Congresso de Ciências Veterinárias [Proceedings of the Veterinary Sciences Congress, 2002], SPCV, Oeiras, 10-12 Out., pp. 229-238
Anatomia Patológica
Recolha e envio de material para análise histopatológica
[Basic rules of collection and submission samples to histopathologic examination]
Maria dos Anjos Pires
Laboratório de Histologia e Anatomia Patológica, Departamento de Patologia e Clínicas Veterinárias U.T.A.D. 5000-911 Vila Real. Portugal. Telf - 259 350 637/13. Fax - 259 350480. <[email protected]>
PhD, MSc. Professora Associada de Patologia Geral
Summary
The histopathology or surgical pathology is useful and relevant in the help of the diagnostic in all
veterinary activities (the clinic, the inspection or in public health).
The condition in witch a specimen to histopathologic examination comes to laboratory can be
conclusive to the swiftness and fidelity of the results.
The diagnostic cytology most of times is the first one to approach the histopathological diagnosis, a
very useful for pratician veterinarians. The correct collection, manipulation of samples, fixation and
submission of the cytology is essential to further diagnostic.
In this work the author describe the basic rules of collection, fixation and delivering of the material
to histopathological and cytological examination.
Introdução
O Médico Veterinário, quando exerce a sua actividade profissional em qualquer das suas
especialidades, encontra por vezes situações duvidosas no diagnóstico das lesões macroscópicas que
observam, tornando-se necessário o recurso a um laboratório especializado.
A implementação de acções curativas ou profiláticas em relação a um animal, ou a um grupo de
animais, e a defesa da saúde pública, obrigam que estes exames sejam efectuados o mais
rapidamente possível, de forma a que as respostas sejam emitidas em tempo útil.
Para que esta consulta seja efectiva e haja uma boa colaboração entre a entidade remetente e o
laboratório, torna-se necessário que o material biológico seja colhido e enviado em condições que
permitam a sua manipulação laboratorial. A conveniente leitura das lesões macroscópicas
observadas assim como a sua descrição o mais correcta, completa e precisa possível num relatório
que deve acompanhar o material enviado, constituirá um precioso auxiliar para o especialista poder
elaborar um diagnóstico correcto, rápido e útil.
É objectivo desta comunicação dar a conhecer as regras básicas de recolha e envio de material para
o exame histopatológico.
Colheita de Material para Exame Histopatológico
Para que a resposta do laboratório seja rápida e correcta, é necessário que se respeitem algumas
normas básicas de colheita, fixação e envio, assim como o preenchimento de um formulário que
acompanha a análise.
O material mal seleccionado ou traumatizado (e.g. por compressão excessiva por pinça na
extirpação cirúrgica ou necrópsia), pode comprometer o seu subsequente processamento e
interpretação das lesões.
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A recolha e a fixação do material devem ser efectuadas logo após a morte do animal ou da exérese
cirúrgica, de modo a evitar os processos de autólise e putrefacção que podem comprometer
irremediavelmente o exame.
Deve-se iniciar por reconhecer a alteração macroscópica que determina a recolha do material.
Dependendo, como é evidente, do seu volume e tendo-se ainda em consideração a sua subsequente
fixação, sempre que possível deverá ser enviada a totalidade da lesão; quando tal não for possível,
os fragmentos enviados devem ser criteriosamente seleccionados evitando-se o envio de grandes
extensões de material exclusivamente necrosado, purulento ou hemorrágico. Como os processos
mórbidos são progressivos, a periferia e o centro das lesões correspondem normalmente a estádios
diferentes, pelo que o envio do seu conjunto é, sem dúvida, mais correcto, já que a análise de
aspectos individuais pode não permitir a correcta identificação do processo ou conduzir a dúvidas.
A melhor zona para a colheita é a zona de transição entre a lesão e o tecido normal adjacente,
englobando material das duas partes. Quando o processo atinge vários orgãos, devem ser colhidas
amostras de todos eles, tendo a preocupação de respeitar a orientação da lesão em relação à
topografia do orgão em que se situa. Deve evitar-se o envio de amostras muito pequenas ou
fragmentadas, com o risco de se perderem na manipulação ou não conterem material suficiente para
o processamento e emissão de um diagnóstico correcto.
Os instrumentos de corte e preensão utilizados na recolha do material para exame histopatológico
são essenciais. Devem permitir um bom corte, evitando o esmagamento e a compressão da peça. Os
tecidos não devem nunca ser "serrados" ou, se tal acontecer, essa porção de tecido será eliminada do
posterior processamento, para evitar os aspectos artefactuais resultantes da compressão e
estiramento tecidulares. As facas ou bisturis utilizados devem ter uma lâmina fina e o gume bem
afiado, sendo manejados sem pressão excessiva e com um movimento único. As pinças devem ser
atraumáticas.
