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OPERAÇÃO DOS CROMATÓGRAFOS A
LÍQUIDO: HPLC SERIE 200 / UHPLC
FLEXAR
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1. INTRODUÇÃO
O cromatógrafo a líquido é um equipamento que possui a função de identificar e quantificar analitos
orgânicos nas mais diversas matrizes, incluindo as de origem biológica (urina, soro, plasma, etc.). O
cromatógrafo pode ser composto por cinco partes: a bomba, o detector, o autosampler, o forno da coluna e o
degaseificador.
A bomba é a parte do equipamento que bombeará a fase móvel utilizada na análise através de tubulação e
coluna específicas. Nesta coluna ocorrerá a separação das substâncias presentes na matriz analisada.
A bomba pode ser isocrática ou binária. A bomba isocrática possui um único canal, ou seja, é capaz de
bombear uma única solução (fase móvel) para o sistema cromatográfico. A bomba binária possui 2 canais (A e
B), ou seja, consegue bombear duas soluções diferentes para o sistema cromatográfico ao mesmo tempo,
sendo possível determinar a percentagem de cada uma destas soluções através do painel de comando da
própria bomba ou através do software utilizado.
O detector é capaz de captar a presença do analito na solução de análise no momento que a mesma chegar
ao seu caminho ótico por meio da absorção e/ou transmissão de energia num determinado comprimento de
onda. Segunda a lei de Beer, as energias absorvida e transmitida são, respectivamente, diretamente e
inversamente proporcionais à sua concentração do analito na solução de análise. A magnitude desta variação
de energia será expressa em concentração massa/volume pelo software de trabalho.
A injeção das amostras, quando feita manualmente, se dá por meio de uma seringa específica para
HPLC/UHPLC em um loop de injeção externo. Quando se trata de injeção automatizada, a mesma é feita por
meio de um autosampler. Os UHPLCs Flexar possuem autosampler com bandeja refrigerada (Peltier). A
depender da natureza dos extratos analisados, é necessária a refrigeração para evitar que o analito de
interesse se degrade e/ou que o solvente utilizado no extrato evapore.
O forno da coluna tem como função aquecer a mesma. Isto porque, algumas separações cromatográficas são
mais eficientes quando se processa a temperaturas superiores à temperatura ambiente.
O degaseificador a vácuo tem por função retirar microbolhas presentes na fase móvel antes que a mesma
chegue à coluna de separação.
As colunas utilizadas nas análises dependerão do que se quer separar, identificar e quantificar na rotina
analítica e de qual equipamento será utilizado para tal. Para a maioria das análises de interesse toxicológico
em saúde ocupacional, as colunas RP-8 e RP-18 de 5 um podem ser empregadas. As colunas RP-18 de 2 um
suporta pressões maiores e, por conseguinte, separam os analitos num tempo bem menor do que o usual.
2. ABRANGÊNCIA
Setor de toxicologia.
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3. SIGLAS E DEFINIÇÕES
HPLC (high-Performance Liquid Chromatography): cromatógrafo a líquido que trabalha a pressões máximas
de 6000 psi e com colunas de micragem de 5 um;
UPLC (ultra Performance Liquid Chromatography): cromatógrafo a líquido que trabalha a pressões máximas
de 18000 psi e com colunas de micragem de 2 um. Os tempos de retenção são muito menores do que os
obtidos pelo HPLC;
Autosampler: amostrador automático;
Detector PDA: detector de arranjo de diodos;
Detector FL: detector de fluorescência;
Detector UV/Vis: detector que trabalha nas áreas espectrais do ultravioleta e do visível;
Coluna RP-18 5 um: coluna de separação cromatográfica octadecilsilano de 5 micrômetros.
Coluna RP-8 5 um: coluna de separação cromatográfica octasilano de 5 micrômetros.
Coluna RP-18 2 um: coluna de separação cromatográfica octadecilsilano de 2 micrômetros, utilizada em
UHPLC. Resiste a pressões de até 18000 psi.
Pescador: peça de metal com porosidade acoplada à extremidade de uma mangueira, cuja outra extremidade,
estará ligada à bomba do equipamento. Esta peça metálica estará imersa nas fases móveis e soluções de
lavagem do equipamento contidas em recipientes de vidro, em badejas montadas acima do autosampler ou
do detector.
