INSTITUTO HAHNEMANNIANO DO BRASIL DEPARTAMENTO DE ENSINO Curso de Pós-Graduação Lato sensu em Homeopatia Área de Concentração: Farmácia MONOGRAFIA Determinação de cobre em preparações homeopáticas utilizando espectroscopia de emissão óptica e espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado (ICP-OES e ICP-MS) RAQUEL NOGUEIRA Rio de Janeiro 2010 INSTITUTO HAHNEMANNIANO DO BRASIL DEPARTAMENTO DE ENSINO Curso de Pós-Graduação Lato sensu em Homeopatia Área de Concentração: Farmácia MONOGRAFIA Determinação de cobre em preparações homeopáticas utilizando espectroscopia de emissão óptica e espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado (ICP-OES e ICP-MS) RAQUEL NOGUEIRA Monografia submetida como requisito parcial para obtenção do certificado de conclusão de curso de Pós graduação lato sensu em Homeopatia área Farmácia. Rio de Janeiro 2010 N778d Nogueira, Raquel Determinação de cobre em preparações homeopáticas utilizando espectroscopia de emissão óptica e espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado (ICP-OES E ICP-MS)/ Raquel Nogueira. – Rio de Janeiro: Instituto Hahnemanniano do Brasil, 2010. ix, 38f. il. color.; 30 cm. Orientador: Ilídio Afonso 1. Farmácia. 2. Metais . 3. Controle de qualidade. I. Título. INSTITUTO HAHNEMANNIANO DO BRASIL DEPARTAMENTO DE ENSINO Curso de Pós-Graduação Lato sensu em Homeopatia Área de Concentração: Farmácia MONOGRAFIA Determinação de cobre em preparações homeopáticas utilizando espectroscopia de emissão óptica e espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado (ICP-OES e ICP-MS) RAQUEL NOGUEIRA MONOGRAFIA APROVADA EM____/____/____ ________________________________________ Instituto Hahnemanniano do Brasil Ilídio Ferreira Afonso - Mestre ORIENTADOR ________________________________________ Instituto Hahnemanniano do Brasil Carmelinda Monteiro Costa Afonso - Mestre Coordenadora AGRADECIMENTOS Gostaria de agradecer ao orientador Ilídio Afonso. Ao Luiz e à Maria Luisa, da Sanatus Homeopatia em Petrópolis, agradeço a cordialidade e a boa vontade em preparar as matrizes homeopáticas utilizadas nesta monografia. Um agradecimento especial à equipe do Laboratório de Análise Inorgânica do Inmetro, especialmente Lindomar Augusto dos Reis, Monique Gonçalves de Mello, Maria Cristina Baptista Quaresma e Rodrigo Caciano de Sena, que me deram total suporte para a realização da parte prática deste trabalho. RESUMO A presente monografia descreve os resultados dos testes laboratoriais realizados com a finalidade de realizar o doseamento de cobre em matrizes homeopáticas (3 CH a 12 CH) por ICP-OES e ICP-MS, os quais são métodos analíticos de alta sensibilidade para determinação de metais. Palavras chave: Medicamentos homeopáticos, cobre, controle de qualidade, espectroscopia de emissão óptica com plasma indutivamente acoplado (ICP-OES), espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado (ICP-MS). ABSTRACT This monograph describes the results of the laboratorial studies performed to quantify cupper in homeopathic matrixes (3 CH to 12 CH) using ICP-OES and ICP-MS, which are very sensitive techniques for metal analysis. Key words: Homoeopathic medicine, cupper, quality control, inductively coupled plasma optical emission spectroscopy (ICP-OES), inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS). LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Plasma indutivamente acoplado ................................................................................... 9 Figura 2 - Matrizes homeopáticas de cobre (3 CH, 4 CH, 5 CH, 6 CH, 9 CH e 12 CH) ............. 15 Figura 3 - ICP-OES Ultima 2 (Horiba Jobin Yvon) com nebulizador ultrassônico U60000AT+ (Cetac Technologies) .................................................................................................................. 19 Figura 4 - ICP-MS Elan DRC II (Perkin Elmer) ........................................................................... 19 Figura 5 - Sistema de digestão assistido por microondas Multiwave 300 (Anton Paar)............. 21 Figura 6 - Etapas de preparo das amostras para ICP-MS (experimento 2) ............................... 24 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Concentrações de analito nas diluições centesimais e decimais Hahnemannianas .. 3 Tabela 2 - Exemplos de princípios ativos de origem mineral (metais e sais metálicos) utilizados na homeopatia ............................................................................................................................... 6 Tabela 3 - Comparação entre técnicas de ICP-OES da literatura e técnica empregada para as análises de cobre no Inmetro ...................................................................................................... 12 Tabela 4 - Comparação entre técnicas de ICP-MS da literatura e técnica empregada para as análises de cobre no Inmetro ...................................................................................................... 13 Tabela 5 - Programação do forno de microondas para digestão de amostras para análise por ICP-MS ........................................................................................................................................ 20 Tabela 6 - Resumo do preparo farmacotécnico das matrizes homeopáticas e do preparo laboratorial para leitura no ICP-OES e ICP-MS .......................................................................... 22 Tabela 7 - Curva de calibração de cobre .................................................................................... 26 Tabela 8 - Resultados do ICP-MS para matrizes 5 CH e 12 CH e etanol (absoluto e 70%) ...... 27 Tabela 9 - Preparo gravimétrico de matrizes líquidas para ICP-MS (1. experimento) ............... 29 Tabela 10 - Preparo gravimétrico de triturado (3 CH) para ICP-MS (1. experimento) ............... 29 Tabela 11 - Ordem de preparo das amostras para leitura no ICP-MS (2. experimento) ............ 30 Tabela 12 - Preparo das amostras para leitura no ICP-MS (2. experimento) ............................ 31 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS CH: Diluição centesimal Hahnemanniana DH: Diluição decimal Hahnemanniana ICP-OES: Espectroscopia de emissão óptica com plasma indutivamente acoplado ICP-MS: Espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado SUMÁRIO AGRADECIMENTOS .................................................................................................................... v RESUMO .......................................................................................................................................vi ABSTRACT .................................................................................................................................. vii LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................... viii LISTA DE TABELAS ................................................................................................................... viii LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS ................................................................. viii SUMÁRIO ......................................................................................................................................ix 1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................................... 1 1.1 EMBASAMENTO DO TRABALHO ..................................................................................... 1 1.2 OBJETIVO ........................................................................................................................... 7 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ....................................................................................................... 8 2.1 DOSEAMENTO DE METAIS EM BAIXAS CONCENTRAÇÕES........................................ 8 2.1.1 TÉCNICAS ANALÍTICAS PARA DOSEAMENTO DE METAIS ................................... 8 2.1.2 PREPARO DE AMOSTRAS....................................................................................... 10 2.1.3 DETERMINAÇÃO DE COBRE: TRABALHOS NA LITERATURA ............................. 11 3 MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................................... 14 3.1 ETAPAS DE DESENVOLVIMENTO DO TRABALHO ...................................................... 14 3.2 AMOSTRAS, REAGENTES E MATERIAIS ...................................................................... 14 3.2.1 AMOSTRAS DE MATRIZES HOMEOPÁTICAS DE COBRE .................................... 14 3.2.2 REAGENTES ............................................................................................................. 16 3.2.3 MATERIAIS ................................................................................................................ 17 3.2.3.1 DESCONTAMINAÇÃO DE FRASCOS E VIDRARIAS ....................................... 17 3.3 EQUIPAMENTOS ............................................................................................................. 17 3.3.1 ICP-OES ..................................................................................................................... 17 3.3.1.1 Princípios de funcionamento do ICP-OES .......................................................... 17 3.3.1.2 ICP-OES: Condições testadas ............................................................................ 17 3.3.1.3 Dados sobre o nebulizador ultrassônico (USN) com membrana de desolvatação acoplado ao ICP-OES ..................................................................................................... 18 3.3.1.4 Etapas de uso do ICP-OES................................................................................. 18 3.3.2 ICP-MS ....................................................................................................................... 19 3.3.2.1 ICP-MS: Condições testadas .............................................................................. 