Implementação de uma nova metodologia para detecção de painel de vírus
respiratórios através RT-PCR Microarray: CLART® Pneumovir.
Niewiadonski, V.D.T; Scarpelli, L.C; Alfieri,A; Gaburo Jr, N.
Departamento de Diagnóstico Molecular - DASA
Summary
The Respiratory virus infection is one of the most important causes of childhood
respiratory diseases and is traditionally diagnosed by direct immunofluorescence (DIF) and
cell culture. However, these techniques can detect only a restricted amount of pathogens
and does not include emerging respiratory viruses. To attend this demand, panels of
respiratory virus analyzed with molecular biology techniques, are capable to detect
emerging and traditional viruses, with increased sensitivity. Fifteen samples of nasotracheal
secretions were collected from children up to 2 years of age and tested using the Clart ®
Pneumovir, technique that simultaneously detects 18 different respiratory viruses. The
results were compared with DIF and showed 93.3% positive results in Clart ® Pneumovir
against 26.6% in DIF. There was agreement between two methods in 86.6% of samples
tested. The frequency analysis of the viruses detected in Clart ® Pneumovir showed:
Rhinovirus (40%), Bocavirus (33.3%) and RSV A (26%). The presence of multiple
infections using Clart ® Pneumovir was observed in 53.3% of samples tested. Clart ®
Pneumovir test showed higher positivity than the traditional method for detecting
respiratory viruses in the analyzed samples.
1
Resumo
A infecção por vírus respiratórios é uma das causas principais de doenças
respiratórias infantis e, tradicionalmente, é diagnosticada através de imunofluorescência
direta (IFD) e cultura de células. Entretanto, estas técnicas são capazes de detectar apenas
uma quantidade restrita de patógenos e não contemplam os vírus respiratórios emergentes.
Para atender a essa demanda, os painéis de vírus respiratórios analisados com técnicas de
biologia molecular, são capazes de detectar vírus emergentes e tradicionais, com maior
sensibilidade. Quinze amostras de secreção nasotraqueal foram coletadas de crianças com
até 2 anos de idade e testadas utilizando o ensaio CLART® Pneumovir, técnica que detecta
simultaneamente 18 tipos de vírus respiratórios. Os resultados obtidos foram comparados
com a IFD e mostraram 93,3% de resultados positivos no CLART® Pneumovir contra
26,6% de positividade na IFD. Houve concordância entre as duas metodologias em 86,6%
das amostras testadas. A análise das frequências dos vírus detectados no CLART®
Pneumovir mostrou: Rhinovirus (40%), Bocavirus (33,3%) e RSV A (26%). Já a presença
de infecções múltiplas usando CLART® Pneumovir foi observada em 53,3% das amostras
testadas. O teste CLART® Pneumovirmostrou maior positividade para detecção dos vírus
respiratórios nas amostras analisadas que os métodos tradicionais.
2
Introdução
Doenças respiratórias podem ser atribuídas a diversos agentes etiológicos, incluindo
vírus da Influenza A sazonal, Influenza B, Influenza A H1N1 pandêmica, Adenovírus,
Vírus sincicial respiratório (RSV), Bocavírus humano, Coronavírus, Metapneumovírus e
Parainfluenza vírus, entre outros. (1). Estes vírus representam um importante papel nas
infecções respiratórias de crianças, idosos e outros grupos de indivíduos imunossuprimidos,
levando a hospitalização nos casos mais severos. (2).
Além de sua capacidade de causar doenças, os vírus respiratórios apresentam tempo
de incubação relativamente curto (Tabela 1) e podem ser transmitidos de pessoa para
pessoa através de contato direto ou de gotículas de saliva. (3).
Tabela 1. Período de incubação de alguns vírus respiratórios.
