GENOTIPAGEM DE BACTÉRIAS
Nalvo F Almeida
Faculdade de Computação – UFMS
Tuberculose bovina
Afeta bovinos e bubalinos
¨  Causada pela bactéria Mycobacterium bovis
¨  Crônica nos animais
¨ 
¤  pulmões,
fígado, baço, carcaça, úbere
¤  transmissão entre bovinos via leite e aerógena
Em geral não apresenta sintomas visíveis
¨  Emagrecimento em casos acentuados
¨  Queda na produção de leite, de carne
¨  Perdas anuais de ~3 bilhões de dólares
¨ 
Tuberculose bovina
¨ 
Não existe vacina ou tratamento
¤  O
¨ 
animal infectado é eliminado (max. 30 dias)
Transmissível ao homem
¤  Leite
contaminado
¤  Perdigoto
Tuberculose bovina
¨ 
Diagnóstico feito com teste intradérmico
¤  injeção
de um composto de proteínas de M. bovis denominado
Derivado Proteico Purificado (PPD)
¤  animais infectados manifestam um aumento localizado da
espessura da dobra da pele 72 horas após a injeção
¤  podem não responder ao teste mesmo infectados (falsos
negativos)
Tuberculose bovina
¨ 
Diagnóstico feito com teste intradérmico
¤  injeção
de um composto de proteínas de M. bovis denominado
Derivado Proteico Purificado (PPD)
¤  animais infectados manifestam um aumento localizado da
espessura da dobra da pele 72 horas após a injeção
¤  podem não responder ao teste mesmo infectados (falsos
negativos)
¨ 
Diagnósticos mais precisos e mais rápidos são necessários
Tuberculose bovina
Genotipagem de Mycobacterium
¨ 
¨ 
¨ 
Entendimento mais aprofundado de Mycobacterium bovis
Precisamos antes saber como determinar corretamente uma
espécie/cepa
Mycobacterium tuberculosis Complex (MTbC ou MTC)
Mycobacterium tuberculosis
¤  Mycobacterium africanum
¤  Mycobacterium bovis
¤  Mycobacterium microti
¤  Mycobacterium canettii
¤  Mycobacterium caprae
¤  Mycobacterium pinnipedii
¤  Mycobacterium mungi
¤ 
Genotipagem de Mycobacterium
¨ 
Problema
¤ 
Cepas de Mycobacterium (em especial de bovis) são muito similares
Técnicas de genotipagem
MLST
¨  Espoligotipagem
¨  MIRU-VNTR
¨ 
Técnicas de genotipagem
MLST
¨  Espoligotipagem
¨  MIRU-VNTR
¨ 
Mycobacterium
Técnicas – MLST
¨ 
Multi-Locus Sequencing Typing
Técnicas – Espoligotipagem
•  Spoligotyping - Spacer oligonucleotide typing
•  Método baseado em PCR
•  Detecta uma região de DR (Direct Repeat) – 36bp – em genomas
MTB (mycobacterium tuberculosis complex)
Técnicas – Espoligotipagem
Guide to the Application of Genotyping to Tuberculosis Prevention and Control. CDC Tuberculosis Genotyping
Laboratory Procedures
Técnicas – MIRU-VNTR
Mycobacterium Interleaved Repeat Unit
¨  Variable Number of Tandem Repeat
¨  Análise de seqs formadas por repetição em tandem
(40-100bp) exclusivas de MTC
¨ 
Técnicas – MIRU-VNTR
Técnicas – MIRU-VNTR
Técnicas de genotipagem
Espoligotipagem
¨  MIRU-VNTR
¨ 
Não conseguem diferenciar subspécies/cepas muito
próximas de Mycobacterium
¨  Características investigadas nesses métodos
apresentam evolução convergente
¨ 
91191 V2D V2A 04-­‐303 534 91193 91192 45-­‐08B 18-­‐08C 07-­‐08. 61-­‐09 32-­‐08 49-­‐09 08-­‐08BF2 33 50 35 268 AN5 0822-­‐11 02-­‐6316_S6 04-­‐1858_S3 08-­‐1086_S8 08 1930 08 4364 10-­‐1862_S5 10-­‐7911_S8 10 7070 12-­‐5092_S3 95-­‐01315_S6 1101101000001110111111111111111111111100000!
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!
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!