4. ESPECIFICAÇÃO DO EQUIPAMENTO
a) HPLC Serie 200 manual: Trata-se do cromatógrafo de injeção manual da marca PerkinElmer modelo Serie
200, composto por uma bomba binária (n. série 291N7080401A), um detector UV/Vis (n. série 292N8052405
E) e um degaseificador.
b) HPLC Serie 200 autosampler: Trata-se do cromatógrafo de injeção automatizada da marca PerkinElmer
modelo Serie 200, composto por uma bomba isocrática (n. série 291N8051503A), um detector UV/Vis (n.
série 292N7080804A), um autosampler (n. série 293N8052906A) e um degaseificador.
c) UHPLC Flexar PDA: Trata-se do cromatógrafo de injeção automatizada da marca PerkinElmer modelo
Flexar, composto por uma bomba binária (n. série 291P2022206B), um detector PDA (n. série
292N2110904PX), um forno de coluna (n. OVHF 120815648), um autosampler (n. série 293H2092703B) e um
degaseificador.
d) UHPLC Flexar PDA-FL: Trata-se do cromatógrafo de injeção automatizada da marca PerkinElmer modelo
Flexar, composto por uma bomba binária (n. série 291P20222205B), um detector PDA (n. série
292N2111904PX), um detector de fluorescência (n. série 2414024), um forno de coluna (n. série OVHF
120715627) e um degaseificador.
5. MANUTENÇÕES
a) Diária: Durante a manutenção diária destes equipamentos, deve-se realizar as seguintes ações:
• Realizar a purga do sistema para a retirada de bolhas maiores do que aquelas capazes de serem
removidas pelo degaseificador;
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• Lavar a coluna de separação por, pelo menos, 20 min com uma solução de metanol grau HPLC / água
destilada1:1
• Trocar a fase móvel ou refiltrá-la antes da análise;
• Trocar a solução de lavagem (metanol / água destilada 1:1) da probe que encontra-se no autosampler do
equipamento.
• Realizar lavagem da probe do autosampler utilizando o comando Flush Autosampler no software.
Quando se tratar do HPLC Serie 200 autosampler, pode-se também realizar a lavagem da probe pressionado o
botão Flush na parte frontal do equipamento.
• Anotar as manutenções realizadas nas planilhas LAB-107-VR02, LAB-108-VR02, LAB-109-VR02, LAB-110VR02 para o HPLC Serie 200 autosampler, Serie 200 manual, UHPLC Flexar PDA e UHPLC Flexar PDA_FL
respectivamente.
1 OBS: Semanalmente, deve-se descartar o esgoto do equipamento assim como verificar o estado da coluna e
pré-coluna do equipamento; caso seja necessário, deve-se proceder a sua troca. Registrar as manutenções
dos equipamentos nas suas respectivas planilhas LAB-135-VR01; LAB-136-VR01; LAB-137-VR01 e LAB-138VR01.
b) Preventiva: As manutenções preventivas assim como os testes de desempenho são realizados pela
Perkin-Elmer anualmente e os períodos em que as preventivas ocorrem são acordados entre esta e o analista
responsável pelo setor.
c) Corretiva: As manutenções corretivas são realizados pela Perkin-Elmer, conforme contrato de
manutenção entre esta e o Laboratório do Grupo Santa Helena. Tal contrato é renovado anualmente e
contempla a realização de serviços de manutenções corretivas sem o fornecimento de peças.
6. CALIBRAÇÃO
A verificação da calibração do equipamento e/ou a sua recalibração, quando necessária, são realizadas pela
equipe técnica da PerkinElmer no momento da manutenção preventiva e/ou corretiva.
A calibração do autosampler consiste em ajustar as coordenadas X,Y e Z da agulha da probe, assim como o
volume aspirado e dispensado. Quanto à bomba, é preciso que o fluxo mostrado no display esteja em acordo
com o fluxo real de bombeamento e o detector tem que separar a faixa espectral na nanometragem indica no
display.
7. MATERIAIS E REAGENTES
Colunas cromatográficas RP-8 de 5 um ou similar.
Pré-colunas para as colunas citadas acima.
Seringa de injeção de 100 uL para HPLC.
Vials de rosca de 2 mL e suas respectivas tampas para o autosampler.
8. DETALHAMENTO DO PROCEDIMENTO
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a) DESCRIÇÃO DO SOFTWARE E DO EQUIPAMENTO.
Os cromatógrafos são divididos em bomba, detector, forno e autosampler, que são instalados e montados
sobrepostos. O funcionamento se dá em conjunto tendo como objeto comum o cromatograma da corrida
analítica. Todos estes possuem chaves de força (Power) onde, uma vez acionadas, permite-se a passagem de
corrente elétrica para o equipamento. A disposição dessas varia conforme o equipamento e o modelo. Os
botões de força dos cromatógrafos Flexar situam-se na parte frontal superior do equipamento. Nos HPLCs
Serie 200, os botões situam-se na parte lateral inferior ou na parte traseira do equipamento. A ordem de
acionamento não importa no caso dos UHPLCs Flexar. Já para os HPLCs Serie 200, a ordem é importante.
Primeiro liga-se a bomba, em seguida o detector e por último o autosampler. Para desligar, a sequência é
inversa. Todos estes trabalham numa corrente de 220 V e estão ligados a um Nobreak.
Os cromatógrafos Serie 200 e UHPLCs podem ser controlados pelo software Chromera versão 3.4.1. Com o
auxílio deste, pode-se executar tarefas tais como purga do sistema, lavagem da probe de injeção, caliobração
de ensaios analíticos, execução de determinações analíticas, reprocessamentos de resultados entre outras.