19 3.3.2.2 Etapas de uso do ICP-MS ................................................................................... 19 3.3.3 OUTROS EQUIPAMENTOS ...................................................................................... 20 3.3.3.1 Balança analítica ................................................................................................. 20 3.3.3.2 Purificador de água ............................................................................................. 20 3.3.3.3 Estufa .................................................................................................................. 20 3.3.3.4 Sistema de digestão de amostras assistido por microondas .............................. 20 3.3.3.5 Banho seco.......................................................................................................... 21 3.4 PREPARO DE AMOSTRAS DE MATRIZES HOMEOPÁTICAS PARA LEITURA POR ICP-OES E ICP-MS ................................................................................................................. 21 3.4.1 Experimento no ICP-OES ......................................................................................... 23 3.4.2 Experimento 1 no ICP-MS......................................................................................... 23 3.4.3 Experimento 2 no ICP-MS......................................................................................... 23 3.5 CÁLCULOS PARA CURVA DE CALIBRAÇÃO DE COBRE ............................................ 26 3.6 DETERMINAÇÃO DOS LIMITES DE DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DOS EQUIPAMENTOS.................................................................................................................... 26 4 RESULTADOS E DISCUSSÕES ............................................................................................. 27 4.1 EXPERIMENTO NO ICP-OES .......................................................................................... 27 4.1.1 RESUMO DO PROCEDIMENTO UTILIZADO ........................................................... 27 4.1.2 RESULTADOS E DISCUSSOES ............................................................................... 27 4.2 EXPERIMENTO 1 NO ICP-MS ......................................................................................... 28 4.2.1 RESUMO DO PROCEDIMENTO UTILIZADO ........................................................... 28 4.2.2 RESULTADOS E DISCUSSOES ............................................................................... 30 4.3 EXPERIMENTO 2 NO ICP-MS ......................................................................................... 30 4.3.1 RESUMO DO PROCEDIMENTO UTILIZADO ........................................................... 30 4.3.2 RESULTADOS E DISCUSSÕES ............................................................................... 34 5 CONCLUSÕES ........................................................................................................................ 35 REFERÊNCIAS ........................................................................................................................... 37 1 INTRODUÇÃO 1.1 EMBASAMENTO DO TRABALHO A homeopatia baseia-se no uso de medicamentos diluídos (ou ultra-diluídos) e dinamizados. A dinamização é uma etapa essencial no preparo, uma vez que é diretamente responsável pela energização e efeito do medicamento homeopático. Quanto mais diluído e dinamizado for o medicamento homeopático, maior é a sua energia. Os métodos de preparo de medicamentos homeopáticos são: método Hahnemanniano, método Korsakoviano e método de Fluxo Contínuo. Para o método Hahnemanniano, existem as escalas Centesimal Hahnemanniana (CH), Decimal Hahnemanniana (DH) e Cinquenta Milesimal (LM) (F.H.B. II ed.). A escala Centesimal Hahnemanniana, a qual foi desenvolvida pelo próprio Hahnemann, criador da homeopatia, consiste em realizar diluições centesimais (1 parte para 100 partes ou 1 parte + 99 partes) e dinamizá-las por sucussão (100 batidas) ou trituração (3 etapas de 20 minutos), para misturas líquidas e sólidas, respectivamente. Assim, a 1 CH consiste em uma mistura de 1 parte da substância de interesse (ativo) com 99 partes de insumo inerte, seguida de dinamização. Do mesmo modo, a 2 CH consiste em uma mistura de 1 parte da 1 CH com 99 partes de insumo inerte e posterior dinamização. Algumas diferenças no preparo são necessárias dependendo da solubilidade do ativo em etanol, água ou suas misturas. Caso o ativo seja solúvel, todas as potências serão líquidas. Da 1 CH até a 3 CH será necessário observar a alcoolatura do solvente para evitar precipitação. Se o ponto de partida de preparo do medicamento homeopático, por exemplo, for uma tintura-mãe (TM) vegetal (10% de ativo) ou animal (5% de ativo), será necessário respeitar a alcoolatura da TM até a 3 CH, para evitar precipitações (F. H. B. II ed.). A partir da 4 CH, no entanto, as matrizes homeopáticas de ativos solúveis serão normalmente preparadas em álcool a 70%. Vale ressaltar que cada diluição líquida é dinamizada através da aplicação de 100 sucussões (batidas) feitas manualmente ou em equipamento. 1 No caso de ativos insolúveis em etanol, água e suas misturas, o preparo da 1 CH até a 3 CH é feito por trituração em gral de porcelana, respeitando-se a mesma proporção (1 parte de ativo + 99 partes de inerte), sendo a lactose o insumo inerte normalmente utilizado. O preparo da 4 CH consiste, portanto, em uma etapa de solubilização, na qual 1 g de 3 CH é adicionado de 80 ml de água e 20 ml de etanol a 96%, e de dinamização (100 sucussões) (F. H. B. II ed.) ou ainda na tomada de 1 g de 3 CH, adição de 9 ml de água e 100 sucussões (MNT 3. ed.). A partir da 4 CH, que já está na forma líquida, a 5 CH é preparada como descrito anteriormente, utilizando-se álcool a 70%. A escala Decimal Hahnemanniana (DH) segue o mesmo princípio da escala CH, no entanto utiliza-se 1 g de ativo e 9 g de insumo inerte (1:10). Esta escala foi criada por Hering, discípulo de Hahnemann, a fim de se obter diluições intermediárias. Como pode ser visto na tabela 1, a potência 1 CH corresponde à 2 DH em termos de concentração, mas não podemos perder de vista que a 2 DH passou por duas dinamizações, enquanto a 1 CH foi dinamizada apenas uma vez. Como pode ser visto na tabela 1, a partir da 12 CH ou 24 DH não existem teoricamente mais moléculas nas preparações homeopáticas (o número de Avogrado 6 x 1023 é zerado na 23 DH, diluição intermediária entre 11 CH e 12 CH). Uma das complicações desta constatação é a realização do controle de qualidade de medicamentos homeopáticos. Sabe-se que o controle de processo da produção de medicamentos farmacêuticos, bem como o controle de qualidade físico-químico e microbiológico dos mesmos, são etapas fundamentais para se garantir a qualidade do medicamento. É claro que atualmente tem sido dada uma grande ênfase ao controle de processo, uma vez que a qualidade não deve ser verificada somente no “final da linha”, mas sim ao longo de toda a cadeia produtiva, segundo as Boas Práticas de Fabricação (GMP). No entanto, o controle de qualidade continua sendo necessário para verificação da qualidade do medicamento antes da sua liberação para venda ao consumidor. 2 Tabela 1 - Concentrações de analito nas diluições centesimais e decimais Hahnemannianas Diluição Hahnemanniana 1 DH 2 DH 1 CH 3 DH 4 DH 2 CH 5 DH 6 DH 3 CH 7 DH 8 DH 4 CH 9 DH 10 DH 5 CH 11 DH 12 DH 6 CH 13 DH 14 DH 7 CH 15 DH 16 DH 8 CH 17 DH 18 DH 9 CH 19 DH 20 DH 10 CH 21 DH 11 CH 22 DH 23 DH 12 CH 24 DH 25 DH 26 DH 13 CH 27 DH 28 DH 14 CH 29 DH 30 DH 15 CH 40 DH 20 CH 60 DH 30 CH 80 DH 40 CH 100 DH 50 CH 120 DH 60 CH 140 DH 70 CH 160 DH 80 CH 180 DH 90 CH 200 DH 100 FC 400 DH 200 FC Fonte: AFONSO, 2009. (mg mat-part / mg dose) -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -7 10 -8 10 -9 10 -10 10 -11 10 -12 10 -13 10 -14 10 -15 10 -16 10 -17 10 -18 10 -19 10 -20 10 -21 10 -22 10 -23 10 -24 10 -25 10 -26 10 -27 10 -28 10 -29 10 -30 10 -40 10 -60 10 -80 10 -100 10 -120 10 -140 10 -160 10 -180 10 -200 10 -400 10 Concentração ppm (µg matpart / g dose) 5 10 4 10 3 10 2 10 1 10 0= 10 1 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -7 10 -8 10 -9 10 -10 10 -11 10 -12 10 -13 10 -14 10 -15 10 -16 10 -17 10 -18 10 -19 10 -20 10 -21 10 -22 10 -23 10 -24 10 -34 10 -54 10 -74 10 -94 10 -114 10 -134 10 -154 10 -174 10 -194 10 -394 10 ppb (µg matpart / kg dose) 8 10 7 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 1 10 0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -7 10 -8 10 -9 10 -10 10 -11 10 -12 10 -13 10 -14 10 -15 10 -16 10 -17 10 -18 10 -19 10 -20 10 -21 10 -31 10 -51 10 -71 10 -91 10 -111 10 -131 10 -151 10 -171 10 -191 10 -391 10 mols 23 (6,02 x 10 ) 22 6,02 x 10 21 6,02 x 10 20 6,02 x 10 19 6,02 x 10 18 6,02 x 10 17 6,02 x 10 16 6,02 x 10 15 6,02 x 10 14 6,02 x 10 13 6,02 x 10 12 6,02 x 10 11 6,02 x 10 10 6,02 x 10 9 6,02 x 10 8 6,02 x 10 7 6,02 x 10 6 6,02 x 10 5 6,02 x 10 4 6,02 x 10 3 6,02 x 10 2 6,02 x 10 1 6,02 x 10 0 6,02 x 10 -1 6,02 x 10 -2 6,02 x 10 -3 6,02 x 10 -4 6,02 x 10 -5 6,02 x 10 -6 6,02 x 10 -7 6,02 x 10 -17 6,02 x 10 -37 6,02 x 10 -57 6,02 x 10 -77 6,02 x 10 -97 6,02 x 10 -117 6,02 x 10 -137 6,02 x 10 -157 6,02 x 10 -177 6,02 x 10 -377 6,02 x 10 3 As altas diluições empregadas na homeopatia, ou seja, as baixas concentrações de analitos presentes nas formulações homeopáticas, tornam difícil a quantificação dos princípios ativos nestas preparações. Segundo a Farmacopéia Homeopática Brasileira II ed., o controle de qualidade de preparações homeopáticas baseia-se nos testes físico-químicos e microbiológicos descritos nas monografias dos princípios ativos e dos insumos inertes. O prazo de validade destas preparações, inclusive, baseia-se fortemente na validade dos insumos inertes. No Reino Unido e no restante da União Européia, os medicamentos homeopáticos devem atender à legislação para medicamentos. Existe um procedimento simplificado para registro para produtos homeopáticos medicinais suficientemente diluídos (mínimo 1:10.000), destinados ao uso externo ou oral, e para os quais não seja declarada eficácia. Neste caso, os fabricantes precisam demonstrar qualidade e segurança, mas não eficácia. No caso de preparações homeopáticas administradas parenteralmente, que não sejam suficientemente diluídas ou para os quais seja feita declaração de eficácia, devem ser atendidas as mesmas exigências para medicamentos convencionais (AFONSO, 2009; BARNES, 2003). Segundo o Anexo I da RDC 67/2007 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, os medicamentos homeopáticos são excluídos dos controles de que trata o item 9 (Controle de Qualidade de Preparações Magistrais e Oficinais), enquanto segundo o Anexo V, item 9.2., o controle de qualidade dos insumos ativos será estabelecido respeitando-se as peculiaridades das preparações homeopáticas. Do mesmo modo, a Farmacopéia Americana (USP 32) estabelece que preparações homeopáticas não precisam atender aos requisitos do item relativo ao prazo de validade no Code of Federal Regulations 21 (CRF 21), que trata de Boas Práticas de Fabricação de Medicamentos (AFONSO, 2009). Esta monografia começou a ser desenvolvida para verificar a aplicabilidade de técnicas analíticas sensíveis na quantificação de princípios ativos em preparações homeopáticas. 