Validação do método Colilert®-18/Quanti-Tray®
para contagem de E. coli e bactérias
coliformes em água
janeiro de 2008
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Validação do método Colilert-18/Quanti-Tray
para contagem de E. coli e bactérias
coliformes em água
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ONE IDEXX DRIVE
WESTBROOK, MAINE 04092
ESTADOS UNIDOS
VERSÃO FINAL CORRIGIDA, 30 de janeiro de 2008
Validação do método Colilert®-18/Quanti-Tray® para contagem de
E. coli e bactérias coliformes em água
1 Introdução
O método Colilert®-18/Quanti-Tray® é um ensaio criado especificamente para
contagem NMP de E. coli e bactérias coliformes em água, potável ou não, com ou sem
tratamento.
O Colilert-18 mede simultaneamente o total de coliformes e de E. coli em amostras de
água. A base do ensaio é a tecnologia de substrato definido (DST, sigla em inglês de
Defined Substrate Technology). O método consiste em misturar o reagente DST com
100 ml de amostra e incubar em um ensaio tipo presença/ausência (PA) ou tipo
número mais provável (NMP). A amostra adquire cor amarela quando as bactérias
coliformes metabolizam o ONPG, que serve como nutriente e indicador, e fluoresce
sob luz UV quando a E. coli metaboliza o MUG, um outro nutriente e indicador. O
Colilert-18 permite detectar essas bactérias simultaneamente à concentração de 1
ufc/100 ml em 18 horas na presença de bactérias heterotróficas em concentrações de
até 2 x 106 por 100 ml de amostra.
O Quanti-Tray foi projetado para produzir contagens quantitativas de bactérias de
amostras de até 100 ml usando reagentes DST. A mistura reagente-amostra é
adicionada a uma placa Quanti-Tray, que é então selada com o selador Quanti-Tray
Sealer e depois incubada. A placa é projetada de forma a conter 51 cavidades com a
mistura reagente-amostra após a selagem. O selador é uma ferramenta motorizada de
selagem por calor, projetado para selar a Quanti-Tray. Em seguida, as cavidades
positivas são contadas e os NMPs de bactérias coliformes e/ou E. coli são
determinados a partir de uma tabela.
2 Aplicações do Colilert-18/Quanti-Tray
A principal aplicação do Colilert®-18/Quanti-Tray® é a análise de águas, potáveis ou
não. O Colilert-18/Quanti-Tray já foi aprovado para tal aplicação na América do Norte
(EUA, Canadá e México), América do Sul (Brasil, Argentina, Chile e Colômbia), Europa
(Dinamarca, Alemanha, Hungria, Islândia, Irlanda, Itália, Noruega, Espanha e Reino
Unido) e Extremo Oriente (Japão e Coréia). Também já foi aprovado para análise de
água engarrafada pela International Bottled Water Association e de água purificada
para uso farmacêutico pela US Pharmacopeial Convention. Nos EUA, a Agência de
Proteção Ambiental (USEPA) já sancionou o Colilert-18/Quanti-Tray para pesquisa de
coliformes e E. coli em água de fontes e em águas subterrâneas e pesquisa de E. coli
em águas ambientais, águas para uso recreativo e águas residuais.
3 Identificação de organismos-alvo (ISO/TR 13843 Seções 10.2.1 e 9.2)
No método Colilert®-18/Quanti-Tray®, as bactérias coliformes são aquelas que
produzem coloração amarela por meio da ação da β-galactosidase sobre o
ortonitrofenil-β-D-galactopiranosídeo (ONPG), e a E. coli é definida como uma bactéria
coliforme que apresenta fluorescência azul sob luz UV devido à ação da
β-glicuronidase sobre o 4-metilumbeliferil-β-D-glicuronídeo (MUG).
1
3.1 Teste em cultura pura (ISO/TR 13843 Seção 10.2.1)
As definições das reações promovidas por bactérias-alvo e por outras bactériasforam
confirmadas testando o Colilert-18/Quanti-Tray com culturas puras de cepas de
referência de E. coli, bactérias Gram-negativas coliformes e não-coliformes obtidasda
American Type Culture Collection. A Tabela 1 mostra as reações típicas dessas cepas
de referência, que são usadas pela IDEXX para controle de qualidade de rotina do
Colilert-18/Quanti-Tray.
Tabela 1 Cepas de referência de E. coli, bactérias coliformes e outras bactérias
Gram-negativas para confirmação das reações positivas e negativas
típicas na placa Colilert®-18/Quanti-Tray®.
Bactéria
Nº. ATCC*
Reação no Colilert-18
Forte coloração amarela
Escherichia coli
25922
Forte fluorescência azul sob UV
Forte coloração amarela
Citrobacter freundii
8090
Não fluoresce sob UV
Forte coloração amarela
Klebsiella pneumoniae
31488
Não fluoresce sob UV
Forte coloração amarela
Enterobacter aerogenes
13048
Não fluoresce sob UV
Não cresce
Pseudomonas aeruginosa
10145
Sem coloração amarela
Não fluoresce sob UV
Não cresce
Aeromonas hydrophila
35654
Sem coloração amarela
Não fluoresce sob UV
* American Type Culture Collection (coleção de cepas bacterianas)
3.2 Estudos de sensibilidade, especificidade e seletividade (ISO/TR 13843 Seção
9.2)
A ISO/TR 13843 define essas características dos métodos microbiológicos da seguinte
forma:
Sensibilidade:
Fração dos positivos que foi corretamente classificada na contagem
presuntiva;
Especificidade: Fração dos negativos que foi corretamente classificada na contagem
presuntiva;
Seletividade:
Relação entre o número de colônias-alvo e o total de colônias no
volume da amostra.