Há dois computadores no setor de toxicologia onde foram instalados o software Chromera. Um destes
computadores possui o software que controla o HPLC Serie 200 manual e o UHPLC Flexar PDA_FL e o outro
possui o que controla o HPLC Serie 200 autosampler e o UHPLC Flexar PDA. A depender do equipamento com
o qual se deseja trabalhar, deve-se clicar na janela correspondente. Para o UHPLC Flexar PDA_FL há 3 janelas
salvas na área de trabalho. Flexar PDA, Flexar FL e Flexar PDA_FL caso se deseje trabalhar com o UHPLC
usando apenas o detector PDA, usando apenas o detector de fluorescência e usando ambos os detectores,
respectivamente.
Após clicar na janela Chromera, observa-se que a janela principal está divida em várias workspaces. À direita
do programa, visualiza-se a workspace Control Mode, onde, vê-se na parte superior, uma subdivisão divisão
em Manual Control, Single Run e Sequence. Ainda na mesma workspace, na parte inferior tem-se a seguinte
subdivisão: Run Time, Method, Sequence, Post Run, Reprocess e Reports.
Na parte superior à esquerda do programa, pode ser visualizado a workspace Control Panel onde encontramse os comandos Start Pump / Stop Pump. Na parte inferior à esquerda, visualiza-se a workspace Status Panel
onde se observa parâmetros, relacionados à análise e ao equipamento, que são monitorados pelo software,
tais como pump pressure, current vial, sequence status, pump status, PDA status, AS status, A%, B%, peltier
tray temp, pump flow entre outros.
O posicionamento das workspaces pode ser modificado a qualquer momento pelo operador, basta arrastá-lo
com o auxílio do cursor do mouse.
Caso uma das partes do equipamento não esteja ligado no momento que abrir o Chromera, o software
mostrará através da janela Device Connections que ainda não conseguiu conectar-se a esta parte do
equipamento. Então, deve-se ligar o mesmo e em seguida clicar no botão connect na janela Device
Connections. Para desconectar qualquer das partes do equipamento, clicar em disconnetc na janela Device
Connections. Se precisar abrir a janela Device Connections para verificar, a qualquer momento, se alguma das
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partes do equipamento de desconectou, clicar na barra de ferramentas da janela principal do Chromera o
ícone correspondente. Passar o cursor do mouse sobre os ícones para identificá-lo pelo nome.
b) MANUTENÇÃO DIÁRIA
1 – Ligar o computador (senha para entrar no Windows: Advia 1);
2 – Ligar os equipamentos (bomba, detector(es), autosampler, forno, degaseificador) no botão power.
3 – No Windows, clicar na janela Chromera equivalente ao equipamento que deseja trabalhar.
4- Após clicar na janela do equipamento desejado, o mesmo levará alguns segundo para abrir. Logo em
seguida, o mesmo tomará o controle total dos equipamentos, mostrando, através da janela Device
Connections, que já se conectou com a bomba, detector, forno e autosample. Esta janela será exibida
automaticamente por alguns segundos.
5 – Em seguida, clicar em Manual Control na subdivisão Control Mode. Será exibido na parte central do
Chromera as opções de tarefas, tais como Pump Setttings, Purge Pump e Flush Autosampler.
6 – Ao lado da linha Pump Settings, há campos onde serão digitados o fluxo da bomba e proporção dos
solventes nos canais A e B. Digita-se o fluxo e a proporção desejados e clica-se em Apply. Caso a bomba não
comece a funcionar, clicar em Start Pump em Control Panel.
7 – Para fazer a purga do sistema, abrir a tampa frontal da bomba dos cromatógrafos para ter acesso às
válvulas de purga. Estas válvulas devem ser abertas para que possíveis bolhas saiam do sistema. Os HPLCs
Serie 200 possuem apenas uma válvula. Os UHPLCs possuem duas válvulas. Os cromatógrafos devem estar
com seus pescadores imersos nas soluções de lavagem (água destilada / metanol grau HPLC 1:1).
8 - Na janela principal do software Chromera, ao lado da linha Purge Pump, há três colunas onde são
mostrados o fluxo da bomba e os canais A e B. Clicar no campo Flow e digitar o valor desejado (2 a 3 mL/min),
em seguida, selecionar qual dos canais fará a purga primeiro. Em seguida, clicar em Apply. Se a bomba já
estiver em funcionamento a purga começará imediatamente. Caso a mesma não esteja em funcionamento,
deve-se iniciar o bombeamento clicando em Star Pump em Control Panel. Esperar aproximadamente 20
minutos (ou mais a depender do estado de bolhas do sistema) e, em seguida, selecionar o próximo canal a
sofrer a purga e clicar em Apply. Esperar aproximadamente 20 minutos (ou mais a depender do estado de
bolhas do sistema).
9 – Quando terminar a purga do último canal, clicar em Stop Pump em Control Panel para parar a bomba.
