Anais do XVII Encontro de Iniciação Científica – ISSN 1982-0178
Anais do II Encontro de Iniciação em Desenvolvimento Tecnológico e Inovação – ISSN 2237-0420
25 e 26 de setembro de 2012
DESENVOLVIMENTO DE UM BIOSSENSOR POTENCIOMÉTRICO
PARA A DETERMINAÇÃO DE TRIGLICERÍDEOS EM BIODIESEL
Barbara Paulino Moino
Renata K. Mendes Valente
Faculdade de Química
CEATEC
[email protected]
Metrologia Química, Quimiometria e Química Analítica
CEATEC
[email protected]
Resumo: Uma fonte energética renovável, alternativa aos combustíveis fósseis, que tem recebido bastante atenção é o biodiesel, por apresentar características similares e, em alguns casos, até melhores
que o diesel mineral. No entanto, para garantir o controle da qualidade deste biocombustível, a Agência
Nacional do Petróleo e Biocombustiveis (ANP), estabelece limites considerados adequados para manter
suas características químicas e físico-químicas. Atualmente, a técnica cromatográfica é a mais utilizada
para a determinação dos níveis dos produtos no biodiesel. Porém, é conhecido que métodos cromatográficos são bastante dispendiosos, de custo elevado
para a compra e manutenção, além da necessidade
de pessoal treinado para realização das medidas. O
uso de biossensores (sensores químicos que possuem como elemento de reconhecimento um material
biológico) é uma alternativa interessante para o controle da qualidade, devido à sua relativa simplicidade
de utilização e grande sensibilidade nos resultados.
Neste contexto, este trabalho tem como objetivo a
quantificação de glicerídeo no biocombustível, usando um biossensor modificado com a enzima peroxidase, uma vez que o glicerídeo pode ser decomposto
a peróxido de hidrogênio através de sucessivas reações enzimáticas.
Palavras-chave: biossensor eletroquímico, biodiesel, peroxidase, triglicerídeo
Área do Conhecimento: Ciências Exatas e da Terra– Química – CNPq.
1. INTRODUÇÃO
O conceito de biodiesel adotado pelo Programa
Brasileiro de Biodiesel é: "um combustível obtido a
partir de misturas, em diferentes proporções, de diesel fóssil e alquil ésteres de óleos vegetais ou gorduras animais". Existem várias opções de fontes de
óleos vegetais. No Brasil, o óleo de soja é uma fonte
para a produção de biodiesel. No entanto, outras matérias-primas, tais como girassol, de amendoim, de
algodão, óleo de palma, coco, de babaçu e, especialmente, óleo de rícino, podem ser utilizados no futu-
ro próximo, uma vez que o seu cultivo pode atingir
um aumento de escala econômica [1]. Além de possuir custo relativamente baixo e não poluir o ambiente ainda não possui associação à elevação do efeito
estufa, porque permite o ciclo fechado do carbono,
onde ele é absorvido quando a planta cresce e é liberado quando o biodiesel é queimado na combustão
do motor. Para garantir a qualidade do biodiesel é
necessário estabelecer padrões de qualidade, objetivando fixar teores limites dos contaminantes que não
venham prejudicar a qualidade das emissões da
queima, bem como o desempenho, a integridade do
motor e a segurança no transporte e manuseio [2].
O biodiesel atualmente é encontrado misturado ao
óleo diesel nos postos de abastecimento. A presença
de glicerol livre (GL) e de glicerídeos, quantificados
indiretamente pelo glicerol total (GT), no produto final
pode, em níveis elevados, levar à formação de depósitos no motor, daí a necessidade de serem monitorados e controlados [3].
Dentre todos os procedimentos disponíveis para
análise de GL e GT, os métodos cromatográficos são
os mais usados. Embora sejam sensíveis, as técnicas cromatográficas não apresentam simplicidade,
necessitando de profissionais capacitados, as análises são lentas e trabalhosas, uma vez que exigem
minucioso preparo da amostra, além de serem de
alto custo, por conta dos reagentes de alta pureza e
manutenção das colunas. Uma alternativa bastante
eficiente para a obtenção de parâmetros analíticos
da qualidade de um determinado produto é a utilização de biossensores, devido à sua facilidade de utilização, alta seletividade e grande sensibilidade nos
resultados [4].