4 Entre os equipamentos mais sensíveis para a quantificação de ativos estão aqueles utilizados na determinação de metais, incluindo a espectroscopia de emissão atômica (AES), espectroscopia de emissão óptica (OES), espectrometria de massa (MS) e espectroscopia de absorção atômica (AAS), algumas delas com plasma indutivamente acoplado (ICP) para atomização das espécies metálicas. Para as técnicas de ICP-OES e ICP-MS, limites de detecção da ordem de partes por bilhão (ppb, µg/kg ou 10-9 g/g) são usuais, podendo chegar a partes por trilhão (ppt ou 10-12 g/g). Consultando-se a tabela 1, pode-se verificar que estes equipamentos deveriam ser teoricamente capazes de detectar metais em preparações homeopáticas até as potências 4 CH, 5 CH ou 6 CH. Realizou-se, portanto, um levantamento de um metal que seria ao mesmo tempo utilizado na homeopatia e também possível de ser dosado por ICP-OES e ICP-MS. Vale lembrar que a homeopatia utiliza não somente princípios ativos minerais, mas também princípios ativos de origem vegetal (grande maioria) e origem animal, bem como substâncias químicas-farmacêuticas, materiais biológicos patogênicos ou não, e outros agentes (F. H. B. II ed.). A tabela 2 mostra diferentes tipos de princípios ativos de origem mineral a base de metais ou seus sais, com suas aplicações. Nota-se que grande parte destes ativos são insolúveis em misturas hidro-alcoólicas, de modo que as potências 1 CH, 2 CH e 3 CH precisam ser preparadas por trituração. O cobre foi o metal escolhido, devido ao seu uso na homeopatia e também por ser analisado com freqüência pelo Laboratório de Análise Inorgânica (Labin) do Inmetro, onde a parte prática desta monografia foi desenvolvida. 5 Tabela 2 - Exemplos de princípios ativos de origem mineral (metais e sais metálicos) utilizados na homeopatia Composto metálico Alumina (óxido de alumínio) Usos na homeopatia Tratamento da demência senil, preguiça, vertigem ao fechar os olhos, esclerose múltipla. Antimonium tartaricum (tartarato Pessoas ofegantes, mas fracas para tossir e expelir catarros, cefaléia com potássico de antimônio) sensação de aperto. Argentum metallicum (prata) Artrite reumatismo. Argentum nitricum (nitrato de prata) Problemas nervosos (fobias, ansiedade) e digestivos. Arsenicum álbum (arsenopirita, Ansiedade e medo provocados por insegurança, problemas nas mucosas dos óxido de arsênio) sistemas digestivo e respiratório. Arsenicum iodatum (iodeto de Crianças hiperativas, psoríase, bronquite. arsênio) Aurum metallicum (ouro) Depressão e tendência suicida, problemas vasculares, hipersensibilidade a ruídos, odores, entre outros. Baryta carbonica (carbonato de Lento desenvolvimento físico, intelectual ou emocional, demência senil. bário) Calcarea carbonica (carbonato de Desenvolvimento lento de ossos e dentes, dores nas juntas e ossos. cálcio) Calcarea fluorica (fluoreto de cálcio) Calcarea sulphurica (sulfato de cálcio) Manutenção da elasticidade dos tecidos, músculos e ligamentos estirados, hipertrofia do tecido adenóide. Para enfermidades com secreção de pus, abscessos de difícil cicatrização. Calcarea phosphorica (fosfato de Dor nos ossos e dor de dente, problemas de crescimento, fraqueza física e cálcio) mental, problemas digestivos, sensação de insatisfação. Causticum (composto de potássio) Fraqueza, paralisia dos nervos e músculos. Cuprum metallicum (cobre) nervosos (epilepsia, convulsões) e problemas respiratórios (asma, Cólicas e espasmos musculares, esgotamento mental, problemas coqueluche). Pessoas fracas com problemas circulatórios de anemia, apesar da boa Ferrum metallicum (ferro) Ferrum phosphoricum (fosfato de constituição física. Primeiros estágios da inflamação; febre e infecção antes do aparecimento de ferro) Hepar sulphuris calcareum (sulfeto de cálcio impuro) sintomas, tosses e resfriados de início lento. Tratamento de acne e furúnculos; antídoto para mercúrio; infecções com pus; dor de garganta, dor de ouvido ao engolir; enfermidades com dores agudas, secreções de odor acre e sensibilidade à dor, toque e ruídos. Kali bichromicum (dicromato de Muco grosso, fibroso, amarelo ou branco, dores que mudam de uma parte do potássio) corpo para outra e que aparecem / desaparecem periodicamente. Kali bromatum (brometo de Enfermidades no sistema nervoso (epilepsia) e dermatoses (acne). potássio) Kali carbonicum (carbonato de Afecções musculares e vertebrais, problemas menstruais e da menopausa, potássio) bronquite. Kali iodatum (iodeto de potássio) Problemas glandulares (gripe, dor de garganta) com corrimento nasal espesso ou aquoso, problemas de próstata. Kali muriaticum (cloreto de Inflamações de membranas mucosas com corrimento fibroso, infecções do potássio) ouvido médio e das trompas de Eustáquio. Kali phosphoricum (fosfato de Esgotamento físico ou mental com aversão a companhia e calafrios, secreções potássio) purulentas. Fonte: LOCKIE; GEDDES, 2008 (continua) 6 Tabela 2 - Exemplos de princípios ativos de origem mineral (metais e sais metálicos) utilizados na homeopatia (continuação) Composto metálico Magnesia carbonica (carbonato de magnésio) Usos na homeopatia Distúrbio do paladar e distúrbios digestivos, bebês que crescem com pouco aumento de peso, desenvolvimento retardado de músculos e incapacidade de manter a cabeça erguida. Magnesia phosphorica (fosfato de Moléstias nos nervos e músculos. magnésio) Mercurius corrosivus (cloreto de Colite ulcerosa. mercúrio) Mercurius dulcis (cloreto Otite média secretora. mercuroso) Mercurius solubilis (mercúrio) Natrium muriaticum (cloreto de Enfermidades acompanhadas por secreções corporais abundantes de odor forte, problemas da boca e da garganta. Problemas emocionais (ansiedade, depressão) provocados por sintomas sódio) reprimidos, vasta gama de usos. Natrium sulphuricum (sulfato de Doenças hepáticas, asma, bronquite, ferimentos na cabeça que causam sódio) depressão e tendência suicida. Platinum metallicum (platina) Enfermidades os órgãos reprodutores femininos e do sistema nervoso. Plumbum metallicum (acetato ou Arteriosclerose, esclerose múltipla e mal de Parkinson. carbonato de chumbo) Radium bromatum (brometo de Dermatoses (acne, câncer de pele, eczema). rádio) Stannum metallicum (estanho) Enfermidades toráxicas (bronquite, asma, traqueíte), cefaléias, nevralgia. Zincum metallicum (zinco) Extrema fraqueza mental e física. Fonte: LOCKIE; GEDDES, 2008 1.2 OBJETIVO O objetivo desta monografia é utilizar duas técnicas analíticas de alta sensibilidade, a espectroscopia de emissão óptica com plasma indutivamente acoplado (ICP-OES) e a espectometria de massa com plasma indutivamente acoplado (ICP-MS), para determinar cobre em matrizes homeopáticas com potências entre 3 CH e 12 CH. 7 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 DOSEAMENTO DE METAIS EM BAIXAS CONCENTRAÇÕES O doseamento de metais em baixas concentrações encontra diversas aplicações além do objetivo proposto nesta monografia de doseamento de cobre em matrizes homeopáticas, tais como determinar elementos traços em particulados atmosféricos [UPADHYAY et al., 2009] e elementos traços em alimentos (identificação da origem geográfica) [OLESZCZUK et al., 2007]. 2.1.1 TÉCNICAS ANALÍTICAS PARA DOSEAMENTO DE METAIS Entre as técnicas mais sensíveis para a quantificação de metais estão a espectroscopia de absorção atômica (AAS) e a espectroscopia de emissão atômica (AES). Os metais devem ser inicialmente volatilizados, em uma etapa denominada atomização, na qual se forma uma fase gasosa de átomos e íons. Para a atomização dos metais, empregam-se diferentes técnicas, tais como chama, atomizador eletrotérmico e plasma indutivamente acoplado (ICP) [SKOOG, 2006]. Enquanto a chama e o atomizador eletrotérmico são usados na espectroscopia de absorção atômica [SKOOG, 2006], o plasma indutivamente acoplado (Figura 1) é fonte de atomização de grande importância para a espectroscopia de emissão óptica (ICP-OES) e para a espectrometria de massa (ICP-MS) [SKOOG, 2006, ENGELHARD et al., 2007]. No plasma de argônio, os íons argônio e elétrons são as espécies condutoras principais e são capazes de absorver potência suficiente de uma fonte externa para manter temperaturas tão altas quanto 10.000 K. As amostras em geral são introduzidas na chama ou no plasma através de nebulização [SKOOG, 2006]. 