GUERRA, P.A.; VIEIRA, L.J.; FERREIRA, C.F.; SOUZA, F.V.D. Indexação do PMWaV via RT-PCR em acessos do BAG abacaxi para
fins de crioterapia. In: II Simpósio da Rede de Recursos Genéticos Vegetais do Nordeste, 2015, Fortaleza. Anais do II Simpósio da
RGV Nordeste. Fortaleza, Embrapa Agroindústria Tropical, 2015 (R 75).
Indexação do PMWaV via RT-PCR em acessos do BAG abacaxi para fins de
crioterapia
Patrícia Araújo Guerra1; Lívia de Jesus Vieira2; Claudia Fortes Ferreira3; Fernanda Vidigal Duarte
Souza3
1
Estudante de Mestrado. Universidade Federal do Recôncavo da Bahia (UFRB), Centro de Ciências Agrárias,
2
Ambientais e Biológicas (CCAAB). CEP: 44380-000, Cruz das Almas, BA. [email protected]; Bolsista de PósDoutorado FAPESB/CAPES/Embrapa Mandioca e Fruticultura. Rua Embrapa, s/n. CEP: 44380-000, Cruz das Almas,
3
BA. [email protected]; [email protected]; Embrapa Mandioca e Fruticultura. Rua Embrapa, s/n.
CEP: 44380-000, Cruz das Almas, [email protected]; [email protected]
Palavras chaves: ananas, limpeza viral, Pineapple Mealybug Associated Virus.
Introdução
A murcha-do-abacaxizeiro, ou vermelhão do abacaxizeiro, é causada pelo vírus Pineapple
mealybug wilt-associated virus (PMWaV), em associação com cochonilhas das espécies Dysmicoccus ssp.
Atualmente considera-se o PMWaV um complexo de vírus (PMWaV-1, PMWaV-2, PMWaV-3, PMWaV-4 e
PMWaV-5 ), que tem o abacaxizeiro como seu único hospedeiro conhecido (VENTURA; COSTA, 2002). A
doença causa perdas significativas em vários países produtores, e no Brasil, começa a se tornar um
problema. O Banco Ativo de Germoplasma de abacaxi da Embrapa Mandioca e Fruticultura (BAG abacaxi)
têm sido severamente ameaçados nos últimos anos devido à presença deste complexo viral. Várias ações
de limpeza e prevenção estão em andamento, incluindo o cultivo de meristema e ensaios preliminares de
crioterapia. A crioterapia de meristemas é um método baseado nas técnicas de criopreservação e que pode
promover a morte de células infectadas, por injúrias causadas pelo congelamento. Pode proporcionar
plantas livres vírus com elevada eficiência (YOUNES et al., 2014) e vem sendo utilizada para várias
culturas. Entretanto, para o estabelecimento do protocolo de crioterapia, é necessário diagnosticar a
presença do vírus antes e após o procedimento. Uma das técnicas para o diagnóstico viral atualmente
utilizada é a RT-PCR (reação em cadeia da polimerase associada à transcrição reversa), utilizando
oligonucleotídeos (primers) específicos para cada uma das espécies virais. Assim, o objetivo deste trabalho
foi avaliar a incidência do PMWaV-1,2,3 em 5 acessos do BAG da Embrapa Mandioca e Fruticultura e
proceder a ajustes no protocolo de limpeza viral para melhorar sua eficiência.
Material e Métodos
Como material vegetal foram utilizadas folhas de 5 acessos (BGA 265, BGA 332, BGA 335,
BGA 365 e BGA 366) todos pertencentes à variedade botânica Ananas comosus var. comosus e
provenientes do BAG Abacaxi. Esses acessos foram selecionados por apresentarem sintomas da infecção
por PMWaV em campo. Como controle negativo (livre de vírus) foi utilizado o acesso BGA 001 mantido in
vitro. (Tabela 1). As amostras foram inicialmente maceradas utilizando nitrogênio líquido. A extração do
RNA total foi realizada utilizando o protocolo CTAB (DOYLE; DOYLE, 1990) rápido em que se utiliza o
tampão de extração 2-mercaptoetanol a 2%, o PVP a 2% e o CTAB. As amplificações por PCR foram
preparadas com reagentes padronizados para PCR em tempo real e adicionado aos conjuntos de primers e
sonda específica para os genes de interesse. O produto das reações de PCR foi submetido à eletroforese
em gel de agarose a 1% e corados com brometo de etídio para a visualização e a confirmação da
amplificação.