Os orgãos complexos tais como os rins, gânglios linfáticos e glândulas adrenais, devem ser cortados
de forma a que a amostra reúna um fragmento de cada território anatómico. Por exemplo, no rim
deve incluir o bacinete, medula e cortex e, os gânglios linfáticos e glândulas adrenais, devem incluir
cápsula, cortex e medula.
Os orgãos côncavos como o estômago, intestino ou útero devem ser representados por amostras que
incluam a parede e devem ser esvasiados do seu conteúdo por lavagem com solução fisiológica ou
fixadora, nunca com água.
No encéfalo, a topografia do orgão deve ser respeitada. Só após 24 horas de fixação e quando tiver
adquirido rigidez, pode ser cortado transversalmente, sem que as porções seccionadas sejam
separadas inteiramente. Se o orgão não for destinado na sua totalidade, ao exame histopatológico, é
conveniente seccioná-lo longitudinalmente (dos hemisférios cerebrais ao bulbo) e, mais tarde,
efectuar cortes transversais a vários níveis, na metade seccionada.
Figura 1 - Esquema em que se exemplifica a colheita, tendo em conta a heterogeneidade da lesão.
A fixação é um processo químico que permite a conservação dos tecidos num estado
morfologicamente semelhante ao que apresentavam em vida. Deve ser efectuada o mais breve
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possível após a separação dos componentes do organismo vivo ou a morte do indivíduo. Consiste
numa morte rápida dos elementos celulares e na suspensão instantânea dos processos autolíticos, de
modo que os tecidos mantenham a sua forma e estrutura, e endureçam, de maneira a poderem
suportar, sem deformação, a acção dos reagentes e os processos técnicos consecutivos empregues
na técnica histológica.
Os orgãos com elevada população bacteriana, como o intestino, e os de conteúdo enzimático, como
o pâncreas, alteram-se precocemente tornando-se necessário uma fixação imediata após a recolha, e
o seu envio isolado dos outros orgãos.
O fixador ideal é aquele que modifica o menos possível as estruturas naturais e que confere aos
tecidos uma solidez e insolubilidade que lhes permitam serem sujeitos à acção dos reagentes ao
longo do processamento. A congelação não deve ser utilizada, por haver risco de rotura celular e de
cristalização intra e extra-celular.
Não há fixadores perfeitos. O fixador vulgarmente utilizado é o formol a 10%. É um fixador
coagulante, barato, de fácil preparação, eficaz e de longa duração, se utilizado de uma forma
correcta. Permite também o recurso posterior a muitas técnicas de coloração, a fixação secundária
por outros fixadores ou à aplicação de técnicas de imunocitoquímica.
O formol comercial é uma solução a 40% de formaldeído gasoso, mas considera-se como estando a
100%. Este deve ser diluído a 10% em água, de preferência destilada, embora também se possa
utilizar a da rede pública. Os vapores de formol são irritantes, afectando principalmente as vias
aéreas superiores, podendo mesmo chegar a ser agente causal de reacções de anafilaxia em
indivíduos mais sensíveis; por isso se devem tomar as devidas precauções no seu manuseamento.
Para que a fixação do tecido se processe em boas condições é muito importante a relação entre o
volume da peça a fixar e a quantidade do fixador. Os fragmentos não devem ser muito espessos ou
compridos, e a quantidade de líquido fixador deve ser de dez vezes o volume da peça a fixar.
A amostra nunca deve ser dobrada ou comprimida dentro do recipiente ou colocada dentro de
frascos cuja abertura seja menor que o tamanho da peça. É conveniente colocar primeiro o fixador
no recipiente, e só então colocar a peça, para evitar a sua aderência às paredes do recipiente.
Recomenda-se a agitação do recipiente em que se encontra a peça e o fixador para renovar o líquido
que entra em contacto com a amostra e evitar as aderências quer à embalagem quer entre os
diversos fragmentos nele contidos.
Orgãos como o fígado, que têm forte tendência a aderir ao fundo do recipiente, devem ser colocados
sobre uma pequena quantidade de algodão ou de gaze. O pulmão e outras amostras que flutuem no
fixador devem ser protegidas com um pequeno fragmento de algodão ou de gaze colocado à
superfície do fixador, para que nenhuma das porções da amostra fique em contacto com o ar. A
quantidade de algodão não deve ser, no entanto, excessiva de forma a que não promova a
desidratação da amostra. A injecção de líquido fixador no lúmen de orgãos ocos permite fixar a
mucosa em boas condições.
