INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
CAROLINA DE QUEIROZ SACRAMENTO
Efeitos do análogo triazólico da Ribavirina, PAR038, sobre
a replicação in vitro do vírus influenza.
Dissertação apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz
como parte dos requisitos para obtenção do título de
Mestre em Biologia Celular e Molecular.
Orientador: Prof. Dr. Thiago Moreno Lopes e Souza
RIO DE JANEIRO
2013
ii
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
AUTORA: Carolina de Queiroz Sacramento
Efeitos do análogo triazólico da ribavirina, PAR038, sobre a
replicação in vitro do vírus influenza.
ORIENTADOR: Prof. Dr. Thiago Moreno Lopes e Souza
Aprovada em: 26/08/2013
EXAMINADORES:
Prof. Dr.
Prof. Dr.
Profª. Drª.
Prof. Dr.
Profª. Drª.
Marcelo Alves Pinto - Presidente
André Miguel Japiassú
Izabel Christina Nunes de Palmer Paixão
Gonzalo José Bello Bentancor
Andrea Cheble de Oliveira
Rio de Janeiro, 26 de agosto de 2013
iii
Agradecimentos
Ao Dr. Thiago Moreno, meu orientador, pelos ensinamentos, confiança e oportunidades;
A Dra. Marilda Siqueira e equipe do Laboratório de Vírus Respiratórios e do Sarampo
(LVRS), pela contribuição, troca de conhecimentos e momentos de confraternização;
A Milene, Viviane, Adair por toda ajuda, conversas e conselhos e, principalmente, a Natalia e
Andressa, que além de todo auxílio e companheirismo dentro do laboratório se tornaram
grande amigas fora do LVRS;
A minha mãe Aliane por todo amor incondicional, carinho, apoio, força e ajuda durante toda
minha vida;
Aos meus irmãos Rafael e Katherine, e minha “boadrasta” Beth, por sempre me
proporcionarem momentos felizes;
Ao meu namorado e amigo, Thiago Faria, por todo o amor, paciência e por sempre me apoiar
e acreditar em mim;
À amiga Flávia que, embora distante, está sempre presente em minha vida;
À Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular, coordenadores, funcionários e corpo
docente por todo aprendizado e oportunidade de crescimento;
Aos colegas da Pós-Graduação, em especial a Flavia Savassi, que compartilhou disciplinas,
seminários, almoços e conversas;
Ao grupo da Dra. Núbia Boechat e Dr. Luiz Pinheiro de Farmanguinhos/Fiocruz por nos ceder
os compostos utilizados neste estudo;
Ao André Costa Ferreira e Dr. Fernando Bozza pelo auxílio, discussões e experimentos;
Ao CNPq pelo apoio financeiro;
E a todos que contribuíram direta ou indiretamente para a conclusão deste trabalho.
iv
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Efeitos do análogo triazólico da ribavirina, PAR038, sobre a replicação in vitro do vírus
influenza.
RESUMO
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Carolina de Queiroz Sacramento
Os vírus influenza representam uma das principais causas das infecções respiratórias
agudas, e são de grande impacto para saúde pública devido a ocorrência de epidemias sazonais
e pandemias. A variabilidade genética deste vírus e seu amplo espectro de hospedeiros
dificulta o controle das infecções através da vacinação, o que torna os antivirais importantes
na prevenção e tratamento. Até o presente momento, existem duas classes de antivirais
disponíveis para o tratamento da infecção pelo vírus influenza, os bloqueadores de canal M2
(amandadina e rimantadina), que não são mais utilizados clinicamente pois as cepas
circulantes são resistentes e os inibidores de neuraminidase (NAIs – oseltamivir e zanamivir),
classe em uso clínico embora já tenham sido descritas cepas resistentes ao oseltamivir. Existe
também a ribavirina, um antiviral de amplo espectro que inibe DNA/RNA polimerases virais
mas é altamente citotóxico. Devido ao número limitado de drogas anti-influenza, vem sendo
realizados estudos sobre a eficácia da ribavirina e sua combinação com NAIs para tratamento
das infecções causadas pelo influenza. A RNA polimerase do vírus influenza vem sendo cada
vez mais explorada como alvo para novas drogas, e, desta forma, o objetivo deste trabalho foi
investigar o efeito antiviral do PAR038, um análogo triazólico da ribavirina como potencial
inibidor da polimerase. O composto PAR038 se mostrou menos citotóxico para células
MDCK e 400 vezes mais potente que a ribavirina, com CC50 > 1000 µM e IC50 = 0,07 µM.
Nosso composto foi capaz de inibir a RNA polimerase do vírus influenza com EC50 igual a
1,6 ± 0.15 µM, além de inibir a replicação viral em células A549 (IC50 = 21,2 µM) e
apresentar propriedades imunomodulatórias, já que diminuiu os níveis de IL-8 e MCP-1 no
sobrenadante das células A549 infectadas com o vírus influenza. Após 2 passagens do vírus
influenza A H3N2 em células MDCK, utilizando-se uma concentração do PAR038
aproximadamente 400 vezes maior que seu IC50, ainda não foram observadas mutações de
resistência ao composto. O PAR038 se mostrou um potente inibidor do vírus influenza in
vitro e sua estrutura química é bastante promissora para o desenvolvimento de novas drogas
anti-influenza.
Palavras-chave: Vírus influenza A, antivirais, RNA polimerase RNA dependente,
ribavirina, análogos triazólicos.
v
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Effects of a ribavirin triazolic analogue, PAR038, in the in vitro replication of influenza
virus.
ABSTRACT
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Carolina de Queiroz Sacramento
Influenza virus represents one of the main causes of acute respiratory infections, being
a major cause of mortality, morbidity and burden to public health system. The genetic
variability of influenza viruses and broad spectrum of these viruses` hosts impose difficulties
in control strategies through vaccination. Therefore, antiviral drugs have become critical in the
prevention and treatment of the infections caused by influenza viruses. There are two classes
of anti-influenza drugs, M2 channel blockers (amantadine and rimantadine), which are no
longer used since circulating strains are resistant to these antivirals, and neuraminidase
inhibitors (NAIs – oseltamivir and zanamivir), in clinical use. Despite that, oseltamivirresistant strains have been described. An additional antiviral, ribavirin, is endowed with a
broad spectrum activity against DNA/RNA polymerases, although high cytotoxic has been
described. Due to the limited number of anti-influenza drugs, studies have been carried out on
the effectiveness of ribavirin and its combination with NAIs for treating influenza infections.
Thus, influenza RNA polymerase still is a valid target for development of novel antiviral.
Based on that, we aimed here to investigate the antiviral effect of PAR038, a triazolic
analogue of ribavirin. PAR038 is 400-fold potent than ribavirin, with CC50 > 1000 µM and
IC50 = 0,07 µM towards MDCKs cytotoxicity and influenza in vitro replication. Our
compound inhibits influenza RNA polymerase with an EC50 of 1,6 ± 0,15 µM and also
inhibits viral replication in an A549 cells (IC50 = 21,2 µM). PAR038 seems to have
immunomodulatory properties, reducing the levels of IL-8 and MCP-1 on A549 culture
supernatants. We did not find resistance mutations on influenza polymerase after the treatment
with high levels of PAR038. Thus, PAR038 is a potent inhibitor of influenza polymerase and
its chemical structure may be a promising one for the development of novel anti-influenza
drugs.
Keywords: Influenza A viruses, antiviral, RNA dependent RNA polymerase,
ribavirin, triazolic analogues.
vi
ÍNDICE
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 1
1.1. Histórico ...................................................................................................................... 1
1.2. O Vírus Influenza ........................................................................................................ 2
1.2.1. Infecções causadas pelos vírus influenza .......................................................... 2
1.2.2. Classificação e nomenclatura ............................................................................ 3
1.2.3. Morfologia, genoma e proteínas virais .............................................................. 4
1.2.4. Ciclo replicativo ................................................................................................ 7
1.2.5. RNA polimerase viral ...................................................................................... 10
1.3. Antivirais .................................................................................................................... 14
1.3.1. Bloqueadores do canal M2 .............................................................................. 16
1.3.2. Inibidores de neuraminidase (NAIs) ............................................................... 16
1.3.3. Ribavirina ........................................................................................................ 18
1.3.4. Análogos triazólicos da ribavirina ................................................................... 20
2. OBJETIVOS ................................................................................................................... 22
2.1. Objetivo geral ............................................................................................................ 22
2.2. Objetivos específicos ................................................................................................. 22
3. METODOLOGIA .......................................................................................................... 23
3.1. Células, vírus e compostos utilizados ....................................................................... 23
3.1.1. Células ............................................................................................................ 23
3.1.2. Vírus ............................................................................................................... 23
3.1.3. Compostos ...................................................................................................... 23
3.2. Determinação da viabilidade celular ......................................................................... 24
3.3. Ensaios de inibição da replicação viral ..................................................................... 24
3.4. Avaliação da produção viral ..................................................................................... 25
3.4.1. Quantificação por RT-PCR em tempo real em etapa única ............................ 25
3.4.1.1.
Extração de RNA ............................................................................... 25
3.4.1.2.
RT-PCR em tempo real em única etapa ............................................. 25
3.4.2. Titulação em células MDCK por TCID50/ml ................................................. 27
3.5. Ensaios de inibição da atividade da polimerase viral ............................................... 27
3.6. Monitoramento da emergência de cepas resistentes ................................................. 28
vii
3.6.1. Treinamento viral .......................................................................................... 28
3.6.2. Sequenciamento da polimerase viral pelo método de Sanger ...................... 28
3.6.2.1.
Síntese do cDNA .............................................................................. 28
3.6.2.2.
PCR para amplificação dos genes da polimerase viral ..................... 29
3.6.2.3.
Análise e purificação dos produtos amplificados ............................. 32
3.6.2.4.
