Universidade Estadual de Feira de Santan a Departamen to de Ciências Bio lógi cas P rogram a de P ós­gradu ação em Bio tecn ologia LABIO, Sala 06 – Campus Universitário. CEP 44036­900 Fone / FAX: (75)3161.8132 E­mail: [email protected] Homepage: www.uefs.br/ppgbiotec RESUMO A cultura de cacau (Theobroma cacao ), no sul da Bahia, vem sofrendo grandes prejuízos econômicos, desde o surgimento nesta região, em 1989, do fungo patogênico causador da vassoura­de­bruxa do cacaueiro, o Moniliophthora perniciosa . Um dos principais componentes da parede celular fúngica é a quitina, que é sintetizada através da conversão da UDP­N­acetil­glicosamina­6­P pela ação da enzima sintase da quitina (EC 2.4.1.16). Esta enzima pode ser um alvo para o controle deste fungo fitopatogênico, já que a quitina está presente na parede celular de fungos e não ocorre na parede celular de plantas. O gene que codifica a sintase da quitina em M. perniciosa foi identificado e caracterizado, e construiu­se um modelo tridimensional teórico do seu produto gênico. O presente estudo teve como objetivos: (i) caracterização ao nível gênico da sintase da quitina, (ii) clonagem e expressão heteróloga deste gene, (iii) construção de um modelo 3D da proteína por modelagem comparativa, (iv) realização de triagem virtual para a identificação de potenciais inibidores desta enzima,(v) realização de simulações de dinâmica molecular com os inibidores que apresentaram os melhores resultados e (vi) teste in vitro dos inibidores mais promissores selecionados após as análises in silico . Pretende­se que os resultados subsidiem a identificação de novos compostos ou de modificações químicas de compostos existentes, direcionados à inibição da síntese de quitina na parede celular das hifas do M. perniciosa e, consequentemente, aponte­se mais uma alternativa ao controle da vassoura­de­bruxa do cacaueiro. A sequência do gene completo é de 3.443 pb, interrompidos por 13 íntrons pequenos,compreendendo um cDNA que codifica uma proteína com 913 aa com todos os motivos e dominiostipicamente encontrados em sintases de quitina de classe III. Verificou­se a maior expressão deste gene na fase de vassoura seca quando avaliado in vivo (na planta) e, nas fases necrotrófica e biotrófica quando avaliado o desenvolvimento in vitro. A clonagem e expressão foram realizadas em células BL21 (DE3) e a verificação da expressão foi feita em gel SDS­PAGE. Na área de Modelagem Molecular, construiu­se um modelo 3D por homologia comparativa, que foi validado pelo gráfico de Ramanchandran e ANOLEA, Esse modelo 3D validadoposteriormente, utilizado para triagem virtual, com informações de ligantes da literatura, confrontados com o banco de dados Zinc 12 e com o banco de dados NatProDB, do qual os testes in vitro apontaram algumas cumarinas como efetivas contra o M. perniciosa . Palavr as­chave: Moniliophthora perniciosa , sintase da quitina, clonagem, expressão, Modelagem Molecular, triagem virtual, inibidores.
1