Em conjunto com o fixador pode utilizar-se a acção do frio, retardando a autólise e favorecendo
assim a acção do fixador. Esta prática está indicada quando o fixador tem pouco poder penetrante
ou a peça é volumosa.
Os recipientes devem ser de vidro ou plástico e possuir uma tampa que permita fechá-los de forma
hermética. A sua dimensão deve ser suficiente de modo a conter a peça e o fixador nas proporções
correctas e, o seu bucal suficientemente largo para que o material seja retirado com facilidade. O
seu encerramento pode ser reforçado com fita adesiva ou ser parafinado.
Devem ser devidamente identificados e assinalada a data da colheita, com letra legível e tinta
indelével.
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Figura 2 - Imagem de uma peça bem fixada, com as proporções ideais entre o volume do material e
a quantidade de formol.
Colheita para Exame Citológico
O exame de citologias é um bom meio auxiliar de diagnóstico para a prática da Medicina
Veterinária. As amostras para o exame citológico são, em geral, de colheita fácil, rápida e barata e
com pouco risco para o paciente. Em situações de necrópsia torna-se também, em determinadas
situações, um rápido meio de diagnóstico.
A citologia pode ser corada e avaliada no local em que se faz a colheita, sendo apenas necessárias
lâminas, os meios de coloração (por exemplo um Kit comercial do género do Diff-Quik®) e um
microscópio.
O material para exame citológico pode ser obtido a partir de esfregaços, raspagens ou aspirados da
lesão. As técnicas utilizadas na colheita dependem da localização anatómica da lesão, características
do tecido e do paciente em causa.
Esfregaço por aposição - Podem ser preparados a partir de lesões externas nos animais vivos, de
tecidos removidos por exérese cirurgica ou de uma necrópsia. Têm a vantagem de ser de fácil
manipulação mas, dependendo da lesão, a celularidade é baixa e têm maior contaminação de
material não desejado (por exemplo bactérias).
Este tipo de citologia não é o mais indicado para lesões superficiais contaminadas por colherem
maioritariamente bactérias, detritos celulares e hemorragia; pode no entanto, ser útil em
determinados casos para a identificação do agente em causa.
Para fazer este tipo de citologia a partir de orgãos provenientes de necrópsia ou exéreses, é
necessário primeiro retirar o sangue em excesso com papel absovente, limpo e que não deixe
resíduos. Obtém-se esta amostra pressionando o tecido em causa sobre a lâmina. Uma só impressão
é suficiente para a obtenção de material necessário para observação, e pela grande disponibilidade
de material, é recomendado que se faça mais que uma lâmina por caso.
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Figura 3 - Exemplos da realização de esfregaços após a recolha das células. (A) Coloca-se a
amostra numa lâmina e pressiona-se levemente com outra lâmina, espalhando-a. Deve ter-se o
cuidado de não se pressionar em excesso para não roturar as células. (B) Uma gota de amostra é
colocada num dos extremos de uma lâmina. Com o topo de outra lâmina espalham-se rapidamente
as células para o outro extremo. Neste local há maior concentração celular (adaptado de Tyler et al.,
1989).
Raspagens - Este tipo de esfregaço é recomendado em lesões sólidas pouco produtivas, a partir de
exéreses, material de necrópsia e lesões externas do animal. A maior desvantagem está no facto
deste tipo de citologia só apresentar as células da superfície da lesão.
Estas células são obtidas por raspagem com uma lâmina de bisturi posicionado verticalmente em
relação à superfície da lesão. As células obtidas são colocadas no centro da lâmina e posteriormente
espalhadas, quer por rotação, quer longitudinalmente.
Esfregaços - São efectuados em situações em que as aposições, raspagens e aspirados não são
passíveis de ser executados, como por exemplo nas citologias vaginais, tractos fistulosos ou
colheitas óticas. As lesões são esfregadas com uma cotonete estéril, em geral humedecida em soro
fisiológico para que a rotura celular seja mínima durante a colheita e elaboração do esfregaço. Caso
a lesão seja exsudativa, não é necessário humedecer a cotonete.
A cotonete deve rolar suavemente na superfície da lâmina, para evitar o esmagamento e destruição
das células.
Aspirados - É uma técnica efectuada com agulha fina e utiliza-se para a colheita de massas
incluindo linfonodos, orgãos internos e lesões cutâneas (quando se requer mais informação da
periferia da lesão e evitar contaminações). O número de células obtidas é menor que no caso das
raspagens, mas consegue ter acesso a lesões mais profundas.
Esta metodologia requer uma agulha de 21 a 25 ga e uma seringa de 3 a 20 ml. Quanto mais mole é
o tecido a aspirar, mais pequena é a seringa usada. Quanto mais grossa fôr a agulha, mais
probabilidade há de a amostra ser contaminada com sangue.