Reação de sequenciamento ............................................................... 32
3.7. Dosagem de citocinas .............................................................................................. 33
3.8. Análise estatística .................................................................................................... 33
4. RESULTADOS ........................................................................................................... 34
4.1. Efeito inibitório dos análogos triazólicos da ribavirina ......................................... 34
4.2. Citotoxicidade e efeito inibitório do composto PAR038 ...................................... 35
4.3. O composto PAR038 inibe a atividade da RNA polimerase viral ........................ 37
4.4. Geração de cepas virais resistentes ao PAR038 .................................................... 40
4.5. O composto PAR038 possui efeito imunomodulatório em células A549 ............. 40
5. DISCUSSÃO ............................................................................................................... 42
6. CONCLUSÕES .......................................................................................................... 48
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 49
viii
Índice de Figuras
Figura 1.1 - Esquema representativo do vírus influenza A .............................................. 5
Figura 1.2 - Representação de uma ribonucleoproteína viral (RNP) ............................... 5
Figura 1.3 - Representação esquemática do ciclo replicativo do vírus influenza A ........ 8
Figura 1.4 - Estrutura e função das três subunidades da RNA polimerase do vírus
influenza ........................................................................................................................ 11
Figura 1.5 - Mecanismos de transcrição e replicação do genoma viral ......................... 13
Figura 1.6 - Etapas da replicação do vírus influenza que são alvos dos principais
antivirais ........................................................................................................................ 15
Figura 1.7 - Estrutura principal dos adamantanos ......................................................... 16
Figura 1.8 - Estruturas químicas do NAIs ..................................................................... 17
Figura 1.9 - Estrutura química da ribavirina .................................................................. 18
Figura 1.10 - Possíveis mecanismos de ação da ribavirina ............................................ 20
Figura 1.11 - Comparação entre as estruturas químicas da ribavirina e dos seus análogos
triazólicos ....................................................................................................................... 21
Figura 4.1 - Inibição da replicação viral em células A549 ............................................ 36
Figura 4.2 - Comparação entre a replicação viral em células MDCK e A549 .............. 37
Figura 4.3 - Inibição da atividade da RNA polimerase do vírus influenza A H3N2 pelo
PAR038 ......................................................................................................................... 39
Figura 4.4 - Alteração nos níveis de citocinas após o tratamento com o PAR038 ........ 41
ix
Índice de Tabelas
Tabela 1.1 - Pandemias humanas de influenza ocorridas no século XX ......................... 1
Tabela 1.2 - Proteínas codificadas pelos segmentos genômicos do vírus influenza A e
suas respectivas funções .................................................................................................. 6
Tabela 3.1 - Reagentes para a quantificação do gene M do vírus influenza A .............. 26
Tabela 3.2 - Reagentes para síntese de cDNA ............................................................... 29
Tabela 3.3 - Reagentes para amplificação dos genes PA, PB1 e PB2 ........................... 30
Tabela 3.4 - Relação dos primers utilizados para a amplificação dos genes PA, PB1 e
PB2 ................................................................................................................................ 31
Tabela 3.5 - Reagentes para reação de sequenciamento ................................................ 32
Tabela 4.1 - Efeito inibitório dos três análogos triazólicos da ribavirina sobre a
replicação in vitro do vírus influenza A H3N2 .............................................................. 35
Tabela 4.2 – Citotoxicidade, efeito inibitório e índice de seletividade do PAR038 ...... 36
Tabela 5.1 - Comparação entre a citotoxicidade, o efeito inibitório e o índice de
seletividade do PAR038 e os compostos de referência ribavirina, oseltamivir e
zanamivir ....................................................................................................................... 43
x
Lista de Siglas e Abreviaturas
A549 - Células de linhagem de epitélio pulmonar humano
aa - Aminoácidos
ATP - Adenina trifosfato
BSA - Albumina de soro bovino
CC50 - Concentração da droga que mantém 50% das células viáveis
CDC - Center for Disease Control and Prevention
cDNA - Ácido desoxirribonucleico complementar
cm2 - Centímetros quadrados
CO2 - Dióxido de carbono
CPE - Efeito citopático
Ct - Cycle threshold
CTL - Linfócitos T citotóxicos
CTP - Citosina trifosfato
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium
DMSO - Dimetilsulfóxido
DNA - Ácido desoxiribonucleico
dNTPs - Dideoxi-nucleotídeos
DP - Desvio padrão
EC50 - Concentração da droga capaz de inibir 50% da atividade enzimática
EDTA - Ácido etilenodiamino tetra-acético
FDA - Food and Drug Administration
Fiocruz - Fundação Oswaldo Cruz
GMP - Guanosina monofosfato
GTP - Guanosina trifosfato
HA - Hemaglutinina
HCV - Vírus da hepatite C
HPA - Health Protection Agency
HSV - Vírus Herpes Simples
IC50 - Concentração da droga capaz de inibir 50% da replicação viral
IC50m - IC50 baseado em ensaio molecular
IC50t - IC50 quantificado por titulação
ICTV - Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus
xi
IFN-α/β/γ - Interferon alfa/beta/gama
IL - Interleucina
IMP - Inosina monofosfato
IMPHD - Inosina monofosfato desidrogenase
Kb - Kilobases
LDH - Lactato desidrogenase
MCP-1 - Proteína quimiotática para monócitos
MDCK - Células epiteliais de rim canino
mg - Miligramas
ml - Mililitros
mM - Milimolar
MOI - Multiplicidade de infecção (relação vírus/célula)
NA - Neuraminidase
NAIs - Inibidores de neuraminidase
NEP/NS2 - Proteína de exportação nuclear/proteína não estrutural 2
ng - Nanograma
nm - Nanômetros
nM - Nanomolar
NP - Nucleoproteína
NS1 - Proteína não estrutural 1 (nonstructural protein 1)
nt - Nucleotídeos
NTPs - Nucleotídeos trifosfatados
OMS - Organização Mundial de Saúde
OST - Oseltamivir
PA - Polimerase ácida
PB1 - Polimerase básica 1
PB2 - Polimerase básica 2
PBS - Tampão salina fosfato
PCR - Reação em cadeia da polimerase
pg - Picograma
pH - Potencial hidrogeniônico
PKR - Proteína kinase R
pM - Picomolar
PMS - N-metil-sulfato de metila dibenzopirazina
xii
RANTES - Regulated on Activation, Normal T cell Expressed and Secreted
RB - Ribavirina
RDP - Ribavirina defosfatada
RE - Retículo endoplasmático
RMP - Ribavirina monofostato
RNA - Ácido ribonucleico
RNAc - Ácido ribonucleico complementar
RNAmc - Ácido ribonucleico mensageiro celular
RNAmv - Ácido ribonucleico mensageiro viral
RNAv - Ácido ribonucleico viral
RNP - Ribonucleoproteína
rpm - Rotações por minuto
RpRd - RNA polimerase RNA dependente
RT - Transcrição reversa
RTP - Ribavirina trifosfato
SFB - Soro fetal bovino
SI - Índice de seletividade
TCAD - Tripla combinação de drogas antivirias
TCID50 - Título viral infectivo para 50% do tecido em cultura
Th - Linfócitos T helper
TNF-α - Fator de necrose tumoral alfa
U - Unidades
UTP - Uracila trifosfato
VRS - Vírus Sincicial Respiratório
WHO - World Health Organization
XTT
-
Sal
de
tetrazol
(ácido
benzeno
sulfônico
(fenilaminocarbonil)-3,4-tetrazólio]-bis (4-metóxi-6-nitro))
ZAN - Zanamivir
μl - Microlitros
µM - Micromolar
µg – Microgramas
xiii
hidratado
sódio
3`-[1-
1. INTRODUÇÃO
1.1. Histórico
Os primeiros relatos de infecção pelo vírus influenza ocorreram por volta do século V
a.C., quando Hipócrates, considerado o “pai da medicina”, relatou casos de uma doença
respiratória com sintomatologia semelhante à ocasionada pelo influenza, que, em algumas
semanas, levou a muitos óbitos e depois desapareceu. Posteriormente, atribui-se ao vírus
influenza a responsabilidade por variados surtos de doenças respiratórias ao longo da história
[1].
No século XX ocorreram três notáveis pandemias nos anos de 1918, 1957 e 1968 e,
uma de extensão menor em 1977 [2]. A Tabela 1.1 resume as quatro pandemias do século
XX, identificando o subtipo e a possível origem do vírus influenza A que causou cada uma
delas, além do impacto gerado pelas pandemias [2].
Tabela 1.1: Pandemias humanas de influenza ocorridas no século XX. Aqui estão
representadas as pandemias de influenza que ocorreram no século XX, causadas por diferentes
subtipos do vírus influenza A.
Fonte: Adaptado de World Health Organization – Influenza Pandemic Plan [2].
Ano
Nome / Vírus
Origem
Impacto
1918
“Gripe Espanhola”
Recombinação vírus suíno ou
20 milhões a 40 milhões de óbitos.
(H1N1)
aviário ou adaptação direta do
vírus aviário em humanos.
1957
1968
“Gripe Asiática”
Possível recombinação
(H2N2)
genética de vírus humano
1 milhão de óbitos.
(H1N1) e aviário (H2N2).
Vírus H1N1 desapareceu.
“Gripe de Hong Kong”
Alta probabilidade de
1 milhão de óbitos.
(H3N2)
recombinação genética do
vírus humano (H2N2) e do
Vírus H2N2 desapareceu.
vírus aviário (H3Nx).
1977
“Gripe Russa” (H1N1)
Origem desconhecida, mas o
Potencial pandêmico. Envolveu inicialmente
vírus H1N1 é idêntico ao de
pessoas nascidas após 1950. O vírus H1N1
1950.
co-circulou com o H3N2.
Em 1996, um novo vírus influenza aviário H5N1 altamente patogênico foi isolado de
alguns gansos na província de Guangdong na China. Em 1997, foi detectado um surto deste
mesmo subtipo em aves domésticas em Hong Kong e, neste mesmo ano, foram reportados 18
casos de infecção em seres humanos, sendo 6 casos fatais, confirmando o rompimento da
1
barreira animal-humano. Embora ainda não tenha sido confirmada a transmissão sustentada
entre humanos, a emergência de um vírus aviário de alta patogenicidade capaz de infectar
seres humanos é de significativa importância para a saúde pública, sendo necessária a
vigilância contínua deste subtipo já que em fevereiro de 2003 ainda foram confirmados 2
casos de infecção humana pelo H5N1 em Hong Kong, sendo 1 caso fatal [4].
No ano de 2009 ocorreu a emergência de nova linhagem de influenza A/H1N1, que
provocou a primeira pandemia do século XXI, e ficou conhecida como A(H1N1)pdm09. A
circulação deste vírus teve início no México e Canadá e rapidamente se espalhou por todo o
mundo [5]. Este novo vírus foi produto de um rearranjo gênico entre uma linhagem aviária
norte-americana, uma linhagem sazonal de H3N2, a linhagem suína clássica norte-americana e
uma linhagem suína euro-asiática [6]. Este vírus teve alta transmissibilidade entre humanos e,
após a pandemia, o vírus A(H1N1)pdm09 passou a co-circular na população juntamente com
o H3N2, tornando-se portanto, um influenza sazonal, que foi incluído nas vacinas de 2010,
2011, 2012 e 2013 [7-10].
Mais recentemente, em 2013, foi detectada pela primeira vez a infecção de seres
humanos com o vírus influenza aviário A(H7N9). Foram confirmados 132 casos na China. A
maioria dos casos foi considerada severa e 37 pessoas morreram. Embora seja um vírus
aviário, o H7N9 não causa doença severa em aves domésticas, o que torna difícil a
confirmação da procedência aviária dos casos reportados. O vírus H7N9 ainda é pouco
conhecido com relação aos seus reservatórios e sua capacidade de transmissão de aves para
humanos e entre humanos, porém, por ser um vírus altamente patogênico, a Organização
Mundial de Saúde (OMS) recomenda que os países se mantenham em alerta para uma
possível circulação maciça desse subtipo viral [11].
1.2. O Vírus Influenza
1.2.1. Infecções causadas pelos vírus influenza
As infecções pelos vírus influenza ocorrem mundialmente, sob a forma de surtos
localizados ou regionais, em epidemias ou pandemias associadas aos subtipos do vírus
influenza A. Globalmente, a taxa de infecção atinge de 5 a 15% da população, podendo
ocasionar cerca de 3 a 5 milhões de casos severos, com 250 mil a 500 mil óbitos [12]. Elas
apresentam um padrão sazonal, ocorrendo surtos principalmente durante o período de inverno.
No Brasil, devido à grande diversidade climática, são observados diferentes padrões de
2
sazonalidade, cujo o pico da epidemia no Norte do país costuma ocorrer cerca de três meses
antes (março-abril) daquele observado na região Sul [13].
As infecções causadas pelos vírus influenza são infecções agudas do trato respiratório
inferior cujos principais sintomas (febre, coriza, tosse, dor de cabeça e no corpo e inflamação
das vias aéreas superiores) duram geralmente de 7 a 10 dias. Os picos de replicação do
influenza ocorrem em aproximadamente 48 horas após a infecção e a excreção viral diminui
dentro de 6 dias [14].
Apesar de geralmente auto-limitadas, as infecções causadas pelo vírus influenza
apresentam grande impacto na saúde pública, pois constituem uma das principais causas de
morbidade e mortalidade. Tanto a morbidade quanto a mortalidade por influenza podem variar
ano a ano, dependendo das cepas circulantes, do grau de imunidade da população geral e da
população susceptível. Os grupos mais vulneráveis a complicações devido à infecção pelos
vírus influenza são crianças menores de 2 anos de idade, idosos com mais de 65 anos,
portadores de doenças crônicas e imunodeprimidos [15].
1.2.2. Classificação e nomenclatura
Os vírus influenza estão classificados na família Orthomyxoviridae, gênero
Influenzavirus [16]. Atualmente, existem 5 gêneros de vírus influenza: Influenzavirus A, B e
C, considerados como vírus influenza propriamente ditos, além dos Isavirus e Thogotovírus
[17]. Os Thogotovírus foram isolados de carrapatos e são agentes infecciosos capazes de
causar meningite e meningoencefalite em seres humanos. Já os Isavirus estão relacionados a
quadros clínicos de anemia infecciosa em salmões [17]. A característica geral dos 5 gêneros é
apresentação do genoma na forma de RNA fita simples, segmentado com polaridade negativa
[18].
Os três gêneros de vírus influenza propriamente ditos diferem na gama de hospedeiros
e na patogenicidade. Os gêneros B e C são isolados quase exclusivamente de humanos,
enquanto o gênero A possui uma ampla variedade de hospedeiros [19]. As aves aquáticas
representam o reservatório natural dos vírus influenza A, que podem ser então transmitidos
para cavalos, gatos, cachorros, baleias, focas, aves silvestres migratórias, galinhas, porcos,
humanos e, mais recentemente, este gênero também foi encontrado em morcegos, embora sua
origem ainda seja desconhecida [20]. Enquanto os vírus influenza A são responsáveis por
causar de surtos epidêmicos a pandemias, os vírus influenza B causam epidemias periódicas, e
o gênero C causa somente endemias e doenças respiratórias leves [14].
3
Os vírus influenza A são divididos em subtipos de acordo com a combinação das suas
glicoproteínas de superfície, a hemaglutinina (HA) e a neuraminidase (NA) [16]. Até o
presente momento, já foram descritos 16 tipos de HA (H1 a H16) e 9 tipos de NA (N1 a N9),
encontrados em diferentes espécies animais [21] [22].
De acordo com a OMS, a nomenclatura das amostras humanas é representada da
seguinte maneira: indica-se o gênero do vírus ao qual pertence (A, B ou C), a origem
geográfica de isolamento (cidade ou país), número da amostra do laboratório e ano de
isolamento e, finalmente, coloca-se entre parênteses o subtipo de HA e NA. Por exemplo, uma
amostra designada como influenza A/England/42/1972 (H3N2) pertence ao gênero A, subtipo
H3N2, isolada na Inglaterra no ano de 1972 e recebeu o número 42.
Em contraste com o vírus influenza A, não existem subtipos de influenza B. Este
gênero é constituído por duas linhagens principais (Yamagata e Victoria). Embora existam
diferenças consideráveis entre as linhagens, seja em termos genéticos ou antigênicos, elas não
são suficientes para a designação em diferentes subtipos [23]. Assim, a nomenclatura adotada
para o vírus influenza B descreve apenas o gênero, local de detecção, número de origem e ano
(exemplo: B/Florida/4/2006).
1.2.3. Morfologia, genoma e proteínas virais
Os vírus influenza são vírus envelopados com tamanho de 80-120 nm de diâmetro e
apresentam capsídeo proteico com simetria helicoidal de aproximadamente 100 nm de
diâmetro [16]. São constituídos de 0,8 a 1% de RNA, 70% de proteína, 20% de lipídios e 5 a
8% de carboidratos (Figura 1.1).
4
Figura 1.1: Esquema representativo do vírus influenza A. As glicoproteínas HA e NA
encontram-se inseridas no envelope lipídico, assim como a proteína M2, que forma o canal
iônico viral. Abaixo do envelope encontra-se a proteína de matriz M1 e, internamente à matriz
estão os segmentos de RNAv fita simples.
