fricção das moléculas dipolares como
resposta à aplicação de um campo elétrico alternado” (Ordóñez et al., 2005). No
aquecimento dielétrico são empregadas
altas freqüências, em geral 13,56; 27,12
ou 40,68 MHz (Vicente e Castro, 2007).
Desta forma, o aquecimento dielétrico
difere do aquecimento ôhmico devido à
freqüência empregada e a condutividade
elétrica do material ao qual é aplicável.
Quando comparado com metodologia tradicional (aquecimento por banho
de água ou trocadores de calor), o aquecimento dielétrico apresenta vantagens
similares ao aquecimento ôhmico e às
microondas, as quais são essencialmente devidas à geração de calor por todo
o volume do material processado. Suas
principais desvantagens são: alto custo
operacional e dos equipamentos utilizados; obtenção de menores velocidades
de aquecimento quando comparado às
microondas e o limitado conhecimento
atual quanto às propriedades dielétricas
dos alimentos.
(iv) O aquecimento ôhmico, em
seu campo de aplicação, apresenta,
portanto, diversas vantagens quando
comparado com outras metodologias de
aquecimento por radiação eletromagnética. Diferentemente do aquecimento por
infravermelhos, o aquecimento ôhmico
possibilita o aquecimento do material
processado por toda a extensão de seu
volume.
Quando comparado ao aquecimento
por microondas e ao aquecimento dielétrico, o aquecimento ôhmico apresenta
menores custos iniciais e operacionais,
maior homogeneidade de aquecimento e
maior previsibilidade da distribuição térmica quando comparado às microondas,
37
maior aplicabilidade a materiais com
alto teor hídrico e maiores velocidades
de aquecimento quando comparado ao
aquecimento dielétrico. O aquecimento
ôhmico apresenta ainda maior faixa de
freqüências aplicáveis uma vez que as
microondas e o aquecimento dielétrico
apresentam limitações de freqüência
para que não haja interferência com outras tecnologias como radares e comunicações.
Microbiologia durante
aquecimento ôhmico
A inativação microbiana observada
durante o aquecimento ôhmico deve-se
principalmente ao efeito da temperatura
sobre os microrganismos. A literatura
científica atual não indica a existência
de quaisquer microrganismos ou cepas
patogênicas especificamente resistentes
a esta tecnologia, sendo os microrganismos observados como mais resistentes
os mesmos apresentados a tratamentos térmicos convencionais (USA-FDA,
2000). Porém, alguns estudos recentes indicam que o aquecimento ôhmico
apresenta efeito não-térmico adicional
capaz de gerar danos celulares devido
à incidência de campos elétricos (Cho et
al., 1999; Sun et al., 2008; Vicente et al.,
2007). A principal razão atribuída a este
dano adicional observado no tratamento
ôhmico é a freqüência aplica (geralmente entre 50 e 60 Hz), a qual possivelmente provoca desestabilização das paredes
celulares com posterior formação de poros (usa-fda, 2000).
Estudos comparativos de inativação
microbiana indicam que o aquecimento
ôhmico é capaz de provocar maiores
velocidades de morte microbiana que
as metodologias tradicionais. Esta maior
velocidade foi observada para microrganismos como: Escherichia coli e Bacillus
licheniformis (Perreira, 2007), Bacillus
subtilis e Bacillus atrophaeus (Cho,
1999), Streptococcus thermophilus (Sun,
2008), Saccharomyces cerevisiae (Yoon
et al., 2002) e Byssochlamys fulva. (Castro, 2007)
Para a E. coli a redução observada,
por Perreira e colaboradores (Perreira
et al., 2007), no valor D a 65ºC foi de
2,64 minutos, sendo o valor D para o
aquecimento convencional de 3,5 mi-
38
nutos e para o aquecimento ôhmico de
0,86 minutos. Neste mesmo estudo,
variações similares foram observadas
para B. licheniformis. “Estes resultados
indicam que a corrente elétrica (aplicada
no aquecimento ôhmico) afeta a taxa de
mortalidade. (...) Desta forma, considerando ambas as cepas dos microrganismos estudados, para um mesmo grau de
inativação, o tempo requerido de tratamento térmico foi reduzido quando foi
utilizado o aquecimento ôhmico, indicando que adicionalmente ao efeito térmico
a presença de um campo elétrico provoca um efeito letal não-térmico sobre
células vegetativas de E. coli e esporos
de B. licheniformis em leite de cabras e
geléia de cloudberry, respectivamente.”
(Perreira et al., 2007).
Em estudo realizado por Cho e colaboradores (1999) com B. subtilis e B.
atrophaeus observou-se novamente a
incidência de efeito não-térmico sobre a
morte microbiana durante o tratamento
ôhmico. Para temperaturas de 92,3ºC
verificou-se redução de até um minuto
nos valores D apresentados para o aquecimento ôhmico quando comparados a
aquecimento convencional por banho
d’água. De modo similar, Sun e colaboradores (2008) reportam valores de tempo de inativação significativamente menores para S. thermophilus sob processo
ôhmico. Os resultados “demonstram claramente que o aquecimento ôhmico causa maior taxa de morte microbiana que
o aquecimento convencional. (...) Estes
resultados indicam que o aquecimento
ôhmico apresentou um efeito térmico letal e um efeito não-térmico letal adicional
para aeróbios viáveis (provenientes do
leite) e S. thermophilus”.
Quando aplicado em temperaturas
sub-letais, os efeitos não-térmicos do
aquecimento ôhmico apresentam potencial para beneficiar processos fermentativos. Estudos realizados em fermentações por Lactobacillus acidophilus
indicam que o efeito de desestabilização
das membranas celulares provocados
pelo aquecimento ôhmico pode facilitar o transporte de nutrientes do meio
de fermentação para o interior celular,
tornando-o mais rápido e eficiente (Cho
et al. 1996). Observou-se que quando
aplicado o aquecimento ôhmico em fermentações por L. acidophilus a fase lag
do processo fermentativo é reduzida.
Não foram observadas variações de pH,
de consumo de glicose ou de liberação
de ácido lático significativas durante as
fases iniciais de fermentação. Observouse, porém que em estágios avançados
a produtividade da fermentação decaiu.
Este decréscimo possivelmente relaciona-se também ao fenômeno de eletroporação provocado. Durante os estágios
finais de fermentação, a eletroporação
pode possibilitar a entrada de metabólitos para o interior celular e conseqüentemente inibir o processo fermentativo.
Casos confirmados e devidamente
entendidos, os efeitos não-térmicos,
como o efeito de eletroporação, e seus
efeitos decorrentes provocado pelo
aquecimento ôhmico apresentam potencial para causar significativo impacto
econômico.
Além da capacidade de causar lesão
celular e conseqüente redução do tempo de tratamento térmico de produtos, o
efeito de eletroporação apresenta potencial para aplicação sinérgica da técnica
de aquecimento ôhmico com outras metodologias de controle microbiano, como
por exemplo, a utilização de bacteriocinas antimicrobianas termoressistentes
como a nisina. Entretanto, segundo
nosso atual conhecimento, não existem
relatos científicos que suportem a teoria
de sinergismo. Porém, caso confirmado,
pode influenciar sobremaneira a qualidade de diversos produtos.
UTILIZAÇÃO DE PEPTÍDEO
ANTIMICROBIANO no
aquecimento ôhmico
Os benefícios potenciais do aquecimento ôhmico para a indústria de
produtos lácteos transcendem sua aplicação na pasteurização. Estudou-se a
aplicação do aquecimento em processo
fermentativo com Lactobacillus acidophilus. Neste estudo, controle de temperatura do processo foi realizado de modo
convencional (por circulação continua
de água) e por aquecimento ôhmico (a
voltagem constante de 15V para baixa
voltagem e 40V para alta voltagem). O
processo foi realizado a diferentes temperaturas (30, 35 e 40oC). Observou-se
que aplicação de campo elétrico pode induzir a formação de poros de membrana
(similarmente ao processo de eletroporacão, técnica bastante explorada para
transformação celular em estudos de
biologia molecular) os quais permitem o
transporte de nutriente de maneira mais
eficiente e veloz, desta forma reduzindo
a fase lag. Verificou-se a existência de
uma diferença mínima entre o pH dos
meios, entretanto, o consumo de glicose
e a liberação de acido láctico não foram
influenciados pelo aquecimento ôhmico.