No Colilert-18/Quanti-Tray, essas características dizem respeito ao número de
cavidades positivas para coliformes ou E. coli que realmente continham as bactérias
procuradas e com o número de cavidades negativas que realmente não continham as
bactérias procuradas. A sensibilidade, a especificidade e a seletividade do
Colilert-18/Quanti-Tray foram avaliadas identificando-se isolados positivos para
β-galactosidase e β-glicuronidase em cavidades positivas produzidas usando-se
amostras naturais obtidas pelo repique de água potável declorada com água de rios.
Foram usadas três fontes de água de superfície — dois rios e um reservatório de água
de superfície — para se obter um litro de amostras de água potável declorada
2
repicada. Após a incubação, foram escolhidas 100 cavidades amarelas e nãofluorescentes de 30 amostras (3 a 5 de cada amostra), selecionadas de forma a
garantir que todas as intensidades de amarelo encontradas estivessem presentes. Da
mesma forma, foram selecionadas 100 cavidades amarelas e fluorescentes, de modo
a abranger todos os níveis de fluorescência encontrados. Das 30 amostras, apenas 54
cavidades negativas estavam disponíveis, sendo que duas delas apresentaram
proliferação com turbidez. As reações positivas e/ou negativas para β-galactosidase ou
β-glicuronidase foram confirmadas e os isolados identificados usando painéis de
identificação miniatura BBL Crystal E/NF (Becton, Dickinson and Company, Sparks,
MD, EUA).
3.2.1 Cálculo da sensibilidade, especificidade, seletividade e taxas de falsos
positivos e falsos negativos
Para cada parâmetro, os dados de identificação foram divididos em quatro categorias:
a = número de cavidades positivas que continham coliformes ou E. coli (positivos
verdadeiros)
b = número de cavidades negativas que continham coliformes ou E. coli (falsos
negativos)
c = número de cavidades positivas que não continham coliformes ou E. coli (falsos
positivos)
d = número de cavidades negativas que apresentaram proliferação e não continham
coliformes ou E. coli (negativos verdadeiros).
A sensibilidade, especificidade, seletividade e as taxas de falsos positivos e falsos
negativos foram calculadas pelas seguintes equações:
Sensibilidade = a / (a+b)
Especificidade = d / (c+d)
Seletividade = log10 [(a+c) / (a+b+c+d)]
Taxa de falsos positivos = c / (a+c)
Taxa de falsos negativos = b / (b+d)
Foi calculado ainda um outro parâmetro, a eficiência (E), definido como a fração de
cavidades classificadas corretamente, pela fórmula E = (a+d) / (a+b+c+d).
3.2.2 Coliformes não-E. coli
Foram obtidos isolados para β-galactosidase de todas as 100 cavidades amarelas sem
fluorescência que foram subcultivadas. Nenhuma dessas placas apresentou reação de
β-glicuronidase. O Apêndice A1 apresenta as reações de oxidase e indol, perfis BBL
Crystal E/NF e identificação desses isolados. Todos foram identificados como positivos
para β-galactosidase, e os negativos para β-glicuronidase são outras
Enterobacteriaceae que não E. coli. Ao todo, foram identificadas 23 espécies de E. coli
(Tabela 2).
3.2.3 E. coli
Os isolados de ß-galactosidase foram obtidos de todas as 100 cavidades amarelas
sem fluorescência que foram subcultivadas. O Apêndice A1 apresenta as reações
de oxidase e indol, perfis BBL Crystal E/NF e identificação desses isolados.
3
Noventa e nove isolados foram identificados como E. coli e o isolado restante, que
apresentou reação positiva para β-glicuronidase no painel Crystal E/NF, foi
caracterizado como Klebsiella oxytoca.
3.2.4 Cavidades negativas
Cinqüenta e quatro cavidades negativas foram subcultivadas e houve crescimento em
duas delas, com produção de colônias negativas para β-galactosidase e
β-glicuronidase, positivas para oxidase e negativas para indol (Apêndice A3). Ambas
foram classificadas como Shewanella putrefaciens pelo sistema BBL Crystal E/NF.
Não houve crescimento em nenhuma das outras 52 cavidades.