Os biossensores são sensores modificados com
material biológico intimamente ligado à superfície de
um transdutor. Quando este material é uma enzima,
estes sensores são denominados biossensores enzimáticos, que, entre outros, podem fazer uso da atividade enzimática como sinal analítico a ser monitorado [5]. A grande aplicabilidade está relacionada às
vantagens referentes aos biossensores, podendo-se
destacar: sensibilidade, respostas rápidas e baixo
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custo, alta especificidade, detecção de baixas concentrações do analito, número variável de enzimas
disponíveis comercialmente, além de uma variedade
de metodologias empregadas na construção destes
sensores biológicos [6].
Baseado nisso, o objetivo do Plano de Trabalho de Iniciação Científica foi a determinação de glicerídeos em amostras de biodiesel, utilizando-se um
biossensor eletroquímico a base de enzimas peroxidase, extraída de vegetais.
2. METODOLOGIA
2.1. Materiais
Os equipamentos utilizados para a execução deste
projeto foram: Balança de precisão Shimadzu AW
220, Centrífuga Excelsa II Modelo 206 MP Fanem,
Espectrofotômetro UV/Vis HP Agilent 8453, pHmetro
Digimed DM 20 e Potenciostato PGSTAT 30
AUTOLAB (Metrohm).
Os reagentes utilizados foram: Solução Guaiacol 2% (Dinâmica), Peróxido de Hidrogênio P.A (Vetec), Óleo Mineral (Mantecorp), Fosfato de sódio bibásico heptahidratado P.A (Synth), Fosfato de potássio monobásico P.A (Synth), Pó de Grafite (Aldrich),
Ácido Acético P.A (Nuclear), Clorofórmio P.A
(J.T.Baker), Acetato de Sódio Anidro P.A (Dinâmica).
2.2. Obtenção do extrato enzimático
Ao nabos utilizados foram adquiridos em uma chácara da região de Campinas. Após a lavagem e secagem, 25 g de nabo descascado foram picadas e homogeneizadas em um liquidificador com 100 mL de
-1
tampão fosfato 0,1 mol.L – pH 7,0. Em seguida, o
extrato foi filtrado em quatro camadas de tecido –
gaze - e centrifugado a 1800 rpm durante 20 min. A
solução sobrenadante foi dividida em diversas alíquotas, armazenadas em freezer a -5°C e usadas como
fonte de peroxidase.
2.3. Início das atividades de desenvolvimento de
um sistema de imobilização em pasta de carbono
Como suporte, utilizou-se grafite devido ao seu baixo
custo, sua baixa capacidade de adsorção de oxigênio
e baixas impurezas eletroativas. A pasta de carbono
foi obtida homogeneizando 0,375 g de pó de grafite e
1950 unidades da concentração de enzima (unidades
-1
mL ), que corresponde a 200 µL do extrato enzimático, em um almofariz com pistilo durante 20 minutos.
Em seguida, foram adicionados 0,1848 g de óleo mineral (aglutinante) e homogeneizado por mais 20
minutos. Logo após, esta pasta foi embutida em seringas de 1 mL e fazendo contato elétrico com um fio
de cobre, estando prontos os biossensores para a
realização das leituras. Para realizar as leituras, utilizou-se o eletrodo de Ag/AgCl como referência, e o
biossensor como eletrodo indicador, conectados ao
potenciostato.
2.4. Estudo da influência da quantidade de peroxidase na resposta do biossensor.
Para este estudo foram construídos quatro biossensores diferentes, cada um contendo uma concentra-1
ção distinta de enzima:390, 780, 1950 e 3900 U mL .
O estudo foi realizado em um potenciostato, para
medidas voltamétricas (variação de corrente) em
função da quantidade enzimática.
2.5. Estudo da influência da proporção pó de grafite/óleo mineral na resposta do biossensor
Para este estudo foram construídos quatro biossensores diferentes, cada um contendo uma proporção
distinta de pó de grafite/óleo mineral: 45:65%,
50:50%, 75:25% e 90:10%. Este estudo também foi
realizado em um potenciostato, com medidas voltamétricas da variação da corrente em função do potencial.
2.6. Transformação dos glicerídeos em peróxido
de hidrogênio
O glicerídeo foi extraído do biodiesel utilizando-se o
método de extração segundo [3], ou seja, 5,0g de
biodiesel foram colocados em um funil de separação
e o glicerídeo foi extraído utilizando-se 2,0 mL de
água destilada e 2,0 mL de heptano. A fase orgânica
era aquela que continha o glicerídeo não reagido.