Pode-se, portanto, inferir que o aquecimento ôhmico apresenta grande potencialidade de aplicação em processos fermentativos , reduzindo o tempo total de
processo na produção de bacteriocinas
(nisina, lacidina), assim também de produtos lácteos, dentre outras aplicações
(Cho et al. 1996; Vicente, 2007).
Dentre os agentes antimicrobianos
potenciais para aplicação conjunta ao
aquecimento ôhmico apresenta-se a
bacteriocina nisina. A nisina e um peptídeo bioativo, composto de 34 resíduos
de aminoácido (3500Da), sintetizado por
Lactococcus lactis ATCC 11454, pertencente à família dos lantibioticos, grupo
de antimicrobianos caracterizados pela
presença de aminoácidos raros em sua
estrutura (De Vuyst & Vandamme, 1992).
Possui amplo espectro inibitório contra
bactérias Gram-positivas e esporos,
porem apresenta efeito inibitório contra
Gram-negativas, fungos e leveduras
quando na presença de agentes quelantes (Vessoni Penna et al., 2006; Arauz et
al., 2009; Ukuku e Fett, 2004; Millette et
al., 2004).
O tratamento térmico de materiais
encontra-se dentre os processos mais
utilizados industrialmente. Dentre as
tecnologias de aquecimento emergentes, o aquecimento ôhmico apresentase bastante promissor. O aquecimento
ôhmico é definido como o processo no
qual uma corrente elétrica transpassa
um determinado material com o objetivo
principal de aquecê-lo. Uma ampla gama
de potenciais aplicações futuras existe
para o aquecimento ôhmico, incluindo o
branqueamento, evaporação, desidratação, fermentação, extração, esterilização,
pasteurização, aquecimento de alimentos
pré-ingestão no campo militar ou aeroespacial em missões de longa duração.
Estudos comparativos de inativação
microbiana indicam que o aquecimen-
to ôhmico é capaz de provocar maiores velocidades de morte microbiana
que as metodologias tradicionais. Esta
maior velocidade foi observada para microrganismos como: Escherichia coli e
Bacillus licheniformis (Perreira, 2007),
Bacillus subtilis e Bacillus atrophaeus
(Cho, 1999), Streptococcus thermophilus
(Sun, 2008), Saccharomyces cerevisiae
(Yoon et al., 2002) e Byssochlamys fulva.
(Castro, 2007). A inativação microbiana
observada durante o aquecimento ôhmico deve-se principalmente ao efeito da
temperatura sobre os microrganismos.
Porém, alguns estudos recentes indicam
que o aquecimento ôhmico apresenta
efeito não-térmico adicional capaz de
gerar danos celulares devido à incidência de campos elétricos. A principal razão
atribuída a este dano adicional observado
no tratamento ôhmico é a freqüência aplica (geralmente entre 50 e 60 Hz), a qual
possivelmente provoca desestabilização
das paredes celulares com posterior formação de poros (usa-fda, 2000).
Além da capacidade de causar lesão
celular e conseqüente redução do tempo de tratamento térmico de produtos, o
efeito de eletroporação apresenta potencial para aplicação sinérgica da técnica
de aquecimento ôhmico com outras metodologias de controle microbiano, como
por exemplo, a utilização de bacteriocinas antimicrobianas termoressistentes
como a nisina. Entretanto, segundo
nosso atual conhecimento, não existem
relatos científicos que suportem a teoria
de sinergismo. Porém, caso confirmada,
pode influenciar sobremaneira a qualidade de diversos produtos.
products. Journal of Food Process Engineering, v. 26, p. 17–29, 2003.
CHO, H.Y.; YOUSEF, A.E.; SASTRY, S.K.
Growth kinetics of Lactobacillus acidophilus
under ohmic heating. Biotechnology and
Bioengineer, v. 49, n. 3, p. 334-340, 1996.
CHO, H.Y.; YOUSEF, A.E.; SASTRY, S.K. Kinetics of inactivation of Bacillus subtilis spores
by continuous or intermittent ohmic and
conventional heating. Biotechnology and
Bioengineer,v. 62, n. 3, p. 368-372, 1999.
de Vuyst, L. and Vandamme, E. J. Influence of the carbon source on nisin production
in Lactococcus lactis subsp. lactis batch fermentations. J. Gen. Microbiol. 138, 571–578,
1992.
IMAI, T.; UEMURA, K.; ISHIDA, N.; YOSHIZAKI, S.; NOGUCHI, A. Ohmic heating of
Japanese White Radish Raphanus sativus L.
International Journal of food science and
technology, v. 30, p. 461-472, 1995.
KIM, H.J.; CHOI, Y.M.; YANG, T.C.S.; TAUB,
I.A.; TEMPEST, P.; SKUDDER, P.; TUCKER,
G.; PARROTT, D.L. Validation of OH for
quality enhancement of food products. Food
Technology, v. 50, p. 253–261, 1996.
LIMA, M.; HESKITT, B.F.; BURIANEK, L.L.;
NOKES, S.E.; SASTRY, S.K. Ascorbic acid
degradation kinetics during conventional and
ohmic heating. Journal of Food Preservation, v. 23, p. 421-434, 1999.
Millette, M., Smoragiewicz, W. and
Lacroix, M. Antimicrobial potential of immobilized Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC
11454 against selected bacteria. J Food
Prot.67(6):1184-9, 2004.
Referências
Bibliográficas
ORDÓÑEZ, J.A. (ed.) Tecnologia de alimentos: Componentes dos alimentos e processos, vol. 1. Porto Alegre: Artmed, 2005.
ARAUZ, L. J.; JOZALA, A. F.; MAZZOLA, P.
G.; PENNA, T. C. V. Nisin Biotechnological
Production and Application: a review. Trends
in Food Science & Technology, v. 20, p.
146-154, 2009.
PALANIAPPAN, S.; & SASTRY, S.K. Effects
of electroconductive heat treatment and electrical pretreatment on thermal death kinetics
of selected microorganisms. Biotechnology
and Bioengineering, v. 39, p. 225-232, 1992.
CASTRO, I. Ohmic heating as an alternative to conventional thermal treatment.
2007. Tese (Doutorado), Universidade do
Minho, Braga, Portugal.
PALANIAPPAN, S.; SASTRY, S. Ohmic heating. In: JUNEJA, V.K.; SOFOS. J.N. (org.).
Control of foodborne microorganisms.
New York: Marcel Dekker, 2002.
CASTRO, I.; TEIXEIRA, J.A.; VICENTE, A.A.
The influence of field strength, sugar and solid
content on electrical conductivity of strawberry
PARROTT, D.L. Use of OH for aseptic processing of food particulates. Food Technology, v. 45, p. 68–72, 1992.
39
Penna TCV, Jozala AF, Gentille TR,
Pessoa Jr A and Cholewa O. Detection
of nisin expression by Lactococcus lactis using two susceptible bacteria to associate the
effects of nisin with EDTA. Appl Biochem
Biotechnol. 121–124:334–346, 2006.
PEREIRA, R.; MARTINS, J.; MATEUS, C.;
TEIXEIRA, J.A.; VICENTE, A.A. Death kinetics of Escherichia coli in goat milk and Bacillus licheniformis in cloudberry jam treated by
ohmic heating. Chemical Papers, v. 61, n. 2,
p. 121-126, 2007.
RICE, J. Ohmic Adventures. Food Processing, p. 56, n. 3, p. 87-91, 1995.
SASTRY, S.K. Advances in ohmic heating and
moderate electric field (MEF) processing. In:
BARBOSA-CÁNOVAS, G.V.; TAPIA, M.S.;
CANO, M.P. (ed.). Novel food processing
technologies. Boce Raton, FL: CRC Press,
2005.
SASTRY, S.K.; BARACH, J.T. Ohmic and Inductive Heating. Journal of Food Science
Supplement, v. 65, n. 4, p. 42-46, 2000.