Tabela 2 Identificação pelo sistema Colilert®-18/Quanti-Tray® de bactérias
coliformes (número de isolados) obtidas de cavidades positivas para
coliformes não-E. coli
Cedecea lapegei (1)
Citrobacter amalonaticus (2)
Citrobacter freundii (10)
Enterobacter aerogenes (1)
Enterobacter asburiae (1)
Enterobacter cancerogenus (1)
Enterobacter cloacae (25)
Enterobacter sakazakii (7)
Escherichia vulneris (4)
Hafnia alvei (1)
Klebsiella oxytoca (4)
Klebsiella pneumoniae (6)
3.3 Determinação
especificidade
das
características
Kluyvera ascorbata (12)
Kluyvera cryocrescens (3)
Leclercia adecarboxylata (1)
Pantoea agglomerans (9)
Serratia fonticola (1)
Serratia liquefaciens (3)
Serratia marcescens (1)
Serratia odorifera (1)
Serratia plymuthica (4)
Serratia rubidea (1)
Serratia spp (1)
relacionadas
à
sensibilidade
e
à
3.3.1 Bactérias coliformes
No sistema Colilert-18/Quanti-Tray, os coliformes são microrganismos que produzem
coloração amarela (com ou sem fluorescência) e os resultados dos parâmetros
calculados foram:
Sensibilidade = a / (a+b) = 200 / (200+0) = 1
Especificidade = d / (c+d) = 2 / (0+2) = 1
Seletividade = log10 [(a+c) / (a+b+c+d)] = log10 [(200+0) / (200+0+0+2)] = -0,004
Taxa de falsos positivos = c / (a+c) = 0 / (200+0) = 0
Taxa de falsos negativos = b / (b+d) = 0 / (0+2) = 0
Eficiência (E) = (a+d) / (a+b+c+d) = (200+2) / (200+0+0+2) = 1
3.3.2 E. coli
No sistema Colilert-18/Quanti-Tray, a E. coli é o microrganismo que produz coloração
amarela e fluorescência. Os resultados dos parâmetros calculados foram:
Sensibilidade = a / (a+b) = 99 / (99+0) = 1
Especificidade = d / (c+d) = 102 / (1+102) = 0,99
Seletividade = log10 [(a+c) / (a+b+c+d)] = log10 [(99+1) / (99+0+1+102)] = -0,305
4
Taxa de falsos positivos = c / (a+c) = 1 / (99+1) = 0,01
Taxa de falsos negativos = b / (b+d) = 0 / (0+102) = 0
Eficiência (E) = (a+d) / (a+b+c+d) = (99+102) / (99+0+1+102) = 0,995
As análises dos dados mostraram que, para as bactérias coliformes, o método Colilert18/Quanti-Tray tem alta sensibilidade e especificidade, com zero de falsos positivos e
falsos negativos. A seletividade também é elevada: o valor encontrado de -0,004 é
muito superior ao valor de referência -1 sugerido pelo ISO/TR 13843 para métodos de
contagem de colônias. Como sua eficiência é igual a 1, o método pode ser
considerado altamente eficiente para bactérias coliformes. Os dados de identificação
mostraram que o Colilert-18/Quanti-Tray permite detectar uma ampla variedade de
bactérias coliformes.
O Colilert-18/Quanti-Tray também é altamente sensível e específico para E. coli: a
seletividade (-0,305) é inferior à observada para bactérias coliformes, mas essa
diferença é esperada porque o teste tem natureza dual, ou seja, a E. coli é um subtipo
de bactéria coliforme. Apesar disso, a seletividade é superior ao valor de referência
estipulado pela norma ISO/TR 13843. O método é altamente eficiente (E = 0,995) para
detecção de E. coli.
4 Incerteza na contagem (ISO 13843 Seção 10.2.1 e Anexo B)
A repetibilidade e a reprodutibilidade são duas variáveis que estimam a confiabilidade
de um método analítico. Pode-se medi-las em um método como um todo por meio de
testes em amostras naturais apropriadas ou observando-se a incerteza na contagem
durante a leitura dos resultados do método em questão. Os resultados produzidos por
qualquer método dependem da facilidade com que o operador consegue contar as
colônias ou reações de NMP positivo. Esses fatores são influenciados pelas diferenças
na morfologia das colônias dos microrganismos (procurados ou não) durante a
contagem em placas de ágar e pela clareza das reações positivas e negativas em
testes NMP em caldos de cultura. Portanto, as medições das incertezas associadas à
contagem podem indicar possíveis problemas associados à adoção disseminada do
método.
As definições de repetibilidade (r) e reprodutibilidade (R) são:
Repetibilidade:
Grau de concordância dos resultados de medições sucessivas do
mesmo objeto, realizadas sob condições idênticas de medição
Reprodutibilidade: Grau de concordância dos resultados de medições do mesmo
objeto, realizadas sob condições diferentes de medição
Na contagem de colônias microbiológicas em placas de ágar ou reações positivas em
testes NMP, a 'condição' que varia ou permanece a mesma é o indivíduo que faz a
contagem. Nesse contexto, portanto, a repetibilidade é a obtenção de contagens
idênticas quando um operador conta mais de uma vez, e a reprodutibilidade é a
obtenção de contagens semelhantes quando dois ou mais operadores fazem a
contagem. De modo geral, a avaliação da reprodutibilidade é mais informativa que o
estudo da repetibilidade.
O Anexo B da ISO/TR 13843 dá orientações sobre o uso de desvios padrão relativos
(DPR) para avaliar a repetibilidade e a reprodutibilidade das contagens. Também
recomenda que o valor ideal do DPR com o uso de culturas puras seja inferior a 0,02,
ou seja, o desvio padrão máximo não deve superar 2%. Os analistas da IDEXX
fizeram estudos de incerteza das contagens, cujos resultados são apresentados no
5
Apêndice B. As contagens foram feitas sem que os analistas soubessem os valores
obtidos pelos outros analistas. Os NMPs foram anotados como números inteiros nãofracionários. Os DPRs relativos dos NMPs em um sistema Colilert®-18/Quanti-Tray®
inoculado com um coliforme típico (Klebsiella pneumoniae ATCC 33186) e E. coli
(ATCC 25922) foram:
Klebsiella pneumoniae
Repetibilidade
=
Reprodutibilidade =
0,022
0,020
Escherichia coli
Repetibilidade
=
Reprodutibilidade =
0,000
0,007
Os valores para o coliforme típico são da ordem do valor de referência de <0,02
(ISO/TR 13843 Seção B1) e os valores para E. coli são bem inferiores ao valor de
referência. Isso indica que o Colilert-18/Quanti-Tray é capaz de produzir contagens
confiáveis de NMP para Klebsiella pneumoniae e E. coli.