Após separação das fases, foi adicionado o reativo
enzimático presente no kit comercial da empresa
Laborlab para análise de triglicerídeos. As reações
que ocorrem são apresentadas abaixo:
Triglicerídeos
Lipase
Glicerol + Ácidos Graxos
Glicerol Quinase
Glicerol + ATP
Glicerol - 3 - fosfato + ADP
Glicerol 3fosfato-Oxidase
Glicerol 3-fosfato + O2
dihidroxiacetona +H2O2
O reativo enzimático é composto por: lípase (5000
U/L); glicerol quinase (250 U/L); glicerol 3-fosfato oxidase (1500 U/L) e ATP (quantidade não informada).
Após uso do kit, os glicerídeos presentes no biodiesel
são convertidos a peróxido de hidrogênio e, posteriormente, analisados por um biossensor contendo a
enzima peroxidase, cujo substrato é o peróxido formado.
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2.8. Transformação dos glicerídeos em peróxido
de hidrogênio
Para esta análise, utilizou-se a solução de peróxido
de hidrogênio formado após aplicação do reativo enzimático do kit da empresa Laborlab, conforme descrito anteriormente. O H2O2 foi extraído da fase orgânica para a fase aquosa utilizando-se uma solução
contendo 6 mL de ácido acético 0,01 M e 9 mL de
clorofórmio. Foram necessárias 4 extrações para
garantia de que todo peróxido havia sido extraído.
Esta etapa foi necessária, pois o biossensor não
conseguiria realizar as medidas na fase orgânica,
pois poderia haver a lixiviação da pasta de carbono
na solução, uma vez que é feita a partir de óleos minerais.
Como as extrações foram realizadas em meio ácido,
o pH foi acertado para 6,5 com acetato de sódio para
que ficasse mais próximo do pH ótimo da enzima.
Após esta etapa, foi adicionado guaiacol à solução e
medido a quantidade de peróxido de hidrogênio presente, em triplicata. Com a equação da reta obtida na
curva de calibração, a média dos valores de corrente
obtida na medida descrita acima foi substituída no y e
calculou-se o valor de x que corresponde à quantidade de peróxido presente. Como a reação de formação de peróxido mostra que a reação é 1:1, a quantidade de peróxido obtida corresponde estequiometricamente à quantidade de glicerídeo presente.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3. 1. Estudo da resposta do biossensor em relação ao seu substrato.
O preparo do biossensor para medidas potenciométricas não gerou resultados significativos. Assim, optou-se por modificar a técnica de transdução de sinal
para a voltametria (medidas de corrente). Porém, não
há perdas com a mudança da técnica, uma vez que o
método continua sendo eletroquímico. Para testar a
resposta do biossensor em relação ao substrato da
enzima peroxidase, foram realizadas medidas voltamétricas com o dispositivo apenas em tampão fosfato 0,1 mol.L-1 , pH 7,0 e, após a medição do sinal,
houve a adição de uma solução de peróxido de hidrogênio e uma nova resposta foi obtida. A Figura 1
exibe os resultados.
0
-5
I / µA
2.7 Obtenção da curva de calibração
Como as extrações de peróxido de hidrogênio obtido
pela reação enzimática foram realizadas utilizando-se
ácido acético, a curva de calibração foi realizada não
em tampão fosfato, mas em solução de ácido acético
0,01 mol L-1. No entanto, essa solução possui um pH
muito baixo para que a enzima mantenha sua atividade normal. Assim, o pH da solução foi corrigido
utilizando-se acetato de sódio até 6,5. Após, foi realizada a curva de calibração, adicionando-se concentrações crescentes de peróxido de hidrogênio a esta
solução e realizando as medidas voltamétricas, contendo guaiacol 0,04% com volume constante. As
concentrações de H2O2 no sistema variam de 1,16 a
-1
9,35 mmol L . Depois de concluídas todas as medições, construiu-se uma curva de calibração, onde o
eixo y corresponde à corrente em microampéres (µA)
e o eixo x a concentração de peróxido de hidrogênio
em mmol.L-1 e obteve-se a equação da reta.