40
SASTRY, S.K.; JUN, S.; SOMAVAT, R.; SAMARANAYAKE, C.; YOUSEF, A.; PANDIT,
R.B.. Heating and sterilization technology for
long-duration space missions. In: INTERDISCIPLINARY TRANSPORT PHENOMENA:
ANNALS OF N.Y. ACADEMY OF SCIENCES,
v. 1161, p. 562–569. doi: 10.1111/j.17496632.2009.04088.x. 2009.
SUN, H.X.; KAWAMURA, S.; HIMOTO, J.I.;
ITOH, K.; WADA, T.; KIMURA, T. Effects of ohmic heating on microbial counts and denaturation of proteins in milk. Food Science and Technology Research, v. 14, p. 117–123, 2008.
TUCKER, G.S. Food waste management and
value-added products: using the process to
add value to heat-treated products. Journal
of Food Science, v. 69, n. 3, p. CRH102CRH104, 2004.
UNITED STATES OF AMERICA, Food and
Drug Administration, Center for Food Safety
and Applied Nutrition. Kinetics of microbial inactivation for alternative food processing technologies: Ohmic and inductive heating. Disponível em: http://www.cfsan.fda.gov/~comm/
ift-ohm.html. Acesso em: 17 de fevereito de
2009.
VICENTE, A.A.; CASTRO, I. Novel thermal
processing technologies. In: TEWARI, G.;
JUNEJA, V.K. (eds). Advances in thermal
and non-thermal food preservation. Oxford,
UK, Blackwell publishing, 2007.
VICENTE, A.A.; CASTRO, I.; TEIXEIRA, J.A.
Ohmic heating for food processing. In: DAWEN SUN (editor). Thermal Food Processing: New Technologies and Quality Issues.
Boca Raton, FL, USA: CRC Press, Taylor &
Francis Group. p 424- 468, 2006.
WANG, C.S.; KUO, S.Z.; KUO-HUANG, L.L.;
WU, J.S.B. Effect of Tissue Infrastructure on
Electric Conductance of Vegetable Stems.
Journal of Food Science: Food Engineering
and Physical Properties, v. 66, n. 2, p. 284288, 2001.
Yoon, S. W., Lee, C. Y. J., Kim, K. M., &
Lee, C. H. Leakage of cellular material from
Saccharomycies cerevisiae by ohmic heating.
Journal of Microbiology and Biotechnology, 12, 183-188, 2002.
Ciência in Foco
A síndrome hemolítica
urêmica (SHU) e a busca
de uma estratégia de
controle para a doença
Priscila Aparecida Dal Pozo Gomes
Instituto de Ciências Biomédicas II - Departamento de Microbiologia
Universidade de são Paulo, São Paulo - SP, Brasil. [email protected]
Rita de Cássia Café Ferreira
Instituto de Ciências Biomédicas II - Departamento de Microbiologia
Universidade de são Paulo, São Paulo - SP, Brasil. [email protected]
Marina Sandra Palermo
Instituto de Investigações Hematológicas - Academia Nacional de Medicina
Buenos Aires, Argentina. [email protected]
Luis Carlos de Souza Ferreira
Instituto de Ciências Biomédicas II - Departamento de Microbiologia
Universidade de são Paulo, São Paulo - SP, Brasil. [email protected]
A origem
Em 1955 surgiram na Europa os primeiros relatos em crianças de casos
fatais de uma síndrome que se caracterizava por forte anemia hemolítica, trombocitopenia e falência renal aguda cuja
etiologia era totalmente desconhecida
na época (GASSER e col, 1955). Alguns
anos depois, na América do Sul, o médico
e pesquisador argentino Gianantonio observou os mesmos sintomas em crianças
em um hospital infantil em Buenos Aires
sendo, posteriormente, denominada de
Síndrome Hemolítica Urêmica (SHU).
Vinte anos após o primeiro relato, Kaplan
e colaboradores (1975) descreveram os
casos semelhantes de SHU em crianças
no Canadá e a partir de estudos epide-
miológicos entre familiares, concluíram
que se tratava de uma doença infecciosa.
Evidências adicionais indicavam que a
SHU era, em geral, precedida por diarréia
associada a um quadro de colite hemorrágica causada por linhagens patogênicas
de Escherichia coli, hoje denominadas de
E. coli enterohemorrágica (EHEC), produtoras de uma potente enterotoxina com
características citotóxicas.
A etiologia da SHU foi esclarecida
por Karmali e colaboradores em 1983
que associaram a produção da citotoxina
por linhagens de EHEC com os sintomas associados à doença. Nessa mesma época, surgiram surtos de SHU nos
Estados Unidos que tiveram um grande
impacto psicológico na população e receberam um enorme destaque da mídia
de todo o mundo. Os surtos iniciais foram associados ao consumo de carne
(hambúrgueres) mal cozida servida em
uma rede de “fast-food” (RILEY e col,
1983). Outros surtos se sucederam tanto
nos Estados Unidos como em países da
Europa e Japão e tinham em comum a
presença de uma linhagem com um perfil
sorológico considerado raro na época, o
sorotipo O157:H7. Essas linhagens se
caracterizavam pela produção de uma
toxina semelhante à toxina produzida por
outra bactéria a Shigella dysenteriae, e,
portanto, foi denominada de Stx. Até hoje
linhagens de EHEC do sorotipo O157:H7
recebem destaque na mídia e são frequentemente reconhecidas como a “bactéria assassina”, considerada por alguns
uma potencial arma biológica.
41
O desenvolvimento da doença iniciase com diarreia acompanhada de fortes
dores abdominais. Frequentemente,
observa-se a presença de sangue nas
fezes e ocasionalmente ocorrem vômitos acompanhados ou não por febre
baixa. Cerca de 20% das infecções
agravam para SHU e mais de 50% dos
casos com diarréia sanguinolenta requer
hospitalização, especialmente crianças
menores de 5 anos de idade e idosos. A
SHU caracteriza-se por destruição das
células vermelhas do sangue (anemia
hemolítica), falência renal aguda que
pode ser acompanhada por deterioração
neurológica e trombocitopenia. Infecções
com linhagens de EHEC representam a
principal causa de falência renal aguda
em crianças nos EUA e Argentina e respondem por 20% dos casos de transplantes renais na Argentina tanto em crianças
como em adolescentes (EXENI, 2001).
Nos casos em que não há possibilidade
de transplante, o paciente deve recorrer
à hemodiálise por toda a vida (GRIFFIN
e TAUXE, 1991, SPIZZIRRI, e col., 1997).
Uma fração significativa dos indivíduos infectados (aproximadamente 10%)
pode apresentar sequelas como pressão
alta, crise convulsiva, cegueira, paralisia
e diabetes. A SHU normalmente é uma
condição ameaçadora à vida e a letalidade pode chegar a mais de 6% e, entre
idosos, pode atingir a 50% dos indivíduos
infectados (CDC 2006, 2009).
Não há um tratamento específico para
a SHU e os pacientes recebem apenas
medidas de suporte visando aliviar os
sintomas. Diálise peritoneal e hidratação
intravenosa podem reduzir os índices de
mortalidade e amenizar sequelas nos
casos em que a concentração de Stx na
corrente sanguínea é baixa. A utilização
de antibióticos não é recomendada, pois
pode agravar os sintomas da SHU ao promoverem aumento na produção da toxina
ou liberação através da ruptura das células bacterianas.
Na natureza, as linhagens de EHEC
causadoras da SHU estão associadas ao
gado de corte que atua como principal reservatório para o homem, mas não sofre
qualquer sintoma relacionado à doença
observada nos seres humanos. A ingestão de carne crua ou mal passada assim
como outros alimentos, como frutas, vegetais e água contaminada representam
as principais fontes de infecção para os
seres humanos. Adicionalmente, a elevada diversidade genética das linhagens
circulantes, recobrindo quase todo o território dos países onde está presente, suporta a noção de que essas bactérias são
capazes de sobreviver e persistir em diferentes nichos, como folhas de hortaliças,
aumentando a possibilidade de transmissão à população humana (PALERMO e
col., 2009). Em função da relevância da
doença, uma lei criada no governo do
presidente Bill Clinton dita que toda carne
Figura 1. Estrutura da subunidade da toxina Stx produzida por linhagens de
EHEC. As subunidades A e B estão indicadas por setas.