5 Robustez: Sensibilidade ao tempo (ISO/TR 13843 Seções 10.2.2 e B.4)
Dois aspectos da robustez são importantes para o sistema Colilert®-18/Quanti-Tray®: o
período de incubação recomendado de 18–22 horas e a vida útil de 15 meses do meio
Colilert-18 armazenado a 4–25ºC. O Apêndice C mostra as contagens pareadas de
análises de suspensões de pequenos números de culturas de referência de E. coli,
Klebsiella pneumoniae e Citrobacter freundii depois de 18 horas e 22 horas de
incubação no mesmo lote de Colilert-18 após armazenamento a 25 °C por até 541
dias.
5.1 Robustez do tempo de incubação
Após 18 e 22 horas de incubação, houve 48 resultados de contagens pareadas. Todos
os 48 pares tiveram valores idênticos para E. coli após o tempo de incubação. Para
Klebsiella pneumoniae, 47 (98%) das contagens foram idênticas. Na última contagem
pareada, apenas uma cavidade se tornou positiva após 22 horas de incubação. Com o
Citrobacter freundii, porém, a contagem aumentou após 22 horas de incubação, com
13 (27%) a mais de amostras positivas que após 18 horas de incubação. Todas menos
uma dessas contagens mais elevadas foram aumentos de uma ou duas cavidades
positivas. A cepa de Citrobacter parece mostrar uma taxa de crescimento mais lenta
ou uma cinética enzimática mais fraca em comparação a outras bactérias testadas.
Segundo os dados de experimentos, o período de incubação recomendado de 18–22
horas é robusto para E. coli e bactérias coliformes resistentes como a Klebsiella
pneumoniae, mas pode haver aumento das contagens àpós 22 horas de incubação,
em comparação a 18 horas, com algumas bactérias coliformes que crescem mais
lentamente ou produzem enzimas em pequena quantidade.
O aumento das contagens durante um período específico de incubação (p.ex. 18–24
horas para métodos de filtração em membrana típicos, como os descritos na ISO
9308-1) são um fenômeno bem descrito, especialmente com coliformes ambientais.
No entanto, o uso das contagens após 18 horas é considerado aceitável, por motivos
operacionais e práticos, se não houver aumento excessivo das contagens após
incubação prolongada.
5.3 Robustez na armazenagem do Colilert®-18
6
O meio Colilert-18 armazenado a 4–25°C tem uma vida de prateleira de 12 meses. Os
dados para as três bactérias testadas com a mesma amostra de meio de cultura
armazenado a 25ºC não mostraram diferença no desempenho após armazenagem por
até 541 dias, uma durabilidade muito superior ao período de um ano estipulado pela
norma. Para esse teste, foi escolhida uma temperatura de armazenagem mais
elevada, pois ela seria mais passível de desestabilizar o meio de cultura Colilert-18
que em temperaturas de refrigeração.
6 Limite superior das contagens (ISO/TR 13843 Seções 10.2.4 e 6.3.3)
O Colilert®-18/Quanti-Tray® é um método NMP com intervalo de contagem arbitrário
entre 0 e 201, definido pelo número de cavidades na placa Quanti-Tray. Segundo a
Seção 6.3.3 da ISO/TR 13843, não se pode, por motivos práticos e estatísticos, definir
um limite superior para métodos NMP, "pois não existe uma relação simples entre a
precisão e o número de partículas introduzidas no sistema de detecção".
7 Precisão (ISO/TR 13843 Seções 10.2.5 e 9.5.5)
A precisão dos métodos NMP é descrita pelos intervalos de 95% de confiança
calculados para cada valor de NMP (ISO/TR 13843 Seção 9.5.5). O Apêndice D
mostra os intervalos de confiança para contagens obtidas com o Colilert®-18/QuantiTray®, calculadas usando o programa do Bacteriological Analytical Manual (BAM) da
US Food and Drug Administration (FDA), disponibilizado on-line em
http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-a2.html#excl.
É possível calcular um valor teórico para a repetibilidade de um NMP a partir dos
valores do NMP e de seus intervalos de confiança. O Apêndice D também mostra os
valores relativos de incerteza para cada NMP (log10SD, calculado a partir do intervalo
de 95% de confiança para NMP) e de repetibilidade (incerteza padrão relativa) na
forma de coeficientes de variação (CV%). Esses valores de Poisson servem como
indicadores de precisão mínima, podendo ser associados a outros dados disponíveis
em um laboratório (p.ex. variabilidade na decantação do volume de teste ou incertezas
na contagem) para se obter uma estimativa total da repetibilidade para cada NMP.
8 Bibliografia
8.1 Normas ISO
ISO 9308-1:2000 Qualidade da água: Detecção e contagem de Escherichia coli e
bactérias coliformes. Parte 1: Método de filtração por membrana. Genebra:
International Organisation for Standardization.