Fechar as válvulas das bombas e fechar a tampa frontal dos equipamentos. Digitar o valor inicial de 1 mL/min
no campo correspondente ao fluxo na linha Purge Pump. Em seguida, digitar no campo Flow da linha Pump
Settings o fluxo que deseja para a bomba e as proporções desejadas nos campos dos canais A e B. Deixar
estabilizar por pelo menos 10 minutos antes de trocar as soluções de lavagem pelas fases móveis utilizadas
nas corridas cromatográficas.
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c) INICIAR UMA CORRIDA ANALÍTICA.
1 - Na janela principal do programa Chromera, à sua direita, há seis linhas identificadas pelos seguintes
nomes: Run Time, Method, Sequence, Post Run, Reprocess e Reports. Para criar uma sequência de análise,
clicar em Sequence.
2 – Uma nova janela será exibida, onde na parte superior, haverá os campos Name, Description, Group. No
campo Name, digitar o nome da corrida analítica (por exemplo: AHP 20/07/14); em Description, digitar
alguma informação acerca da corrida analítica (por exemplo: ROTINA) e em Group, digitar ou selecionar a
pasta na qual se deseja guardar as análises (por exemplo: Julho 2014).
3 – Ainda nesta janela, observar-se colunas tais como Sample Type, Sample Name, Vial, Method, Injections,
Dilutions Factor e Injection Volume. Em Sample Type, selecionar a categoria da injeção. No caso de uma
corrida analítica num método já calibrado, selecionar a opção “sample”. Em Sample Name, digitar a ordem de
serviço (O.S.) da amostra. À medida que for digitando a O.S. das amostras, tecle Enter e uma nova linha
aparecerá em seguida.
4 – Quando terminar de digitar todas as ordens de serviço, clicar em Sample Type com o botão direito na
última O.S. que já esteja com a opção “sample” e selecionar Fill Down para que esta opção seja preenchida
em todas as linhas (a seleção pode ser feita manualmente linha por linhaa). Se, na coluna Vial, a numeração
não estiver completa, clicar com o botão direito no último número exibido e selecionar a opção Fill Down para
que a numeração seja preenchida na sequência. Esta seleção pode ser feita linha por linha. O carrossel do
autosampler possui capacidade para 100 vials.
5 – Na coluna Method, clicar à esquerda do campo e selecionar o método desejado. Clicar com o botão direito
em Fill Down para que todas as linhas sejam preenchidas por este método. Na coluna Injections, selecionar
quantas injeções de cada amostra deseja. Caso queira o mesmo número para todas as amostras, clicar com o
botão direito na última linha que já contenha o número de injeções e selecionar Fill Down para que todas as
linhas sejam preenchidas por este número. Nas colunas Dilutions Factor e Injections Volume digitar os
valores desejados e selecionar com o botão Fill Down para preencher as demais linhas. Normalmente não se
alteram os valores já exibidos pelo programa para estas duas últimas colunas.
6 – Quando terminar de confeccionar a sequência, clicar em file, na parte superior à direita desta janela, e em
Save sequence. O nome que será salvo é o mesmo digitado no campo Name. Caso queira mudá-lo, clicar em
Save sequence as e inserir o novo nome da corrida analítica. Em seguida, fechar a janela, clicar em Run Time
na janela principal do Chromera. Marcar, na parte superior à direita do programa, em Control Mode, a opção
Sequence. Em seguida, clicar em file, em Open sequence e marcar a corrida analítica salva anteriormente. Em
seguida, clicar no botão Open. O programa retornará à janela principal onde será exibida, na parte inferior, a
sequência criada anteriormente.
7 – Após certificar-se de que as mangueiras e com seus pescadores estão devidamente posicionadas nas fases
móveis de trabalho, acionar a bomba clicando no botão Start Pump em Control Panel. Esperar
aproximadamente 10 minutos para estabilizá-la e, em seguida, clicar no botão verde, acima da sequência
exibida, para dar início às análises. À medida que as amostras foram lidas, uma barra verde será descerá a lista
até que todas as alíquotas sejam analisadas. Se precisar parar as análises, clicar no botão vermelho acima da
sequência exibida.
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d) PARA PEGAR OS RESULTADOS DAS AMOSTRAS.
1 – Após ter terminado de analisar todas as amostras, clicar em Post Run na janela Chromera, em Control
Mode, na parte inferior à direita do programa. Uma nova janela será aberta onde serão exibidas as pastas que
contêm as corridas analíticas. Clicar na pasta que escolheu ou criou no momento da confecção da lista de
sequência para arquivar os resultados da corrida analítica. Em seguida, clicar em cima do sinal de adição (+)
que fica ao lado do nome da corrida analítica. Clicar em open. Será aberto um campo na parte central do
software que por sua vez é subdivido em duas partes. A superior chamada de Batch: (Nome da corrida) e a
inferior chamada Results. Em Batch, serão visualizados os cromatogramas e em Results os resultados nas
ordens de serviço.