Resultados e Discussão
Através da indexação foi possível notar a presença dos três tipos virais, inclusive com três dos
cinco acessos avaliados com infecção mista (Tabela 1 e Figura 1). A presença do PMWaV3 foi detectada
em todos os acessos, com exceção da planta controle. PERON at al. (2010) demonstrou a viabilidade do
uso da técnica de RT-PCR na indexação de plantas matrizes e material propagativo de abacaxizeiros. Os
resultados observados mostram que a técnica de RT-PCR utilizando primers específicos é útil para detectar
a infecção das plantas sendo o tempo de diagnóstico menor e menos oneroso. Após a confirmação da
presença do complexo viral nos acessos, as plantas serão encaminhadas para os procedimentos de
crioterapia, que envolvem o cultivo de meristema em dimensões muito reduzidas (< que 0,5 mm) e seu
congelamento de acordo com os procedimentos de criogenia usados na criopreservação do abacaxi (Souza
et al, NO PRELO).
II Simpósio da Rede de Recursos Genéticos Vegetais do Nordeste
Fortaleza, 10-13 de novembro de 2015
Valorização e Uso das Plantas da Caatinga
Tabela 1 - Acessos do Banco de Germoplasma de Abacaxi, classificação botânica e Indexação para
PMWaV-1,2,3 por RT-PCR. Embrapa Mandioca e Fruticultura. Cruz das Almas.
Acessos
Controle 001
BAG265
BAG332
BAG335
BAG365
BAG366
PMWaV1
Negativo
Positivo
Positivo
Negativo
Negativo
Positivo
PMWaV2
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Positivo
Negativo
PMWaV3
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Figura 1 –Produtos da RT-PCR por eletroforese em gel de agarose 1% (M) Marcador de peso molecular
1kb, (C) Controle negativo. ((1 - BGA 265, 2 - BGA 332, 3 - BGA 335, 4 - BGA 365 e 5 - BGA 366)
Conclusão
A indexação realizada foi eficiente para a detecção dos três tipos virais nos acessos estudados
com casos de infecção mista. Este diagnóstico é imprescindível para estabelecer um protocolo de
crioterapia com a finalidade de regenerar plantas livres de vírus.
Referências
DOYLE, J. J.; DOYLE, J. L. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, v. 12, n. 1, p. 13-15, 1990.
PERON, F.N.; FERNANDES, P.M.B.; VENTURA, J.A. Detecção de PMWAV-1 e PMWaV-2 em
abacaxizeiros no Estado do Espírito Santo. Tropical Plant Pathology. Lavras-MG, v.34 (suplemento),
p.268, 2009.
VENTURA, J.A. & H. COSTA. Manejo integrado das doenças de fruteiras tropicais: Abacaxi, banana e
mamão, p. 279-352. In L. Zambolim (ed.) Manejo integrado; fruteiras tropicais - doenças e pragas. Viçosa,
UFV, 672p, 2002.
YOUNES, N. A.; ALY, MM El-Sheikh; ABOUL-NASR, M. H. Heat and freezing pre-thermal treatments as a
means of freeing potatoes from mosaic virus and its effects on potato plants quality characters. Journal of
Phytopathology and Pest Management, v. 1, n. 2, p. 44-52, 2014
II Simpósio da Rede de Recursos Genéticos Vegetais do Nordeste
Fortaleza, 10-13 de novembro de 2015