ISO/TR 13843:2000(E) Qualidade da água: Orientação sobre a validação de métodos
microbiológicos. Genebra: International Organisation for Standardization.
7
Apêndice A
Dados de estudos de sensibilidade, especificidade e seletividade
(ver Seção 3.2)
Apêndice A1
Identificação de isolados de cavidades amarelas e nãofluorescentes no sistema Colilert®-18/Quanti-Tray®
Isolado ref. Oxidase
Y1
Y2
Y3
Y4
Y5
Y6
Y7
Y8
Y9
Y10
Y11
Y12
Y13
Y14
Y15
Y16
Y17
Y18
Y19
Y20
Y21
Y22
Y23
Y24
Y25
Y26
Y27
Y28
Y29
Y30
Y31
Y32
Y33
Y34
Y35
Y36
Y37
Y38
Y39
Y40
Y41
Y42
Y43
-
Indol
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Perfil Crystal E/NF
5765637153
4764417153
4724477151
7764477153
4764477151
4724467153
5764475555
4760427053
5764637051
5766477152
7424676151
7764672153
7764476157
5764637151
5765677151
4764627151
7734457051
5765477157
7766276157
5764476153
3764217153
5764427151
7764637157
5764627452
7764627555
0764437152
7765275557
4760056153
5765276157
5764617151
5764677557
7564677151
4560477153
5464454151
5464654155
5764427151
5664456055
4764475555
5760467555
4764627051
5764677150
4760473151
5764637151
8
Identificação
Enterobacter sakazakii
Pantoea agglomerans
Kluyvera cryocrescens
Enterobacter cloacae
Kluyvera cryocrescens
Pantoea agglomerans
Klebsiella oxytoca
Pantoea agglomerans
Kluyvera ascorbata
Enterobacter cloacae
Citrobacter freundii
Enterobacter cloacae
Enterobacter sakazakii
Kluyvera ascorbata
Kluyvera ascorbata
Escherichia vulneris
Pantoea agglomerans
Klebsiella oxytoca
Serratia liquefaciens
Enterobacter cloacae
Cedecea lapagei
Pantoea agglomerans
Enterobacter sakazakii
Leclercia adecarboxylata
Klebsiella pneumoniae
Pantoea agglomerans
Serratia rubidaea
Enterobacter asburiae
Serratia liquefaciens
Kluyvera ascorbata
Klebsiella oxytoca
Enterobacter cloacae
Enterobacter cloacae
Citrobacter freundii
Citrobacter freundii
Pantoea agglomerans
Citrobacter freundii
Klebsiella pneumoniae
Klebsiella pneumoniae
Escherichia vulneris
Enterobacter cloacae
Enterobacter cloacae
Kluyvera ascorbata
Confiança
0,5861
0,7217
0,9829
0,9962
0,6287
0,7127
0,9825
0,9481
0,9264
0,9886
0,9335
0,8268
0,6102
0,9925
0,8702
0,5764
0,9932
0,8524
0,5712
0,8943
0,9835
0,7613
0,9734
0,999
0,9154
0,8776
0,9942
0,9504
0,5545
0,982
0,9555
0,9987
0,9961
0,9998
0,9994
0,7613
0,9973
0,9241
0,9413
0,9475
0,8043
0,9673
0,9925
Y44
Y45
Y46
Y47
Y48
Y49
Y50
Y51
Y52
Y53
Y54
Y55
Y56
Y57
Y58
Y59
Y60
Y61
Y62
Y63
Y64
Y65
Y66
Y67
Y68
Y69
Y70
Y71
Y72
Y73
Y74
Y75
Y76
Y77
Y78
Y79
Y80
Y81
Y82
Y83
Y84
Y85
Y86
Y87
Y88
Y89
Y90
Y91
Y92
Y93
Y94
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
5766476156
7765627157
5774677153
7775677555
7765627157
5464477553
7775637153
4774437151
5764677557
5464457051
7764272153
5766477152
5764476152
5764256057
5764676557
5420677151
5766476152
5470473153
5774637151
5764676153
4764476057
5766476153
7765671151
7764477153
5764276057
4675477153
5765276057
5624657151
5725654447
5766477152
5764477555
5724627052
5766476153
5420677151
7767276157
5420444051
7764276557
5766477153
5423614153
5764627151
5765677557
5765476553
5767476152
5764637051
5764276057
5664677151
4464654141
5764627051
5764455555
5765647151
7765256157
9
Enterobacter sakazakii
Enterobacter sakazakii
Kluyvera ascorbata
Klebsiella pneumoniae
Enterobacter sakazakii
Enterobacter cloacae
Enterobacter cancerogenus
Kluyvera cryocrescens
Enterobacter aerogenes
Citrobacter freundii
Enterobacter cloacae
Enterobacter cloacae
Enterobacter cloacae
Serratia plymuthica
Serratia odorifera
Citrobacter amalonaticus
Enterobacter cloacae
Enterobacter cloacae
Kluyvera ascorbata
Kluyvera ascorbata
Enterobacter sakazakii
Enterobacter cloacae
Enterobacter cloacae
Enterobacter cloacae
Serratia plymuthica
Enterobacter cloacae
Serratia plymuthica
Citrobacter freundii
Serratia fonticola
Enterobacter cloacae
Klebsiella pneumoniae
Escherichia vulneris
Enterobacter cloacae
Citrobacter amalonaticus
Serratia liquefaciens
Citrobacter freundii
Serratia marcescens
Enterobacter cloacae
Hafnia alvei
Kluyvera ascorbata
Klebsiella oxytoca
Enterobacter cloacae
Enterobacter cloacae
Kluyvera ascorbata
Serratia plymuthica
Kluyvera ascorbata
Citrobacter freundii
Escherichia vulneris
Klebsiella pneumoniae
Pantoea agglomerans
Serratia spp.