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MIRU 02-­‐6316_S6 23335432534 04-­‐1858_S3 23237552533 08-­‐1086_S8 3237552533 08 1930 25237452534 08 4364 25237452534 10-­‐1862_S5 23336442535 10-­‐7911_S8 25147452323 10 7070 23335432534 Nossa abordagem
¨ 
Ferramentas computacionais para genômica
¤  Comparação
de sequências
¤  Anotação
¤  Famílias
de proteinas
Abordagem genômica
Abordagem genômica
Abordagem genômica
Abordagem genômica
Abordagem genômica
Abordagem genômica
Abordagem genômica
Abordagem genômica
Abordagem genômica
Pipeline
Blastp
OrthoMCL
Orthologsorter
MUSCLE
Gblocks
RAxML
NJplot
árvore
Pipeline
Blastp
OrthoMCL
Orthologsorter
MUSCLE
Gblocks
RAxML
NJplot
árvore
Altschul, S.F., Madden, T.L., Schäffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J. (1997) "Gapped BLAST and
PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.
Pipeline
Blastp
OrthoMCL
Orthologsorter
MUSCLE
Gblocks
RAxML
NJplot
árvore
Li Li, Christian J. Stoeckert, Jr., and David S. Roos. OrthoMCL: Identification of Ortholog Groups for Eukaryotic
Genomes. Genome Res. 2003 13: 2178-2189.
Pipeline (ortólogos e parálogos)
E.V. Koonin. An apology fo orthologs - or brave new memes. Genome Biology, 2(4), 2001.
Pipeline
Blastp
OrthoMCL
Orthologsorter
MUSCLE
Gblocks
RAxML
NJplot
árvore
Orthologsorter: inferindo genotipagem e funcionalidade a partir de famílias de proteínas ortólogas. Nariélly Calista
Farias. Dissertação de Mestrado, Faculdade de Computação, UFMS 2013.
Pipeline
Blastp
OrthoMCL
Orthologsorter
MUSCLE
Gblocks
RAxML
NJplot
árvore
Edgar, R. C. (2004). "MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput." Nucleic Acids Res
32(5): 1792-1797.
Castresana, J. (2000). "Selection of conserved blocks from multiple alignments for their use in phylogenetic analysis."
Mol Biol Evol 17(4): 540-552.
Pipeline
Blastp
OrthoMCL
Orthologsorter
MUSCLE
Gblocks
RAxML
NJplot
árvore
RAxML (Randomized Axelerated Maximum Likelihood) Version 8: A tool for Phylogenetic Analysis and Post-Analysis of
Large Phylogenies. Bioinformatics, 2014.
Pipeline
Blastp
OrthoMCL
Orthologsorter
MUSCLE
Gblocks
RAxML
NJplot
árvore
(USA_08_4364:0.00018719,(USA_10-7070:0.00066666,USA_08-1930:0.00020743)1.000000:0.00013801,
(((ARG_4303:0.00007828,(Ref:0.00034238,(ARG_V2D-05-566:0.00004808,ARG_V2A:
0.00000483)1.000000:0.00002851)1.000000:0.00002214)1.000000:0.00002337,((BRA_AN5:0.00024547,
((USA_10-7911:0.00018700,((USA_04-1858:0.00016328,USA_08-1086:0.00004543)0.998000:0.00002663,
(USA_98-0251:0.00006950,USA_95-1315:0.00005472)0.440000:0.00000852)1.000000:0.00010365)1.000000
:0.00002107,(BRA_49-09:0.00030382,(((BRA_33:0.00009861,BRA_35:0.00025503)1.000000:0.00003722,
(USA_02-6316:0.00022218,USA_10-1862:0.00017178)1.000000:0.00003041)0.999000:0.00002578,
(BRA_08-08BF2:0.00009549,((BRA_45-08B:0.00008231,(BRA_50:0.00008819,(BRA_18-08C:
0.00012513,BRA_61-09:0.00016375)0.654000:0.00003647)0.859000:0.00001190)0.967000:0.00001088,
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0004806)1.000000:0.00004978)1.000000:0.00003899)0.666000:0.00000748)1.000000:0.00002415,
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0002688,(USA_12-5092:0.00011986,(ARG_534:0.00005095,(ARG_91191:0.00002124,
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0001248)0.467000:0.00000362)1.000000:0.00034397);!
!
Perrière G, Gouy M (1996). "WWW-Query: An on-line retrieval system for biological sequence banks". Biochimie
78:364-369.