8 Figura 1 - Plasma indutivamente acoplado Fonte: [ENGELHARD et al., 2007] Após atomização dos metais: • Na espectroscopia de emissão atômica, os átomos são excitados por uma fonte de calor ou energia elétrica (por exemplo pelo próprio plasma ou pela própria chama) e emitem energia em uma linha de emissão típica que pode ser quantificada (espectro de emissão); • Na espectroscopia de absorção atômica, os metais atomizados são expostos a uma fonte externa de radiação de comprimento de onda apropriado (ex.: lâmpadas contendo o próprio elemento a ser doseado), gerando um espectro de absorção; • Na espectrometria de massa, é desejável que a amostra seja convertida em íons em fase gasosa, ao invés de átomos em fase gasosa. O plasma é capaz de gerar uma fração substancial de átomos ionizados, em geral na forma de íon positivo monocarregado. Os íons são então separados por um analisador de massas, com base na razão massa-carga, gerando um espectro de massas [SKOOG, 2006]. 9 Resumidamente, as técnicas usuais para determinação de metais são: • ICP-AES (“inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy”): Espectroscopia de emissão atômica com plasma indutivamente acoplado. • ICP-OES (“inductively coupled plasma optical emission spectroscopy”): Espectroscopia de emissão óptica com plasma indutivamente acoplado. Uma das características importantes desta técnica é sua habilidade em produzir curvas de calibração lineares em uma faixa de 4 a 6 ordens de magnitude [ENGELHARD et al., 2007]. Outras vantagens incluem capacidade multi-elementar, boa sensibilidade, boa precisão e independência relativamente alta em relação a interferências não espectrais [OLESZCZUK et al., 2007]. • ICP-MS (“inductively coupled plasma mass spectrometry”): Espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado. Através desta técnica é possível obter limites de detecção (LOD) da ordem de ppb ou sub-ppb [LEWEN et al., 2004]. Entre as vantagens desta técnica estão sua capacidade multi-elementar, larga faixa linear de trabalho (de ppt a ppm) [UPADHYAY et al., 2004; NARDI et al., 2009], requerimento de pequenos volumes de amostra e pequeno tempo de análise [UPADHYAY et al., 2004]. • F-AAS (“flame atomic absorption spectroscopy”): Espectroscopia de absorção atômica de chama. • GF-AAS (“graphite furnace atomic absorption spectroscopy”): Espectroscopia de absorção atômica com forno de grafite. 2.1.2 PREPARO DE AMOSTRAS Em geral a análise de metais requer a digestão de amostras, com destruição da matriz orgânica, restando somente resíduos inorgânicos. Alguns exemplos de técnicas de digestão são: a) Digestão por via úmida em frascos abertos: ocorre normalmente por adição de ácidos e/ou oxidantes fortes, tais como ácido nítrico e peróxido de hidrogênio, os quais são os reagentes frequentemente utilizados para digestão de substratos para a análise de metais. 10 b) Digestão por via úmida em frasco fechado: normalmente é realizada em forno de microondas, sendo um processo rápido e eficiente, além de reduzir o risco de contaminação de amostras e perda de analitos por volatilização [NARDI et al., 2009]. A vantagem do uso do peróxido de hidrogênio é a reduzida formação de NO (g) e as menores pressões nos frascos fechados submetidos à digestão em microondas [UPADHYAY et al., 2004]. O uso de misturas de HNO3 e H2O2 tem-se mostrado mais eficiente para digerir amostras de alimentos em microondas em relação a outras misturas [NARDI et al., 2009; OLESZCZUK et al., 2007], além de produzir efeitos de matriz mínimos no ICP-OES [OLESZCZUK et al., 2007]. c) Queima a temperatura elevadas até formação de cinzas, após evaporação da água e carbonização em placa aquecida [NARDI et al., 2009]. Para análises por ICP-OES, as amostras podem ser preparadas em ácido nítrico a 2% e o uso de soluções mais concentradas de ácidos ou sais leva a um decréscimo nas linhas de emissão atômica e iônica [MORALES et al., 1998]. Para o preparo de amostras para ICP-MS, os melhores resultados são obtidos quando as amostras são preparadas em água e ácido nítrico [LEWEN et al., 2004]. 2.1.3 DETERMINAÇÃO DE COBRE: TRABALHOS NA LITERATURA A tabela 3 mostra alguns trabalhos publicados na literatura sobre o uso de ICPOES para análise de cobre em diversas matrizes, enquanto a tabela 4 faz um levantamento da análise de cobre por ICP-MS. São apresentadas as condições utilizadas pelo Laboratório de Análise Inorgânica do Inmetro, para fins de comparação. 11 Tabela 3 - Comparação entre técnicas de ICP-OES da literatura e técnica empregada para as análises de cobre no Inmetro Técnica Aparelho Radio-frequência (rf) Fluxo de gás total (“total gas flow”) Fluxo de gás somente para o plasma Fluxo de gás carreador (“sample gas carrier flow”) Fluxo de gás adicional (“additional gas flow”) Fluxo de gás auxiliar (“auxiliary plasma gas flow”) Fluxo de gás de saída (“outer plasma gas flow”) Fluxo de gás nebulizador (“nebulizer gas flow”) [MORALES et al., 1998] ICP-OES Inmetro ICP-OES Perkin-Elmer Optima 300 DV (radial viewing) Ultima 2 ICP-OES (Horiba Jobin Yvon) 1200 W 1300 W 14,1 L/min Argônio 15,0 L/min Argônio - - - 15 L/min Argônio 0,8 L/min Argônio - - 0,3 L/min - - 1,0 L/min Argônio 0,5 L/min 1,4 L/min Argônio 12,0 L/min - - - 0,5 L/min 0,61 L/min 1 ml/min Materiais de Referência Nebulizador ultrassônico (USN) U-6000 AT+ (Cetac Technologies, Omaha, NE, USA) USN: nebulização: 140 ºC, resfriamento pós-nebulização: -10 ºC, fluxo de ar para nebulização: 0,61 ml/min, membrana a 160 ºC, fluxo de ar na membrana: 1 ml/min 1 ml/min (bomba peristáltica) Materiais de Referência [ENGELHARD et al., 2007] ICP-OES Spectro Ciros CCD ICP OES espectrômetro (axial plasma viewing) (Spectro, Kleve, Alemanha) 1400 W Sistema de introdução de amostras Nebulizador ultrassônico (USN) U6000 AT+ (Cetac Technologies, Omaha, NE, USA) Programação do sistema de introdução de amostras USN, temperatura de aquecimento: 413 K, temperatura de resfriamento: 275 K Fluxo de injeção de amostra Tipo de amostras Digestão e preparo de amostras Comprimento de onda Metais avaliados 2,5 ml/min “rye grass” e Materiais de Referência Digestão com HNO3 (conc.) em microondas CEM Mars 5 (CEM Corporation, Mathews, NC, USA), 300 W, 55 bar, gradiente até 393K/5 min, até 433 K/5 min, até 473 K/5 min (temperaturas intermediárias mantidas por 5 min e temperatura final mantida por 30 min) Cu(I): 324,754 / 327,396 nm Cu e outros (ver artigo) Faixa linear Limite de Detecção (LOD) 0,06 ppb (µg/L) 0,12 ppb (µg/L) Amostras preparadas em HNO3 2% Em geral as amostras sofrem digestão química, sendo então reconstituídas em HNO3 2% ou em solução contendo baixo conteúdo de álcool (até 7%) Cu(I): 324,754 / 327,396 nm Cu: 324 nm Faixa linear estimada para Cu em etanol a 70%: 5-100 ppb 0,5 ppb para Cu em etanol a 7% (valor estimado para Cu em etanol a 70%: 1-2 ppb) 12 Tabela 4 - Comparação entre técnicas de ICP-MS da literatura e técnica empregada para as análises de cobre no Inmetro Técnica Aparelho Radio frequência Fluxo de gás nebulizador (“nebulizer gas flow”) Scan mode Resolução Tempo de replicata (“replicate time”) Dwell time Sweeps / reading Tempo de integração (“integration time”) Isótopos [UPADHYAY et al., 2004] ICP-MS ICP-MS de alta resolução (Thermo Finnigan Element 2, Bremen, Alemanha) - [NARDI et al., 2009] ICP-MS ICP-MS Elan DRC II (Perkin Elmer, Norwalk, CT), câmara de spray ciclônica, nebulizador Meinhard 1100 W - 0,6 – 0,9 L/min Argônio - Peak hopping 0,7 amu Inmetro ICP-MS ICP-MS Elan DRC II (Perkin Elmer), câmara de spray ciclônica, nebulizador Meinhard 1100 W 0,6 – 0,9 L/min Argônio (0,86 L/min Argônio) Peak hopping 0,7 amu - 1s 1s - 50 s 20 50 s 20 - 1000 ms 63Cu 1000 ms 63Cu e 65Cu Poliuretano, polipropileno, “quarz fiber”, celulose (filtros para Alimentos e Materiais de Tipo de amostras amostragem de traços de metais Referência em particulados atmosféricos) e Materiais de Referência Pré-digestão por 24 em mistura de Digestão usando 0,10 g - 0,25 g de HNO3 (7,5 ml) e H2O2 (2,5 ml), amostra, 4 ml de solução de ácido seguida da adição de HCl (1,9 ml) nítrico concentrado a 20% v/v (ou e HF (0,5 ml) e digestão em 14 mol/L) e 2 ml de peróxido de microondas CEM Mars 5: 1200 W, hidrogênio a 30% v/v, em forno de gradiente partindo da temperatura microondas Ethos 1600 (Milestone, ambiente até 180 ºC em 30 Monroe, CT). Programa de minutos, mantendo-se a temperatura: 160 ºC/1000 W por temperatura final por 30 min. Após Sistema de digestão e 4,5 min; 160 ºC/0 W por 0,5 min; resfriamento por 1 h, evaporação preparo de amostras 230 ºC/1000 W por 5,0 min; 230 da mistura ácida a 60 ºC até ºC/1000 W por 15,0 min; 0 ºC/0 W redução do volume final a 0,5 ml, por 20,0 min. Após resfriamento, seguida de diluição em água. foi adicionada água Milli Q até o Foram adicionados padrões volume desejado (1). Foram internos para eliminar efeitos de adicionados padrões internos para matriz e compensar o drift do compensar o drift do aparelho. aparelho (10 µl de solução 1 mg/L Soluções estoque preparadas em para cada 10 ml de solução de HNO3 2% (v/v). amostra). Metais avaliados Cu e outros (ver artigo) Cu Faixa linear Limite de Detecção (LOD) 10 ng/L (10 ppt) 16 ng/L (16 ppt) 17 ng/Kg (17 ppt) Taxas de recuperação 96-98% (1) Os autores avaliaram quatro técnicas de digestão, sendo que a primeira (listada acima) foi a mais eficiente. As outras três técnicas foram: - 4 ml de solução de HNO3 14 mol/L e microondas (digestão duas vezes menor). - 4 ml de solução de HNO3 2,8 mol/L, 2 ml de H2O2 30% v/v e microondas (digestão semelhante àquela do procedimento descrito na tabela). - 1 ml de solução de HNO3 14 mol/L, 3 ml de HCl 12 mol/L e microondas (digestão 1,5 vezes menor). 13 3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 ETAPAS DE DESENVOLVIMENTO DO TRABALHO Foram planejadas as seguintes etapas para o trabalho: 1) Obtenção de matrizes homeopáticas; 2) Preparo de amostras de matrizes homeopáticas em laboratório para leitura no ICP-OES e ICP-MS; 3) Preparo da curva de calibração de cobre; 4) Determinação da concentração de cobre nas diluições homeopáticas por ICP-OES e ICP-MS; 5) Determinação do Limite de Quantificação (LOQ) e do Limite de Detecção (LOD) do ICP-OES e do ICP-MS para o cobre. As etapas 1 e 2 foram concluídas. As etapas 3 e 4 foram iniciadas, mas não concluídas devido aos problemas ocorridos, como relatado a seguir. A etapa 5 baseou-se apenas em dados teóricos, uma vez que dependia da conclusão satisfatória da etapa 3. 