42
bovina comercializada nos EUA deve ser
submetida à tratamento com irradiação
gama.
A incidência da SHU varia de acordo
com o país e na Argentina os índices
atingem a 17 casos/100.000 crianças
menores de 5 anos de idade por ano
(RIVAS e col, 2006). A incidência de
SHU no país vizinho é cerca de 10 vezes
mais alta do que observado em outros
países como nos EUA, segundo país no
mundo mais afetado pela doença com 2
casos/100.000 habitantes (CDC, 2008).
No Brasil, ainda não existe registro de
surtos epidêmicos da doença e o número de crianças com registro de infecção
com EHEC permanece muito baixo. No
entanto, a presença de linhagens EHEC
tem sido confirmada no rebanho bovino
assim como em ovinos e caprinos (IRINO e col 2005; OLIVEIRA e col, 2008,
VETORATTO e col, 2009). Esses dados
indicam que a ameaça está próxima e
monitoramento epidemiológico cuidadoso
e medidas de vigilância sanitária devem
ser implementada para evitar que a doença atinja o país.
A patogênese da EHEC.
Todo caso de SHU inicia-se com a ingestão de pequenas quantidades da bactéria presente em alimentos ou água contaminada. Uma vez ingerida, a bactéria
atravessa o ambiente ácido do estômago
e coloniza o epitélio intestinal por meio de
proteínas secretadas pela bactéria e uma
adesina (proteína bacteriana com capacidade de se ligar a receptores presentes
na superfície da célula alvo do hospedeiro), denominada, intimina. Nesse ambiente a bactéria inicia a liberação da toxina
Stx que atravessa o epitélio intestinal,
cai na corrente sanguínea ligando-se a
células que expressam quantidades elevadas do receptor específico. Atualmente
são conhecidos dois grandes grupos de
toxinas Stx produzidas por linhagens de
EHEC, mas apenas um tipo (Stx2) está
comprovadamente associado ao desenvolvimento da SHU.
A toxina Stx é caracterizada por ser
uma toxina do tipo AB5, isto é, uma toxina
formada por duas subunidades independentes com estrutura e função próprias. A
subunidade A é responsável pelos efeitos
tóxicos no organismo e promove o blo-
queio da síntese protéica após penetrar
nas células alvos e atingir os ribossomos,
onde inativa o RNA ribossomal da subunidade 60S. Durante o trânsito intracelular, a subunidade A e clivada em duas
porções (A1 e A2) sendo que a atividade
tóxica está relacionada à subunidade A1.
A segunda porção, ou domínio funcional/
estrutural, da toxina Stx é representada
por 5 subunidades B que se organizam
na forma de um barril no qual se encaixa
a subunidade tóxica. As subunidades B
têm como função o reconhecimento e a
ligação a um receptor celular glicolipídico,
denominado Gb3 , encontrado na superfície de muitas células do corpo, como
no epitélio do intestino delgado, mas é
particularmente abundante em células de
endotélio microvascular renal e cerebral,
assim como no pâncreas e pulmões (PATON e col., 1998),
Durante o processo infeccioso a
EHEC não invade o organismo permanecendo aderida ao epitélio intestinal onde
promove as lesões celulares locais, na
forma da colite hemorrágica, pela produção da toxina. As lesões mais graves, característica da SHU, estão associadas à
presença da toxina na circulação sanguínea cuja passagem pelo epitélio intestinal
ainda não foi totalmente esclarecida. Uma
vez em contato com as células alvo, não
é possível neutralizar a toxina e, consequentemente, evitar os danos celulares e
teciduais associados à SHU. Os sintomas
da SHU aparecem nos indivíduos infectados muito rapidamente, cerca de duas
semanas após a infecção com a bactéria.
Figura 2. Mecanismo de ação da toxina Stx. O transporte retrógrado pelo Golgi e RE. da toxina está demonstrado. Fonte: J C Paton and A W Paton (2006)
Estratégias de controle
da SHU
A falta de um tratamento específico
para a SHU tem incentivado pesquisas
que visam encontrar estratégias profiláticas e terapêuticas efetivas contra a doença. Tais estudos abordam três linhas
principais que envolvem: (i) o uso de
análogos sintéticos dos receptores de toxina, (ii) imunoterapia com anticorpos monoclonais e (iii) vacinas. (Tabela 1). Tanto
o uso de análogos sintéticos do receptor
da toxina Stx assim como o uso de anticorpos monoclonais capazes de neutralizar a toxina circulante foram submetidos
a testes clínicos e os resultados obtidos
foram lamentavelmente frustrados pela
Figura 3. Progressão da infecção. Fonte: Tarr, P. (2005)
pouca eficácia do tratamento (análogos
de receptor) ou toxicidade (anticorpos
monoclonais). Atualmente as maiores expectativas estão voltadas para o desenvolvimento de uma estratégia vacinal cuja
aplicação permita um controle preventivo
da doença, por meio da imunização ativa em populações de maior risco. Por
representarem a estratégia com melhor
relação custo-benefício em relação ao
controle de doenças infecciosas, vacinas
representam uma esperança para que
em futuro próximo seja possível reduzir
tanto a mortalidade como a morbidade
associada à SHU. Para tal descrevemos
na presente revisão as principais estratégias relacionadas ao desenvolvimento de
vacinas voltadas para o controle da SHU.
A pesquisa de vacinas voltadas para
o controle da SHU está concentrada em
laboratórios sediados em países desenvolvidos, sobretudo nos locais onde a
43
doença possui grande relevância epidemiológica. No entanto, pesquisas nessa
área também estão conduzidas por grupos de pesquisa no Brasil e Argentina. Até
o momento, a pesquisa de vacinas contra
a SHU segue duas vertentes sendo uma
voltada para aplicação veterinária e outra que visa o uso em seres humanos.
As vacinas de uso veterinário têm como
objetivo evitar que o gado se infecte e
dissemine linhagens de EHEC para os
seres humanos. Em geral, essas vacinas
procuram desencadear imunidade na mucosa intestinal, inibindo a colonização e
baseiam-se em proteínas envolvidas na
adesão da bactéria às células do epitélio
visando quebrar o ciclo de transmissão,
(POTTER e col., 2004; PETERSON e
col., 2007; SMITH e col., 2009). Infelizmente, até o momento, tais vacinas não
mostraram resultados promissores tanto
em condições laboratoriais com em relação à sua aplicabilidade no campo.
A segunda vertente de pesquisa relacionada ao desenvolvimento de vacinas tem como objetivo a prevenção da
doença em seres humanos. Nesses estudos procura-se estimular a produção
de anticorpos circulantes contra a toxina
Stx de modo a neutraliza-la antes que
atinja células e tecidos alvos. Porém, por
se tratar de uma doença transmitida via
fecal-oral, estudos também buscam a indução de anticorpos na mucosa intestinal
capazes de bloquear a toxina produzida
no intestino durante os estágios iniciais
da doença, de modo a impedir a penetração na corrente sanguínea. Diferentes
estratégias de imunização foram descritas e envolvem o uso de vetores vacinais
vivos administrados pela via oral, vacinas
acelulares com proteínas purificadas ou
toxóides e vacinas de DNA (Tabela 2).
Vacinas baseadas em bactérias recombinantes.
O uso de vetores bacterianos vivos
baseia-se na geração de linhagens bacterianas recombinantes que expressam
formas atóxicas da toxina Stx de forma a
promover a produção de anticorpos específicos na mucosa intestinal e na corrente
sanguínea. Foram descritos resultados
de imunização em condições laboratoriais com linhagens vacinais de Vibrio
cholerae (BUTTERTON e col., 1997), Salmonella enterica (ROJAS e col., 2010) e
Bacillus subtilis (GOMES e col., 2009).