Fonte: Adaptado de Kaiser, J. Science, 2006. [24]
Os vírus influenza A possuem 8 segmentos genômicos de RNA fita simples negativa
(Figura 1.1). Cada segmento encontra-se associado a nucleoproteínas virais (NP), formando
uma estrutura no qual o RNA viral (RNAv) enovela-se adquirindo uma forma helicoidal, e a
um complexo polimerase, e este conjunto recebe o nome de ribonucleoproteína (RNP) (Figura
1.2) [25]. Dentro do vírion existem 8 RNPs, que se encontram ancoradas internamente ao
envelope lipídico através das proteínas de matriz M1, que servem como proteínas
adaptadoras. A proteína M1 confere rigidez ao envelope viral, além de atuar como a força
motriz do brotamento viral. [26].
5
O genoma do vírus influenza A apresenta cerca de 13 Kb. Dos 8 segmentos, 6
codificam uma proteína cada, enquanto os outros 2 (genes M e NS) codificam para mais de
uma proteína. Os três maiores fragmentos genômicos codificam as três subunidades da RNA
polimerase viral, PA, PB1 e PB2. O gene PB1 pode ainda gerar dois produtos gênicos
menores: uma forma truncada da subunidade PB1 originada a partir de um códon de iniciação
alternativo e um pequeno peptídeo, PB1-F2 [27]. As proteínas codificadas pelos segmentos
genômicos do vírus influenza A e suas respectivas funções estão resumidas na tabela abaixo
(Tabela 1.2).
Tabela 1.2: Proteínas codificadas pelos segmentos genômicos do vírus influenza A e suas
respectivas funções. A tabela relaciona a numeração (de 1 a 8) referente ao segmento de
RNAv à(s) proteína(s) por eles codificadas, com suas respectivas funções. Entre parênteses
estão representados o tamanho dos genes (em número de nucleotídeos) e das proteínas (em
número de aminoácidos).
Fonte: Adaptado do NIAID
RNA
Proteína
Segmento 1 (2341 nt)
PB2 (759 aa)
RNA polimerase – reconhecimento do cap
Segmento 2 (2341 nt)
PB1 (757 aa)
RNA polimerase – alongamento da cadeia
Segmento 3 (2233 nt)
PA (716 aa)
RNA polimerase – atividade endonuclease
Segmento 4 (1778 nt)
HA (550 aa)
Adsorção e fusão
Segmento 5 (1565 nt)
NP (498 aa)
Ligação de RNA e forma o nucleocapsídeo
Segmento 6 (1413 nt)
NA (454 aa)
Atividade sialidásica
Segmento 7 (1027 nt)
M1 (252 aa)
Interação com RNP e importante para brotamento
M2 (366 aa)
Canal iônico
NS1 (890 aa)
Proteína multifuncional
Segmento 8 (890 nt)
NEP/NS2 (418
Função
Exportação da RNP
aa)
Inseridas no envelope viral estão presentes duas glicoproteínas, a HA e a NA, e a
proteína de membrana M2 (Figura 1.1) [16]. As glicoproteínas HA e NA conferem à partícula
viral uma morfologia espiculada quando observadas à microscopia eletrônica [18].
A HA é uma proteína trimérica formada por monômeros de hemaglutinina (HA0), que
são compostos por subunidades HA1 e HA2. A HA1 participa da adsorção viral, já que
contém o sítio de ligação que interage com os resíduos de ácido siálico presentes na
membrana plasmática da célula hospedeira. A HA2 é importante para fusão do envelope viral
com a membrana endossomal. Esta subunidade possui o peptídeo de fusão na sua extremidade
6
N-terminal, que devido à mudança de pH no interior do endossoma, sofre uma mudança
conformacional expondo o peptídeo e permitindo fusão de membranas [28].
A NA catalisa a clivagem de resíduos de acido siálico presentes na membrana
plasmática, permitindo a liberação das novas partículas virais formadas. Além disso, a NA
também remove o ácido siálico presente nas próprias glicoproteínas impedindo a agregação
das partículas virais. Este processo é importante para a mobilidade dos vírus no trato
respiratório [29].
A proteína M2 atravessa o envelope viral formando o canal iônico do vírion [30].
Após a endocitose do vírus, este canal permite o influxo de prótons e a acidificação do interior
do vírion, necessária para a exposição do peptídeo de fusão presente na HA e para a
dissociação entre as RNPs e as proteínas M1. Após este processo, as RNPs são então liberadas
para migrarem para o núcleo e darem início à transcrição e replicação viral [31].
Proteínas não estruturais também estão presentes nas partículas virais, como a NS1 e a
NEP/NS2 (do inglês nuclear export protein/nonstructural protein 1 e 2). A proteína NS1
possui diversas funções dentro do vírion. Ela está envolvida na regulação do splicing do
segmento 8 do RNA viral, na inibição da poliadenilação e clivagem do RNA mensageiro
celular (RNAmc), tornando-o disponível como fonte de iniciadores para a síntese de RNA
mensageiro viral (RNAmv) e no escape viral ao sistema imunológico do hospedeiro. Neste
último processo, a NS1 estimula inibidores celulares da proteína kinase R (PKR), que
participa da resposta imunológica inata e inibe a síntese de proteínas virais e celulares durante
a infecção [32]. Já a proteína NS2 participa da exportação do RNAmv do núcleo celular para
o citoplasma, onde será traduzido em proteínas virais e parece estar envolvida na regulação da
replicação viral [33].
1.2.4. Ciclo Replicativo
A replicação do vírus influenza A encontra-se esquematicamente apresentada na figura
1.3. O principal alvo da infecção pelos vírus influenza em humanos são as células epiteliais
ciliadas do trato respiratório, por apresentarem maior abundância de resíduos de ácido siálico
nas suas membranas. Os resíduos de ácido siálico ficam associados a resíduos de galactose
por ligações α-2,3 ou α-2,6, que se encontram preferencialmente no trato respiratório superior
e inferior, respectivamente [34]. Essas ligações são reconhecidas de maneira distinta por
hemaglutininas de vírus humanos e animais e são críticos na determinação do hospedeiro e no
tropismo tecidual.
7
Figura 1.3: Representação esquemática do ciclo replicativo do vírus influenza A. (a) O
vírus influenza possui um envelope lipídico no qual estão inseridas as proteínas HA, NA e M2
e seu genoma possui 8 segmentos de RNA fita simples organizados em complexos proteicos
chamados RNPs. As RNPs se encontram ancoradas no interior do envelope pelas proteínas de
matriz M1. Durante a adsorção do vírus influenza à célula hospedeira, ocorre a ligação da HA
aos resíduos de ácido siálico presentes na membrana citoplasmática. (b) O vírus é endocitado
e o baixo pH do endossoma leva à acidificação no interior do vírion através da entrada de
prótons pelo canal M2. Ocorre uma mudança conformacional na HA, que expõe o peptídeo
responsável pela fusão do envelope viral com a membrana endossomal. A acidificação faz
com que as RNPs se dissociem das proteínas M1 e sejam liberadas. As RNPs migram para o
núcleo celular, onde ocorre a replicação e a transcrição viral. (c) No núcleo, ocorre a
transcrição do RNAmv pela RNA polimerase dependente de RNA. As novas moléculas de
RNAmv são exportadas para o citoplasma celular com auxílio da proteína NEP/NS2. (d) No
citoplasma, os RNAmv são traduzidos nas proteínas virais. As proteínas de superfície HA,
NA e M2 são processadas no RE, glicosiladas no complexo de Golgi e transportadas para a
superfície celular. (e) A proteína NS1 tem um papel fundamental para a transcrição viral, já
que impede a saída do RNAmc do núcleo. (f) A RNA polimerase viral também é responsável
pela replicação do RNAv através da síntese de uma fita de RNA complementar que serve de
molde para a geração de novas fitas de RNAv, com polaridade negativa. Neste momento, as
NPs já se ligam aos novos RNAv formados gerando novas RNPs, que são transportadas para o
citoplasma com ajuda das proteínas M1 e NEP/NS2. (g) As RNPs são direcionadas para a
membrana plasmática celular, onde já estão ancoradas as proteínas de envelope viral, para
formarem as novas partículas virais por brotamento. As novas partículas virais são liberadas
para o meio extracelular pela ação da NA.
Fonte: Adaptado de Das et al, Nature, 2010 [35].
8
Os resíduos de ácido siálico permitem a ligação da HA e a adsorção do vírus influenza
à membrana plasmática da célula hospedeira (Figura 1.3). A ligação ocorre na subunidade
HA1. Após a adsorção, ocorre a endocitose da partícula viral (Figura 1.3). O endossoma
celular já é um ambiente fisiologicamente ácido, permitindo então a entrada de prótons para o
interior do vírion através do canal iônico M2 [36]. A acidificação (pH entre 5,0 e 6,0) do
interior da partícula viral causa uma mudança conformacinal na HA, que leva à exposição de
seu domínio hidrofóbico contendo o peptídeo de fusão. Este se insere na membrana do
endossoma, possibilitando sua fusão com o envelope viral. A diminuição do pH dentro do
vírion também possibilita que as RNPs se dissociem das proteínas M1 e sejam liberadas para
o citoplasma celular [31].
Uma vez no citoplasma, as RNPs migram para o núcleo celular através da ligação a
nucleoporinas (Figura 1.3). A penetração no núcleo é dependente de importinas α e β, que
reconhecem sinais de localização nuclear presentes tanto na proteína viral NP [35] quanto na
subunidade PB2 da RNA polimerase [37].
No núcleo ocorrem os processos de transcrição e replicação do genoma viral pelo
complexo polimerase. A transcrição ocorre em momentos iniciais do ciclo replicativo e é um
processo dependente de uma sequência iniciadora, que é obtida a partir do pré-RNAmc. Os
RNAmv formados são transportados para o citoplasma celular com auxílio da proteína
NEP/NS2 e de fatores celulares, onde serão traduzidos em proteínas virais utilizando-se da
maquinaria celular. As proteínas virais de superfície, como a HA, NA e M2, são processadas
no retículo endoplasmático (RE) da célula, glicosiladas no complexo de Golgi e são
direcionadas para a membrana plasmática celular (Figura 1.3). A proteína M1 é sintetizada na
fase inicial da replicação, a partir do RNAmv codificado pelo segmento 7, que, em uma fase
mais tardia, sofre o mecanismo de splicing, originando a proteína M2. O mesmo acontece com
as proteínas NS1 e NEP/NS2, sendo a segunda dependente do splicing [30].
A replicação do genoma viral se dá através da síntese de uma fita intermediária de
RNA complementar (RNAc) com polaridade positiva, para posterior geração das novas fitas
de RNAv polaridade negativa. Logo após a formação dos novos RNAv, as NP se ligam e dão
origem às novas RNPs, que se associam às proteínas M1 e NEP/NS2. Juntamente com a
maquinaria de exportação nuclear da célula, o complexo RNP-M1-NEP/NS2 é exportado para
o citoplasma celular até a região da membrana plasmática onde estão inseridas as proteínas de
superfície virais. A proteína M1 é a responsável por recrutar todos os componentes virais para
o sítio de brotamento, além de se associar à membrana plasmática celular [30].
9
A liberação das novas partículas virais ocorre por brotamento (Figura 1.3). Este
processo requer uma curvatura da membrana plasmática, que é estimulada pelo acúmulo de
proteínas M1 no interior da mesma [26]. O brotamento termina quando ocorre a fissão da
membrana plasmática celular. Nesse momento, as novas partículas virais estão prontas para
serem liberadas e a NA cliva os resíduos de ácido siálico presentes na membrana celular e
remove o ácido siálico presente nas próprias glicoproteínas, impedindo a reinfecção da célula
já infectada e a agregação das partículas virais (Figura 1.3) [29].
1.2.5. RNA polimerase viral
A polimerase do vírus influenza é uma RNA polimerase RNA dependente (RpRd)
constituída por 3 subunidades: uma subunidade ácida, chamada de PA (do inglês polymerase
acid) e duas subunidades básicas, chamadas PB1 e PB2 (do inglês polymerase basic 1 e 2)
(Figura 1.4) [38]. As três subunidades interagem formando o complexo polimerase,
responsável pela replicação e transcrição. A estrutura da RNA polimerase do vírus influenza
ainda não foi totalmente caracterizada. A estrutura da subunidade PA é a mais conhecida
(Figura 1.4), já que seu domínio C-terminal de interação com a subunidade PB1 foi
determinado em 2008 [39-40], e, em 2009, foi atribuída ao seu domínio N-terminal a função
de endonuclease, responsável pela clivagem do cap do pré-RNAmc [41-42]. A subunidade
PB2 possui 3 domínios resolvidos: o domínio C-terminal de interação com PB1, um domínio
central cuja função é de ligação ao cap do pré-RNAmc chamada de cap binding, e o domínio
N-terminal de interação com proteínas do hospedeiro (Figura 1.4) [37]. Dentro deste último,
estão bem descritos 2 resíduos, o 627, que está relacionado à adaptação do vírus influenza A
aos seus diversos hospedeiros, e o de sinal de localização nuclear citado anteriormente (Figura
1.4) [37]. Diferentemente das subunidades PA e PB2, a PB1 permanece pouco caracterizada,
sendo conhecidos somente os domínios de interação com as outras 2 subunidades (Figura 1.4).
A estrutura central de PB1 possui motivos conservados característicos de RNA polimerases
dependentes de RNA fita simples e, por isso, foi atribuída a função de polimerase
propriamente dita a esta subunidade [43-44].
10
Figura 1.4: Estrutura e função das três subunidades da RNA polimerase do vírus
influenza. (A) Estrutura linearizada e estrutura terciária das subunidades PA (azul), PB1
(vermelho) e PB2 (verde). Os domínios estruturalmente caracterizados estão representados
pelos retângulos mais largos nas três subunidades. Os resíduos apresentados em preto estão
relacionados à adaptação ao hospedeiro. (B) Durante a transcrição do RNAv, a subunidade
PB2 da polimerase se liga à extremidade 5`cap do pré-RNAmc (vermelho), que é clivado pelo
domínio endonuclease da subunidade PA. O pequeno RNA capeado resultante é utilizado para
iniciar a síntese do RNAmv a partir do RNAv molde (verde). O alongamento da nova fita é
realizado pela subunidade PB1 e, com isso, é gerado o RNAmv (vermelho e azul), que é
exportado para o citoplasma para ser traduzido em proteínas virais.