0,8111
0,9416
0,9439
0,9853
0,9416
0,9999
0,5033
0,8422
0,8747
0,9962
0,8189
0,9886
0,9048
0,8677
0,7963
0,8735
0,6927
0,9996
0,9864
0,9308
0,7089
0,6618
0,937
0,9962
0,8302
0,9921
0,6877
0,996
0,9933
0,9886
0,9919
0,9987
0,6618
0,8735
0,6819
0,9799
0,9547
0,9872
0,9847
0,9942
0,9715
0,9226
0,7434
0,9876
0,8302
0,9349
0,999
0,6454
0,9504
0,6856
0,9846
Y95
Y96
Y97
Y98
Y99
Y100
-
+
+
-
5765477153
5464654151
5765637151
5764427151
5764077153
5420656050
10
Enterobacter cloacae
Citrobacter freundii
Kluyvera ascorbata
Pantoea agglomerans
Enterobacter cloacae
Citrobacter freundii
0,9957
0,9771
0,8306
0,7613
0,9948
0,994
Apêndice A2
Identificação de isolados de cavidades amarelas e fluorescentes
no sistema Colilert®-18/Quanti-Tray®
Isolado ref. Oxidase
F1
F2
F3
F4
F5
F6
F7
F8
F9
F10
F11
F12
F13
F14
F15
F16
F17
F18
F19
F20
F21
F22
F23
F24
F25
F26
F27
F28
F29
F30
F31
F32
F33
F34
F35
F36
F37
F38
F39
F40
F41
F42
F43
F44
F45
F46
-
Indol
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Perfil Crystal E/NF
5464444171
5461444171
5464444171
4464444171
5465464171
5464444171
5464444171
5464444171
5464444171
5464444171
5424444171
4464444171
5424444171
5464444171
5464444171
5425444571
5464444171
5464444171
5464444171
5464444171
5424444171
5464444171
5424444171
5465444161
5465444161
5464044171
5465446071
5464444171
5464444171
5464444171
5464444171
5425444571
5464444171
5464444171
5424444171
5464444171
5464044171
5464444171
5464444171
5465464171
5464444171
5464444171
5464444171
5464444171
5424444171
5464444171
11
Identificação
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Confiança
0,9998
0,9737
0,9998
0,9813
0,991
0,9998
0,9998
0,9998
0,9998
0,9998
0,9997
0,9813
0,9997
0,9998
0,9998
0,9679
0,9998
0,9998
0,9998
0,9998
0,9997
0,9998
0,9997
0,9976
0,9976
0,999
0,9945
0,9998
0,9998
0,9998
0,9998
0,9679
0,9998
0,9998
0,9997
0,9998
0,999
0,9998
0,9998
0,991
0,9998
0,9998
0,9998
0,9998
0,9997
0,9998
F47
F48
F49
F50
F51
F52
F53
F54
F55
F56
F57
F58
F59
F60
F61
F62
F63
F64
F65
F66
F67
F68
F69
F70
F71
F72
F73
F74
F75
F76
F77
F78
F79
F80
F81
F82
F83
F84
F85
F86
F87
F88
F89
F90
F91
F92
F93
F94
F95
F96
F97
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
5665444171
5464444171
5465404171
5464444171
5465464171
5464444171
5464444171
5464444171
5424444171
5464444171
5464444171
5464444171
5464444171
5464444171
5464444171
5464444171
5464444171
5464444171
5424444171
5665444171
5464444171
5464444171
5435444171
5464444171
5464444171
4464444171
5464444171
5724444571
5465464171
5424444171
5424444171
5464444171
5464444171
5464444171
5424444061
5464044171
5465446071
5464444171
5464444171
5564044171
5464444171
5464444171
5464444171
5424444171
5464444171
5464444171
5424444171
5420444571
5425444571
5464444171
5464444171
12
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
0,9962
0,9998
0,9314
0,9998
0,991
0,9998
0,9998
0,9998
0,9997
0,9998
0,9998
0,9998
0,9998
0,9998
0,9998
0,9998
0,9998
0,9998
0,9997
0,9962
0,9998
0,9998
0,9803
0,9998
0,9998
0,9813
0,9998
0,9999
0,991
0,9997
0,9997
0,9998
0,9998
0,9998
0,8035
0,999
0,9945
0,9998
0,9998
0,9911
0,9998
0,9998
0,9998
0,9997
0,9998
0,9998
0,9997
0,9983
0,9679
0,9998
0,9998
F98
F99
F100
-
+
+
+
5464444171
5465464171
5765475577
13
Escherichia coli
Escherichia coli
Klebsiella oxytoca
0,9998
0,991
0,7486
Apêndice A3
Isolado
ref.