-10
-15
p rese nça do substrato
solução ta mpã o fosfato pH 7,0
-20
-300
-2 00
-1 00
0
1 00
200
E / mV
Figura 1. Comportamento do biossensor em solução contendo peróxido de hidrogênio.
3. 2. Estudo da influência da concentração de peroxidase na resposta do biossensor.
Este estudo inicia o processo de otimização das condições experimentais do sistema. A concentração da
enzima peroxidase no desenvolvimento do dispositivo é um parâmetro importante. De maneira geral,
baixas concentrações de enzima não são suficientes
para completar eficientemente a reação enzimática.
No entanto, altas concentrações podem causar problemas na estabilidade do biossensor. Assim, foi realizado este estudo para verificação da quantidade de
enzima que fornece o valor máximo de resposta, que
será utilizada na construções dos biossensores nos
estudos subsequentes.
Para isso, foram construídos quatro biossensores
com concentrações distintas de enzima: 390, 780,
-1
1950 e 3900 U mL . Os resultados dessa influência
podem ser claramente observados na Figura 2, em
medidas voltamétricas dos biossensores em solução
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10
0
-10
I / µA
-20
-30
-40
-1
390 U mL
-1
780 U mL
-1
1950 U mL
-1
3900 U mL
-50
-60
-70
-300
-200
-100
0
100
200
E / mV
Figura 2. Resultados do estudo da influência da concentração da enzima na resposta do biossensor em solução
tampão fosfato pH 7,0 contendo solução de peróxido de
hidrogênio e guaiacol 0,04%.
3. 3. Estudo da influência da proporção pó de grafite/óleo mineral na resposta do biossensor.
A proporção de pó de grafite e óleo mineral na construção de biossensor a base de pasta de carbono é
um fator que influencia no desempenho do dispositivo. Isso porque muito material aglutinante torna a
pasta fluida e impede que seja inserida de maneira
eficiente na seringa. No entanto, baixas quantidades
tornam a pasta quebradiça, permitindo que saia facilmente da seringa e fique na solução. Já o grafite é
um material condutor e essencial para medidas eletroquímicas. Porém, baixos teores não permitem boa
condução do sinal, interferindo de maneira direta na
resposta do dispositivo.
A resposta dessa influência foi estudada para quatro
biossensores contendo proporções distintas de pó de
grafite/óleo mineral: 90:10%, 75:25%, 50:50% e
45:65%. Os resultados podem ser observados na
Figura 3 para medidas voltamétricas realizadas em
-1
solução tampão fosfato 0,1 mol L pH 7,0 contendo
-1
45 mmol L de peróxido de hidrogênio e guaiacol
0,04%.
20
10
0
-10
I / µA
-20
-30
-40
-50
-60
45% / 65%
50% / 50%
75% / 25%
90% / 10%
-70
-80
-90
-300
-200
-100
0
100
200
E / mV
Figura 3. Resultados do estudo da influência da proporção pó de grafite/óleo mineral na resposta eletroquímica
-1
do biossensor em solução tampão fosfato 0,1 mol L contendo peróxido de hidrogênio e guaiacol 0,04%.
3. 4. Curva Analítica
Depois de otimizados todos os parâmetros analíticos,
foi possível a obtenção de uma curva de calibração,
que será utilizada posteriormente na análise em biodiesel. A curva de calibração proposta foi construída
com a introdução do eletrodo na solução contendo
-1
ácido acético 0,01 mol L e acetato de sódio até pH
igual a 6,5 e com sucessivas adições de peróxido de
hidrogênio e realizando medidas voltamétricas, contendo guaiacol 0,04% com volume constante (Figura
4).
4.5
4.0
3.5
I / µA
-1
tampão fosfato 0,1 mol L pH 7,0 contendo 45mmol
-1
L de peróxido de hidrogênio e guaiacol 0,04% .
3.0
2.5
2.0
1.5
0
2
4
6
8
concentração H2 O2 / mmol L
10
-1
Figura 4. Resultado das adições sucessivas de peróxido
de hidrogênio em tampão acetato pH 6,5 e das medidas
voltamétricas, contendo guaiacol 0,04% com volume
constante
Por meio da curva acima foi possível obter a equação
-6
-4
da reta: y (A) = 1,25499.10 + 3,23943.10 x com
coeficiente de correlação de 0,99888.