Fonte: Adaptado de Boivin et al JBC, 2010 [37].
Durante o processo de transcrição do RNAv, a síntese do RNAmv se dá pelo
complexo polimerase residente nas RNPs, que se encontra ligado ao RNA molde (RNAv) e na
conformação cis (Figura 1.5) [45]. Cada segmento de RNAv contém sequências de 13 e 12
nucleotídeos nas extremidades 5` e 3`, respectivamente, que são conservadas e parcialmente
complementares (de 5 a 7 nucleotídeos). Este fato faz com que os nucleotídeos
complementares formem uma região pareada, que é reconhecida pelo complexo polimerase
(Figura 1.5). O processo de transcrição é dependente de uma sequência iniciadora 5`cap, que é
obtida através da ligação da subunidade PB2 ao pré-RNAmc e da clivagem pelo domínio
endonuclease de PA (Figuras 1.4 e 1.5). A síntese do RNAmv é então iniciada na extremidade
3` do RNA molde e PB1 catalisa o alongamento da nova cadeia formada até a sequência de 5
a 7 uracilas (U) localizada a 16 nucleotídeos da extremidade 5` do RNA molde.
11
Diferentemente do RNAmc, que necessita de uma polimerase específica para a
poliadenilação, a própria RNA polimerase viral sintetiza a cadeia poli-A do RNAmv [46].
A replicação do genoma viral ocorre em um momento mais tardio da infecção pelo
complexo polimerase solúvel na conformação trans (Figura 1.5) [45]. O processo da
replicação é independente de iniciador e o RNAv é sintetizado a partir de um RNAc de
polaridade positiva. A extremidade 3` do RNAv (RNA molde) é liberada do complexo
polimerase associado as RNPs por mecanismos não conhecidos, permitindo sua ligação ao
complexo polimerase solúvel. A replicação é iniciada com auxílio de uma molécula de GTP e
ocorre o alongamento da fita de RNAc. A extremidade 3` se desliga deste complexo e permite
a ligação da extremidade 5` do RNA molde, para que ocorra a síntese completa do RNAc. A
proteína NP é então recrutada e ocorre a síntese do novo RNAv (polaridade negativa) a partir
do RNAc (Figura 1.5) [46]. Um mecanismo alternativo de síntese do RNAc envolvendo o
complexo polimerase na conformação cis também já foi proposto. Neste caso, o complexo
polimerase residente nas RNPs sintetiza os RNAc, que mesmo em baixos níveis ficam
acumulados até que os complexos polimerase recém-sintetizados sejam importados para o
núcleo da célula e os utilizem como molde para síntese do novo RNAv de polaridade
negativa. Quando o RNAv é formado, a NP é recrutada e são formadas novas RNPs [46].
12
Figura 1.5: Mecanismos de transcrição e replicação do genoma viral. O complexo
polimerase presente nas RNPs, ou seja, na conformação cis, se liga à extremidade
parcialmente complementar do RNAv (azul). (i) Para o início da transcrição, a subunidade
PB2 se liga ao cap do pré-RNAmc (vermelho) e PA cliva essa extremidade. (ii) Esta
extremidade é posicionada no sítio ativo de PB1 junto com a extremidade 3` do RNA molde
(RNAv) e a transcrição se inicia. (iii) Ocorre o alongamento da fita de RNAmv (vermelho) e a
poliadenilação é realizada pela própria RNA polimerase viral através da síntese repetitiva de
A a partir da sequência de U presente próxima da extremidade 5` do RNA molde. (iv) O
RNAmv é então liberado do complexo polimerase e se liga ao complexo de ligação ao cap
(CBC) presente no núcleo celular, que auxilia a proteína NEP/NS2 no transporte para o
citoplasma celular. (v) A replicação do genoma viral é realizada pelo complexo polimerase na
conformação trans. Para tal, a extremidade 3` do RNA molde (azul) é liberada do complexo
polimerase associado às RNPs por mecanismos não conhecidos, permitindo sua ligação ao
complexo polimerase na conformação trans. (vi) A replicação é iniciada com auxílio de uma
molécula de GTP, o que promove o alongamento da fita de RNAc (vermelho). (vii) Através
da ligação da extremidade 5` do RNA molde ao complexo polimerase na conformação trans,
ocorre a síntese completa do RNAc. A proteína NP é então recrutada e ocorre a síntese do
novo RNAv (polaridade negativa) a partir do RNAc (não mostrado nesta figura).
Fonte: Adaptado de Fodor, E. Acta Virologica, 2013 [46].
O RNAv funciona como molde tanto para a síntese do RNAmv na transcrição quanto
para a síntese do RNAc durante a replicação. Embora os mecanismos de síntese sejam
distintos, ambos são realizados pelo complexo polimerase do vírus influenza e ainda
permanece bastante desconhecido quais são os mecanismos de regulação entre os processos de
13
transcrição e replicação. Uma possível explicação seria que durante a transcrição, o complexo
polimerase atuaria em uma conformação distinta quando comparada ao processo de replicação
[45].
Diferentemente do RNAmv, os RNAc e RNAv recém sintetizados são encapsidados,
isto é, se ligam à NPs solúveis logo após a sua síntese. Este fato sugere que a NP esteja
envolvida na regulação da troca entre transcrição e replicação e essa hipótese vem sendo
discutida em diversos trabalhos, já que é a NP que interage diretamente tanto com o RNAv
quanto com a RNA polimerase [47-48]. Além da NP, a proteína NEP/NS2 também parece
estar envolvida com esse processo de regulação. Alguns artigos demonstraram que o efeito da
NEP/NS2 na síntese de RNAv é dependente da sua concentração, já que em grandes
quantidades a NEP/NS2 anula completamente a atividade da RNA polimerase [49]. Este dado
ainda é um pouco controverso, já que também foi mostrado que baixas concentrações de
NEP/NS2, além de estimularem a replicação, também estimulam a síntese de RNAmv
dependendo do modelo experimental [33, 49].
Diversos outros mecanismos de regulação da troca entre replicação e transcrição vem
sendo propostos. Entre eles estão a existência de pequenos RNAs virais que estariam
envolvidos na regulação [50], além de fatores do hospedeiro, que poderiam interagir com a
NP e com a polimerase viral durante estes processos [51-52], mostrando que ainda são
necessários mais estudos estruturais e funcionais sobre as proteínas virais, suas interações e
funções.
1.3. Antivirais
Os vírus influenza apresentam grande variabilidade genética, ocasionada basicamente
por dois processos: drift e shift genético. O drift genético corresponde ao acúmulo de
mutações pontuais nas proteínas mais antigênicas do vírus influenza, HA e NA, devido ao fato
da RNA polimerase viral não possuir atividade de correção. As mutações no gene HA
constituem o principal obstáculo para o controle da doença através da vacinação, o que
demanda a formulação anual das vacinas utilizadas nos hemisférios Norte e Sul [7, 12]. O
outro mecanismo mais drástico que leva ao aumento da diversidade genética, o shift genético,
corresponde ao rearranjo entre os segmentos genômicos de diferentes linhagens de influenza.
Devido a dificuldade de controle das infecções pelo vírus influenza com a vacinação,
outra estratégia empregada para a contenção e tratamento destas infecções durante os surtos
sazonais é a utilização de drogas antivirais.
14
Existem duas classes de antivirais aprovadas para o uso contra a influenza pela agência
reguladora norte americana, Food and Drug Administration (FDA) [53]. São eles:
bloqueadores do canal de prótons M2 e inibidores de neuraminidase (NAIs) [54] (Figura 1.6).
Figura 1.6: Etapas da replicação do vírus influenza que são alvos dos principais
antivirais. Durante o ciclo replicativo do vírus influenza existem três principais pontos de
inibição por drogas antivirais. As adamantanas (amantadina e rimantadina) bloqueiam o canal
de prótons M2, não permitindo assim a fusão entre o envelope viral e a membrana do
endossoma celular. Os NAIs (oseltamivir e zanamivir) inibem a enzima
neuraminidase/sialidase e, consequentemente, inibem a liberação das novas partículas virais
formadas. Já a ribavirina, inibe a RNA polimerase viral e, com isso, a replicação e a
transcrição do genoma viral.
Fonte: Adaptado de von Itzstein, Nature, 2007 [29].
15
1.3.1. Bloqueadores do canal M2
Os adamantanos (Figura 1.7), amantadina e rimantadina, foram a primeira classe de
drogas anti-influenza utilizada e atua somente contra os vírus influenza A [55]. Tanto a
amantadina quanto a rimantadina possuem o mesmo mecanismo de ação, penetram no canal
iônico M2 do vírus e bloqueiam a passagem de prótons para o interior do mesmo. A
diminuição do pH no interior do vírus é necessária para a mudança conformacional da HA que
permite a fusão entre o envelope viral e a membrana do endossoma celular e para a
dissociação entre as RNPs e as proteínas M1 (Figura 1.6). Além disso, os adamantanos
também podem se ligar às proteínas M2 recém-sintetizadas (Figura 1.6).
Esta classe de drogas não possui atividade contra o vírus influenza B e, além disso, é
rápido o desenvolvimento de resistência viral [56-57]. O vírus influenza A H1N1 pandêmico
de 2009, por exemplo, surgiu naturalmente resistente aos adamantanos, pois adquiriu o gene
M de um vírus influenza suíno euro-asiático resistente a esta classe, contendo a mutação de
resistência mais frequente, a S31N (troca de serina por asparagina na posição 31 da proteína
M2) [58].
1.3.2. Inibidores de neuraminidase (NAIs)
Desde 1999/2000, os NAIs (Oseltamivir; Tamiflu®, Roche e Zanamivir; Relenza®,
GlaxoSmithKline) (Figura 1.8) têm sido utilizados para o tratamento de infecções pelos vírus
Influenza dos gêneros A e B [59].
Estas moléculas são análogos do ácido siálico presente nas células alvo do vírus
influenza. Portanto, os NAIs ligam-se de forma competitiva ao sítio ativo da NA, impedindo
que ocorra a clivagem do ácido siálico e consequente liberação do vírus influenza no trato
16
respiratório, o que acarreta no acúmulo de partículas virais na membrana nas células
infectadas e diminui o espalhamento da infecção.
Figura 1.8: Estruturas químicas dos NAIs. Estão representadas as estruturas químicas do
oseltamivir (à esquerda) e do zanamivir (à direita).
Fonte: Adaptado de Das et al, Nature, 2010 [35].
Até 2007, a circulação mundial de cepas do vírus influenza resistentes aos NAIs era
menor que 1% [60]. Porém, na temporada de 2007-2008 ocorreu a emergência de uma cepa
sazonal de influenza A H1N1 resistente ao OST e, até a temporada de 2008-2009, a
prevalência na circulação desta cepa aumentou para mais de 90% mundialmente, chegando a
100% em alguns países [61-62]. Além da circulação de cepas virais sazonais resistentes do
subtipo H1N1, também já foram descritas cepas resistentes do vírus influenza sazonal H3N2
[62-64] e do vírus pandêmico de 2009 [65-66], demonstrando a necessidade de vigilância
destes vírus.
A sensibilidade da NA aos NAIs é avaliada através de ensaios de inibição enzimática
[67-68] e, a partir destes ensaios, é definida a concentração de droga capaz de inibir 50% da
atividade enzimática (IC50). A diminuição de sensibilidade ou a resistência a uma droga
devido a alguma mutação é caracterizada pelo aumento de 100 a 10.000 vezes no valor de
IC50 [62]. Porém, o valor de IC50 depende do tipo de ensaio utilizado, do gênero e subtipo do
vírus influenza e da droga avaliada, sendo então necessárias análises adicionais para que a
detecção de resistência seja clinicamente relevante. Para tal, é verificada a presença de
mutações que conferem resistência ao OST, como a mutação no resíduo 274 do gene da NA
(numeração de N2, ou, 275 na numeração de N1), a H274Y por pirosequenciamento [69] ou
pelo sequenciamento convencional de Sanger [70]. Também vêm sendo descritas mutações
17
consideradas como redutoras da sensibilidade da NA ao OST, como a mutação E119V dos
vírus H3N2 e a R152K dos vírus influenza B [71].
1.3.3. Ribavirina
A ribavirina (RB) (Figura 1.9) é um antiviral de amplo espectro, que inibe diversos
vírus de RNA, como os paramyxovírus (vírus respiratório sincicial – VSR – e vírus
parainfluenza), flavivírus (vírus da hepatite C - HCV, vírus da febre amarela e vírus do Oeste
do Nilo) e orthomyxovírus (vírus influenza A e B). Este composto também possui atividade
antiviral contra alguns vírus de DNA, como por exemplo os vírus herpes simplex tipos 1 e 2
(HSV-1 e 2) e adenovírus tipo 3. Em modelos animais, o efeito antiviral da RB é mais restrito,
inibindo apenas alguns vírus de RNA [72-73].
Em humanos, a RB é utilizada principalmente no tratamento de hepatite C crônica
juntamente com o interferon peguilado e no tratamento de infecções severas pelo VSR [7475]. Embora o VSR e o HCV sejam vírus de RNA, são bastante diferentes entre si. Além
disso, o tratamento com a RB requer altas doses e causa muitos efeitos adversos. Desta
maneira, compostos alternativos à RB têm sido de grande interesse entre os pesquisadores.