As linhagens são modificadas geneticamente para expressar a subunidade B
da Stx ou derivados de Stx constituídos
pela subunidade B e porções não tóxicas
da subunidade A. A administração por via
oral facilita a indução de imunidade de
mucosa (anticorpos IgA no trato intestinal). No entanto, linhagens patogênicas
atenuadas trazem um potencial risco de
reversão para a forma virulenta. Em geral
os resultados revelam baixa imunogenicidade sistêmica (anticorpos IgG específicos na corrente sanguínea) e proteção
parcial a desafios com a toxina nativa em
ensaios com camundongos.
Vacinas baseadas em toxóides
Toxóides são obtidos pela inativação
de toxinas por métodos físicos ou químicos. Nessa estratégia de imunização a
toxina Stx é utilizada na sua composição
completa, o que preserva suas propriedades imunogênicas, possibilitando a obtenção de anticorpos que reconhecem e
neutralizam a toxina nativa. No caso das
estratégias voltadas para o controle da
SHU os toxoídes são inativados quimicamente por tratamento com glutaraldeído
(LUDWIG e col., 2002, BIELASZEWSKA e
col., 1997). Embora os resultados tenham
sido promissores em modelo experimental,
dificuldades inerentes à inativação completa da Stx criam restrições em relação à segurança da vacina para uso em humanos
Como alternativa ao uso de toxóides,
laboratórios pesquisam o uso de toxinas
recombinantes contendo mutações que
reduzem ou inativem as propriedades
tóxicas da Stx. Tal estratégia mostra-se
atraente, pois dispensa o tratamento químico da toxina, o que simplifica o processo de produção do imunógeno. No caso
específico de Stx foram descritas mutações na subunidade A que reduzem a
toxicidade sem comprometimento da imunogenicidade (ISHIKAWA e col., 2003,
SMITH e col., 2006).
Vacinas baseadas em proteínas purificadas ou peptídeos.
O maior alvo das pesquisas nessa
linha é a subunidade B da Stx, responsável pela ligação ao receptor das células
alvo. Por não estar envolvida com o efeito tóxico da Stx, não há necessidade de
etapas adicionais relacionadas à inativação da proteína purificada. No entanto,
dificuldades encontradas na expressão
da proteína em sistemas heterólogos, a
montagem da proteína na sua conformação pentamérica e a baixa imunogenicidade do antígeno tem sido os principais
fatores que restringiram a pesquisa de
vacinas baseadas na subunidade B da
Stx em condições laboratoriais (Tabela 2).
Tabela 1. Estratégias voltadas para o tratamento ou prevenção da SHU.
Estratégia de controle
44
Características
Situação atual
Análogos de Gb3
sintéticos
Substâncias de estrutura e composição química similar ao
Gb3, visam bloquear a Stx, administradas por via oral ou
parenteral
ARMSTRONG e col. 1995.
ensaios clínicos em humanos foram
ITO e col., 2002,
inconclusivos quanto a eficácia da
TRACHTMAN e col, 2003
terapia
PATON e col., 2000.
Referência
Imunoterapia
Uso de anticorpos monoclonais neutralizantes que possam
conferir imunidade passiva ao indivíduo já infectado. A
proteção é imediata mas temporária. Efeitos colaterais
reduzidos.
Anticorpos aprovados em testes
clínicos e aprovados para uso em
humanos
Vacinas
Imunização ativa gerando resposta imunológica (anticorpos) Pesquisa em nível laboratorial.
contra a toxina Stx. Promove imunidade duradoura com
Nenhuma formulação submetida a
caráter profilático.
testes clínicos
SHEORAN e col., 2003 DONOHUEROLFE, A. e col., 1990
TZIPORI e col., 2004
Detalhadas na tabela 2
Tabela 2. Estratégias vacinais atualmente em desenvolvimento para o controle da SHU.
Estratégia vacinal
Características
Principais vantagens
Principais desvantagens
Referência
Vacinas baseadas em
bactérias recombinantes
Bactérias recombinantes,
atenuadas ou não patogênicas,
capazes de expressar a
subunidade B da toxina Stx
in vivo
Baixo custo de produção,
imunização pela via oral e geração
de anticorpos de mucosa.
Risco de reversão
para formas virulentas.
Formulações complexas com
elementos que desencadeam
respostas inflamatórias
e efeitos adversos como
componentes da parede
celular bacteriana
BUTTERTON e col., 1997
ROJAS e col., 2010
GOMES e col., 2009
Vacinas baseadas em
toxóides
Formas atóxicas de Stx
(toxóides) obtidas por métodos
físicos ou químicos.
Composição menos complexa
baseada na toxina Stx. A vacina
mantém as propriedades
imunogênicas da toxina nativa e
permite a geração de anticorpos
neutralizantes.
Restrições em relação à
segurança em função do
processo de inativação
da toxina sem o
comprometimento de suas
propriedades imunológicas.
LUDWIG e col., 2002,
BIELASZEWSKA e col., 1997
Vacinas baseadas em
formas atóxicas de Stx
Formas atóxicas de Stx geradas
por técnicas de mutagênese
sítio-específica na subunidade A
Mantém as propriedades
imunogênicas da vacina. Permite a
indução de anticorpos neutralizantes
contra a toxina nativa.
Alto custo relacionado à
purificação da toxina mutante.
ISHIKAWA e col., 2003,
SMITH e col., 2006,
Vacinas baseadas em
proteínas recombinantes
ou peptídeos sintéticos
Formas recombinantes da
toxina Stx, (subunidade B
com ou sem fragmentos da
subunidade A) produzidas em
sistemas heterólogos e peptídeos
sintéticos administrados com
adjuvantes vacinais
Composição definida. Ausência de
efeitos colaterais.
Alto custo de produção. Baixa
imunogenicidade exige o uso
de adjuvantes.
HARARI e col., 1988
BOYD e col., 1991
ZHU e col., 2007
BYUN e col., 2001
MARCATO e col., 2001.
TSUJI et al., 2008
Vacinas de DNA
Vacinas baseadas em moléculas
de DNA que promovem a síntese
de formas atóxicas de Stx
pelas células transfectadas do
indivíduo vacinado
Facilidade de obtenção e baixo
custo de produção. Estabilidade
térmica.
Baixa imunogenicidade.
Requer múltiplas doses
para induzir a produção de
anticorpos.
CAPOZZO e col., 2003,
BENTANCOR e col., 2009
Outra estratégia envolve o uso de
peptídeos sintéticos correspondendo a
sequências da subunidade B (HARARI e
col., 1988, 1990, BOYD e col., 1991). Esses peptídeos correspondem geralmente
a regiões hidrofílicas da proteína, ou seja,
trechos da molécula que estão expostos
na toxina permitindo o reconhecimento
por anticorpo. Embora resultados iniciais
tenham sido promissores em condições
experimentais, o alto custo de produção
e a baixa imunogenicidade restringiram o
aprimoramento dessa estratégia vacinal.
Vacinas baseadas em ácidos
nucléicos purificados (vacinas
de DNA)
Vacinas de DNA empregam a informação genética do patógeno para a geração
de plasmídeos purificados como constituintes da formulação vacinal. O DNA
plasmidial consiste em um promotor capaz
de controlar a expressão de um ou mais
antígenos em células de mamíferos após
a inoculação em tecido muscular, resultando na produção do antígeno vacinal alvo.
Resultados promissores foram obtidos em
condições experimentais com formulações
que codificam a subunidade B e porções
atóxicas da subunidade A (CAPOZZO e
col., 2003, BENTANCOR e col., 2009).
Como principais vantagens dessa estratégia estão o baixo custo de produção e a
simplicidade do processo de preparação
que prescinde da purificação do antígeno
alvo. No entanto, a baixa imunogenicidade
das formulações testadas, sobretudo, para
a produção de anticorpos específicos, indica que aprimoramentos ainda devem
ser alcançados antes que essas vacinas
possam ser testadas em seres humanos.