3. 5. Aplicação do biossensor para análise de glicerídeos em amostras de biodiesel
Como não é possível se determinar diretamente a
concentração de glicerídeo no biodiesel utilizando-se
os biossensores, foi necessário converte-los em uma
substância que pudesse ser medida com o dispositivo. Como o biossensor é a base de enzima peroxidase, uma conversão interessante seria do glicerídeo
em peróxido de hidrogênio (que é o substrato da enzima). Por isso, foi utilizado um kit enzimático, onde
os glicerídeos presentes neste biocombustível foram
convertidos a peróxido de hidrogênio e assim foi
possível realizar sua medição. Outra consideração
importante, é que este biossensor não pode ser usado em solventes orgânicos, pois pode haver lixiviação da pasta de carbono (que é preparada com óleo
mineral) para a solução. Como o kit enzimático foi
utilizado em solução de heptano, foi necessário realizar um novo processo de extração do H2O2 para que
este fosse transferido a uma fase aquosa. Este processo foi realizado utilizando-se uma mistura de áci-
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-1
do acético 0,01 mol L e clorofórmio (3:1). Após extração do substrato, o pH do meio foi ajustado para
6,5 com acetato de sódio e foi adicionado guaiacol
0,04%. Assim, determinou-se a quantidade de peróxido presente nesta amostra. As medidas foram realizadas em triplicata, cujo valor médio foi de
-6
2,73027266.10 A.
Substituindo-se este valor na equação da reta achamos a concentração de peróxido de hidrogênio na
-3
-1
fase aquosa: x = 4,55.10 mol L .
Com a concentração de peróxido encontrada e
sabendo-se que o volume de amostra utilizado foi de
5mL pode-se calcular o número de mols do mesmo:
-5
n = 2,275.10 mols.
Levando em conta que o biodiesel utilizado era de
óleo de soja podemos e que 1 mol de óleo de soja
apresenta 884g de glicerídeo, pode-se afirmar que a
massa de glicerídeo é de x = 0,020111g.
Com esse resultado podemos calcular a porcentagem de massa/massa desse contaminante no biodiesel analisado, uma vez que a quantidade inicial de
biodiesel pesada foi de 5 g encontrando o valor de
0,402% m/m.
Observando os cálculos nota-se que estão levemente fora do padrão. Se analisar a porcentagem
massa/massa que é de 0,402% e comparar com a
estipulada pela Agência Nacional de Petróleo, Gás
Natural e Biocombustíveis (ANP) onde limita o teor
máximo de glicerol total (GT) em 0,25% m/m, verifica-se que está um pouco acima do limite. Esta diferença pode ser atribuída devido ao fato de que o biodiesel analisado não é comercial, mas obtido por um
aluno de iniciação científica deste mesmo Grupo de
Pesquisa. Assim, acredita-se que este parâmetro
pode não ter sido totalmente controlado.
4. CONCLUSÕES
Com o uso do biossensor a base de enzimas peroxidase obtidas com extrato de nabo, foi possível determinar o teor de triglicerídeos em amostras de biodiesel, após as otimizações das condições experimentais. O dispositivo apresentou boa precisão nas
medidas e é bastante reprodutível. Mostrou-se como
uma alternativa de baixo custo para a detecção dessa substância no biocombustível.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Lauro Kubota (IQ-UNICAMP), à PUCCampinas e ao CNPq pela bolsa concedida.
REFERÊNCIAS
[1] Pinto, A. C.; Guarieiro, L. L. N.; Rezende, M. J.
C.; Ribeiro, N. M.; Torres E. A.; Lopes, W. A.; Pereira, P. A.; de Andrade, J. B.; (2005) J. Braz.
Chem. Soc., Vol. 16, No. 6, p. 1313-1330.
[2] Lôbo, I.P.; Ferreira, S.L.C.; Cruz, R.S. (2009).
Quim. Nova, Vol. 32, No. 6, 1596-1608.
[3] Valdez, H.C.; R.S.A.; F.C.S.; D’Elia, E. (2012).
Quim. Nova. Vol. 35, No. 3, p. 601-607.
[4] Viswanathan S.; Radecka, H.; Radecki, J. (2009).
Monatsh Chem. Vol. 140, p. 891-899.
[5] Marques, P.R.B.O.; Yamanaka, H. (2008)
Quim.Nova, Vol. 31, p.1791-1799.
[6] Lima, R.S.; Nunes, G.S. (2007). Quim. Nova Vol.
30, No.1, p. 9-17.