3.2 AMOSTRAS, REAGENTES E MATERIAIS 3.2.1 AMOSTRAS DE MATRIZES HOMEOPÁTICAS DE COBRE As matrizes homeopáticas utilizadas neste trabalho foram gentilmente preparadas pela farmácia homeopática “Sanatus Homeopatia”, localizada à Rua Dom Pedro II, 37, Centro, Petrópolis, RJ, sob coordenação de Maria Luisa Correa, CRF-RJ 5331. As seguintes matrizes foram preparadas sob encomenda (Figura 2): • Cuprum metallicum 3 CH, triturado, 2 g • Cuprum metallicum 4 CH, 100 ml, em etanol a 20% • Cuprum metallicum 5 CH, 100 ml, em etanol a 70% • Cuprum metallicum 6 CH, 100 ml, em etanol a 70% • Cuprum metallicum 9 CH, 100 ml, em etanol a 70% • Cuprum metallicum 12 CH, 100 ml, em etanol a 70% 14 Figura 2 - Matrizes homeopáticas de cobre (3 CH, 4 CH, 5 CH, 6 CH, 9 CH e 12 CH) Embora a preparação das matrizes pela “Sanatus Homeopatia” não tenha sido acompanhada, segue uma descrição das etapas necessárias para o preparo farmacotécnico, conforme F. H. B. II ed. O ponto de partida é o cobre metálico, o qual é insolúvel em água e em etanol. Assim, as três primeiras centesimais são preparadas por trituração com lactose. Preparo da 1 CH: 1. Pesar 3 porções de 3,3 g de lactose cada (total: 9,9 g), transferir a primeira porção para gral de porcelana e reservar as demais. 2. Triturar a primeira porção de lactose até o preenchimento dos poros do gral. 3. Adicionar 0,1 g de cobre metálico e misturar com a espátula até homogeneizar. 4. Triturar energicamente por 6 minutos, raspar a parede do gral e o pistilo com espátula por 4 minutos, triturar novamente por mais 6 minutos e raspar por mais 4 minutos. 5. Adicionar a segunda porção de lactose, homogeneizar com a espátula e repetir o procedimento de trituração e raspagem (6 min, 4 min, 6 min, 4 min). 6. Adicionar a terceira porção de lactose, homogeneizar com a espátula e repetir o procedimento de trituração e raspagem (6 min, 4 min, 6 min, 4 min). 15 Preparo da 2 CH: Repetir o procedimento de preparo da 1 CH, utilizando no entanto 0,1 g de 1 CH. Preparo da 3 CH: Repetir o procedimento de preparo da 1 CH, utilizando 0,1 g de 2 CH. Preparo da 4 CH: 1. Pesar 1 g da trituração 3 CH. 2. Adicionar 80 ml de água. 3. Adicionar 20 ml de álcool a 96% v/v. 4. Tampar e aplicar 100 sucussões. Obs.: O líquido a ser dinamizado deve ocupar 2/3 (F. H. B. II ed.) ou ½ a 2/3 (MNT 3. ed.) da capacidade do frasco a ser utilizado. Preparo das matrizes a partir da 5 CH: 1. Pipetar para frasco 1 parte da matriz imediatamente anterior. 2. Adicionar 99 partes de etanol a 70%. 3. Tampar e aplicar 100 sucussões. Obs.: O líquido a ser dinamizado deve ocupar 2/3 (F. H. B. II ed.) ou ½ a 2/3 (MNT 3. ed.) da capacidade do frasco a ser utilizado. 3.2.2 REAGENTES • Água purificada tipo I (Milli Q); • Etanol absoluto Merck (ethanol absolute for analysis ACS, ISO, Reag. Ph Eur, lote K39687683913, Cu < 0,000002%) (1. experimento ICP-OES); • Etanol absoluto Tedia (ethyl alcohol absolute 200 proof ACS/USP, lote 605234) (1. experimento ICP-OES); Nota: O preparo de álcool 70% foi feito a partir de 9 ml de álcool absoluto (d = 0,792 g/ml; m = 7,128 g) e 3 ml de água Milli Q. A concentração final foi 70,4 % p/p (= 7,128 g / 10,128 g). • Peróxido de hidrogênio 30% p.a Merck, lote K39134010 (experimentos no ICP-MS); 16 • Ácido nítrico tri-destilado no próprio laboratório, a partir de ácido nítrico 65 % p.a. Merck, lote K40166556920 (1. experimento ICP-OES e 1. experimento ICP-MS) e lote K37597356730 (2. experimento ICP-MS). 3.2.3 MATERIAIS • Frascos plásticos de 50 ml com tampa. • Vidrarias. • Espátulas de aço inox. 3.2.3.1 DESCONTAMINAÇÃO DE FRASCOS E VIDRARIAS Os frascos e vidrarias utilizados para o preparo de amostras para análise de cobre foram imersos em ácido nítrico a 10% por no mínimo 12 h, sendo posteriormente enxaguados com água tipo I e levados à estufa a 35 °C. 3.3 EQUIPAMENTOS 3.3.1 ICP-OES 3.3.1.1 Princípios de funcionamento do ICP-OES O ICP-OES opera com a atomização de íons metálicos no plasma de argônio a altas temperaturas e sua excitação, com posterior emissão da energia absorvida, a qual é detectada por sistema óptico de alta resolução. O nebulizador ultrassônico com membrana de desolvatação permite a injeção direta de amostras contendo solventes, os quais são retirados na membrana, não atingindo o plasma, o que poderia desestabilizá-lo. 3.3.1.2 ICP-OES: Condições testadas • Fabricante: Horiba Jobin Yvon (Figura 3) • Modelo: Ultima 2 • Radio-frequência: 1300 W • Fluxo de argônio (plasma): 15 L/min 17 • Fluxo auxiliar de argônio: 1,4 L/min • Método utilizado: USN - álcool (para medidas de cobre em etanol) • Comprimento de onda de detecção: 324 nm • Fluxo de injeção de amostra: 1 ml/min • Injeção de amostras: Automática, através de bomba peristáltica. • Limite de detecção esperado para amostras de cobre em soluções contendo até 7 % de etanol: 0.5 ppb. Em presença de maiores concentrações de álcool, o limite de detecção esperado é 1-2 ppb. • A faixa linear do aparelho para cobre, em soluções contendo concentrações de álcool maiores que 7 %, é estimada em 5-100 ppb. 3.3.1.3 Dados sobre o nebulizador ultrassônico (USN) com membrana de desolvatação acoplado ao ICP-OES • Fabricante do nebulizador ultrassônico (USN – ultrasonic nebulizer): Cetac Technologies • Modelo: U60000AT+ • Temperatura de nebulização: 140 ºC • Temperatura de resfriamento após nebulização: -10 ºC • Fluxo de argônio para nebulização: 0,61 ml/min • Temperatura na membrana: 160 ºC • Fluxo de argônio na membrana: 1 ml/min 3.3.1.4 Etapas de uso do ICP-OES 1. Ligar sistema de resfriamento do ICP-OES, fornecimento de gás (argônio), exaustão, nebulizador e membrana, bomba peristáltica. 2. Purgar o sistema com argônio (√ controles). 3. Ligar o plasma (janela “Automatismo”). 4. Verificar o drift do detector em relação à linha de carbono a 193 nm (comando “Ordem Zero”, comando “Referência”) (drift registrado em 15.04.2010: 0,0065). 5. Injetar etanol absoluto Merck para limpeza do sistema. Acionar o sistema de nebulização somente quando o álcool atingir a câmara de nebulização. 18 Figura 3 - ICP-OES Ultima 2 (Horiba Jobin Yvon) com nebulizador ultrassônico U60000AT+ (Cetac Technologies) 3.3.2 ICP-MS 3.3.2.1 ICP-MS: Condições testadas • Fabricante: Perkin Elmer (Figura 4) • Modelo: Elan DRC II (câmara de spray ciclônica, nebulizador Meinhard) • Radio-frequência: 1100 W • Fluxo de gás nebulizador (argônio): 0,6 – 0,9 L/min (0,86 L/min) • Limite de detecção esperado para amostras de cobre: 17 ng/Kg (17 ppt) • Injeção de amostras: Automática, através de bomba peristáltica 3.3.2.2 Etapas de uso do ICP-MS Após ser ligado, o ICP-MS foi estabilizado por cerca de 1 h. Em seguida, realizou-se a leitura de padrão interno de calibração e das amostras. Figura 4 - ICP-MS Elan DRC II (Perkin Elmer) 19 3.3.3 OUTROS EQUIPAMENTOS 3.3.3.1 Balança analítica O preparo de amostras foi feito em balança analítica com resolução 0,1 mg (PT006, Labin). 3.3.3.2 Purificador de água Para obtenção de água purificada tipo I, foi utilizado equipamento Milli Q (Millipore). 3.3.3.3 Estufa A secagem de vidrarias e materiais foi realizada em estufa. 3.3.3.4 Sistema de digestão de amostras assistido por microondas A digestão de amostras para leitura em ICP-MS foi realizada no sistema Microwave Reaction System, Multiwave 3000, Anton Paar (Figura 5). Este sistema tem espaço para oito tubos de quartzo, mas as digestões foram realizadas sempre utilizando quatro tubos, dispostos de modo diametralmente opostos. Foi utilizada potência de 1000 W (NARDI et. al, 2009) e de acordo com o programa da tabela 5. O equipamento não permite o ajuste de temperatura, a qual varia automaticamente com a potência aplicada. O programa descrito a seguir gerou temperaturas em torno de 200 °C e pressões inferiores a 60 Bar. Tabela 5 - Programação do forno de microondas para digestão de amostras para análise por ICP-MS Power 1000 0 Ramp 10 5 Holder 25 5 20 Figura 5 - Sistema de digestão assistido por microondas Multiwave 300 (Anton Paar) 3.3.3.5 Banho seco Para evaporação de solventes de amostras, foi utilizado banho seco Nova Ética, programado para a temperatura de 110 °C. 3.4 PREPARO DE AMOSTRAS DE MATRIZES HOMEOPÁTICAS PARA LEITURA POR ICP-OES E ICP-MS A tabela 6 sumariza o procedimento usado no preparo farmacotécnico das matrizes homeopáticas, bem como o procedimento utilizado em laboratório para preparo das amostras para leituras nos equipamentos. Para leitura no ICP-MS, é necessária a digestão da amostra para destruir qualquer matéria orgânica, especialmente etanol e lactose, pois tais substâncias podem levar ao entupimento do cone do aparelho. Adicionalmente, o etanol pode levar ao apagamento do plasma. Para leitura no ICP-OES, a injeção direta de amostras em etanol a 70% foi possível somente devido à presença do nebulizador ultrassônico, que é capaz de retirar solventes. Foram injetadas diretamente no ICP-OES as matrizes 5 CH e 12 CH, pois considerou-se que a partir da 5 CH o teor de lactose já era baixo o suficiente para não comprometer o aparelho, embora a lactose também seja um interferente para as análises neste equipamento. 