Imunoterapia
A imunoterapia passiva representa
uma alternativa real para o tratamento
da SHU em pessoas infectadas. A inoculação intravenosa de anticorpos antiStx em camundongos e suínos mostrou
ser capaz de neutralizar a toxina antes
que danos irreversíveis ocorram nos
tecido alvo (SHEORAN e col., 2005,
DONOHUE-ROLFE e col., 1999). De
forma semelhante ao tratamento de pessoas picadas por cobras venenosas, a
efetividade da imunoterapia está restrita
a um reduzido intervalo de tempo entre
a infecção e o período em que a toxina
está na circulação sanguínea. Quando
administrada no início da fase diarréica a
imunoterapia pode reduzir drasticamente os riscos de desenvolvimento da SHU
(TZIPORI e col., 2004). Alguns anticorpos monoclonais foram licenciados para
uso em humanos (REICHERT, 2001). No
entanto, o custo elevado e as dificuldades inerentes a um diagnóstico rápido e
preciso limitam a aplicação desses reagentes (MATISE e col. , 2001).
45
Perspectivas para o
controle preventivo ou
terapêutico da SHU
Cerca de três décadas se passaram
entre a descoberta da associação entre
a produção da toxina Stx por linhagens
de EHEC e os sintomas característicos
da SHU. No entanto, ainda não dispomos
de um tratamento ou profilaxia eficaz no
combate da doença que mata ou deixa
sequelas permanentes em centenas de
pessoas a cada ano. Nos últimos anos,
avanços importantes no diagnóstico rápido da bactéria e no monitoramento e controle do patógeno em alimentos contribuíram para a redução de surtos da doença
em diferentes partes do mundo. Por outro
lado, as dificuldades encontradas no desenvolvimento de vacina ou imunoterapia
eficaz para o controle da SHU revelam
que tal desafio só poderá ser vencido com
muita dedicação e persistência de grupos
de pesquisa que trabalham na área.
As pesquisas voltadas para a busca
de uma vacina contra EHEC revelaram
alguns aspectos importantes que nos
ajudam a planejar trabalhos futuros. A
toxina Stx, representa o principal alvo a
ser neutralizado e para tal é necessário
que níveis elevados de anticorpos neutralizantes estejam presentes entre o momento de entrada na corrente sanguínea
e a interação da toxina com as células
alvo. Por outro lado, pesquisas revelaram
que a toxina Stx, seja na forma de toxóide ou de proteína recombinante, é pouco
imunogênica e/ou altamente tóxica dificultando a obtenção de antígenos seguros
e com imunogenicidade elevada. Nesse
sentido, o emprego da imunoterapia passiva baseada em anticorpos, sejam esses
policlonais ou monoclonais, se destaca
entre as alternativas até hoje testadas
para o controle da SHU. No entanto, o sucesso dos anticorpos monoclonais encontra uma barreira no custo elevado e indica
que as buscas de vacinas ou imunoterapias clássicas, com custo mais reduzido,
não devam ser abandonadas. Para tal a
pesquisa de formulações que garantam
a produção de altos níveis de anticorpos
neutralizantes é uma prioridade.
Finalmente deve ser lembrado que a
SHU é consequência de uma infecção
alimentar. Treinamento da classe médica e o monitoramento epidemiológico
46
do agente infeccioso em alimentos, rebanhos ou pacientes com diarréia sanguinolenta devem ser estimulados assim
como o controle rigoroso de alimentos utilizados pela população. Tais medidas podem contribuir de forma expressiva para
a redução dos índices de mortalidade e
morbidade associados à doença. Por fim,
a mudança de hábitos alimentares, como
a ingestão de carne mal cozida, pode
contribuir para que o número de pessoas
afetadas pela doença decline nos locais
onde o problema está instalado e contribua para que o patógeno não se dissemine em países, como o Brasil, onde a
incidência da síndrome ainda é baixa.
Referências
ARMSTRONG, G. D. e col. A phase-1 study
of chemically-synthesized verotoxin (Shiga like
toxin) Pk-trisaccharide receptors attached to
chromosorb for preventing hemolytic uremic
syndrome. J. Infect Dis. v. 171, p. 1042-5. 1995
BENTANCOR, L. V et al. DNA vector encoding the enterohemorragic Escherichia coli
(EHEC) Shiga-like toxin 2 (Stx2) A2 and B
subunits confers enhanced immunogenicty
and protective immunity to Stx challenge in
the murine model. Clin. Vaccine Immunol. v.
16 (5), p. 712-18. 2009.
BIELASZEWSKA, M. e col. Localization of intravenously administered verocytotoxins (Shiga-like toxins) 1 and 2 in rabbits immunized
with homologous and heterologous toxoids
and toxin subunits. Infect. Immun., v. 65, p.
2509-2516, 1997.
BOYD, B.; RICHARDSON, S.; GARIÉPY,
J. Serological response to the B subunit of
Shiga-like toxin 1 and its peptide fragments
indicate that the B subunit is a vaccine candidate to counter the action of the toxin. Infect.
Immun., v. 59, p. 750-757, 1991.
BUTTERTON, J.R. e col.. Coexpression of
the B Subunit of Shiga toxin 1 and EaeA from
enterohemorrhagic Escherichia coli in Vibrio
cholerae vaccine strain. Infect Immun., v. 65,
p. 2127-2135, 1997.
BYUN, Y. e col. Nasal immunization with E.
coli verotoxin 1 (VT1)-B subunit and a nontoxic mutant of cholera toxin elicits serum
neutralizing antibodies. Vaccine, v. 19, p.
2061-2070, 2001.
CAPOZZO, A. e col. Development of DNA
vaccines against Hemolytic Uremic Syndrome
in a murine model. Infect. Immun., v. 71, p.
3971-3978, 2003.
DONOHUE-ROLFE, A. e col. Antibody based
protection of gnobiotic piglets infected with
Escherichia coli O157:H7 against systemic
complications associated with Shiga toxin 2.
Infect. Immun. v. 67, p. 3645-48, 1990.
EXENI R. Síndrome Urémico Hemolítico.
Archivos Latinoamericanos de Nefrología
Pediátrica v. 1, p. 35-56. 2001.
GASSER, C., GAUTIER, E., EHECK, A.
Hamolytisch-uramishe syndrome: Bilaterale
Nierenrindennekrosen bei akuten erworbenen
hamolytischen Anamien. Schweiz Med Wochenschr v. 85, p. 905-9, 1955. In: TARR, P.
I. e col. Shiga toxin-producing Escherichia coli
and haemolytic uremic síndrome. Lancet. v.
365, p. 1073-86, 2005.
GIANANTONIO, C. A. e col. The hemolytic—
uremic syndrome. J. Pediatr. v. 54, p. 478491. 1964.
GOMES, P. A. D. P. e col. Antibody responses
elicited in mice immunized with Bacillus subtilis vaccine strains expressing Stx2B subunit of
enterohaemorragic Escherichia coli O157:H7.
Braz. J. Microbiol. v. 40, p. 332-7. 2009.
GRIFFIN, P. M., TAUXE, R. V. The Epidemiology of infections caused by Escherichia coli
O157:H7, other enterohemorrhagic Escherichia coli and the associated Hemolytic
Uremic Syndrome. Epidemiologic Reviews
v. 13, p. 60-98, 1991.
HARARI, I. e col. Synthetic peptides of Shiga
toxin B subunit induce antibodies which neutralize its biological activity. Infect. Immun., v.
56, p. 1618-1624, 1988.
IRINO, K. e col. Serotypes and virulence
markers of Shiga toxin-producing Escherichia
coli (STEC) isolated from dairy cattle in São
Paulo State, Brazil. Vet. Microbiol., v.105, p.
29-36, 2005.
ISHIKAWA, S. e col. Protection against Shiga
toxin 1 challenge by immunization of mice with
purified mutant Shiga toxin 1. Infect. Immun.,
v. 71, p. 3235-3239, 2003.
ITO, H. e col. Preventive effect of TAK-75IS on
complications of hemorrhagic colitis (results of
clinical study of TAK-75IS). Jpn. J. Antibiot.
v. 55, p. 203-27. 2002.
KAPLAN, B. S., CHESNEY, R. W. , DRUMMOND, K. N. Hemolytic uremic syndrome in
families. N. Engl. J. Med. v. 292, p. 1090–93.