No caso dos vírus influenza, devido ao número limitado de drogas anti-influenza,
vários estudos clínicos da eficácia da RB e sua combinação com NAIs vêm sendo realizados.
A RB se mostrou um potente inibidor in vitro e in vivo dos vírus influenza A e B. Em estudos
utilizando a tripla combinação de drogas antivirias (TCAD), amantadina, OST e RB,
observou-se um efeito inibitório sinérgico dos três compostos contra os principais subtipos de
vírus influenza humanos, H1N1 e H3N2, sensíveis aos compostos ou resistentes à amantadina
ou ao OST [76-77].
18
Embora sejam realizados diversos estudos com relação à atividade antiviral da RB, seu
mecanismo de ação ainda não foi completamente elucidado. Existem três possíveis
mecanismos inibitórios propostos pela literatura (Figura 1.10). O primeiro mecanismo,
descrito em 1973, foi o de inibição de enzimas celulares envolvidas na biossíntese de
nucleotídeos, mas especificamente, da inosina monofosfato desidrogenase (IMPHD),
responsável pela conversão de iosina 5`-monofosfato em xantina 5`-monofosfato e crucial na
produção intracelular de guanosina trifosfato (GTP) e na síntese de RNA viral (Figura 1.10b)
[78]. O outro mecanismo é o de inibição direta da RNA polimerase viral, embora acredite-se
que este não seja seu principal alvo, já que até hoje não foram descritas mutações de
resistência a este composto (Figura 1.10c). O terceiro mecanismo, proposto mais
recentemente, é o de mutagênese letal (Figura 1.10d) [79-80]. Neste caso, a RB é incorporada
como sendo análoga de GTP e ATP (adenosina trifosfato) por RNA polimerases dependentes
de RNA. Desta maneira, pode ocorrer o aumento do número de mutações geradas durante a
replicação viral para uma taxa acima do limite, levando ao acúmulo de erros (catástrofe por
erro) e a diminuição da fidelidade genética. Consequentemente, novas partículas virais não
funcionais são geradas ou o ciclo replicativo completo é abortado [73].
Além dos mecanismos de inibição da replicação viral, já foi descrita uma possível
função imunomodulatória para a RB em modelos de camundongos com hipersensibilidade.
Dependendo da linhagem utilizada, a RB inibiu ou aumentou a secreção de interleucina 10
(IL-10) [81]. Além disso, durante o tratamento de hepatite C crônica com a RB, se observa
somente uma pequena redução da carga viral, sendo seu efeito predominante na diminuição
dos danos hepáticos, sugerindo que esta droga possui um efeito anti-inflamatório suplementar
ao efeito antiviral [82] (Figura 1.10a).
19
Figura 1.10: Possíveis mecanismos de ação da ribavirina. Este esquema demonstra os
possíveis mecanismos de ação da RB, tendo como exemplo o tratamento contra hepatite C
crônica. (a) A RB parece possuir um efeito imunomodulatório, inibindo a resposta Th2 e
estimulando Th1. Este estímulo leva à secreção de IFN-γ e TNF-α por células T citotóxicas
(CTL). (b) Após a entrada da RB na célula, esta é convertida em ribavirina monofosfato
(RMP) e é então difosforilada (RDP – ribavirina difosfato) ou trifosforilada (RTP – ribavirina
trifosfato) por enzimas celulares. A forma RMP inibe a enzima inosina monofosfato
desidrogenase (IMPDH), levando à depleção de GTP intracelular e a inibição indireta da
replicação viral. (c) A forma RTP é capaz de inibir diretamente a RpRd e, consequentemente,
inibe a replicação viral. (d) A forma trifosfatada da RB também é capaz de atuar através do
mecanismo de catástrofe por erro, que aumenta o número de mutações no RNA viral e os
novos vírions formados não são funcionais.
Fonte: Adaptado de Feld & Hoofnagle, Nature, 2005. [83]
1.3.4. Análogos triazólicos da ribavirina
A RB é um antiviral de amplo espectro e por isso sua estrutura química pode ser um
protótipo interessante para o desenvolvimento de novas drogas antivirais. Porém, seu uso
clínico é limitado devido à toxicidade consideravelmente alta deste composto.
Moléculas que possuem um anel triazólico em sua estrutura, como a RB, apresentam
atividades biológicas diversas, antibacterianas [84], antifúngicas [85], anti-câncer [86],
antivirais [87], entre outras.
O grupo da Drª Núbia Boechat e do Drº Luiz Pinheiro de Farmanguinhos/Fiocruz
sintetizou três compostos que são análogos triazólicos da RB. Foram utilizadas técnicas
padrão da química medicinal, como, por exemplo, a substituição isostérica e o bioisosterismo
20
de anel (substituição de grupos farmacofóricos, ou seja, grupos funcionais), já descritas
anteriormente pelo grupo [88-89].
Os três compostos possuem estrutura química semelhante à da RB, contendo a ribose e o
anel triazólico (Figura 1.11), embora o anel 1,2,4-triazol da RB tenha sido substituído pelo
1,2,3-triazol. Foram adicionados radicais benzeno no lugar das hidroxilas para proteger as
novas moléculas (Figura 1.11), já que trabalhos anteriores demonstraram que nucleosídeos
protegidos possuem melhor atividade antiviral [87], além de serem intermolecularmente mais
estáveis. A principal alteração na estrutura foi o grupo funcional amida da ribavirina, que foi
substituído pelos radicais c-propil, trifluorometil e métoxi, originando os compostos
chamados de PAR017, PAR018 e PAR038, mostrados na figura abaixo (Figura 1.11).
Por serem compostos análogos à RB, são potenciais antivirais. Então, através de uma
colaboração, os três análogos foram gentilmente cedidos ao nosso laboratório para que
verificássemos sua atividade anti-influenza.
Figura 1.11: Comparação entre as estruturas químicas da ribavirina e dos seus análogos
triazólicos. Durante a síntese dos análogos triazólicos da ribavirina, foi mantido o corpo
básico da estrutura, que representa a ribose (círculo cinza) e o anel triazólico (retângulo
cinza). A principal alteração foi no grupo funcional, onde o grupo amida da ribavirina foi
substituído pelos radicais c-propil, trifluorometil ou métoxi.
21
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Estudar o efeito dos compostos análogos triazólicos da ribavirina sobre a replicação in
vitro do vírus influenza.
2.2. Objetivos específicos

Verificar a potência dos análogos PAR017, PAR018 e PAR038;

Avaliar a citotoxicidade do PAR038;

Determinar o efeito inibitório e a potência do PAR038 sobre a replicação in vitro
do vírus influenza;

Investigar o efeito do PAR038 sobre a RNA polimerase viral;

Gerar cepas do vírus influenza resistentes ao PAR038;

Avaliar a possível função imunomodulatória do PAR038.
22
3. METODOLOGIA
3.1. Células, vírus e compostos utilizados
3.1.1. Células
Células epiteliais de rim canino (MDCK) e células de linhagem de epitélio pulmonar
humano (A549) foram cultivadas, respectivamente, em meio de manutenção DMEM
(Dulbecco's Modified Eagle Medium) suplementado com 10 % de soro fetal bovino (SFB) e
DMEM/F-12 suplementado com 2% de soro fetal bovino e 1 % de L-glutamina. Ambos os
meios foram também suplementados com antibióticos (penicilina; 100 U/mL, e
estreptomicina; 100 µg/mL). Ambas as culturas foram mantidas em garrafas de poliestireno de
75 cm2, em atmosfera de 5% de gás carbônico (CO2) a 37ºC e acompanhadas diariamente ao
microscópio óptico de campo claro. Durante o repique as células foram lavadas com PBS
(tampão salina fosfato) 1x pH 7,2 e tratadas com tripsina 0,25 % (A549) ou tripsina-EDTA
(ácido etilenodiamino tetra-acético) 0,25 % (MDCK).
3.1.2. Vírus
A cepa viral utilizada nos experimentos foi a influenza A/England/42/1972 (H3N2), cepa
sazonal do ano de 1972, sensível ao oseltamivir. Tal cepa foi utilizada por se tratar de um
agente já adaptado a laboratório. Para propagação, esta cepa foi inoculada em células MDCK
cultivadas em meio de inoculação (meio DMEM contendo 4 % de albumina – BSA – e 0,4
mg/mL de tripsina). A cultura foi incubada a 35ºC e acompanhada diariamente até a
observação do efeito citopático (CPE), alterações causadas nas células devido à infecção viral.
O sobrenadante foi então coletado e centrifugado a 1500 rpm por 5 minutos. O precipitado
contendo os restos celulares foi descartado e o sobrenadante contendo os vírus foi coletado e
congelado a -70ºC até sua utilização.
3.1.3. Compostos
Os três compostos análogos triazólicos da ribavirina utilizados, PAR017, PAR018 e
PAR038, foram sintetizados pelo grupo da Drª Núbia Boechat e do Drº Luiz Pinheiro de
Farmanguinhos/Fiocruz e gentilmente cedidos ao nosso laboratório, através de uma
colaboração, para que avaliássemos sua atividade biológica. Os compostos foram diluídos em
23
DMSO 100 % nas concentrações estoque de 50 e 1 mM. Durante o uso, os compostos foram
diluídos em meio de manutenção de acordo com a concentração utilizada nos experimentos.
3.2. Determinação da viabilidade celular
A citotoxicidade do análogo triazólico da ribavirina, PAR038, foi determinada a partir de
ensaios de viabilidade celular em células MDCK e em células A549.
Para o ensaio em células MDCK, utilizou-se a técnica de redução do sal de tetrazol, o
XTT. Neste ensaio, as células viáveis metabolizam o XTT gerando o formazan, produto de
coloração alaranjada cuja quantidade pode ser medida através de um espectrofotômetro.
Então, quanto mais cor, maior o número de células viáveis. Para tal, as células foram
semeadas em placas de 96 poços de fundo chato (5x104 células/poço) em meio de
manutenção. Após 24 horas, foram tratadas com diferentes concentrações do composto (100,
250, 500, 750 e 1000 μM) diluído em meio DMEM com 2 % de SFB e foram mantidas por 72
horas a 37ºC e atmosfera de 5% CO2. Após esse período, 5 mg/mL do sal XTT foi adicionado
em meio DMEM sem soro na presença de 0,01 % do ativador de respiração celular PMS (Nmetil-sulfato de metila dibenzopirazina). Após a incubação de 4 horas a 37ºC, foi realizada a
leitura da metabolização do XTT pelas células viáveis no espectrofotômetro a 492 nm e 620
nm. Para a determinação do valor de CC50 (concentração do composto que mantém 50 % das
células viáveis), foi feita uma curva de regressão linear utilizando-se o programa Excel.
Para determinação da citotoxicidade em células A549, a liberação da enzima lactato
desidrogenase (LDH) no conteúdo extracelular foi quantificada. Neste caso, as células A549
foram plaqueadas em placas de 24 poços (3x105 células/poço) e, após 24 horas foram tratadas
com o composto PAR038 na concentração de 15 µM em meio de manutenção sem SFB. Após
mais 24 horas de incubação a 37ºC e atmosfera de 5% CO2, o sobrenadante foi coletado e foi
feita a dosagem de LDH com o kit de Doles, de acordo com as instruções do fabricante. Neste
caso, a viabilidade celular será inversamente proporcional à liberação de LDH.
3.3. Ensaios de inibição da replicação viral
Células MDCK foram semeadas em placas de 24 poços (2x105 células/poço) e cultivadas
em meio de manutenção. Após atingirem 80% de confluência, o meio foi retirado, as células
foram lavadas duas vezes com meio de inoculação e infectadas durante 1 hora a 35ºC e
atmosfera de 5 % de CO2 com o vírus influenza A H3N2 em um MOI de 0,05 (multiplicidade
de infecção – relação vírus/célula). O inóculo foi retirado e as células infectadas foram
24
tratadas com diferentes concentrações do composto PAR038 (1, 5, 10, 25 e 50 µM) diluído
em meio de inoculação. Após 24 horas de tratamento, os sobrenadantes das culturas foram
coletados e congelados a -70ºC até sua utilização. Os vírus presentes nos sobrenadantes foram
quantificados por RT-PCR em tempo real e titulados em células MDCK por TCID50 (título de
vírus infectivo para 50 % da cultura celular).
Os ensaios de inibição da replicação viral também foram realizados nas células A549, as
quais foram semeadas em placas de 24 poços (4x105 células/poço) em meio de manutenção.
Após atingirem 80 % de confluência, o meio foi retirado, as células foram lavadas duas vezes
com meio de inoculação e infectadas com o vírus H3N2 em um MOI de 0,25. Após incubação
de 1 hora a 35ºC e 5 % de CO2, o inóculo foi retirado e as células infectadas foram tratadas
com diferentes concentrações do PAR038 (0, 5, 15, 30 e 60 µM). Após 24 horas de
tratamento, o sobrenadante foi coletado e os vírus foram titulados em células MDCK por
TCID50/mL.
3.4. Avaliação da produção viral
3.4.1. Quantificação por RT-PCR em tempo real em etapa única
3.4.1.1.
Extração de RNA
As extrações de RNA viral foram realizadas utilizando-se o kit QIAmp Viral RNA mini
kit (Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante. Brevemente, foi adicionado 560 µL
de solução desnaturante (tampão AVL) capaz de inativar RNAses e assegurar à liberação do
RNA a 140 µL da amostra a ser extraída. Após incubação de 10 minutos a temperatura
ambiente, foi adicionando 560 µL de etanol para permitir a ligação do RNA à membrana de
sílica em gel “QIAamp”. Foram realizadas duas etapas de lavagens para retirada de impurezas
e o RNA viral purificado foi eluído em 80 µL de água livre de DNAse/RNAse e estocado a 70ºC até o momento de uso.