2 – Clicar no sinal de adição ao lado da ordem de serviço. Serão exibidas novas linhas para esta amostra
mostrando a(s) substância(s) de interesse com seu(s) respectivo(s) tempo(s) de retenção e concentração na
unidade cadastrada no método. Caso o programa tenha identificado o pico errado, ou o pico de interesse
tenha sofrido alteração do seu tempo de retenção, pode-se reprocessar o resultado da amostra (caso tenha
sido com uma única ou com poucas amostras) ou pode-se reprocessar toda a corrida analítica, inserindo no
método o novo tempo de retenção e reprocessando todas as amostras (ver em 7.6).
3 – Caso queira proceder alguma intervenção no cromatograma ou integração de um resultado em particular,
deve clicar em Actions na barra de ferramentas do Chromera, situada na parte superior do programa. Em
seguida, clicar em Peak Identification Review. Será possível observar na parte inferior do campo Results duas
abas chamadas de Results e Integration. Em Results observa-se as ordens de serviço com seus resultados e
em Integration observa-se colunas tais como Component, Retention Time, Peak Search Start (min) e Peak
Search End (min) onde estão descritos, respectivamente, o nome do(s) componente(s) analisados(s), o(s)
tempo(s) de retenção e os tempo(s) onde o(s) pico(s) começa(m) a ser formado(s) e termina(m). Estes dois
tempos formam a faixa de aceitação com que o software entenderá que o pico do analito pode ser
encontrado.
4 – Logo abaixo há uma linha chamada Events. Nesta, pode-se selecionar o evento que o operador julgar
necessário para melhorar a integração dos picos.
e) PARA CRIAR MÉTODO.
1 – Clicar na opção Method em Control Mode. Em seguida em New Method. Serão exibidos, na região central
do Chromera, campos onde será possível inserir o nome do método em Method Name, o grupo ou pasta ao
qual o método estará inserido em Group, uma descrição breve do método em Description e em Notes.
2 – Será possível ver, à direita do software, a workspace chamada Method. Nela, encontram-se parâmetros
integrantes do método que deverão ser editados pelo operador. O primeiro parâmetro chama-se
Instruments. Neste, será possível observar campos referentes à bomba, detector(es), forno da coluna e
autosampler.
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Instruments – Bomba
3 – Clicar em Bomba. Será exibida uma linha com o campo Advanced. Após clicar neste, serão exibidos na
parte central da janela principal, campos onde será definido o funcionamento da bomba nesse método. Os
principais campos a serem editados são:
3.1 – Transition – Determina se a bomba funcionará de forma binária (Gradient) ou isocrática (Isocratic);
3.2 – Initial Equil Time – Determina se a quanto tempo a bomba precisará para atingir o equilíbrio entre uma
injeção e outra;
3.3 – Run Time Reconciliation – Deve estar marcado para que o software ajuste o tempo da bomba com o
tempo do detector.
3.4 – Stop Time After Equil (min) – Deve ser digitado 120, pois será o tempo que a bomba levará para de
funcionar após entrar em Stand by.
3.5 – Standby Time (min) – Deve ser digitado 30, pois será o tempo em minutos necessário para que a bomba
entre em Stand by após a última injeção ou depois de ter sido manipulada pela última vez.
3.6 – Standby Flow (mL/min) – Deve ser digitado 0,2 mL/min, pois será o fluxo utilizado pela bomba no
momento de Stand by.
3.7 – Pressure Units – selecionar a opção psi.
3.8 – Upper Pressure Limit - Digitar 3000 psi para o HPLC e 8000 psi para o UHPLC para que, caso as bombas
alcancem estas pressões, a mesma interromperia o seu funcionamento.
3.9 – Lower Pressure Limit - Digitar 0 (zero).
4 – Clicar no sinal de adição, à direita da primeira linha de campos da bomba. Outros campos serão exibidos
tais como Step, Step Type, Step Time (min), Flow (mL/min), %A e %B.
5 - Clicar no campo em branco abaixo de Step. Este campo mostrará, de forma vertical, quantas etapas terão a
corrida analítica neste método. A primeira etapa será de 0 (zero), o segundo 1 (um) e assim por diante.
6 – Abaixo de Step Type, será exibida a qualificação de cada etapa. A etapa primeira etapa será sempre de
equilíbrio (Equil), ou seja, o tempo que o sistema levará para equilibrar entre uma injeção e outra. As etapas
seguintes são das corridas propriamente ditas (Run).
7 – Abaixo de Step Time (min), deve ser digitado o tempo da corrida analítica. A soma dos tempos das etapas,
exceto o da primeira, corresponderá ao tempo da corrida analítica.
8 – Abaixo de Flow (mL/min) de ser digitado o fluxo da corrida analítica. Cada etapa pode ter o seu próprio
fluxo.
9 – Abaixo de %A e %B serão digitados as proporções dos canais A e B respectivamente. Cada etapa pode ter
as suas próprias proporções; para tanto, é preciso selecionar em Transition a opção Gradient.