21 Tabela 6 - Resumo do preparo farmacotécnico das matrizes homeopáticas e do preparo laboratorial para leitura no ICP-OES e ICP-MS CH 1 CH 2 CH 3 CH Preparo farmacotécnico (a) 1 g Cuprum metallicum + 99 g lactose (trituração) 1 g 1 CH + 99 g lactose (trituração) 1 g 2 CH + 99 g lactose (trituração) Concentração Veículo Preparo laboratorial para leitura no ICP-OES Conc. Conc. (ppm) (ppb) Preparo (µg/ml) (µg/L) Preparo laboratorial para leitura no ICP-MS Conc. Conc. Preparo (ppm) (ppb) (µg/ml) (µg/L) (g/g) ppm (µg/g) ppb (µg/kg) Lactose 10-2 104 107 - - - - - - Lactose 10-4 102 105 - - - - - - 0,05 50,0 0,05 50,0 Lactose 10-6 100 103 - - - 200 mg, digestão, volume final 4 ml (b) g/ml 4 CH 5 CH 6 CH 7 CH 8 CH 9 CH 10 CH 11 CH 12 CH (a) 1 g 3 CH, 80 ml água, 20 ml álcool 96% 1 ml 4 CH, 99 ml etanol 70% 1 ml 5 CH, 99 ml etanol 70% 1 ml 6 CH, 99 ml etanol 70% 1 ml 7 CH, 99 ml etanol 70% 1 ml 8 CH, 99 ml etanol 70% 1 ml 9 CH, 99 ml etanol 70% 1 ml 10 CH, 99 ml etanol 70% 1 ml 11 CH, 90 ml etanol 70% Álcool 20% 10-8 ppm (µg/ml) 10-2 ppb (µg/L) 101 - - - 20 ml, digestão, volume final 4 ml (c) Álcool 70% 10-10 10-4 10-1 Leitura direta 10-4 10-1 (c) 0,0005 0,50 Álcool 70% 10-12 10-6 10-3 - - - (c) 5 x 10-6 0,005 Álcool 70% 10-14 10-8 10-5 - - - - - - Álcool 70% 10-16 10-10 10-7 - - - - - - Álcool 70% 10-18 10-12 10-9 - - - (c) 5 x 10-12 5x 10-9 Álcool 70% 10-20 10-14 10-11 - - - - - - Álcool 70% 10-22 10-16 10-13 - - - - - - Álcool 70% 10-24 10-18 10-15 Leitura direta 10-18 10-15 (c) 5 x 10-18 5x 10-15 Ver detalhamento do preparo farmacotécnico no item 3.2.1. Na tabela não são citadas as 100 sucussões para as potências líquidas, nem a trituração para as potências sólidas. (b) 0,2 mg + 4 ml HNO3 conc. + 2 ml de H2O2 30%, digerir em microondas, evaporar e reconstituir em 4 ml de HNO3 2%. (c) Evaporar 20 ml até quase secura, adicionar 4 ml HNO3 conc. e 2 ml de H2O2 30%, digerir em microondas, evaporar e reconstituir em 4 ml de HNO3 2%. 22 3.4.1 Experimento no ICP-OES No experimento realizado no ICP-OES (15.04.2010), as matrizes 5 CH e 12 CH foram lidas diretamente no aparelho, sem abertura das amostras. 3.4.2 Experimento 1 no ICP-MS O procedimento consistiu em evaporar 20 ml das matrizes líquidas até secura ou tomada de amostra de 50 mg da matriz sólida (3 CH), adição de HNO3 conc. ou de mistura HNO3 conc. - H2O2 v/v (2:1) (NARDI et al., 2009), digestão das amostras em banho seco a 110 °C, evaporação até secura e reconstituição da amostras em 4 ml de ácido nítrico a 2 %. 3.4.3 Experimento 2 no ICP-MS O procedimento consistiu em evaporar 20 ml das matrizes líquidas até secura ou tomada de amostra de 0,2 g da matriz sólida (3 CH), adição de 6 ml de mistura HNO3 conc. - H2O2 v/v (2:1) (NARDI et al., 2009), digestão em forno de microondas, evaporação das soluções em banho seco a 110 °C e reconstituição da amostras em 4 ml de ácido nítrico a 2%. As etapas seguidas em 30.09.2010 estão sumarizadas na Figura 6 e são descritas a seguir: 23 Matriz sólida (3 CH) Matrizes líquidas (4 CH, 5 CH, 6 CH, 9 CH, 12 CH) Pesagem da amostra (0,2 g) Pesagem da amostra (20 ml) e evaporação do solvente em banho seco a 110 °C Transferência para tubo de quartzo e adição de HNO3 conc. (4 ml) e H2O2 30% v/v (2 ml) Digestão em microondas Transferência das soluções digeridas para frascos plásticos e evaporação em banho seco a 110 °C Reconstituição em ácido nítrico a 2 % (4 ml) Leitura no ICP-MS Figura 6 - Etapas de preparo das amostras para ICP-MS (experimento 2) Detalhamento do preparo de amostras para ICP-MS (experimento 2): Matriz sólida (3 CH): - Pesar um vidro de relógio pequeno e registrar a massa. - Adicionar 0,2 g da matriz sólida (triturado em lactose) e registrar a massa (os experimentos de 30.09.2010 foram feitos em triplicata). Obs.: A massa de matriz sólida é posteriormente calculada por diferença. - Transferir a matriz para um tubo de quartzo (microondas). - Adicionar 4 ml de ácido nítrico concentrado. - Adicionar 2 ml de peróxido de hidrogênio 30%. Obs.: Usar o ácido e o peróxido para a lavagem do tubo plástico (transferência quantitativa). - Preparar o branco, usando os mesmos volumes de ácido e peróxido. - Anotar os números dos tubos gravados no quartzo e fazer a correspondência com o número da amostra em preparação. - Tampar os tubos de quartzo e levá-los à digestão em microondas. Obs.: A distribuição dos tubos no microondas deve ser feita de modo uniforme, para não danificar o rotor (ex.: 4 tubos, colocados em posições opostas 2 a 2). 24 - Pesar um tubo de plástico com tampa (não reutilizável) e registrar a massa. Rotular o tubo e a tampa com o número da amostra. - Transferir o líquido restante da digestão para o tubo plástico. Usar no mínimo três pequenos volumes de água tipo I na transferência, realizando a lavagem inclusive da tampa do tubo de quartzo. - Colocar os tubos em banho seco a 110 °C, sem tampa, e aguardar a evaporação até secura. - Aguardar o resfriamento do tubo, pipetar 80 µl de ácido nítrico concentrado, agitar alguns segundos para dissolver o resíduo, pipetar 4 ml de água tipo I para o tubo, tampar, pesar, registrar a pesagem e homogeneizar (conc. final de ácido nítrico: 2 %). Reservar o tubo com amostra para leitura no espectrômetro. Matrizes líquidas (4 CH, 5 CH, 6 CH, 9 CH, 12 CH): - Pesar frasco de plástico com tampa e registrar a massa. - Retirar a tampa, adicionar cerca de 20 ml de matriz líquida em etanol, recolocar a tampa e registrar a massa (em 30.09.2010, as matrizes líquidas foram preparadas em duplicata). Obs.: A massa de matriz líquida é posteriormente calculada por diferença. - Colocar os tubos em banho seco a 110 °C, sem tampa, e aguardar a evaporação do etanol. Não permitir a secagem até secura, pois isto inviabilizará a transferência do resíduo para o tubo de quartzo (microondas). Nota: A evaporação do solvente é necessária para evitar risco de explosão no microondas. - Transferir o líquido residual da evaporação para um tubo de quartzo. - Adicionar 4 ml de ácido nítrico concentrado. - Adicionar 2 ml de peróxido de hidrogênio 30%. Obs.: Usar o ácido e o peróxido para a lavagem do tubo plástico (transferência quantitativa). - Preparar o branco, usando os mesmos volumes de ácido e peróxido. - Anotar os números dos tubos gravados no quartzo e fazer a correspondência com o número da amostra em preparação. - Tampar os tubos de quartzo e levá-los à digestão em microondas. Obs.: A distribuição dos tubos no microondas deve ser feita de modo uniforme, para não danificar o rotor (ex.: 4 tubos, colocados em posições opostas 2 a 2). - Pesar um tubo de plástico com tampa e registrar a massa. Rotular o tubo e a tampa com o número da amostra. - Transferir o líquido restante da digestão para o tubo plástico. Usar no mínimo três pequenos volumes de água tipo I na transferência, realizando a lavagem inclusive da tampa do tubo de quartzo. - Colocar os tubos em banho seco, sem tampa, e aguardar a evaporação até secura. - Aguardar o resfriamento do tubo, pipetar 80 µl de ácido nítrico concentrado, agitar alguns segundos para dissolver o resíduo, pipetar 4 ml de água tipo I para o tubo, tampar, pesar, registrar a pesagem e homogeneizar (conc. final de ácido nítrico: 2 %). Reservar o tubo com amostra para leitura no espectrômetro. 25 3.5 CÁLCULOS PARA CURVA DE CALIBRAÇÃO DE COBRE A tabela 7 mostra os cálculos para o preparo da curva de calibração de cobre a partir de solução estoque de concentração 100 ppm (100.000 ppb). Somente as soluções com concentração de até 25 ppm destinam-se à leitura no ICP-MS. Tabela 7 - Curva de calibração de cobre Volume de Volume de solução de ácido nítrico Concentração Volume final (ppb) restante para partida (ml) 2% (ml) - - - - (em volume) leitura (ml) 100.000 - 1 Estoque 0,4 39,6 40 1000 39 2 1 1 19 20 50 10 3 2 10 10 20 25 10 4 3 10 15 25 10 15 5 4 10 10 20 5 16 6 5 4 16 20 1 10 7 6 10 10 20 0,5 10 8 7 10 10 20 0,25 10 9 8 10 15 25 0,1 15 10 9 10 10 20 0,05 10 11 10 10 10 20 0,025 10 12 11 10 10 20 0,0125 10 13 12 10 10 20 0,00625 10 14 13 10 10 20 0,003125 10 15 14 10 10 20 0,0015625 20 Solução em Solução de preparo partida Estoque Volume total (ml) 3.6 DETERMINAÇÃO DOS LIMITES DE DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DOS EQUIPAMENTOS O Limite de Detecção (LOD) e o Limite de Quantificação (LOQ) dos equipamentos podem ser determinados a partir dos resultados para a curva de calibração prevista na tabela 08, com base no método do sinal / ruído (S / N: Signal-to-Noise) (ICH, 1994). 26 4 RESULTADOS E DISCUSSÕES 4.1 EXPERIMENTO NO ICP-OES 4.1.1 RESUMO DO PROCEDIMENTO UTILIZADO As amostras das matrizes 5 CH e 12 CH, formuladas em álcool a 70 %, foram lidas diretamente no ICP-OES (experimento de 15.04.2010). Adicionalmente, foram lidas amostras de etanol absoluto e etanol a 70 %. 4.1.2 RESULTADOS E DISCUSSOES Os resultados das leituras no ICP-OES são mostrados na tabela 8. Tabela 8 - Resultados do ICP-MS para matrizes 5 CH e 12 CH e etanol (absoluto e 70%) Amostra Álcool etílico absoluto Merck Leitura Leitura próxima ao sinal de base (ruído) Álcool etílico Merck 70% p/p Leitura próxima ao sinal de base (ruído) Álcool absoluto Tedia Álcool Tedia 70% p/p 5 CH 12 CH Leitura em torno de 67.000 contagens (Obs.: 1000 contagens equivalem a cerca de 1 ppb de cobre) Leitura próxima ao sinal de base (ruído) Leitura próxima ao sinal de base (ruído) Leitura próxima ao sinal de base (ruído) Discussão O álcool absoluto Merck contém quantidades muito baixas de cobre (< 0,000002% ou 20 ppb), as quais não interferem na leitura do aparelho, sendo obtido somente o sinal de base (ruído). O álcool absoluto Tedia contém maiores concentrações de cobre em relação ao álcool absoluto Merck (não declaradas no rótulo). Sua leitura direta no aparelho resultou em sinal significativo no comprimento de onda analisado, o qual poderia ser um interferente na análise. A adição de água ao álcool absoluto Tedia causou a diminuição da sensibilidade do ICP-OES, de modo que o sinal observado com o álcool absoluto desta marca deixou de ser obtido, verificando-se apenas a linha de base (ruído). Esta perda de sensibilidade, portanto, deve ser esperada para as amostras 5 CH e 12 CH, preparadas em álcool a 70%. Foi observado somente o sinal de base. Foi observado somente o sinal de base. 27 A análise das matrizes homeopáticas por ICP-OES acoplado ao nebulizador ultrassônico foi inicialmente escolhida porque a presença deste nebulizador permite a injeção direta de amostras com altas concentrações de solventes, os quais são eliminados na membrana, evitando o resfriamento do plasma e comprometimento da análise. Deste modo, a interferência no ICP-OES do etanol a 70 % presente nas matrizes homeopáticas a partir da 5 CH seria eliminada. Adicionalmente, a concentração da lactose a partir desta potência (5 CH) foi considerada baixa o suficiente para permitir sua injeção direta no sistema, o que é uma vantagem, eliminando a etapa de preparo de amostras. No entanto, a presença de água no solvente causa a perda de sensibilidade do aparelho (tabela 8). Testes previamente realizados no laboratório já haviam revelado uma perda de sensibilidade de 30 % do ICP-OES na detecção de metais após a adição de água ao álcool. Assim, a baixa concentração de cobre nas matrizes testadas (5 CH e 12 CH) e a perda de sensibilidade do ICP-OES devido à presença de água no solvente resultaram em sinais próximos à linha de base na análise destas matrizes. A análise das potências 3 CH e 4 CH poderia eventualmente ter resultado em leitura no ICP-OES, no entanto a injeção direta destas matrizes não seria possível, já que ambas necessitariam de digestão prévia da lactose, lembrando ainda que a 4 CH é formulada em mistura contendo 80 % de água e 20 % de etanol, o que levaria à perda de sensibilidade da análise. Como o preparo de amostras foi considerado necessário (evaporação do solvente da matriz quando aplicável, digestão da lactose e reconstituição do resíduo em ácido nítrico a 2 %), fez-se a opção por prosseguir os experimentos usando o ICP-MS, que é um equipamento mais sensível em relação ao ICPOES. 