3.4.1.2.
RT-PCR em tempo real em única etapa
O RNA viral foi submetido à reação de RT-PCR em tempo real em etapa única para
quantificação do gene de matriz (M) do vírus influenza A, de acordo com o protocolo do
25
Centers for Disease Control and Prevention/Atlanta – World Health Organization (CDCWHO) (Tabela 3.1).
Tabela 3.1: Reagentes para a quantificação do gene M do vírus influenza A.
Reagentes
Concentrações
Tampão Rxn
2x
Mistura enzimaa
5 U/µL
Primer INFAb
0,8 µM
Sonda Taqmanc
0,2 µM
Rox
25 µM
RNA
100 ng/µl
Volume final
25 µL
a
SuperScriptTM III Transcriptase Reversa/Platinum® Taq DNA polimerase, proveniente do kit
SuperScriptTM III Platinum® One-Step Quatitative RT-PCR da Invitrogen.
b
Sequências dos primers INFA: direto 5` GACCRATCCTGTCACCTCTGAC 3` e
reverso 5` AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA 3` (Kit Invitrogen, cat. A11400).
c
Sequência sonda: 5` TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG 3` (Kit Invitrogen, cat. A11400).
A transcrição reversa foi realizada a 50ºC por 30 minutos, seguida da desnaturação do
DNA complementar (cDNA) por 2 minutos a 95ºC e 45 ciclos de amplificação a 95ºC por 15
segundos e 55ºC por 35 segundos. As reações foram realizadas em triplicata usando o sistema
de detecção 7500 da Applied Biosystems.
Para a quantificação do RNA viral foi realizada uma curva padrão do vírus H3N2
previamente titulado por TCID50/mL. Esta curva é utilizada para correlacionarmos os valores
de Ct (cycle threshold - o número de ciclos que uma reação leva para atingir uma determinada
quantidade de fluorescência emitida) obtidos das amostras analisadas com o título viral de
uma amostra conhecida e, desta maneira, obtermos a quantificação do RNA viral, designada
TCID50 relativo [90].
26
3.4.2. Titulação em células MDCK por TCID50/mL
Células MDCK foram semeadas em placas de 96 poços com fundo chato (5x104
células/poço) em meio de manutenção. Após atingirem 70% de confluência, o meio foi
retirado e as células foram lavadas duas vezes com meio de inoculação. Para infecção, foram
utilizados os vírus H3N2 presentes nos sobrenadantes coletados do ensaio de inibição da
replicação viral citado anteriormente. Foi feito um pool dos sobrenadantes das replicatas de
cada concentração do composto e cada pool foi utilizado para infecção de uma placa de 96
poços contendo as células MDCK. Os pools dos sobrenadantes foram adicionados na primeira
linha das placas (das colunas de 1 a 10) e foi feita uma diluição seriada de base 10 até a última
linha. Desta maneira, as colunas 11 e 12, contendo somente as células serviram como
controles negativos. Após incubação de 1 hora a 35ºC e 5% de CO2, o inóculo foi retirado e
foi adicionado meio de inoculação. As células infectadas foram mantidas durante 72 horas em
atmosfera de 5% de CO2 a 37ºC. O efeito citopático foi avaliado ao microscópio óptico de
campo claro e o TCID50 foi calculado de acordo com o protocolo da Organização Mundial da
Saúde [91-92].
3.5. Ensaios de inibição da atividade da polimerase viral
Para avaliarmos o efeito do PAR038 sobre a atividade da RNA polimerase do vírus
influenza A H3N2 foram realizados ensaios de inibição da polimerase. A RNA polimerase
dos vírus influenza utilizados foi estimulada com cloreto de magnésio (MgCl2) e os vírus
foram incubados com diferentes concentrações do composto (0,5, 1, 5 e 10 µM) por 1 hora a
37ºC. Foram adicionados os nucleotídeos trifosfatados (NTPs – ATP, UTP, CTP e GTP) na
concentração de 150 µM e os vírus foram novamente incubados a 37ºC por 2 horas. Após esse
período, o RNA viral foi extraído e quantificado por RT-PCR em tempo real em etapa única,
como descrito anteriormente (item 3.4.1). Desta maneira, a atividade da RNA polimerase viral
foi determinada na ausência e na presença das diferentes concentrações do composto.
27
3.6. Monitoramento da emergência de cepas resistentes
3.6.1. Treinamento viral
Para geração de cepas de vírus influenza resistentes ao composto PAR038, foram
realizadas passagens em série do vírus H3N2 na presença de concentrações crescentes do
composto. Células MDCK foram semeadas em placas de 24 poços (2x105 células/poço) e
cultivadas em meio de manutenção por 24 horas. O meio foi retirado, as células foram lavadas
duas vezes com meio de inoculação e infectadas durante 1 hora a 35ºC e 5 % de CO2 com os
vírus influenza H3N2 em um MOI de 0,05. O inóculo foi retirado e as células infectadas
foram tratadas com 15 e 30 µM (1ª e 2ª passagens, respectivamente) do PAR038. Também foi
realizada a passagem em série do vírus H3N2 na ausência do composto, como controle
experimental para avaliar o surgimento de mutações devido somente à passagem do vírus em
cultura de células. A inibição da replicação viral foi acompanhada diariamente por até três
dias através da observação do CPE e através da quantificação da atividade NA no
sobrenadante da cultura. Utilizamos o kit NA-Star Influenza Neuraminidase Inhibitor
Resistance Detection Kit (Applied Biosystems), de acordo com as instruções do fabricante.
Após a quantificação viral, os títulos foram normalizados e, em seguida, parte do
sobrenadante foi utilizada para infecção de uma nova cultura e parte foi congelado a fim de
sequenciarmos a RNA polimerase viral.
3.6.2. Sequenciamento da polimerase viral pelo método de Sanger
3.6.2.1.
Síntese do cDNA
A síntese do cDNA total foi realizada utilizando o primer UNI-12 para influenza,
seguindo o protocolo do Health Protection Agency (HPA) de Londres (Tabela 3.2).
28
Tabela 3.2: Reagentes para síntese de cDNA.
Reagentes
Concentrações
Tampão
5x
DTT
0,1 µM
Mistura dNTP
10 mM
Primer UNI-12*
25 pmol/µl
RNAse out
40 U/µl
SIII RT
200 U/µl
RNA
100 ng/µl
Volume final
40 µl
* Sequência do primer UNI-12: 5` AGCAAAAGCAGG 3`.
A ciclagem utilizada foi de 42ºC por 90 minutos e 95ºC por 3 minutos. Todas as
reações de transcrição reversa e PCR citadas ocorreram no termociclador Verity da Applied
Biosystems.
3.6.2.2.
PCR para amplificação dos genes da polimerase viral
Foram amplificados os segmentos 1, 2 e 3 genoma do vírus influenza, que
correspondem, respectivamente, aos genes do complexo polimerase: PB2, PB1 e PA. A reação
de PCR foi realizada seguindo o protocolo do HPA de Londres. A mistura da reação está
detalhada na tabela 3.3 e os primers utilizados destacados na Tabela 3.4.
29
Tabela 3.3: Reagentes para amplificação dos genes PA, PB1 e PB2.
Reagentes
Concentrações
Tampão
10x
MgSO4
50 mM
Mistura dNTP
10 mM
Primer direto
10 pmol/µl
Primer reverso
10 pmol/µl
Platinum Pfx DNA polimerase
2,5 U/µl
cDNA
100 ng/µl
Volume final
50 µl
30
Tabela 3.4: Relação dos primers utilizados para a amplificação dos genes PA, PB1 e PB2.
PA
Posição*
0-989
702-1292
702-1662
1444-2233
Posição*
22-843
711-1278
1139-1659
1532-2321
Posição*
1-816
713-1509
1447-2341
Sentido
Direto
Reverso
Direto
Reverso
Direto
Reverso
Direto
Reverso
Sentido
Direto
Reverso
Direto
Reverso
Direto
Reverso
Direto
Reverso
Sentido
Direto
Reverso
Direto
Reverso
Direto
Reverso
Sequência 5`- 3`
TGTAAAACGACGGCCAGTAGCAAAAGCAGGTACTGAT
CAGGAAACAGCTATGACCGGTTCTTTCCATCCAAAGAATGTT
TGTAAAACGACGGCCAGTTGCMTTGARAATTTTAGRACCTA
CAGGAAACAGCTATGACCTCRCAKGCCTTGTTGAACTCATT
TGTAAAACGACGGCCAGTTGCMTTGARAATTTTAGRACCTA
CAGGAAACAGCTATGACCTCWAGTCTYGGGTCAGTGAG
TGTAAAACGACGGCCAGTAATGCATCCTGTGCAGCAATGGA
CAGGAAACAGCTATGACCAGTAGAAACAAGGTACCTTTT
PB1
Sequência 5`- 3`
TGTAAAACGACGGCCAGTAGCAAAAGCAGGTCAATT
CAGGAAACAGCTATGACCCTRAAWACTTCTATRGTGTT
TGTAAAACGACGGCCAGTTGAACACRATGACCAARGA
CAGGAAACAGCTATGACCTTGAACATGCCCATCATCATYCCAGG
TGTAAAACGACGGCCAGTCAAATACCYGCAGARATGCTAGC
CAGGAAACAGCTATGACCCCAAGRTCATTGTTTATCAT
TGTAAAACGACGGCCAGTGCYAATTTYAGCATGGAGCT
CAGGAAACAGCTATGACCAGTAGAAACAAGGCATTT
PB2
Sequência 5`- 3`
TGTAAAACGACGGCCAGTAGCAAAAGCAGGTCAATT
CAGGAAACAGCTATGACCGCTTTGRTCAAYATCRTCATT
TGTAAAACGACGGCCAGTCAAGCAGTRTRTACATTGAAGT
CAGGAAACAGCTATGACCGGAGTATTCATCYACACCCAT
TGTAAAACGACGGCCAGTCCAAGYACMGAGATGTCAATGAGA
CAGGAAACAGCTATGACCTAGTAGAAACAAGGTCGTT
* Posição do nucleotídeo
Após a desnaturação durante 10 minutos a 94ºC, foram realizados 35 ciclos de 94ºC/30
segundos, 55ºC/30 segundos e 68ºC/2 minutos, que correspondem aos processos de
desnaturação, hibridização e extensão, respectivamente. E, finalmente, a extensão final se deu
a 68ºC durante 10 minutos.
31
3.6.2.3.
Análise e purificação dos produtos amplificados
Os produtos amplificados pela reação de PCR foram analisados por eletroforese (EGel Agarose 2 % Gel Electrophoresis System, Invitrogen). Foi utilizado um marcador de peso
molecular de 100 pares de base (Bioeasy) e a leitura do gel foi feita em transiluminador de luz
ultravioleta.
Após a confirmação da amplificação pela análise em gel, os amplicons foram
purificados para remoção de dNTPs, primers e qualquer outro contaminante residual. Para tal,
foi utilizado o QIAquick Extraction Gel (Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante.
3.6.2.4.
Reação de sequenciamento
A reação de sequenciamento dos produtos purificados da reação de PCR foi conduzida
utilizando o kit BigDye Terminator da Applied Biosystems. Os reagentes utilizados na reação
estão mostrados na tabela abaixo (Tabela 3.5).
Tabela 3.5: Reagentes para reação de sequenciamento.
Reagentes
Concentrações
Tampão
5x
Primer M13*
3,2 pmol/µl
Kit BigDye
5x
DNA
100 ng/µl
Volume final
20 µl
* Sequências dos primers M13: direto 5′ TGTAAAACGACGGCCAGT 3′ e reverso 5′
CAGGAAACAGCTATGACC 3′.
As condições de ciclagem foram: 30 ciclos de desnaturação a 96ºC por 10 segundos,
anelamento a 50ºC por 5 segundos e extensão a 60ºC durante 4 minutos.
Após a reação de sequenciamento, o excesso de dNTPs terminadores de sequência
marcados que não foram incorporados na construção das fitas foi removido pela purificação
32
do produto através de precipitação com isopropanol 75%. Após incubação de 15 minutos à
temperatura ambiente, foi feita uma centrifugação a 4000 rpm por 45 minutos e o
sobrenadante foi descartado. Em seguida, para secagem, uma nova centrifugação a 900 rpm
por 1 minuto foi realizada com a placa invertida.
Posteriormente à precipitação, os produtos purificados foram ressuspensos em 20 µL
de Hi-Di formamida (Applied Biosystems), desnaturados a 95ºC por 5 minutos e
imediatamente colocados no gelo para permitir a manutenção da desnaturação do DNA. Em
seguida, foram submetidos à corrida eletroforética no sequenciador automático ABI3130XL
(Applied Biosystems), de 16 capilares com 50 cm cada, utilizando o polímero POP-7 (Applied
Biosystems) nas condições padrões do equipamento. Os eletroferogramas foram analisados
com o programa Sequencher 5.0.
3.7. Dosagem de citocinas
A partir dos ensaios de produção viral, parte do sobrenadante das culturas de células A549
infectadas com o vírus influenza H3N2 e tratadas com o composto PAR038 foi reservado para
a quantificação de citocinas. Foram quantificadas as interleucinas 6 e 8 (IL-6 e IL-8) e as
quimiocinas CCL2 ou MCP-1 (do inglês Chemokine Ligand 2 ou Monocyte Chemotactic
Protein-1) e CCL5 ou RANTES (do inglês Chemokine Ligand 5 ou Regulated on Activation
Normal T cell Expressed and Secreted), através do kit R&D Dual Set, de acordo com as
instruções do fabricante.