Instruments - Forno
10 – Após clicar em Forno, será exibida uma linha com os campos In Use, Temperature (oC), Tolerance (+/- oC)
e Equil. Time (min).
11 – O campo In Use deve ser desmarcado caso o operador não opte por usar o forno. No campo
Temperature (oC), digitar a temperatura na qual deseja que a coluna alcance durante a corrida
cromatográfica. Em Tolerance (+/- oC), qual a variação de temperatura o operador aceita para seu método e
em Equil. Time (min), em quanto tempo o equilíbrio da temperatura deve ocorrer.
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CONTROLE DE COPIA:
Instruments - PDA
12 – Após clicar em PDA, será exibida uma linha com os campos Sampling Rate (pts/s), Lamp Type, End Time
(min). Não há necessidade de editar nenhum destes campos com exceção do End Time que deve coincidir
com o tempo da corrida analítica editado em Instruments – Bomba.
13 - Quando houver um sinal de adição (+) à direita da linha PDA, o operador deve clicar neste para que seja
será exibida outra linha logo abaixo. Nesta, pode ser inserido o comprimento de onda do método no campo
Wavelength (nm). Deve-se deixar marcada a opção Autozero nesta mesma linha. Caso não haja o sinal de
adição (+), o operador poderá inserir o comprimento de onda do método no parâmetro Channel Name.
Instruments - Autosampler
14 – Após clicar em autosampler, uma linha será exibida na parte central da janela do Chromera. Da mesma
forma como ocorrido no parâmetro Bomba, o operador deve clicar na opção Advanced. Assim, serão exibidos
campos necessários para editar o funcionamento do autosampler no método montado. Os principais campos
a serem editados são:
14.1 – Injection Volume (uL) – Digitar o volume desejado, respeitando a capacidade do loop do injetor.
14.2 – Tray Temperature – Digitar o valor da temperatura desejada para a bandeja de amostras. Caso não seja
necessário trabalhar com bandeja resfriada, selecionar a opção OFF para esse campo.
14.3 – Tolerance (+/- oC) – Digitar a variação aceitável da temperatura da bandeja caso deseje que bandeja de
amostras seja resfriada.
14.4 – Flash Volume (uL) – Digitar o volume necessário para a lavagem da probe de injeção da amostra. O
comum é 1000 uL.
14.5 – Loop size (uL) – Digitar a capacidade do seu loop.
14.6 - Sample Speed – Selecionar fast ou very fast, para os extratos aquosos ou com densidade inferior à da
água.
14.7 – Flush Speed - Selecionar fast ou very fast, para soluções de lavagem aquosas.
14.8 – Number of Flushes – Digitar 1 (um) ou o número que o operador pensar suficiente para a devida
lavagem da sua probe de injeção.
14.9 – Number of Pre-injections Flushes – Digitar o número de lavagens da probe antes de ser injetada uma
amostra. É comum uma lavagem apenas.
14.10 - Number of Post-injections Flushes – Digitar o número de lavagens da probe depois de ser injetada
uma amostra. É comum uma lavagem apenas.
14.11 – Needle Level – Selecionar a profundidade com o a agulha da probe descerá na vial. Os números
possíveis representam a distância entre o fundo da vial e a altura da probe. Portanto, quanto menor for o
número selecionado, mais fundo a probe descerá.
Channel Name
15 – Se foi possível inserir o comprimento de onda em PDA, não será preciso editar nada mais neste
parâmetro. Caso contrário, o comprimento de onda deve ser inserido aqui.
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Luiz Artur Krause
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CONTROLE DE COPIA:
16 – Após clicar em Channel Name será exibida, na parte central do Chromera, uma linha com os seguintes
campos: Device, Channel Name, entre outros. Clicar no sinal de adição à direita desta linha. Será exibido
outro campo também chamado de Channel Name. Em seguida, clicar no campo logo abaixo para ser exibida
uma linha onde serão mostrados os campos Analytical Wavelenght e Autozero, entre outros.
17 – Digitar o comprimento de onda de interesse e marcar a opção Autozero.
Peaks
18 – Após clicar neste parâmetro, será exibida na parte central do Chromera uma linha com os campos
Device, Channel Name, entre outros. Clicar no sinal de adição à direita desta linha. Será exibida logo abaixo
outra linha com os campos Component, Retention Time (min), Peak Search Start (min) e Peak Search End
(min).
19 – Em Component, selecionar ou digitar o analito de interesse. Em Retention Time (min), digitar o tempo
de retenção do analito em questão. Caso o operador não saiba o tempo exato, pode inserir um aproximado
que poderá ser editado logo após a corrida analítica. Os demais campos serão ajustados automaticamente
pelo software.
20 – Basta clicar na próxima linha abaixo no campo Component, para se inserir um novo analito caso seja
necessário.
21 – Caso um dos analitos seja um padrão interno, clicar no sinal de adição à direita deste no campo
Component. Logo após, será exibida uma linha com o campo Type. Neste campo, selecionar a opção Uses a
Internal Standard para este analito.