Vírus
Incubação (dias)
Período de infecção
Influenza
1-4
7 dias
Parainfluenza
1-7
1-3 semanas
Respiratório
2-8
3-8 dias
Adenovírus
2-14
7-10 dias
Rhinovirus
2-3
7-10 dias
Metapneumovirus
4-6
Média de 5 dias
Coronavirus
2-4
Desconhecido
Bocavirus
Desconhecido
Desconhecido
Vírus Sincicial
Pacientes infectados por tais patógenos desenvolvem uma série de sintomas
comuns, sendo o diagnóstico e laboratorial determinante na conduta terapêutica. (4).
Tradicionalmente o diagnóstico de vírus respiratórios tem se baseado na detecção do
antígeno através da técnica de imunofluorescência direta (IFD) e/ou no isolamento do vírus
através de cultura. A IFD apresenta algumas limitações, como por exemplo, a baixa
sensibilidade da detecção de antígenos além de ter resultados com interpretação subjetiva,
3
e, para tal, requer profissionais altamente treinados e qualificados para realizá-la. Já a
cultura de células, apesar de ser um método mais sensível quando comparado com a IFD
(5), também apresenta limitações, tais como: tempo prolongado para obtenção do resultado,
ser aplicável somente a vírus cultiváveis, além de requerer condições rígidas de transporte e
armazenamento da amostra.
Por estes motivos, tanto a IFD quanto a cultura de células são incompletas para o
diagnóstico de vírus respiratórios e fazem com que alguns casos clínicos permaneçam não
detectados. (6).
Diante deste cenário, o aparecimento de novas técnicas se fez necessário, não só
para detectar vírus emergentes não contemplados no painel tradicional como
Metapneumovirus humano (HMPV), Coronavirus, Bocavirus, (7, 8), mas também para
apresentar ganho real de sensibilidade, acuracia e rapidez na obtenção dos resultados.
A tecnologia molecular tem sido utilizada, por apresentar melhor sensibilidade e
especificidade quando comparada com os métodos tradicionais (5, 6). Além disto, ela se
baseia na amplificação das seqüências de ácidos nucléicos virais específicos e pode,
portanto, permitir a detecção simultânea de uma grande quantidade de vírus respiratórios
tanto tradicionais quanto emergentes (2).
Entre os testes moleculares disponíveis atualmente, existem diversas metodologias
como as que se baseiam em partículas marcadas em suspensão, RT-PCR em tempo real, e o
microarray. Dentre elas optamos pelo teste comercial CLART ® PneumoVir (Genomica,
Madri, Espanha), pois este método permite a detecção simultânea de 18 vírus respiratórios
através da amplificação por uma RT-PCR em multiplex e a detecção do produto
amplificado pela tecnologia de microarray. Trata-se de um método com execução
relativamente rápida, quando comparado a outros métodos como a cultura de células e que
apresenta como vantagem, o fato de detectar diversos vírus em um único ensaio,
favorecendo a economia de recursos como tempo, mão de obra e insumos.
O objetivo deste estudo foi comparar a detecção de vírus respiratórios presentes em
amostras de secreção nasotraqueal de crianças de até 2 anos, utilizando duas técnicas
distintas: o método comercial CLART ® PneumoVir (Genomica, Madri, Espanha) e o
tradicional IFD. Além disto, a frequência e distribuição dos vírus detectados pelo teste
CLART ® PneumoVir também foram analisadas.
4
Material e Métodos
Amostras
De 01 a 29 de agosto de 2011 foram coletadas 15 amostras de aspirado nasotraqueal
de crianças de 0 a 2 anos de idade atendidas nos Hospitais Sabará e Santa Helena, ambos
em São Paulo,com suspeita de infecção respiratória e indicação para realização do painel. A
idade média das crianças foi de 4 meses, com desvio padrão 3,99.
As amostras foram coletadas em duplicata, uma delas foi enviada ao laboratório de
apoio para realização do painel viral por IFD e a outra foi encaminhada ao setor de
Diagnóstico Molecular da DASA para realização dos testes com o teste comercial
CLART® Pneumovir.