3.8. Análise estatística
A análise foi feita utilizando o programa Excel para Windows. Utilizamos o Teste-t de
Student para atestar a significância de nossos dados. Utilizamos um intervalo de confiança de
95%; logo, valores de p < 0,05 foram considerados significativos. Todos os dados foram
analisados a partir da observação de no mínimo três experimentos independentes, sua média e
desvio padrão.
33
4. RESULTADOS
4.1. Efeito inibitório dos análogos triazólicos da ribavirina
Os três análogos triazólicos da ribavirina, PAR017, PAR018 e PAR038, foram avaliados
com relação aos seus efeitos sobre a replicação in vitro do vírus influenza. Para tal, células
MDCK foram infectadas com o vírus influenza A H3N2 e tratadas com diferentes
concentrações dos compostos. Após 24 horas de incubação com os compostos, o sobrenadante
das culturas foi coletado, os vírus foram rapidamente quantificados por RT-PCR em tempo
real; assim, calculamos a porcentagem de inibição da replicação viral e o valor de IC50m
(concentração de droga capaz de inibir 50 % da replicação viral quantificado através de uma
abordagem molecular) de cada um dos compostos (Tabela 4.1).
Os três análogos da ribavirina, PAR017, PAR018 e PAR038, apresentaram porcentagens
de inibição da replicação viral igual a 94, 96 e 98%, respectivamente, quando testados na
concentração de 50 µM (Tabela 4.1). Esses valores são comparáveis à porcentagem de
inibição da ribavirina (composto de referência utilizado como controle positivo), a qual, nesta
mesma concentração, inibe em mais de 90% a replicação viral (Tabela 4.1). Além disso, os
compostos PAR018 e PAR038 se mostraram mais potentes que a ribavirina, já que possuem
valores de IC50m menores que o composto de referência (Tabela 4.1). O composto PAR017
possui IC50m semelhante ao da ribavirina, sendo, portanto, tão potente quanto o composto de
referência (Tabela 4.1). A partir destes dados, o composto mais potente dos análogos da
ribavirina, o PAR038, foi selecionado para aprofundarmos o estudo sobre sua ação antiinfluenza. Vale ressaltar, que além de mais potente, o PAR038 é o que possui a rota de síntese
mais simples entre os três análogos, visando sua produção em larga escala.
34
Tabela 4.1: Efeito inibitório dos três análogos triazólicos da ribavirina sobre a
replicação in vitro do vírus influenza A H3N2.
Compostos
% de inibição da replicação viral (50
IC50m (µM)
µM)
PAR017
94 ± 0,07
33 ± 5
PAR018
96 ± 0,3
19 ± 3
PAR038
98 ± 0,4
14 ± 1,6
Ribavirina
> 90
30 ± 3
4.2. Citotoxicidade e efeito inibitório do composto PAR038
Determinamos a citotoxicidade do composto PAR038 através da redução do XTT.
Incubamos células MDCK com diferentes concentrações de PAR038 durante 72 h. A partir da
leitura obtida em nosso experimento fizemos uma curva de regressão linear para obtenção do
CC50 (concentração de droga que mantém 50 % das células viáveis). O alto valor de CC50
deste composto, maior que 1000 µM, indica que o mesmo é pouco citotóxico às células
MDCK (Tabela 4.2). Além disso, o CC50 do PAR038 é maior que o da ribavirina (94,3 µM),
mostrando que a ribavirina é 10 vezes mais citotóxica que o nosso composto (Tabela 4.2).
A fim de melhor mensurarmos a capacidade inibitória do PAR038 sobre a replicação in
vitro dos vírus influenza A H3N2 - células MDCK foram infectadas, tratadas com diferentes
concentrações do PAR038 e o sobrenadante destas culturas foi titulado por TCID50/mL [91].
Desta maneira, foi determinado o IC50t, por quantificação via titulação. Podemos observar
uma potencia ainda maior do PAR038, aproximadamente 290 vezes superior à ribavirina,
apresentando valor de IC50t igual a 0,07 µM, enquanto que o da ribavirina é de 20,5 µM
(Tabela 4.2). Vale ressaltar que ao compararmos os valores de IC50 observamos uma diferença
de aproximadamente 200 vezes quando os efeitos do PAR038 são avaliados por abordagens
celulares e moleculares (Tabela 4.1.).
Através da razão entre valores de CC50 e de IC50t do PAR038 previamente determinados, o
índice de seletividade (SI – grau de segurança de uma substância in vitro) foi calculado. O SI
obtido para o H3N2 foi maior que 14.000 indicando que a margem de segurança in vitro é alta
e maior que à da ribavirina (SI igual a 4,6) (Tabela 4.2).
35
Tabela 4.2: Citotoxicidade, efeito inibitório e índice de seletividade do PAR038.
Composto
CC50 (µM)
IC50t (µM)
SI (CC50/IC50t)
PAR038
> 1000
0,07 ± 0,006
> 14.000
Ribavirina
94,2
20,5 ± 3
4,6
Para os ensaios de citotoxicidade e inibição da replicação viral também foram
utilizadas células A549, pois esta é uma linhagem de células epiteliais do trato respiratório.
Nos ensaios de inibição da replicação viral, as células A549 foram infectadas com o vírus
influenza A H3N2 e tratadas com diferentes concentrações do PAR038 por 24 h. Os vírus
presentes nos sobrenadantes foram titulados em células MDCK por TCID50/mL e o IC50t foi
calculado. Nosso composto foi capaz de inibir a replicação viral neste modelo celular com
IC50t igual a 21,2 µM (Figura 4.1). Nas concentrações estudadas, o composto PAR038 não foi
citotóxico para a célula A549, apresentando viabilidade acima de 95 %.
Figura 4.1: Inibição da replicação viral em células A549. A monocamanda de células A549
foi infectada com o vírus influenza A H3N2 e tratada com diferentes concentrações do
composto PAR038 por 24 h. Os vírus foram titulados por TCID50/mL em células MDCK.
Vale mencionar que células MDCK replicam melhor o vírus influenza do que as células
A549. Assim, em experimentos com MDCK utilizamos MOI de 0,05, enquanto que nos
ensaios com A549 foi necessário o uso de um MOI de 0,25. Para comparação, podemos
verificar a replicação do influenza em A549 e MDCK infectadas no MOI de 0,05 após 24 h
(Figura 4.2). Naturalmente, o IC50 do PAR038 nas células A549 foi maior que o encontrado
nas células MDCK, já que mais partículas virais foram necessárias para infectar estas células.
36
Figura 4.2: Comparação entre a replicação viral em células MDCK e A549. Células
MDCK e A549 foram infectadas com o vírus influenza A H3N2 no MOI 0,05. Após 24 h de
infecção, os sobrenadantes foram titulados em MDCK por TCID50/mL.
4.3. O composto PAR038 inibe a atividade da RNA polimerase viral
Como o composto PAR038 é um análogo da ribavirina, espera-se que seus mecanismos de
ação sejam semelhantes. A ribavirina inibe DNA e RNA polimerases virais [72] e por isso
investigamos a capacidade do PAR038 em inibir a RNA polimerase do vírus influenza.
Basicamente, a RNA polimerase viral apresenta duas classes principais de substratos, o RNA
genômico e os NTPs. Nos nossos ensaios, enquanto um dos substratos foi mantido constante,
o outro foi incubado em diferentes concentrações, na presença ou ausência do composto
PAR038. Após as incubações específicas, o RNA viral foi extraído, quantificado por RT-PCR
em tempo real e a atividade da RNA polimerase foi determinada (Figura 4.3). Podemos
observar que houve uma diminuição da atividade da RNA polimerase conforme o aumento da
concentração do PAR038, sugerindo um efeito inibitório dose-dependente deste composto
(Figura 4.3 A). Avaliando cada imput inicial de vírus (um indicador do RNA genômico
incluído em cada reação), frente ao tratamento com as diferentes concentrações da droga,
podemos verificar uma inibição dose-dependente da atividade da RNA polimerase do vírus
influenza (Figura 4.3 B). Podemos observar também que, independente da concentração de
nucleotídeos utilizada, houve inibição da atividade da RNA polimerase viral pelo tratamento
com o PAR038 (Figura 4.3 C). A partir destes dados, foi calculado o EC50 (concentração do
composto que inibe 50% da atividade enzimática) e o valor obtido foi de 1,56 ± 0,16 µM.
Neste mesmo ensaio, a ribavirina foi utilizada como controle e seu EC50 foi igual a 1,48 ±
37
0,48 µM. Esses dados sugerem que o PAR038 e a ribavirina são igualmente potentes contra a
RNA polimerase do vírus influenza.
38
39
Figura 4.3: Inibição da atividade da RNA polimerase do vírus influenza A H3N2 pelo
PAR038. Após o estímulo da RNA polimerase do vírus influenza na ausência e presença de
diferentes concentrações do composto, sua atividade foi determinada por RT-PCR em tempo
real. (A) No eixo X temos a concentração de substrato (relativo ao RNA genômico ou imput
inicial de vírus em TCID) e no eixo Y, a atividade da RNA polimerase viral em TCID relativo
por minutox10-3. Cada curva representa uma concentração distinta do composto. (B e C) O
eixo X representa a concentração do PAR038 em µM e o eixo Y, a atividade da RNA
polimerase viral em TCID relativo por minutox10-3. Cada curva representa um imput de vírus
inicial diferente (B) e uma concentração de NTPs distinta (C).
4.4. Geração de cepas virais resistentes ao PAR038
Com o objetivo de verificarmos qual o alvo do composto PAR038 na enzima RNA
polimerase do vírus influenza, passagens sequenciais do vírus influenza A H3N2 na
presença de concentrações crescentes do PAR038 foram realizadas para a geração de
cepas resistentes. Até o momento foram realizadas duas passagens do vírus H3N2, sendo a
maior concentração de PAR038 utilizada (30 µM) aproximadamente 400 vezes maior que
o valor de IC50t do composto. Mesmo utilizando altas concentrações da droga, ainda não
foi possível encontrarmos mutações em nenhuma das três subunidades da RNA
polimerase viral, PB1, PB2 e PA, quando comparamos suas sequências com as sequências
dos vírus H3N2 passados na ausência do PAR038.
4.5. O composto PAR038 possui efeito imunomodulatório em células A549
Parte dos efeitos antivirais da ribavirina pode ser oriundo de uma atividade
imunomodulatória [81-82]. Assim, é possível que o composto PAR038, análogo da ribavirina,
compartilhe esta propriedade. Então, a fim de verificarmos tal possibilidade, duas citocinas
(IL-6 e IL-8) e duas quimiocinas (MCP-1 e RANTES) foram dosadas nos sobrenadantes de
células A549 infectadas com o vírus influenza A H3N2 e tratadas com 15 µM (IC50m
encontrado no primeiro ensaio de inibição da replicação viral - Tabela 4.1.) do PAR038 ou
com 10 µg/mL de dexametasona (Dexa – glicocorticóide com propriedades anti-inflamatórias
conhecidas, utilizado como controle positivo) por 24 h. Como este foi um ensaio piloto, foram
dosadas somente 4 citocinas e o composto de referência, a ribavirina, ainda não foi utilizado
como controle. Podemos observar que, após o tratamento com PAR038, os níveis de IL-6 e
RANTES permaneceram inalterados (Figura 4.4 A e D) e houve uma diminuição significativa
nos níveis de IL-8 e MCP-1 (Figura 4.4 B e C).
40
Figura 4.4: Alteração nos níveis de citocinas após o tratamento com o PAR038. Após a
infecção de células A549 com o vírus influenza H3N2 e tratamento com os compostos
PAR038 ou dexametasona, foi realizada a dosagem das citocinas IL-6 (A) e IL-8 (B), e das
quimiocinas MCP-1 (C) e RANTES (D) nos sobrenadantes das culturas. O eixo X dos
gráficos representa o controle infectado não tratado e a condição experimental de células
infectadas e tratadas, e, o eixo Y, a concentração de citocinas no sobrenadante da cultura em
pg/mL (A, C e D) ou em ng/mL (B). * p < 0,05
41
5. DISCUSSÃO
As infecções causadas pelos vírus influenza são de grande importância para saúde pública,
sobretudo em países em desenvolvimento [12]. Todo ano ocorrem surtos epidêmicos durante
os meses de inverno e, ocasionalmente, novas cepas potencialmente pandêmicas são geradas
devido à grande variabilidade genética destes vírus. Embora campanhas de vacinação sejam
realizadas anualmente na tentativa primária de controle das infecções causadas pelo vírus
influenza, existem diversos casos nos quais a vacinação é ineficaz devido ao escape viral. As
estratégias de vacinação custeadas pelos governos são muitas vezes focadas em certos grupos
de pacientes em maior risco de desenvolver infecções mais severas, assim uma percentagem
significativa de indivíduos permanecem não imunizados e, portanto, susceptíveis, podendo
servir de hospedeiro de um eventual surto epidêmico. Além disso, no caso de uma eventual
pandemia, é provável que não exista tempo hábil para produção de vacina em ovos
embrionados. Assim, a estocagem e uso de antivirais é necessária como estratégia adicional de
controle para ocupar as muitas lacunas abertas pelas ressalvas mencionadas na vacinação antiinfluenza.
Considerando que atualmente o uso de apenas uma classe de drogas anti-influenza, os
NAIs, é pertinente e levando-se em conta que cepas resistentes e com diminuição de
sensibilidade a estes compostos existem [65-66, 93-94], a busca de novas drogas com
diferentes alvos é de interesse científico e clínico. Neste contexto, este trabalho descreve os
efeitos do composto análogo triazólico da ribavirina, PAR038, um promissor inibidor da RNA
polimerase viral.