1975. In: TARR, P. I. e col. Shiga toxin-producing Escherichia coli and haemolytic uremic
síndrome. Lancet. v. 365, p. 1073-86, 2005.
PATON, J. C.; PATON, A. W. Shiga toxin ‘goes
retro’ in human primary kidney cells Kidney
International v. 70, p. 2049-2051, 2006.
KARMALI, M. A. e col. Sporadic cases of
Hemolytic Uremic Syndrome associated with
faecal cytotoxin and cytotoxin-producing
Escherichia coli in stools. Lancet, 619-620,
1983.
PETERSON, R. E. e col., Efficacy of Dose Regimen and Observation of Herd Immunity from
a Vaccine against Escherichia coli O157:H7
for Feedlot Cattle. Journal of Food Protection, v. 70 (11) p. 2561–2567, 2007.
KONOWALCHUK, J., SPEIRS, J. I., STRAVIC,
S. Vero response to a cytotoxin of Escherichia
coli. Infect. Immun.,v. 18, p. 775-9, 1977.
POTTER, A. A. e col. Decreased shedding of
Escherichia coli O157:H7 by cattle following
vaccination with type III secreted proteins.
Vaccine, v. 22, p. 362-369, 2004.
LUDWIG, K. e col. Cross-protection against
challenge by intravenous Escherichia coli
verocytotoxin 1 (VT1) in rabbits immunized
with VT2 toxoid. Can. J. Microbiol., v. 48, p.
99-103, 2002.
MARCATO, P. e col. Immunoprophilactic potential of cloned Shiga toxin 2 B subunit. J.
Infect. Dis., v.183, p. 435-443, 2001.
MATISE, I. e col. Intervention with Shiga toxin
(Stx) antibody after infection by STx-producing Escherichia coli. J. Infect. Dis. v. 183, p.
347–50. 2001.
OLIVEIRA, M. G. Diversity of virulence profiles of Shiga toxin-producing Escherichia coli
serotypes in food-producing animals in Brazil.
International Journal of Food Microbiolog.
v. 127, p.139-146, 2008.
PALERMO, M. S., EXENI, R. A., FERNÁNDEZ, G. C. Interventions in Hemolytic Uremic
Syndrome (HUS), the major Shiga toxin-related complication in E. coli O157:H7 infections.
Exp. Rev. Anti-Infective therapy v. 7(6),
p.697-707 (2009).
PATON, J. C.; PATON, A. W. Pathogenesis
and diagnosis of Shiga toxin-producing Escherichia coli infections. Clin. Microbiol. Rev.,
v. 11 p. 450-479, 1998.
PATON, A. W.; MORONA, R.; PATON, J. C.
A new biological agent for treatment of Shiga
toxigenic Escherichia coli infections and dysentery in humans. Nat. Med., v. 6, p. 265-270,
2000.
RIVAS, M. e col. The epidemiology of hemolytic uremic syndrome in Argentina. Diagnosis of the etiologic agent, reservoirs and
routes of transmission. Medicina (B Aires).
Suppl 66. v. 3, p. 27-32. 2006.
REICHERT, J. M. Monoclonal antibodies and
the clinic. Nat. Biotechnol. v. 19, p. 819–22.
2001
RILEY, L. W. e col. Hemorrhagic colits associated with a rare Escherichia coli serotype. N.
Engl. J. Med. v. 308 (12), p. 681-5. 1983.
ROJAS, R. L. G.; GOMES, P. A D. P.; BENTANCOR, L. V.; SBROGIO-ALMEIDA, M. E.,
COSTA, S. O. P.; MASSIS, L. M; FERREIRA,
R. C. C.; PALERMO, M. S.; FERREIRA, L. C.
S. Salmonella Typhimurium vaccine strains
encoding a non-toxing Stx2 induce partial protective immunity to the toxin expressed by enterohemorragic Escherichia coli (EHEC). Clin.
Vaccine Immunol. v. 17(4) p. 529-36. 2010.
SHEORAN, A. S. e col. Stx2- specific human
monoclonal antibodies protect mice against
letal infection with Escherichia coli expressing
Stx2 variants. Infect. Immun., v. 71, p. 31253130. 2003.
SMITH, M. J. e col. Development of a hibrid
shiga holotoxoid vaccine to elicit heterologous
protection against Shiga toxin types 1 and 2.
Vaccine, v. 24, p. 4122-4129, 2006.
SMITH, D. R. e col. A Two-dose regimen of a
vaccine against type III secreted proteins reduced Escherichia coli O157:H7 colonization
of the terminal rectum in beef cattle in commercial feedlots. Foodborne Pathogens and
Disease. v. 6 (2), p. 155-61. 2009.
SPIZZIRRI F. D. e col. Childhood hemolytic
uremic syndrome in Argentina: long term
follow-up and prognostic features. Pediatr.
Nephrol. v. 11, p. 156-60. 1997.
TARR, P. I. e col. Shiga toxin-producing Escherichia coli and haemolytic uremic síndrome. Lancet. v. 365, p. 1073-86, 2005.
TRACHTMAN, H. e col. Effect of an oral Shiga
toxin-binding agent on diarrhea-associated
hemolytic uremic syndrome in children. JAMA
v. 290, p. 1337-44. 2002.
TSUJI, T. e col. Protection of mice from Shiga
toxin-2 toxicemia by mucosal vaccine of Shiga
toxin 2B-His with Escherichia coli enterotoxin.
Vaccine. v. 26, p. 469-476, 2008.
TZIPORI, S. e col. Antibody therapy in the
management of Shiga toxin-induced hemolytic uremic syndrome. Clin. Microbiol. Rev.,
v. 17, p. 926-941, 2004.
VETTORATO, M. P. Shiga toxin-producing
Escherichia coli and atypical enteropathogenic Escherichia coli strains isolated from
healthy sheep of different populations in São
Paulo, Brazil. Letters in Applied Microbiology, v. 49, p. 53-59, 2009.
ZHU, C. e col. Protection against Shiga toxinproducing Escherichia coli infection by transcutaneous immunization with Shiga toxin B
subunit. Clin. Vaccine Immunol., v. 15. p.
359-366, 2008.
www.cdc.gov.
47
Aprovado pela SBM
confiança na qualidade
do produto
Em 2009 a Sociedade Brasileira de Microbiologia implantou o Selo de Aprovação
SBM, com o objetivo de promover a aprovação de produtos sanitariamente adequados
quanto à presença de microrganismos. Em paralelo ao Selo, foi criado o Departamento
de Avaliação de Produtos pela SBM, responsável pelas análises e pesquisas dos produtos, incluindo as embalagens e informações ao consumidor.
A aprovação do produto começou a ser uma exigência do mercado e os fabricantes
passaram a se preocupar mais em adequar sua produção e seus produtos dentro de
parâmetros qualitativos e com preços competitivos. O programa de aprovação da SBM
visa certificar produtos quanto a sua qualidade microbiológica e/ou sua capacidade germicida.
O processo de aprovação pela SBM segue um programa internacional, cujas diretrizes emanam da Organização Mundial de Saúde.
O primeiro produto a receber o Selo de Aprovação da SBM foi o Dettol® produzido
pela empresa Reckitt-Benckiser nas formas de sabonete em barra, sabonete líquido e
gel anti-séptico. Este selo foi concedido após avaliação de parecer técnico-específico
emitido por especialistas indicados pela SBM.
Como solicitar o Selo SBM
As empresas interessadas em encaminhar seus produtos para avaliação do programa de aprovação da SBM devem:
- Enviar carta à Sociedade Brasileira de Microbiologia e solicitar que o produto, fabricado ou comercializado no Brasil seja analisado
para receber o Selo de Aprovação SBM;
- Também é preciso enviar estudos já realizados sobre o produto, como análises, pesquisas e formulação, além de informações
adicionais que houver;
- Caso a comissão de avaliação achar necessário, novos testes em laboratórios credenciados poderão ser solicitados.