N1
N2
N3
N4
N5
N6
N7
N8
N9
N10
N11
N12
N13
N14
N15
N16
N17
N18
N19
N20
N21
N22
N23
N24
N25
N26
N27
N28
N29
N30
N31
N32
N33
N34
N35
N36
N37
N38
N39
N40
N41
N42
N43
N44
N45
N46
β-Gal
Identificação de isolados em cavidades negativas no sistema
Colilert®-18/Quanti-Tray®
β-Glic Oxidase Indol
Perfil Crystal
E/NF
-
-
+
-
3103310212
-
-
+
-
3103310212
14
Identificação
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
Shewanella putrefaciens
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
Shewanella putrefaciens
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
Confiança
0,9994
0,9994
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
N47
N48
N49
N50
N51
N52
N53
N54
15
Apêndice B
Dados de estudos de incerteza de contagem (ver Seção 4)
Apêndice B1
Incerteza de contagem para NMPs* de cavidades amarelas e nãofluorescentes no Colilert®-18/Quanti-Tray® inoculadas com
Klebsiella pneumoniae ATCC 33186
* Número mais provável, registrado como inteiro não fracionário
Analista Analista
Analista Analista
A
A
B
C
Leitura Leitura
Leitura Leitura
1
2
Repetibilidade
DPR ao
Desv.
quadrad
pad
o
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
2,8284 0,0017
0,0000 0,0000
7,7782 0,0087
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
4,2426 0,0019
4,2426 0,0024
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
Reprodutibilidade
NMP
NMP
NMP
NMP
Média
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
2
6
19
18
36
34
31
27
56
50
41
48
56
89
78
66
109
78
95
95
95
83
109
101
145
145
201
165
165
2
6
19
18
36
34
31
27
56
50
41
48
56
89
78
70
109
89
95
95
101
89
109
101
145
145
201
165
165
2
6
19
18
36
34
31
27
56
50
41
48
56
89
78
70
109
89
95
95
101
89
109
109
145
145
201
165
165
2
6
19
18
36
36
31
27
56
50
41
48
56
89
78
70
109
89
95
95
101
89
109
109
145
145
201
165
165
2,00
6,00
19,00
18,00
36,00
34,00
31,00
27,00
56,00
50,00
41,00
48,00
56,00
89,00
78,00
68,00
109,00
83,50
95,00
95,00
98,00
86,00
109,00
101,00
145,00
145,00
201,00
165,00
165,00
30
201
201
201
201
201,00 0,0000 0,0000 201,00 0,0000 0,0000
Soma DPR
DPRc
16
0,0147
0,0221
Média
DPR ao
Desv.
quadrad
pad
o
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
1,1547 0,0011
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
2,3094 0,0011
0,0000 0,0000
6,3509 0,0055
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
3,4641 0,0012
3,4641 0,0016
0,0000 0,0000
4,6188 0,0019
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
0,0000 0,0000
Amostra
2,00
6,00
19,00
18,00
36,00
34,67
31,00
27,00
56,00
50,00
41,00
48,00
56,00
89,00
78,00
68,67
109,00
85,33
95,00
95,00
99,00
87,00
109,00
106,33
145,00
145,00
201,00
165,00
165,00
Soma DPR
DPRc
0,0125
0,0204
Apêndice B2
Incerteza de contagem para NMPs* de cavidades amarelas e
fluorescentes no Colilert®-18/Quanti-Tray® inoculadas com E. coli
ATCC 25922
* Número mais provável, descrito como inteiro não fracionário
Analista A Analista A
Leitura 1 Leitura 2
Analista Analista
B
C
Leitura Leitura
Repetibilidade
Desv.
pad
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
Reprodutibilidade
Amostra
NMP
NMP
NMP
NMP
Média
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
6
11
9
29
32
21
36
32
56
50
48
45
78
70
66
78
95
109
101
89
130
95
70
74
109
101
145
165
118
6
11
9
29
32
21
36
32
56
50
48
45
78
70
66
78
95
109
101
89
130
95
70
74
109
101
145
165
118
6
11
9
29
32
21
36
32
56
50
48
45
78
70
66
78
95
109
101
89
130
95
70
74
109
101
145
165
118
6
11
9
29
32
21
36
32
56
50
48
48
78
70
66
78
95
109
101
89
130
95
70
74
109
101
145
165
118
6,00
11,00
9,00
29,00
32,00
21,00
36,00
32,00
56,00
50,00
48,00
45,00
78,00
70,00
66,00
78,00
95,00
109,00
101,00
89,00
130,00
95,00
70,00
74,00
109,00
101,00
145,00
165,00
118,00
30
130
130
130
130
130,00 0,0000 0,0000 130,00 0,0000 0,0000
Soma DPR
DPRc
17
Amostra NMP
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
6,00
11,00
9,00
29,00
32,00
21,00
36,00
32,00
56,00
50,00
48,00
46,00
78,00
70,00
66,00
78,00
95,00
109,00
101,00
89,00
130,00
95,00
70,00
74,00
109,00
101,00
145,00
165,00
118,00
NMP