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O local da colheita tem de ser devidamente desinfectado, e dependendo do local pode requerer
cuidados e cuidados cirúrgicos.
A massa a ser aspirada deve estar fixa para que se consiga controlar a direcção da penetração da
agulha. Esta deve estar ligada à seringa e introduzida em direcção ao centro da lesão. Deve exercerse então uma forte pressão negativa no êmbolo da seringa até 3/4 do seu volume. Devem ser
aspiradas várias áreas da lesão, tendo sempre o cuidado de se evitar contaminação por sangue e
outros tecidos. Numa grande parte dos casos, não se obtem material visível na seringa.
Após se retirar a agulha da lesão, separa-se também da seringa, que deve ser cheia de ar. Repõe-se a
agulha e expele-se o conteúdo desta sobre uma lâmina.
Fluídos - A preparação de citologias a partir de fluídos, pode ser feita directamente a partir de uma
gota desse líquido, espalhando-se numa lâmina como se tratasse de um esfregaço de sangue. O teor
de células pode requerer a contagem das mesmas, por exemplo em casos de fluídos articulares,
peritoneais, torácicos e líquido céfaloraquidiano. No caso do número de células ser inferior a 5000
células/ml é necessário efectuar-se uma centrifugação prévia. O pellet ressuspenso no líquido
residual pode ser então espalhado sobre a lâmina.
A fixação ideal das citologias é feita através de um spray de fixação indicado especificamente para
esse efeito. Quando tal não é possível, podem fixar-se com metanol 2 a 3 minutos, ou ao ar. A
fixação das citologias deve ser realizada imediatamente após a colheita, principalmente quando o
conteúdo celular é muito abundante e a lâmina fica muito húmida, para que não haja morte celular e
prejudique, desta forma, o diagnóstico.
Envio ao Laboratório
De acordo com as normas em vigor no Serviço de Correios de Portugal, as amostras devem seguir
em recipiente duplo, com o espaço entre os dois preenchido por material absorvente e protector,
como algodão, estopa, serrim ou papel de jornal. Os frascos devem então ser colocados numa caixa
de polistireno ou, se não for possível, numa caixa de cartão rígido. O polistireno é muito frágil, pelo
que deverá ser protegido por uma caixa de cartão. Na embalagem as indicações sobre o remetente e
o destinatário devem ser claras e legíveis.
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Figura 4 - Os frascos devem ser devidamente identificados, fechados hermeticamente e enviados de
preferência em caixas de polistireno. Um material absorvente deve isolá-los. Este tipo de caixa
deverá ser protegida por outra exterior de características mais sólidas.
Amostras para Histopatologia: A maior parte do material enviado para o exame
Anatomopatológico, quando fixado não constitui um risco para a saúde pública, mas deve-se
obedecer sempre às normas legais para o seu envio, principalmente entre regiões e países em que
existam restrições ao trânsito de animais ou de material infeccioso proveniente destes, para se evitar
a disseminação de doenças e contribuir para o seu controlo e erradicação. Se o recipiente for muito
pequeno e hermético, poderá ser enviado em envelope almofadado (figura 5).
Figura 5 – Quando as frascos são de pequenas dimensões, ou para o envio de lâminas de citologias
deve usar-se um envelope almofadado, devidamente identificado, fechado e enviado de preferência
por correio prioritário.
Amostras para exame Citológico: As lâminas devem ser devidamente acondicionadas em
transportadores próprios de plástico ou cartão. Na impossibilidade de adquirir estas embalagens, é
recomendado que sejam embrulhadas individualmente em papel absorvente (por exemplo, papel
higiénico), colocadas dentro de uma pequena caixa de cartão e enviadas num envelope almofadado.
No exterior devem referir a fragilidade do conteúdo que se envia.
Todo o material a enviar ao laboratório deve ser ser devidamente identificado e acompanhado de
um relatório. O correcto preenchimento de uma ficha modelo, ou o envio de um relatório exaustivo,
pode orientar de forma eficaz o trabalho do laboratório e conduzir a um resultado analítico mais
rigoroso. O relatório deve ser exacto e claro e estar protegido de um eventual derrame de formol ou
outros líquidos durante o transporte. Deve ser colocado sobre a embalagem, num envelope colado à
mesma ou enviado separadamente. A colocação do relatório sobre uma embalagem não hermética,
escrito com tinta não indelével, ou colado de forma a que, ao ser retirado, corra o risco de se rasgar,
pode prejudicar de forma irremediável a identificação e o diagnóstico pretendido.
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Figura 6 - Exemplo do tipo de ficha que deve acompanhar o material. O relatório da necrópsia pode
ser escrito no verso.
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