4.2 EXPERIMENTO 1 NO ICP-MS 4.2.1 RESUMO DO PROCEDIMENTO UTILIZADO O primeiro teste de preparo de amostras para leitura no ICP-MS consistiu na tomada de amostra de 20 ml (matrizes líquidas) ou 0,2 g (triturado 3 CH), 28 evaporação do solvente das matrizes líquidas, adição de ácido nítrico conc. ou de mistura ácido nítrico conc. - peróxido de hidrogênio 30% v/v (2:1) (NARDI et al., 2009) e aquecimento em banho seco a 110 °C para eliminação da matéria orgânica (digestão). A previsão seria reconstituir o resíduo de amostra em ácido nítrico a 2% para leitura no ICP-MS. O preparo gravimétrico de amostras utilizando ácido nítrico concentrado é mostrado nas tabelas 9 e 10. Como a digestão das amostras não foi completada, parte da tabela é representada por dados teóricos. Tabela 9 - Preparo gravimétrico de matrizes líquidas para ICP-MS (1. experimento) Conc. teórica de Frasco cobre vazio (g) (g/ml) Frasco + 20 ml matriz (g) 20 ml matriz (g) Massa teórica cobre (g) Frasco + matriz digerida (g) Frasco + matriz digerida + 4 ml HNO3 Conc. final (g/g) Conc. final (µg/g) (ppm) 2% (g) Conc. final (µg/kg) (ppb) 1 CH4-1 1,00E-08 14,39872 34,18348 19,78476 1,98E-07 14,4 18,4 4,95E-08 4,95E-02 4,95E+01 2 CH4-2 1,00E-08 14,48931 34,34525 19,85594 1,99E-07 14,4 18,4 4,96E-08 4,96E-02 4,96E+01 3 CH5-1 1,00E-10 14,39433 32,27160 17,87727 1,79E-09 14,4 18,4 4,47E-10 4,47E-04 4,47E-01 4 CH5-2 1,00E-10 14,51065 32,63101 18,12036 1,81E-09 14,4 18,4 4,53E-10 4,53E-04 4,53E-01 5 CH6-1 1,00E-12 14,49855 32,52237 18,02382 1,80E-11 14,4 18,4 4,51E-12 4,51E-06 4,51E-03 6 CH6-2 1,00E-12 14,49312 32,29029 17,79717 1,78E-11 14,4 18,4 4,45E-12 4,45E-06 4,45E-03 7 CH9-1 1,00E-18 14,37646 32,16121 17,78475 1,78E-17 14,4 18,4 4,45E-18 4,45E-12 4,45E-09 8 CH9-2 1,00E-18 14,4069 32,04315 17,63625 1,76E-17 14,4 18,4 4,41E-18 4,41E-12 4,41E-09 9 CH12-1 1,00E-24 14,38637 32,62057 18,2342 1,82E-23 14,4 18,4 4,56E-24 4,56E-18 4,56E-15 10 CH12-2 1,00E-24 14,08038 31,98879 17,90841 1,79E-23 14,4 18,4 4,48E-24 4,48E-18 4,48E-15 Dados reais Dados teóricos, já que não houve digestão das amostras Tabela 10 - Preparo gravimétrico de triturado (3 CH) para ICP-MS (1. experimento) Conc. Frasco + Frasco + teórica de Frasco 50 mg Frasco + cobre vazio (g) amostra 50 mg (g) (g/g) (g) Massa Frasco + amostra teórica amostra aberta + 4 cobre (g) aberta (g) ml HNO3 Conc. final final final (g/g) (µg/g) (µg/kg) (ppm) (ppb) 2% (g) 1 CH3-1 1,00E-06 14,4032 14,4534 0,05002 5,00E-08 2 CH3-2 1,00E-06 14,4222 14,4723 0,05001 5,00E-08 Dados reais Conc. Conc. 14,4 18,4 1,25E-08 1,25E-02 1,25E+01 14,4 18,4 1,25E-08 1,25E-02 1,25E+01 Dados teóricos, já que não houve digestão das amostras 29 4.2.2 RESULTADOS E DISCUSSOES Embora a previsão fosse de que a lactose seria rapidamente digerida em presença de ácido nítrico concentrado, ou ainda na presença de uma mistura ácido nítrico concentrado – peróxido de hidrogênio 30% v/v (2:1), observou-se que estes oxidantes não foram suficientes para promover a digestão nas condições utilizadas (banho seco a 110 °C), restando uma “crosta” no fundo dos tubos após evaporação até secura. Conclui-se portanto que a digestão das matrizes deveria ser feita em sistema assistido por microondas. 4.3 EXPERIMENTO 2 NO ICP-MS 4.3.1 RESUMO DO PROCEDIMENTO UTILIZADO Este segundo experimento difere do anterior por ter utilizado o sistema de digestão assistido por microondas no preparo de amostras. Resumidamente, foram tomadas amostras de 20 ml das matrizes líquidas e 0,20 g da matriz sólida. Após evaporação do solvente das matrizes líquidas, foram adicionados 6 ml de mistura ácido nítrico concentrado - peróxido de hidrogênio 30% v/v (2:1) (NARDI et al., 2009). A digestão foi então realizada em microondas (programação descrita na tabela 5). Em seguida, as soluções foram evaporadas até secura em banho seco a 110 °C e o resíduo foi retomado em 4 ml de ácido nítrico a 2 % para leitura no ICP-MS. A tabela 11 mostra a ordem de digestão das amostras em microondas, enquanto a tabela 12 mostra cálculos de concentrações em volume e em peso. Tabela 11 - Ordem de preparo das amostras para leitura no ICP-MS (2. experimento) 1°. uso do microondas 2°. uso do microondas 3°. uso do microondas 4°. uso do microondas CH3-1, CH3-2, CH3-3, Branco-1 Branco-3, CH9-2, CH12-1, CH12-2 Branco-2, CH6-1, CH6-2, CH9-1 CH4-1, CH4-2, CH5-1, CH5-2 30 Tabela 12 - Preparo das amostras para leitura no ICP-MS (2. experimento) CH3-1 CH3-2 CH3-3 Frasco (g) 11.26037 10.90603 11.27654 Frasco + amostra (g) 11.46869 11.10393 11.49212 Amostra (g) (1) 0.20832 0.19790 0.21558 Concentração Cu na potência CH (g/g) 1.00E-06 1.00E-06 1.00E-06 Massa Cu na amostra (g) 2.08E-07 1.98E-07 2.16E-07 Evaporação do solvente Volume de HNO3 conc. (ml) Volume de H2O2 (30%, v/v) - - - 4.0 4.0 4.0 2.0 2.0 2.0 SAP-03 SAP-04 SAP-05 1 2 3 Frasco (g) 14.49514 14.39641 14.47878 Frasco (g) + amostra digerida (g) (informativo) 14.49341 14.36613 14.50578 Volume de HNO3 conc. (ml) 0.08 0.08 0.08 Volume H2O (ml) 4.00 4.00 4.00 4.08000 4.08000 4.08000 Código do tubo de quartzo (microondas) Ordem de digestão (microondas) Volume final de solução (ml) Concentração de HNO3 na solução (%) 1.96078 1.96078 1.96078 Frasco + am. digerida + 80 mcl HNO3 conc. + 4 ml H2O (g) 18.60030 18.48332 18.62182 Concentração Cu (g/ml) (2) 5.1059E-08 4.8505E-08 5.2838E-08 Concentração Cu (mg/ml) 5.1059E-05 4.8505E-05 5.2838E-05 Cálculo de concentração em volume Concentração Cu (mcg/ml) (ppm) 5.1059E-02 4.8505E-02 5.2838E-02 Concentração Cu (ppb) (a) 5.1059E+01 4.8505E+01 5.2838E+01 Massa sol. (am. digerida + HNO3 conc. + H2O) (g) (3) 4.1052E+00 4.0869E+00 4.1430E+00 Concentração Cu (g/g) (4) 5.0746E-08 4.8423E-08 5.2034E-08 Concentração Cu (mg/g) 5.0746E-05 4.8423E-05 5.2034E-05 Concentração Cu (mcg/g) (ppm) 5.0746E-02 4.8423E-02 5.2034E-02 Concentração Cu (ppb) (b) 5.0746E+01 4.8423E+01 5.2034E+01 Cálculo de concentração em peso Diluição adicional da diluição CH3 (1:2) Suporte (g) 15,25714 15,25714 15,25714 Suporte + frasco (g) 21,51025 21,51507 21,52720 Suporte + frasco + 1 ml CH3 reconstituída (g) 22,51711 22,52259 22,53611 Suporte + frasco + 1 ml CH3 reconst. + 1 ml HNO3 2% (g) 23,52382 23,53036 23,54329 25,52941 24,25245 26,41912 1,00686 1,00752 1,00891 Cálculo de concentração em volume Concentração Cu (ppb) (5) Cálculo de concentração em peso Massa de CH3 reconstituída (g) (6) Massa final solução (g) (7) Concentração Cu (ppb) (8) (continua) 2,01357 2,01529 2,01609 25,37484 24,20844 26,03945 Legenda: (1) Amostra (g) = (Frasco + amostra) (g) – Frasco (g) (2) Concentração Cu (g/ml) = Massa Cu na amostra (g) / Volume final de solução (ml) (3) Massa sol. (am. digerida + HNO3 conc. + H2O) (g) = (Frasco + am. digerida + 80 mcl HNO3 conc. + 4 ml H2O) (g) – Frasco (g) (4) Concentração Cu (g/g) = Massa Cu na amostra (g) / Massa de solução (amostra digerida + HNO3 conc. + água) (g) (5) Concentração Cu (ppb) = Concentração Cu (ppb) (a) * 0,5 (6) Massa de CH3 reconstituída (g) = (Suporte + frasco + 1 ml CH3 reconstituída (g)) – (Suporte + frasco (g)) (7) Massa final solução (g) = (Suporte + frasco + 1 ml CH3 reconst. + 1 ml HNO3 2% (g)) – (Suporte + frasco (g)) (8) Concentração Cu (ppb) = Concentração Cu (ppb) (b) * Massa de CH3 reconstituída (g) / Massa final solução (g) 31 Tabela 12 - Preparo das amostras para leitura no ICP-MS (2. experimento) (continuação) CH4-1 CH4-2 CH5-1 CH5-2 Frasco (g) 14.42562 14.47377 14.51629 14.43205 Frasco + amostra (g) 33.99031 34.31237 32.34415 31.44010 Amostra (g) (1) 19.56469 19.83860 17.82786 17.00805 Concentração Cu na potência CH (g/g) 1.00E-08 1.00E-08 1.00E-10 1.00E-10 Massa Cu na amostra (g) 1.96E-07 1.98E-07 1.78E-09 1.70E-09 Evaporação do solvente Evaporação Evaporação Evaporação Evaporação Volume de HNO3 conc. (ml) 4.0 4.0 4.0 4.0 Volume de H2O2 (30%, v/v) 2.0 2.0 2.0 2.0 SAP-06 SAP-22 SAP-23 SAP-08 Código do tubo de quartzo (microondas) Ordem de digestão (microondas) 13 14 15 16 14.38096 14.46036 14.47396 14.48750 Volume de HNO3 conc. (ml) 0.08 0.08 0.08 0.08 Volume H2O (ml) 4.00 4.00 4.00 4.00 Volume final de solução (ml) 4.08000 4.08000 4.08000 4.08000 Concentração de HNO3 na solução (%) Frasco + am. digerida + 80 mcl HNO3 conc. + 4 ml H2O (g) 1.96078 1.96078 1.96078 1.96078 Concentração Cu (g/ml) (2) 4.7953E-08 4.8624E-08 4.3696E-10 4.1686E-10 Concentração Cu (mg/ml) 4.7953E-05 4.8624E-05 4.3696E-07 4.1686E-07 Concentração Cu (mcg/ml) (ppm) 4.7953E-02 4.8624E-02 4.3696E-04 4.1686E-04 Concentração Cu (ppb) 4.7953E+01 4.8624E+01 4.3696E-01 4.1686E-01 Massa sol. (am. digerida + HNO3 conc. + H2O) (g) (3) -1.4381E+01 -1.4460E+01 -1.4474E+01 -1.4488E+01 Concentração Cu (g/g) (4) -1.3605E-08 -1.3719E-08 -1.2317E-10 -1.1740E-10 Concentração Cu (mg/g) -1.3605E-05 -1.3719E-05 -1.2317E-07 -1.1740E-07 Concentração Cu (mcg/g) (ppm) -1.3605E-02 -1.3719E-02 -1.2317E-04 -1.1740E-04 Concentração Cu (ppb) -1.3605E+01 -1.3719E+01 -1.2317E-01 -1.1740E-01 Não aplicável Não aplicável Suporte (g) 16,53051 16,53051 Suporte + frasco (g) 22,77603 22,75457 Suporte + frasco + 1 ml CH3 reconstituída (g) Suporte + frasco + 1 ml CH3 reconst. + 1 ml HNO3 2% (g) 23,78547 23,75877 24,79897 24,76855 Não aplicável Não aplicável 23,97634 24,31201 Não aplicável Não aplicável Frasco (g) Frasco (g) + amostra digerida (g) (informativo) Cálculo de concentração em volume Cálculo de concentração em peso Diluição adicional da diluição CH4 (1:2) Cálculo de concentração em volume Concentração Cu (ppb) (5) Cálculo de concentração em peso Massa de CH3 reconstituída (g) (6) 1,00944 1,00420 Massa final solução (g) (7) 2,02294 2,01398 Concentração Cu (ppb) (8) (continua) 23,32062 24,62838 32 Tabela 12 - Preparo das amostras para leitura no ICP-MS (2. experimento) (continuação) CH6-1 CH6-2 CH9-1 CH9-2 Frasco (g) 14.48319 14.46134 14.42451 14.43744 Frasco + amostra (g) 32.31041 32.57552 33.13716 32.54702 Amostra (g) (1) 17.82722 18.11418 18.71265 18.10958 Concentração Cu na potência CH (g/g) 1.00E-12 1.00E-12 1.00E-18 1.00E-18 Massa Cu na amostra (g) 1.78E-11 1.81E-11 1.87E-17 1.81E-17 Evaporação do solvente Evaporação Evaporação Evaporação Evaporação Volume de HNO3 conc. (ml) 4.0 4.0 4.0 4.0 Volume de H2O2 (30%, v/v) 2.0 2.0 2.0 2.0 SAP-03 SAP-02 SAP-05 SAP-23 Código do tubo de quartzo (microondas) Ordem de digestão (microondas) Frasco (g) 9 10 11 5 14.51187 14.39866 14.49453 14.49672 Frasco (g) + amostra digerida (g) (informativo) 14.39725 14.48646 Volume de HNO3 conc. (ml) 0.08 0.08 0.08 0.08 Volume H2O (ml) 4.00 4.00 4.00 4.00 Volume final de solução (ml) 4.08000 4.08000 4.08000 4.08000 Concentração de HNO3 na solução (%) Frasco + am. digerida + 80 mcl HNO3 conc. + 4 ml H2O (g) 1.96078 1.96078 1.96078 1.96078 18.50807 18.59695 Cálculo de concentração em volume Concentração Cu (g/ml) (2) 4.3694E-12 4.4398E-12 4.5864E-18 4.4386E-18 Concentração Cu (mg/ml) 4.3694E-09 4.4398E-09 4.5864E-15 4.4386E-15 Concentração Cu (mcg/ml) (ppm) 4.3694E-06 4.4398E-06 4.5864E-12 4.4386E-12 Concentração Cu (ppb) 4.3694E-03 4.4398E-03 4.5864E-09 4.4386E-09 Massa sol. (am. digerida + HNO3 conc. + H2O) (g) (3) -1.4512E+01 4.1094E+00 -1.4495E+01 4.1002E+00 Concentração Cu (g/g) (4) -1.2285E-12 4.4080E-12 -1.2910E-18 4.4167E-18 Concentração Cu (mg/g) -1.2285E-09 4.4080E-09 -1.2910E-15 4.4167E-15 Concentração Cu (mcg/g) (ppm) -1.2285E-06 4.4080E-06 -1.2910E-12 4.4167E-12 Concentração Cu (ppb) (continua) -1.2285E-03 4.4080E-03 -1.2910E-09 4.4167E-09 Cálculo de concentração em peso 33 Tabela 12 - Preparo das amostras para leitura no ICP-MS (2. experimento) CH12-1 CH12-2 Branco-1 Frasco (g) 14.47365 14.48331 14.48243 Frasco + amostra (g) 31.64437 32.31417 Amostra (g) (1) 17.17072 17.83086 -14.48243 Concentração Cu na potência CH (g/g) 1.00E-24 1.00E-24 1.72E-23 1.78E-23 Massa Cu na amostra (g) Evaporação do solvente Evaporação Evaporação Volume de HNO3 conc. (ml) 4.0 Volume de H2O2 (30%, v/v) Código do tubo de quartzo (microondas) 4.0 Branco-2 Branco-3 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 - - - 4.0 4.0 4.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 SAP-06 SAP-22 SAP-08 SAP-08 SAP-08 4 Ordem de digestão (microondas) 6 7 Frasco (g) 14.51247 14.38930 Frasco (g) + am. digerida (g) (informativo) 8 12 14.51736 14.38186 14.51634 14.39393 14.48243 14.51302 Volume de HNO3 conc. (ml) 0.08 0.08 0.08 0.08 0.08 Volume H2O (ml) 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00 Volume final de solução (ml) 4.08000 4.08000 4.08000 4.08000 4.08000 Concentração de HNO3 na solução (%) Frasco + am. digerida + 80 mcl HNO3 conc. + 4 ml H2O (g) 1.96078 1.96078 1.96078 1.96078 1.96078 18.62462 18.50548 18.58878 18.62292 Cálculo de concentração em volume Concentração Cu (g/ml) (2) 4.2085E-24 4.3703E-24 0.0000E+00 0.0000E+00 0.0000E+00 Concentração Cu (mg/ml) 4.2085E-21 4.3703E-21 0.0000E+00 0.0000E+00 0.0000E+00 Concentração Cu (mcg/ml) (ppm) 4.2085E-18 4.3703E-18 0.0000E+00 0.0000E+00 0.0000E+00 Concentração Cu (ppb) 4.2085E-15 4.3703E-15 0.0000E+00 0.0000E+00 0.0000E+00 Cálculo de concentração em peso Massa sol. (am. digerida + HNO3 conc. + H2O) (g) (3) 4.1122E+00 4.1162E+00 1.8589E+01 4.1056E+00 1.4382E+01 Concentração Cu (g/g) (4) 4.1756E-24 4.3319E-24 0.0000E+00 0.0000E+00 0.0000E+00 Concentração Cu (mg/g) 4.1756E-21 4.3319E-21 0.0000E+00 0.0000E+00 0.0000E+00 Concentração Cu (mcg/g) (ppm) 4.1756E-18 4.3319E-18 0.0000E+00 0.0000E+00 0.0000E+00 Concentração Cu (ppb) 4.1756E-15 4.3319E-15 0.0000E+00 0.0000E+00 0.0000E+00 4.3.2 RESULTADOS E DISCUSSÕES As leituras no ICP-MS não puderam ser realizadas, tendo em vista que a análise do branco já resultou em leitura muito alta no aparelho (em torno de 60.000 contagens), enquanto as amostras de matrizes homeopáticas mais diluídas (9 CH e 12 CH) resultaram em contagens próximas àquelas permitidas para o aparelho (cerca de 300.000). A principal justificativa para este resultado é a interferência do peróxido de hidrogênio usado na abertura da amostra (a embalagem indica um conteúdo de até 20 ppb de cobre). A interferência pelo ácido nítrico foi descartada, tendo em vista que este ácido foi destilado três vezes antes do uso. 34 5 CONCLUSÕES Foram planejados experimentos para determinação de cobre em matrizes homeopáticas (3 CH a 12 CH) utilizando técnicas sensíveis para determinação de metais: ICP-OES e ICP-MS. Com base no cálculo de concentração de cobre nas matrizes homeopáticas, nos procedimentos propostos para preparo das amostras e nos limites de detecção/quantificação esperados para estes aparelhos (ppb a ppt), havia uma expectativa de que o ICP-OES e o ICP-MS permitissem a quantificação do cobre até as potências 4 CH, 5 CH ou 6 CH, lembrando que o ICP-MS é ainda uma técnica mais sensível que o ICP-OES. No entanto, os experimentos planejados não levaram a resultados satisfatórios, tendo em vista que: - Os diferentes tipos de procedimentos utilizados para preparo farmacotécnico das diferentes matrizes homeopáticas exigem diferentes procedimentos laboratoriais para o preparo de amostras para leitura nos aparelhos analíticos. Neste estudo, foram adquiridas: matriz sólida (3 CH), matriz líquida em álcool a 20 % contendo 1 % de lactose (4 CH) e outras matrizes líquidas em álcool a 70 % com menor concentração de lactose (5 CH, 6 CH, 9 CH e 12 CH). Estas diferentes matrizes demandaram diferentes abordagens para o tratamento de amostras. - A digestão da lactose nas amostras, que é um requerimento antes da injeção em aparelhos analíticos de alta sensibilidade como ICP-OES e ICP-MS, mostrou-se mais complicada do que esperado. Não foi possível realizar a digestão somente em ácido nítrico, sendo necessário utilizar sistema de digestão assistido por microondas. - O etanol presente nas amostras líquidas também é um importante interferente nas análises por ICP-OES e ICP-MS, já que pode levar a um resfriamento do plasma. No caso da leitura no ICP-OES, foi possível a injeção direta das matrizes 5 CH e 12 CH em etanol a 70 % devido à presença do nebulizador ultrassônico, que retira solventes, e ainda também por se considerar que o teor de lactose nestas diluições já era baixo o suficiente para não causar danos ao aparelho. No entanto, a presença do álcool nas amostras é sabidamente 35 responsável por queda significativa na sensibilidade do ICP-OES, o que pode justificar a ausência de sinal para a leitura direta da matriz 5 CH. - O número de etapas para preparo de amostras foi alto em alguns casos, o que aumentou as chances de erro, perda do metal e também contaminação. - As baixíssimas concentrações de cobre nas matrizes aumenta a importância do uso de reagentes de alta qualidade (ultra-puros) (OLESZCZUK et al., 2007). Tais reagentes são caros e nem sempre estão disponíveis no laboratório. Para a última análise realizada no ICP-MS, por exemplo, na qual as amostras foram digeridas em microondas em presença de ácido nítrico concentrado e peróxido de hidrogênio 30 % v/v (2:1), os altos valores obtidos para a leitura do branco e também para as amostras de matrizes mais diluídas (9 CH e 12 CH) indicaram a contaminação em alguma etapa do preparo, por exemplo através do cobre presente no peróxido de hidrogênio. Conclui-se, portanto, que o ICP-MS é mais indicado para a análise de matrizes homeopáticas que o ICP-OES, por ser mais sensível, e que a técnica de preparo de amostras descrita para o experimento 2 (ICP-MS) está correta mas deve ser otimizada através de uma das seguintes alternativas: 1) uso de peróxido de hidrogênio de alta pureza em relação ao cobre, ou 2) digestão sem uso de peróxido, ou seja, somente por adição de ácido nítrico concentrado (tri-destilado) e tratamento em microondas. 36 REFERÊNCIAS AFBH. Manual de Normas Técnicas. 3. ed. São Paulo, 2003. AFONSO, I. Notas de aula de Farmacotécnica Homeopática I. Rio de Janeiro, 2009. BARNES, J. Quality, efficacy and safety of complementary medicines: fashions, facts and the future. Part I: Regulation and quality. British Journal of Clinical Pharmacology, v. 55, n. 3, p. 226-233, 2003. BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC 67. Dispõe sobre boas práticas de manipulação de preparações magistrais e oficinais para uso humano em farmácias. Diário Oficial da União, Brasília, 08 out. 2007. Disponível em: ˂http://www.anvisa.gov.br/legis/resol/2007/rdc/67_rdc_anexo.pdf˂. Acesso em: 08 dez. 2010. ENGELHARD, C.; SCHEFFER, A.; NOWAK, S.; VIELHABER, T.; BUSCHER, W. Trace element determination using static high-sensitivity inductively coupled plasma optical emission spectroscopy (SHIP-OES). Analytica Chimica Acta, v. 583, p. 319-325, 2007. FARMACOPÉIA HOMEOPÁTICA BRASILEIRA. 2. ed. Parte I. Métodos Gerais. São Paulo: Atheneu, 1997. FARMACOPÉIA HOMEOPÁTICA BRASILEIRA. 2. ed. Parte II. 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