NMP
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
1,7321
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0014
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
Soma DPR
DPRc
0,0014
0,0069
Apêndice C
Dias após
fabricação
Contagens replicadas de suspensões de E. coli, Klebsiella
pneumoniae e Citrobacter freundii no sistema
Colilert®-18/Quanti-Tray® após 18 horas e 22 horas de incubação
usando Colilert-18 armazenado a 25 °C por até 541 dias (ver
Seção 5)
Número de cavidades positivas
Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae
Citrobacter freundii
%
%
%
18h
22h
18h
22h
18h
22h
variação
8
15
24
30
36
44
56
84
111
138
175
205
269
319
367
2
4
7
9
16
8
14
9
10
13
17
11
8
13
14
8
5
9
13
4
4
10
8
8
9
5
21
3
2
9
7
11
12
10
8
14
8
10
10
13
18
13
2
11
2
4
7
9
16
8
14
9
10
13
17
11
8
13
14
8
5
9
13
4
4
10
8
8
9
5
21
3
2
9
7
11
12
10
8
14
8
10
10
13
18
13
2
11
variação
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
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0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
12
11
15
9
19
13
14
12
16
18
16
13
18
13
17
24
14
19
10
16
14
14
16
19
20
12
12
14
15
12
15
20
22
17
20
18
13
26
19
15
17
11
12
21
18
12
11
15
9
19
13
14
12
16
18
16
13
18
13
17
24
14
19
10
16
14
14
16
19
20
12
12
14
15
12
16
20
22
17
20
18
13
26
19
15
17
11
12
21
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
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0
0
0
0
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0
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0
0
0
0
+7%
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
variação
11
14
16
2
5
7
14
16
18
18
18
8
16
15
16
11
16
10
6
7
11
11
8
12
20
17
17
8
10
13
16
20
30
18
18
22
14
17
14
4
13
13
17
20
11
14
16
3
5
7
14
16
18
18
18
8
16
15
16
12
18
11
7
14
11
11
8
12
20
17
17
9
10
13
16
21
30
18
18
22
14
17
14
5
15
14
17
20
0
0
0
+50%
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
+9%
+13%
+10%
+17%
+100%
0
0
0
0
0
0
0
+13%
0
0
0
+5%
0
0
0
0
0
0
0
+25%
+15%
+8%
0
0
541
10
7
10
9
10
7
10
9
0
0
0
0
20
13
17
16
19
20
13
17
16
0
0
0
0
21
11
11
8
21
11
12
9
0
0
+9%
+13%
Apêndice D
Intervalos de 95% de confiança e repetibilidade teóricas para
cada valor de NMP no Colilert®-18/Quanti-Tray® de 51 cavidades
(ver Seção 7)
Intervalos de 95%
de confiança
Repetibilidade teórica
Nº. de
cavidades
com reação
positiva
NMP por
amostra de
100 ml
0
<1,0
0,0
1
1,0
0,3
2
2,0
0,6
7,3
0,3071
70,7
3
3,1
1,1
9,0
0,2508
57,7
4
4,2
1,7
10,7
0,2172
50,0
44,7
Inferior
Desvio padrão
da
Superior
repetibilidade
Log10SD
3,7
0,4343
5,6
Incerteza
relativa
padrão
CV%
100,0
5
5,3
2,3
12,3
0,1943
6
6,4
3,0
13,9
0,1774
40,9
7
7,5
3,7
15,5
0,1643
37,8
8
8,7
4,5
17,1
0,1537
35,4
33,4
9
9,9
5,3
18,8
0,1450
10
11,1
6,1
20,5
0,1376
31,7
11
12,4
7,0
22,1
0,1313
30,2
12
13,7
7,9
23,9
0,1257
29,0
13
15,0
8,8
25,7
0,1209
27,8
26,8
14
16,4
9,8
27,5
0,1166
15
17,8
10,8
29,4
0,1127
26,0
16
19,2
11,9
31,3
0,1092
25,1
17
20,7
13,0
33,3
0,1061
24,4
23,8
18
22,2
14,1
35,2
0,1032
19
23,8
15,3
37,3
0,1005
23,1
20
25,4
16,5
39,4
0,0981
22,6
21
27,1
17,7
41,6
0,0959
22,1
21,6
22
28,8
19,0
43,9
0,0938
23
30,6
20,4
46,3
0,0919
21,2
24
32,4
21,8
48,7
0,0902
20,8
25
34,4
23,3
51,2
0,0885
20,4
20,0
26
36,4
24,7
53,9
0,0870
27
38,4
26,4
56,6
0,0856
19,7
28
40,6
28,0
59,5
0,0843
19,4
29
42,9
29,7
62,5
0,0830
19,1
18,9
30
45,3
31,5
65,6
0,0819
31
47,8
33,4
69,0
0,0809
18,6
32
50,4
35,4
72,5
0,0799
18,4
33
53,1
37,5
76,2
0,0791
18,2
18,0
17,9
34
56,0
39,7
80,1
0,0783
35
59,1
42,0
84,4
0,0776
20
36
62,4
44,6
88,8
0,0770
17,7
37
65,9
47,2
93,7
0,0765
17,6
17,5
38
69,7
50,0
99,0
0,0761
39
73,8
53,1
104,8
0,0758
17,4
40
78,2
56,4
111,2
0,0756
17,4
41
83,1
59,9
118,3
0,0756
17,4
17,4
42
88,5
63,9
126,2
0,0757
43
94,5
68,2
135,4
0,0761
17,5
44
101,3
73,1
146,0
0,0768
17,7
45
109,1
78,6
158,7
0,0778
17,9
18,3
46
118,4
85,0
174,5
0,0794
47
129,8
92,7
195,0
0,0819
18,9
48
144,5
102,3
224,1
0,0859
19,8
49
165,2
115,2
272,2
0,0929
21,4
50
200,5
135,8
387,6
0,1094
25,2
infinito
-
-
51
>200,5
146,1
21