Calibration
22 – Após clicar em Calibration, será exibida, na parte central do Chromera, uma janela que possui três abas
na sua parte superior, chamadas Summary, Detail e Set Up Standard. Na aba Set Up Standard, será exibida
uma linha com os campos Device, Channel Name e To Add a Standard. Abaixo desta linha será exibida uma
tabela com as seguintes colunas: Component, Unit, Calibration Type e Origin Treatment.
23 – Clicar com o botão direito em cima do campo To Add a Standard e selecionar a opção Add Standard.
Será exibida a janela Standard Dictionary onde será possível inserir o nome das colunas correspondentes aos
padrões usados na calibração.
24 – Na coluna Component, selecionar o analito a ser calibrado.
25 – Abaixo de cada coluna com o nome dos padrões, digitar suas respectivas concentrações.
26 – Na coluna Unit, selecionar a unidade dos padrões empregados na calibração.
27 – Na coluna Calibration Type selecionar a opção Linear para o tipo de curva que será confeccionada na
calibração.
28 – Na coluna Origin Treatment, selecionar as opções Include ou Ignore para confeccionar uma curva com o
zero passando pela origem ou não.
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CONTROLE DE COPIA:
29 – Salvar o método confeccionado clicando na barra de ferramentas acima da janela Chromera em File e em
seguida em Save Method.
30 – Este método estará pronto para ser usado numa sequência de calibração (Ver item 7.6).
31 – Após a calibração será possível ver a curva do analito calibrado confeccionada com o seu respectivo
coeficiente (r2).
f) PARA REPROCESSAR AMOSTRAS
1 – Após a corrida analítica ter sido completada, pode ser necessário reprocessar todos os resultados com um
novo método ou com o mesmo método (com alguma alteração, como, por exemplo, tempo de retenção).
Assim, o software criará uma nova “batch” de resultados com os ajustes sugeridos.
2 – Deve-se verificar o que exatamente o operador quer corrigir nas análises dos pacientes. Por exemplo, se o
método utilizado estabelece que o tempo de retenção para um o analito de interesse é 1,8 min e o pico deste
está saindo em 1,6 será provável que o Chromera não o enxergue, dando o resultado como indetectável.
Então, o operador deve ir ao método e digitar no campo adequado o novo tempo de retenção. Não esquecer
de salvar o método para gravar a alteração feita (ver em 7.6).
3 – em seguida, na janela principal do Chromera, clicar em Reprocess. Um nova janela se abrirá. Clicar em File
e em Open sequence. Uma janela será exibida onde serão mostradas as pastas onde estão as análises feitas
pelo equipamento.
4 – Clicar no sinal de adição ao lado da pasta desejada. Linhas serão exibidas com os nomes das análises
realizadas. Clicar na corrida de interesse e, em seguida em Open.
5 – A sequência analisada será aberta. Então, no campo Method, clicar à esquerda deste e selecionar o
método que utilizará para reprocessar estas amostras. Neste momento o software perguntará se quer que ele
crie uma cópia desta corrida analítica. É recomendável que se crie, assim de a corrida fora denominada AHP
02/07/2014 a nova, com os dados reprocessados se chamará AHP 02/07/2014 Copy. Dessa forma, fica o
registro de que as foram realizadas as análises e que foi preciso reprocessá-las.
6 - Em seguida, com o botão direito, clicar no campo Method e selecionar Fill Down para que todas as linhas
sejam preenchidas por este novo método.
7 – logo depois, clicar no botão verde. Esperar alguns segundos e será possível observar uma barra verde que
descerá a lista, passando por todas as ordens de serviços. Quando terminar, clicar em Post Run e abrir a nova
lista de resultados, como descrito no item 7.4. Lembrar que o nome da corrida agora possui Copy anexado.
g) PARA CALIBRAR UM MÉTODO.
1 – Preparar uma sequência de padrões e branco (se for o caso) para confecção da curva analítica. Proceder
como descrito no item 7.3 como se fosse correr amostras de pacientes, selecionando em Sample Type a
opção Sample e em Method o método ainda não calibrado ou com calibração a modificar.
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CONTROLE DE COPIA:
2 – Chamar a sequência em Run Time e proceder a corrida como se fosse analisar amostras de pacientes.
3 – Após realizar estas injeções, verificar os tempos de retenção reais e registrá-los no método usado. Para
tanto, clicar em Post Run em Control Mode; em seguida, clicar em File e Open sequence. Será exibida outra
janela onde serão mostradas as pastas onde estão salvas as corridas cromatográficas. Clicar na corrida
desejada em logo depois em Open.
4 - Visualizar os cromatogramas e observar os tempos de retenção reais. Caso sejam diferentes daqueles que
inseriu quando criou o método, os mesmos devem ser alterados e o método salvo. Ver a seção 7.5.
5 - Em seguida, clicar em Reprocess. Nova janela será aberta. Clicar em File e em Open sequence. Uma janela
será exibida onde serão mostradas as pastas onde estão as análises feitas pelo equipamento. Clicar na pasta
onde se encontra a corrida de interesse. Selecioná-la e clicar em Open.