Métodos
CLART® Pneumovir
Para esta metodologia, foram obtidos os ácidos nucleicos (DNA e RNA) em cada
amostra de secreção nasotraqueal que posteriormente foram amplificados por RT-PCT e,
finalmente, hibridizados para visualização dos resultados no microarray. Todas estas etapas
foram executadas conforme instruçoes do fabricante e se resumem como se segue:
Os ácidos nucleicos foram obtidos das secreções nasotraqueais utilizando o kit
comercial QIAamp RNA Mini kit (Qiagen, Hilden, Germany) e posteriormente foram
quantificados através de espectrofotometria (Nanodrop).
A etapa seguinte consistiu em submeter as amostras obtidas ao kit comercial
CLART® Pneumovir. Numa primeira etapa, cada amostra foi amplificada em reação de
RT-PCR Multiplex. Numa segunda etapa, a visualização do produto amplificado foi
realizada numa plataforma de microarrays de baixa densidade em que ocorre a hibridização
do produto amplificado com as sondas específicas imobilizadas nesta plataforma. Nos casos
de presença de material genético viral, houve a precipitação de um produto insolúvel nos
5
locais do microarray onde ocorreu a hibridização dos produtos amplificados. Entretanto,
esta reação só foi considerada positiva quando houve a
hibridização do produto
amplificado viral com três sondas presentes no microarray. Além disto, essa tecnologia
garante a confiabilidade dos seus resultados pois permite a detecção simultânea de
controles de inibição de PCR e de hibridização.
O tempo de execução para amplificação e visualização do produto amplificado é e
de aproximadamente 8 horas , sendo considerado relativamente rápido. Além disto, o
software permite a leitura e interpretação automática dos resultados do microarray evitando
interpretações subjetivas do resultado.
A figura 1 apresenta a imagem do microarray de uma amostra positiva pelo ensaio
CLART® Pneumovir, capturada pelo leitor Clinical Array Reader (CAR).
Fig. 1. Imagem Microarray
H+: Controle de Hibridização a presença dos pontos indica eficiência dos reagentes utilizados durante o
processo.
PCR: Controle de Amplificação: a presença dos pontos indica que não houve inibição da reação de RT-PCR.
V+: a presença dos pontos indica uma reação positiva para um determinado tipo viral.
6
Imunofluorescencia direta (IFD)
A pesquisa de vírus por IFD foi realizada por laboratório de apoio seguindo a
tecnica de Laundry e Ferguson (9). Nesta técnica é realizada a pesquisa de antígenos
através de anticorpos monoclonais marcados com fluorocromo (conjugado) para detecção
dos vírus respiratórios.
Na Tabela 2 estão descritos os vírus passíveis de detecção pelos dois métodos
abordados.
Tabela 2. Vírus respiratórios detectados pelos diferentes painéis.
CLART® Pneumovir
Imunofluorescência Direta (IFD)
Adenovirus ( A – D)
Influenza A
Metapneumovírus A (HMPV A)
Influenza B
Metapneumovirus B (HMPV B)
Virus Sincicial Respiratório (RSV)
Parainfluenza 1 (PIV-1)
Parainfluenza (PIV)
Parainfluenza 2 (PIV-2)
Adenovirus
Parainfluenza 3 (PIV-3)
Parainfluenza 4 (PIV-4 A e B)
Rhinovirus (HRv)
Virus Sincicial Respiratório A (RSV A)
Virus Sincicial Respiratorio B (RSV B)
Bocavirus (HBoV)
Coronavirus 229E (CoV)
Enterovirus (Echovirus, Coxackievirus A,B)
Influenza A (H3N2, H1N1, H1N1 suína)
Influenza B
Influenza C
7
Resultados
A tabela 3 mostra que para o método comercial, das 15 amostras testadas, 14 delas
(93,3%) apresentaram resultado positivo para um ou mais vírus do painel testado enquanto
que para a IFD a presença de resultado positivo foi detectada apenas em 4 amostras
(26,6%).