Depois do envio deste material, o SBM firma com a empresa solicitante um protocolo de pesquisa, informando os objetivos, procedimentos e tempo de estudo. A realização dos ensaios dura entre 30 a 90 dias e todas as análises realizadas, materiais e equipamentos
utilizados obedecem a normas específicas para cada produto. Sendo o produto aprovado, deverá a Empresa assinar um Contrato que
rege todos os pontos do relacionamento com a SBM.
Para tornar possível mais essa atividade da SBM, foi realizado um convênio de parceria com empresa tradicional em proficiência, a
Controllab.
Para obtenção de maiores esclarecimentos entre em contato com:
[email protected]
48
SBM in foco - A forma
direta de falar com
os microbiologistas.
Apresentamos o plano de comercialização para 4 edições da Revista Microbiologia in Foco.
Periódico da Sociedade Brasileira de Microbiologia, com tiragem de 2000 exemplares e
distribuição gratuita. Revista de informação e divulgação sobre temas em bacteriologia,
micologia e virologia nas várias áreas de abrangência da Microbiologia: ambiental, agrícola, básica, de alimentos, industrial, médica humana e veterinária e oral.
A revista ainda conta com espaços para divulgação de consensos, agenda científica,
atualidades e oportunidades de trabalho.
Venha fazer parte deste veículo de informação atualizada!
Atenciosamente,
Marina Baquerizo Martinez e Carlos P. Taborda - Editores
Sociedade Brasileira de Microbiologia
página inteira
21 x 28 cm
Para anunciar entre em contato com José Jair Cagnotto:
E-mail: [email protected]
Telefone: (11) 3813-9647 ou 3037-7095
1/2 página
18 x 12 cm
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Agenda in Foco
I Simpósio Brasileiro sobre Meningites Bacterianas
Data: 01/04/2011 à 02/04/2011.
Local: Centro de Convenções Frei Caneca
São Paulo, SP – Brasil.
XI International Meeting on Paracoccidioidomycosis
Data: 01/05/2011 à 04/05/2011.
Local: Hotel Fazendo Mazzaropi – Taubaté, SP – Brasil.
26º Congresso Brasileiro de Microbiologia
Data: 02/10/2011 à 06/10/2011.
Local: Rafain Palace Hotel e Convention Center
Foz do Iguaçu, PR – Brasil.
XXI Congresso Latino-Americano de Microbiologia
Data: 28/10/2012 à 01/11/2012
Local: Mendes Convention Center – Santos, SP – Brasil
50
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Aperfeiçoamento em Microbiologia
• Microbiologia Clínica
• Microbiologia Industrial
• Microbiologia de Alimentos
• Microbiologia Ambiental
Início das turmas em janeiro e julho
Coodernadora: Dra. Marina Baquerizo Martinez
Profa. Titular da FCF-USP
Público Alvo
Graduados em
• Biologia
• Medicina Veterinária
• Engenharia de Alimentos
• Engenharia Química
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Interessados em atuar na área de microbiologia de
alimentos, ambiental, industrial e clínica.
Profissionais que atuam na área de microbiologia de
alimentos, ambiental, industrial e clínica. E queiram
aprimorar seus conhecimentos específicos.
Seleção: Ficha de inscrição e Envio de currículo
Seleção: Ficha de inscrição e Envio de currículo
Duração: 18 meses, aulas quinzenais, sextas-feiras
das 19:00 a 23:00 horas e sábados das 9:00 as
18:00 horas
Duração: 8 meses, aulas quinzenais, sextas-feiras
das 19:00 a 23:00 horas e sábados das 9:00 as
18:00 horas
Carga Horária Total: 760 horas
Carga Horária Total: 180 horas
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Av. Prof. Lineu Prestes 2415 ICB III | Cidade Universitária | São Paulo | SP | CEP: 05508-000
Tel: 11 3037-7095 | 11 3813-9647 | [email protected]
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FIQUE SÓCIO
Os sócios da SBM têm direito a descontos especiais nos eventos
promovidos ou patrocinados pela SBM . Para usufruir do desconto
de associado em nossas atividades é imprescindivel estar anuente
a dois anos consecutivos com a sociedade. Além disso, têm acesso
livre à revista científica Brazilian Journal of Microbiology (BJM e que
se destina à publicação de trabalhos de pesquisa originais, notas
breves e revisões, envolvendo todos os aspectos da Microbiologia.
É considerada uma das revistas científicas mais importantes do
nosso país. O BJM tem uma política muito severa de avaliação dos
trabalhos submetidos à publicação, sendo cada manuscrito avaliado
por pelo menos dois revisores criteriosamente selecionados.
A revista Microbiologia in Foco tem o objetivo de promover o
intercâmbio de informações científicas entre os associados, publicando os autores nacionais de expressão. Adota o mesmo critério
de avaliação e excelência que a SBM sempre adotou. Enviaremos
o último número da Microbiologia in Foco a todos os novos associados, após sua efetiva associação, um exemplar da revista, no
período composto entre os dias 05 e 10. Nos meses seguintes, os
associados receberão regularmente os novos números publicados
da revista.
Fique sócio da SBM.
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Lembre-se: um sócio da SBM integra a maior e mais representativa associação da comunidade científica que atua na microbiologia nacional.
Valores para associação
Categoria de Sócio ............................................... Anuidade 2011
Aluno de Graduação................................................... R$ 80,00
Aluno de Pós-Graduação
(Mestrado e Doutorado)............................................. R$ 130,00
Aluno de Pós-Doutorado............................................ R$ 160,00
Profissional................................................................ R$ 190,00
Biênio 2010-2011
Presidente
Adalberto Pessoa Junior, USP-SP
1º Tesoureiro
Carlos Pelleschi Taborda, USP-SP
Vice Presidente
Alexandre Soares Rosado, UFRJ-RJ
2º Tesoureiro
Patrícia Silva Cisalpino, UFMG-MG
1º Secretário
Carla Taddei de Castro Neves, USP-SP
Conselho Fiscal
Bernadette G. Franco, USP-SP
Sergio E. L. Fracalanza, UFRJ-RJ
Agnes Marie Sá Figueiredo, UFRJ-RJ
2º Secretário
Lauro Santos Filho, UFPB-PB
Representantes de Área
SBM 2010-2011
Coleções de Cultura
Lara D. Salete, UNICAMP-SP
Carlos Augusto Rosa, UFMG
Microbiologia Clínica
Elizabeth de Andrade Marques, RJ
Jorge Luiz Mello Sampaio, Fleury-SP
Parasito-Hospedeiro
Sandro R. de Almeida, USP-SP
Dario Simões Zamboni, USP-SP
Ensino
Alexandre Lourenço, UNIP/UNISA/FMU-SP
Marcela Pellegrini Peçanha, PUC/UNESP
Microbiologia Industrial
José Gregório, USP-SP
Eleni Gomes, UNESP-Rio Preto
Microbiologia do Solo
Itamar Soares de Melo, Embrapa-SP
Mariangela Hungria, Embrapa-PR
Infecção Hospitalar
Ana Lúcia Darini, USP-SP
Afonso Luis Barth, UFRGS
Microbiologia Médica
Leila Carvalho Campos, FIOCRUZ-BA
Waldir P. Elias Jr, Instituto Butantan-SP
Microbiologia Veterinária
Walter Lilenbaum, UFF-RJ
Odir Antônio Dallagostin, UFPel
Microbiologia de Alimentos
Bernardete G. Franco, USP-SP
Ricardo Souza Dias, FUNED-MG/Metodista de Minas
Micologia
Célia Maria de Almeida Soares, UFG-GO
Marcio Rodriges, UFRJ-RJ
Virologia
Maurício L. Nogueira, FAMERP-SP
Luciana Barros de Arruda, UFRJ-RJ
Microbiologia Ambiental
Irma Grivera, USP-SP
Ricardo Henrique Kruger, UnB
Micotoxinas
Marta Taniwashi, ITAL-SP
Myrna Sabino, Instituto Adolfo Lutz-SP
Genética de Microrganismos e Bioinformática
Vasco Ariston de Carvalho Azevedo, UFMG-MG
Artur Luiz da Costa Silva, UFPA