6 – O software voltará à janela Reproocess onde serão observadas as colunas Sample Type, Sample Name,
Vial, Method, Standard, Injections, Dilutions Factor e Injection Volume. Em Sample Type, selecionar a
categoria da injeção. No caso de uma calibração, selecionar a opção “Calib:Replace”. O software perguntará
se deseja criar uma cópia daquela corrida através da janela Batch Copy Selection; optar por criar nova corrida
clicando em Create New Batch. Logo em seguida, a coluna Standard estará disponível para trabalho. Clicar no
campo Standard para selecionar a concentração à qual corresponde o padrão presente em cada linha da
sequência.
7 - Após ter selecionado a concentração correta para cada padrão, clicar no campo Method e selecionar o
método o qual havia editado e salvo. Clicar neste mesmo campo com o botão direito e selecionar Fill Down
para que todas as linhas sejam preenchidas por este novo método. Clicar no botão verde acima da sequência
de padrões. A barra verde descerá linha por linha realizando o reprocessamento. Desta forma, o operador
estará possibilitando que o software confeccione uma curva analítica nesse método padrões cujas
concentrações foram selecionadas na coluna Standard.
8 – Após reprocessamento, será preciso averiguar se o método foi devidamente calibrado. Para tanto, clicar
em Method, em Control Mode, em File e em Open Method. A janela Date Selector – Single Method será
exibida, onde mostrarão os métodos já criados pelo operador. Selecionar o método que foi reprocessado.
Nova janela será exibida onde serão mostrados os parâmetros integrantes da composição do método de
interesse.
9 – À direita do software, será observada a workspace Method, onde serão visualizados os parâmetros
integrantes do método tais como Instruments, Calibration entre outros. Ver seção 7.5. Clicar em Calibration.
Serão observados, na parte central uma workspace cujo nome será o próprio nome do método. Nesta, na
parte superior, haverá 3 abas chamadas, Summary, Datail e Set Up Standard. Clicando tanto em Summary
quanto em Datail, será possível ver se a curva de calibração foi confeccionada e se o seu coeficiente está
dentro de valores aceitáveis. Caso esteja, este método já poderá ser utilizado para realizar as acorridas
analíticas dos controles e, caso estejam com resultados satisfatórios, processar as análises das amostras dos
pacientes. Caso a(s) curva(s) não estejam satisfatórios, verificar as possíveis causas. Uma vez identificadas,
realizar nova calibração.
9. BIOSSEGURANÇA
Para esta atividade é necessário a utilização de luvas, jaleco, touca e máscara, conforme descrito no POP de
Biossegurança em vigor (Cód. PO-LB-CQ-001).
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Luiz Artur Krause
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CONTROLE DE COPIA:
10. COMENTÁRIOS
Deve-se evitar desligar o equipamento com soluções contendo sais no interior de suas tubulações. Tais sais
podem ocasionar obstruções nas linhas internas o que eleva consideravelmente a pressão do sistema
prejudicando as análises. Quando se trata de UHPLCs o cuidado deve ser maior, pois suas tubulações possuem
um diâmetro interno menor do a dos HPLCs. Para tanto, deve-se deixar passar soluções de água/metanol por
pelo menos 20 min a um fluxo de 0,5 mL/min antes de desligar o equipamento.
11. DOCUMENTOS DE REFERÊNCIA
a) Bibliografia
http://www.ifrj.edu.br/webfm_send/546
http://www3.uma.pt/jcmarques/docs/qaii/QAII4HPLC2007JCM.pdf
b) Documentos Complementares
Manuais PerkinElmer das Bombas Serie 200
Manuais PerkinElmer dos Detectores UV/Vis Serie 200
Manual PerkinElmer do Autosampler Serie 200
Manuais PerkinElmer das Bombas UHPLC Flexar
Manuais PerkinElmer dos Detectores PDA UHPLC Flexar
Manuais PerkinElmer dos Autosampler UHPLC Flexar
Manual PerkinElmer do Detector Flourescência UHPLC Flexar
Plano da qualidade do setor de Toxicologia (Cód. PQ-LB-TX-001)
PO de Orientações de Biossegurança (Cód. PO-LB-CQ-001)
12. HISTÓRICO DAS REVISÕES
Pg.
Natureza da Revisão
Data da Revisão
Versão
Responsáveis
1-15
Procedimento adequado para atender ao item 5.3 da
Norma PALC, versão 2013
01/08/2014
01
Luiz Artur Krause
1-15
Procedimento adequado para atender ao item 5.3 da
Norma PALC, versão 2013 Após Pré auditoria.
28/01/2015
02
Luiz Artur Krause
1-14
Procedimento revisado e sem alterações.
26/10/2015
02
Luiz Artur Krause
13. ANEXOS
Não se aplica.
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CONTROLE DE COPIA:
14. REGISTRO DE TREINAMENTO
DATA
NOME COMPLETO
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