Também, nesta mesma tabela, evidenciamos a presença de co-infecção pelo
CLART® Pneumovir, fato este não detectado pelo método tradicional. Isto é claro nas
amostras 13 e 14 onde houve a detecção de dois tipos distintos de virus, respectivamente,
Influenza B e de RSV na amostra 13 e Influenza A e Parainfluenza na amostra 14. Já, para
estas amostras, os resultados da IFD detectou apenas a presença do vírus RSV na amostra
13 e do Parainfluenza na amostra 14.
Finalmente, a tabela 3 mostra uma serie de resultados positivos que foram negativos
pelo teste IFD. Muitos destes vírus não são detectados pela técnica manual, conforme
descrito na Tabela 2.
Considerando-se apenas os vírus detectados por ambos os testes, a concordância
entre os dois métodos foi de 86,6 %. Este fato deve-se ao resultado discrepante em duas
amostras que apresentaram resultado positivo para Influenza A e H3N2 (amostra 10) e
RSVA (amostra 15) no CLART® Pneumovir sendo Não detectadas na IFD.
8
Paciente ID
Tabela 3. Resultados Painel Vírus Respiratório
CLART® PneumoVir
IFD
1
HboV
NEG
2
HRV / RSV A
RSV
3
HBoV / HMPVA / HRV
NEG
4
HRV
NEG
5
HBoV / HRV
NEG
6
HboV
NEG
7
HBoV / HMPV / HRV
NEG
8
HRV
NEG
9
HRV / RSV A
RSV
10
Influenza A H3N2
NEG
11
NEG
NEG
12
HMPVA
NEG
13
Influenza B / RSV A
RSV
14
Influenza A / PIV- 3
PIV
15
HMPV B / RSV A
NEG
HBoV – Bocavirus, HRV – Rhinovirus, RSV – Virus sincicial respiratório, HMPV – Metapneumovirus, PIV –
Parainfluenza, NEG – Negativo, IFD - Imunofluorescencia direta.
Foi observada a presença de co-infecçao por pelo menos dois vírus em 53,3% das
amostras analisadas enquanto que a infecção por um único vírus foi observada em 40% das
amostras. Apenas uma amostra (6,7%) apresentou resultado negativo para todos os vírus do
painel em ambos os métodos testados.
O gráfico 1 representa a freqüência dos vírus detectados e o gráfico 2 apresenta os
tipos de infecções observadas nos resultados obtidos pelo teste no CLART® Pneumovir.
9
Gráfico 1 –Resultado do Painel de Vírus Respiratório CLART® PneumoVir (Frequência dos vírus
detectados)
Gráfico 2 - Tipos de infecções respiratórias.
10
Discussão
O ensaio por microarray mostrou-se altamente sensível, e permitiu a detecção
simultânea de diversos vírus que não poderiam ser detectados pelos métodos tradicionais.
Além disso, detectou a presença de infecções múltiplas.
A possibilidade de detecção de infecções múltiplas levanta questões referentes à
patogenicidade dos diferentes vírus, pois os sintomas clínicos observados podem ser
ocasionados devido a ação de apenas um ou à uma combinação dos vírus detectados.
Nos resultados obtidos para as amostras 13 e 14, em que houve a detecção de coinfecção no método comercial de dois vírus passíveis de detecção pelos dois métodos
testados, observamos resultado positivo na IFD para apenas um dos vírus. Este fato deve-se
provavelmente à predominância da infecção de um dos vírus presente nas amostras e
comprova o ganho de sensibilidade do método molecular por microarray.
A presença de infecções respiratórias múltiplas ocorre em cerca de 17,4% a 30%
das crianças abaixo de 2 anos de idade admitidas em hospitais segundo estudos anteriores
(10). Neste estudo, foi detectada a presença de co-infecção em 57,1 % das amostras
positivas pelo o método CLART® Pneumovir.