A partir de três compostos análogos triazólicos da RB capazes de inibir a replicação do
vírus influenza, selecionamos o mais potente entre eles, o PAR038, para aprofundarmos o
estudo de sua atividade anti-influenza. Utilizando o composto de referência como controle, a
RB, observamos que o PAR038 é menos citotóxico e 400 vezes mais potente (CC50 > 1000
μM e IC50 = 0,07 μM - Tabela 4.2). Isto nos revela grande margem de segurança para
utilização in vitro deste composto, já que ele apresentou alto índice de seletividade (SI >
14000 - Tabela 4.2).
Ao compararmos o composto PAR038 com os NAIs, drogas em uso clínico, vimos que
nosso composto é menos citotóxico que o OST e o ZAN (CC50 maior que 20 μM e
aproximadamente 300 μM, respectivamente), embora seja menos potente, já que o IC50 de
ambos os NAIs é na faixa de nano molar (Tabela 5.1). Nosso composto e os NAIs apresentam
mecanismos de ação distintos, nos propulsionando a investigar futuramente se existiria
atividade sinérgica ou aditiva entre estas moléculas.
42
Tabela 5.1: Comparação entre a citotoxicidade, o efeito inibitório e o índice de
seletividade do PAR038 e os compostos de referência ribavirina, oseltamivir e zanamivir.
Composto
CC50
IC50
SI
(CC50/IC50)
PAR038
> 1000 µM 0,07 µM
> 14000
Ribavirina
94,2 µM
20,5 µM
4,6
Oseltamivir
> 20 μM
0,2 nM
> 100000
Zanamivir
300 μM
1 nM
300000
Diversos grupos vêm buscando terapias combinadas anti-influenza, com drogas existentes
que atuem em diferentes alvos durante o ciclo replicativo viral. No entanto, muitos dos
antivirais utilizados por estes grupos são substâncias de amplo espectro, como o inibidor de
DNA/RNA polimerases, a RB [77] e o interferon [95]. No caso da RB, além de ser
inespecífica, é altamente citotóxica, o que torna o futuro do nosso composto bastante
interessante para eventual intervenção com terapias combinadas, já que ele é muito potente e
menos citotóxico que a RB.
Por ser um composto análogo à RB, espera-se que o PAR038 apresente mecanismos de
ação semelhantes ao composto de referência. Embora o mecanismo de ação da RB ainda não
seja completamente conhecido, existem três mecanismos propostos: 1) inibição direta da RNA
polimerase viral; 2) inibição de enzimas celulares envolvidas na biossíntese de nucleotídeos e
3) catástrofe por erro [73]. Neste estudo, avaliamos a capacidade do PAR038 em inibir
diretamente a RNA polimerase do vírus influenza e observamos uma inibição dosedependente desta enzima. Tal efeito ocorreu frente aos dois substratos da polimerase, RNA
genômico viral e NTPs. O PAR038 se mostrou, então, um potente inibidor da RNA
polimerase viral, assim como a RB (EC50 igual a 1,56 ± 0,16 e 1,48 ± 0,48 µM,
respectivamente).
Depois de verificarmos que o PAR038 é capaz de inibir a RNA polimerase do vírus
influenza, tentamos determinar sua proteína alvo. Para tal, é necessária a geração de cepas
virais com mutações de resistência ao PAR038. Após a geração, é verificado se as mutações
pontuais geradas ou combinações entre elas realmente levam à resistência ao composto.
Embora tenham sido realizadas somente duas passagens do vírus influenza A H3N2 em
células MDCK na presença de concentrações crescentes do composto, a maior concentração
utilizada foi bastante alta, aproximadamente 400 vezes maior que o valor de IC50 do PAR038.
Até esta concentração não foram encontradas mutações nas três subunidades da RNA
43
polimerase, PA, PB1 e PB2, embora estejam sendo realizadas mais passagens na presença de
concentrações ainda maiores do composto. Outros grupos ainda não demonstraram mutações
de resistência na RNA polimerase do vírus influenza frente ao tratamento com a RB. Além da
RNA polimerase viral, existem proteínas acessórias que contribuem para que o ciclo
replicativo viral seja bem sucessido, como, por exemplo, a nucleoproteína e a proteína de
exportação nuclear. Desta maneira, como não foram encontradas mutações na polimerase
propriamente dita, seria interessante avaliar a presença de mutações nestas proteínas para
verificarmos se o PAR038 poderia ter outro alvo de ação no vírus influenza.
O complexo polimerase do vírus influenza possui múltiplas funções essenciais para
replicação e transcrição do genoma viral, como a captura e clivagem do cap do RNAmc, a
síntese do RNAmv e do RNA genômico, além da poliadenilação do RNAmv. A presença
destas diversas funções faz com que o complexo polimerase seja um alvo atraente para o
desenvolvimento de novos antivirais. Recentemente, diversos grupos vêm buscando
moléculas capazes de inibir o complexo polimerase. Como exemplos temos moléculas que
inibem a subunidade PA e sua atividade endonuclease [96-97]; moléculas que inibem a
interação entre as subunidades da polimerase, como a ligação PA-PB1 [98]; e moléculas que,
além de inibirem a enzima, induzem indiretamente citocinas ligadas à resposta antiviral como
o IFN [99]. Entre os compostos descritos recentemente, o que se mostrou mais promissor é o
T-705 (favipiravir), que inibe in vitro e in vivo a replicação dos vírus influenza A, B e C
[100]. Este composto inibe a RNA polimerase e possui fraca inibição da enzima celular
IMPDH, sugerindo que seu mecanismo de ação é diretamente na polimerase viral. O
favipiravir teve seu estudo clínico de fase II concluído recentemente, em novembro de 2012,
(dados não publicados – www.clinicaltrials.gov) e seu licenciamento para uso contra influenza
é esperado para um futuro próximo.
Curiosamente, os valores de inibição em 50 % do PAR038 sobre a enzima viral foram
superiores ao observados para a cultura de células infectadas (EC50 de 1,56 contra IC50t de
0,07). Em geral, quando se analisa os parâmetros farmacológicos contra alvos mais
específicos, os valores de inibição em 50 % tendem a ser menores. Um exemplo disso ocorre
com o AZT, que inibe a replicação do HIV-1 em células e a atividade da enzima transcriptase
reversa com valores de IC50 de 0,7 µM e 0,01 µM, respectivamente [101-102]. Nossos
resultados com o PAR038 então sugerem que este composto pode apresentar mais de um
mecanismo de ação para inibição da replicação do influenza. Isto é, o PAR038 talvez
apresente também uma ação celular que resulta numa inibição viral, reforçando a necessidade
de investigarmos mais modos de inibição, como a ação sobre enzimas celulares da via de
44
biossíntese de nucleotídeos e/ou desencadeamento do mecanismo de catástrofe por erro.
Imaginamos que um destes mecanismos, ou ambos, podem se sinergizar com a inibição da
RNA polimerase no interior das células infectadas pelo influenza.
Os efeitos do PAR038 sobre o metabolismo podem ser mais amplos do que aquele
apresentado por seu análogo, RB. Assim, outras vias além daquelas relacionadas com a
biossíntese de purinas e pirimidinas devem ser investigadas. Afinal, durante a infecção pelo
vírus influenza, uma série de alterações no estado metabólico da célula ocorre para favorecer a
replicação viral [103]. O vírus utiliza metabólitos celulares para a replicação do genoma e a
síntese de proteínas, levando à diminuição dos níveis intracelulares de nucleotídeos [103].
Ocorre também o aumento da síntese de ácidos graxos, já que os vírus adquirem seu envelope
lipídico a partir da membrana plasmática da célula hospedeira [104]. Frente à infecção, um
aumento significativo da glicólise também ocorre [103]. Desta maneira, é interessante
verificar se o composto PAR038 poderia alterar enzimas chave e/ou a síntese de componentes
intracelulares do metabolismo para, indiretamente, inibir a replicação viral.
Além do PAR038 ter se mostrado mais potente em inibir a replicação viral em cultura de
células MDCK, nosso composto foi capaz de inibir a replicação viral em células A549. O IC50
do PAR038 neste modelo (21,2 µM) foi maior que o encontrado em células MDCK (0,07
µM), porém, a quantidade de vírus necessária para a infecção das células A549 e produção de
títulos virais mensuráveis também foi maior (MOI de infecção em células MDCK e A549 foi
de 0,05 e 0,25, respectivamente). Na infecção em humanos, o principal alvo dos vírus
influenza são as células epiteliais do trato respiratório, porém, o modelo de células utilizado
para estudos in vitro e isolamento viral são as células MDCK, devido a sua alta
susceptibilidade à infecção [105-106]. Esta alta susceptibilidade é, em parte, devido ao fato da
sinalização gerada pelos IFNs (citocinas da resposta imune inata que leva a célula para um
“estado antiviral”) ter apenas um pequeno efeito restritivo na replicação do vírus influenza nas
células MDCK [107]. A porcentagem de infecção em células A549 é menor que em células
MDCK durante as primeiras horas de infecção e aumenta após 24 e 48 h, mas não atinge
100%, provavelmente por estarem presentes mecanismos da resposta imune inata do
hospedeiro humano que não são encontrados em células de outros mamíferos, como é o caso
das MDCKs [108].
Durante uma infecção viral, as principais citocinas envolvidas com a resposta imunológica
inata são os interferons tipo I (IFN-α e IFN-β). Estas moléculas induzem a expressão de
proteínas celulares que atuam na resposta antiviral. No caso da infecção pelo vírus influenza,
os IFN tipo I estimulam as células epiteliais infectadas a produzirem citocinas como IL-8,
45
MCP-1, RANTES, IL-6, IL-1 e TNF-α [109]. Essas citocinas levam a uma resposta tecidual
pró-inflamatória e estimulam o recrutamento de monócitos/macrófagos, linfócitos T e B e
células Natural Killer (NK) para o local de infecção. Essas células, por sua vez, produzem
mais citocinas pró-inflamatórias que favorecem a resposta Th1, necessária para a imunidade
antiviral específica. Além disso, a resposta celular é de grande importância no combate a
infecção pelo vírus influenza, já que as células T CD8+ possuem papel crucial no clearance
viral. Embora as respostas Th1 e citotóxica sejam essenciais para a eliminação da infecção
viral, a grande liberação de citocinas pró-inflamatórias e moléculas citotóxicas resulta em
dano no tecido pulmonar e agravo da infecção [110-111]. A produção exacerbada de citocinas
pró-inflamatórias, cytokine storm, já foi associada a diversas doenças infecciosas e não
infecciosas e, no caso da influenza, foi descrita pela primeira vez em infecções pelo vírus
altamente patogênico H5N1 [112]. Infecções mais severas pelos vírus influenza, além do
H5N1, também estão relacionadas ao cytokine storm, e, nestes casos, drogas
imunomodulatórias deveriam apresentar benefícios terapêuticos. A terapia imunomodulatória
adjuvante à terapia antiviral é extensamente utilizada através do emprego de corticóides.
Porém, os efeitos causados pelo tratamento com estas moléculas são controversos com relação
à melhora do paciente, período de excreção e carga viral [113-114]. Seria interessante então,
se uma droga anti-influenza também possuísse propriedades anti-inflamatórias específicas.
Neste contexto, e sabendo que a RB parece ter função imunomodulatória [81-82],
investigamos se o composto PAR038 é capaz de alterar os níveis de citocinas em
sobrenadantes de células A549 infectadas com o vírus influenza. Como citado anteriormente,
células de linhagens humanas, como a A549, parecem possuir mecanismos da resposta
imunológica do hospedeiro os quais não são compartilhados com células de linhagens de
outros mamíferos, como as MDCKs. Portanto, a linhagem A549 foi utilizada para estes
experimentos. Foram quantificadas, a princípio, 4 citocinas: IL-6, IL-8, MCP-1 e RANTES.
Observamos que nosso composto reduz os níveis de IL-8 e MCP-1 e não altera IL-6 e
RANTES. Estes foram experimentos iniciais, mas os dados já sugerem uma possível função
imunomodulatória do composto PAR038 e abre portas para a avaliação de mais citocinas
relacionadas à resposta anti-influenza e ao cytokine storm, como os IFN do tipo I, IL-1, IL-12,
TNF-α, entre outras.
Nosso grupo visa aprofundar os estudos anti-influenza do composto PAR038.
Investigaremos se nosso composto pode estar atuando também através do mecanismo de
catástrofe por erro e o impacto do tratamento com o PAR038 sobre o metabolismo celular.
Continuaremos a busca por sítios de interação entre o PAR038, o complexo polimerase e as
46
proteínas acessórias NP e NEP/NS2. Aprofundaremos a análise das propriedades
imunomodulatórias do composto in vitro e in vivo, além de avaliarmos os principais aspectos
da farmacodinâmica do PAR038 frente à infecção por influenza in vivo. Nossos resultados,
em conjunto, já demonstram que a estrutura do composto PAR038 é promissora para o
desenvolvimento de novos compostos anti-influenza.
47
6. CONCLUSÕES
O composto análogo triazólico da ribavirina, PAR038:
 É pouco citotóxico para células MDCK (CC50 > 1000 µM) e para células A549;
 Inibe a replicação do vírus influenza A H3N2 em ambos os modelos celulares, com
valores IC50 iguais a 0,07 e 21,2 µM, respectivamente;
 É um potente inibidor da RNA polimerase do vírus influenza (EC50 igual a 1,56 µM)
e, assim como a ribavirina, parece possuir outros mecanismos de ação além da inibição
direta da polimerase viral;
 Ainda não foram encontradas mutações nas três subunidades da RNA polimerase viral,
PA, PB1 e PB2, após duas passagens sequenciais do vírus influenza em células
MDCK;
 Parece possuir propriedades imunomodulatórias frente a infecção de células A549 com
o vírus influenza, já que foi capaz de reduzir a secreção de IL-8 e MCP-1.
48
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