Foi detectada também a predominância de Rhinovirus (40%) uma das causas mais
comuns de infecções respiratórias em crianças abaixo de 2 anos de idade (11). Trata-se
frequentemente do vírus mais prevalente detectado em crianças com doença respiratória
aguda (12). Em estudo realizado previamente em crianças com menos de cinco anos de
idade hospitalizadas, apresentando doença respiratória aguda, foi reportado o Rhinovirus
como o vírus respiratório mais detectado (13).
O segundo vírus mais frequentemente detectado neste estudo foi o Bocavirus
(33,3%) Estudos demonstram que frequência de infecções causadas por Bocavirus varia de
acordo com a população estudada. (14, 15), e a incidência de infecções é inversamente
proporcional a idade, sendo mais comum em crianças abaixo de 5 anos e menos freqüente
após esta idade (15). Além disso, estudos demonstram que a frequência de detecção deste
vírus é sazonal, sendo mais frequentemente encontrada durante os meses de outono e
inverno. (8, 16). Esses dados foram confirmados pelos resultados obtidos neste estudo, pois
a sazonalidade corresponde ao período de coleta das amostras (Agosto de 2011).
11
Também foi detectada uma prevalência de 26,6% de RSVA. Trata-se de um
importante agente causador de hospitalizações em crianças (17).
Do ponto de vista prático, o ensaio CLART® Pneumovir é um ensaio de fácil
manuseio e com obtenção de resultados relativamente rápida. Após a extração dos ácidos
nucleicos, o ensaio leva aproximadamente 8 horas e é dividido em duas etapas: a RT-PCR
multiplex e o processo de hibridização.
O ensaio comercial CLART® Pneumovir apresentou alto índice de positividade
(93,3%). A especificidade descrita pelo fabricante para este método é de 99,55% a 100%,
dependendo do vírus estudado, pois para a obtenção de um resultado positivo, é necessário
que sejam hibridizadas no mínimo três seqüências distintas do vírus às sondas presentes no
microarray, evitando desta forma resultados falso-negativos.
Para as técnicas testadas (CLART® Pneumovir e IFD) houve um índice de
concordância de 86,6%, considerando-se apenas os vírus detectados por ambos os testes.
As discrepâncias podem ser justificadas considerando-se o fato de que o método molecular
é mais sensível quando comparado com a IFD.
O aumento da sensibilidade analítica dos métodos moleculares é importante
clinicamente, pois propicia um diagnóstico mais acurado para orientação e permite a
identificação dos vírus respiratórios tradicionais e emergentes. A detecção simultânea de
diversos patógenos em um uma única reação gera economia de recursos, diminuição do
tempo de execução e dos consumíveis e custa menos do que o custo agregado para a
realização de testes com o objetivo de detectar apenas um alvo.
No caso do kit avaliado, além das vantagens citadas, há também a facilidade na
interpretação dos resultados quando comparados com a IFD, devido à subjetividade da
leitura.
A facilidade na detecção de infecções múltiplas permite a realização de estudos para
examinar a importância do significado clinico das mesmas e contribuindo para o
entendimento da epidemiologia dos vírus respiratórios (3).
12
Conclusão
O presente estudo comparativo entre os dois métodos (CLART® Pneumovir e IFD)
apresentou concordância considerável entre os vírus tradicionais pesquisados por ambos os
testes. As frequências e distribuição dos vírus detectados pelo método molecular CLART®
Pneumovir apresentaram presença de co-infecção na maior parte das amostras estudadas.
O método molecular CLART® Pneumovir, apresenta alta sensibilidade utilizando a
tecnologia de microarray e pode ser aplicado no diagnóstico de doenças respiratórias
agudas, principalmente em atendimentos pediátricos visando à rapidez na liberação dos
resultados e a obtenção de um diagnóstico acurado para orientação da melhor conduta
terapêutica.
13
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