Pipeline
Orthologsorter – subproduto
Blastp
OrthoMCL
Orthologsorter
banco de
dados
MUSCLE
Gblocks
Sistema web
Orthologsorter
RAxML
NJplot
árvore
Orthologsorter
Orthologsorter
Orthologsorter
Orthologsorter
Orthologsorter
Orthologsorter
Orthologsorter
Orthologsorter
Orthologsorter
Orthologsorter
Orthologsorter
Orthologsorter
Orthologsorter
Outras abordagens
¤  SNPs
n  Concatenar
as colunas SNPs para formar o alinhamento
¤  Busca
de regiões específicas para marcadores
moleculares
n  Árvore
de sufixos
n  Characteristic Strings
n  Mais perto de ajudar em técnicas para diagnóstico
Árvore de M. bovis baseada em SNPs
Orthologsorter e Orthologsorter+SNPs
Publicações preliminares
¨ 
¨ 
¨ 
J.V.A.Oliveira, T.Raiol, N.C.Farias, N.F.Almeida, G.P.Telles, J.C.Setubal,
M.L.Araujo, F.P.Lima, C.Benoit-Pilven, M.M.Brigido, M.T.Souza, L.M.P.Moraes
and M.E.T.Walter.
Genome sequence of a Brazilian Bacillus cereus isolate
7th Brazilian Symposium on Bioinformatics, August 2012.
F.R.Araujo, A.B.C.Castelao, A.A.Fonseca-Jr., M.A.Hodon, M.A.Issa,
A.K.Ramalho, G.M.T.Mendes, C.A.N.Ramos, E.B.Sales, P.M.Soares-Filho,
N.C.Farias, C.Nishibe and N.F. Almeida.
Typing of a Brazilian Mycobacterium isolate by whole-genome sequencing
7th Brazilian Symposium on Bioinformatics, August 2012.
H.Muniz, N.C.Farias, T.Raiol, A.L.Cunha-Laura, G.P.Telles and N.F.Almeida
A comparison of two approaches for species identication
7th Brazilian Symposium on Bioinformatics, August 2012.
Onde Orthologsorter foi usado
¨ 
¨ 
¨ 
¨ 
¨ 
A.R.Wattam et al.
Analysis of ten Brucella genomes reveals evidence for horizontal gene transfer despite a
preferred intracellular lifestyle
J. of Bacteriology 2009
J.C.Setubal et al.
The genome sequence of Azotobacter vinelandii, an obligate aerobe specialized to support
diverse anaerobic metabolic processes
J. of Bacteriology 2009
L.M.Moreira et al.
Novel insights into the genomic basis of citrus canker based on the genome sequences of two
strains of Xanthomonas fuscans subsp.
Aurantifolii
BMC Genomics 2010
N.Potnis et al.
Comparative genomics reveals diversity among xanthomonads infecting tomato and pepper
BMC Genomics 2011
R.Cai et al.
The Plant Pathogen Pseudomonas syringae pv. tomato Is Genetically Monomorphic and
under Strong Selection to Evade Tomato Immunity
PLoS Pathogens 2011
Onde Orthologsorter foi usado
¨ 
¨ 
¨ 
¨ 
¨ 
A.Mazzaglia et al.
Pseudomonas syringae pv. actinidiae (PSA) Isolates from Recent Bacterial Canker of Kiwifruit
Outbreaks Belong to the Same Genetic Lineage
PLoS ONE 2012
A.R.Wattam et al.
Comparative Genomics of Early-Diverging Brucella Strains Reveals a Novel
Lipopolysaccharide Biosynthesis Pathway
mBio 2012
S.Slater et al.
The Genome of Agrobacterium tumefaciens C58: Reconciliation of sequence data, updated
annotation, and distribution of linear chromosome in genus Agrobacterium
Appl. Environ. Microbiol. 2012
P.F.Sarris et al
Comparative Genomics of Multiple Strains of Pseudomonas cannabina pv. alisalensis, a
Potential Model Pathogen of Both Monocots and Dicots
PLoS ONE 2013
N.A. Wulff et al.
The complete genome sequence of Candidatus Liberibacter americanus, associated with citrus
Huanglongbing
Molecular Plant-Microbe Interactions 2014
0.05
Acinetobacter
P.aeruginosa PAO1
1.00
P.aeruginosa PA14
1.00
P.aeruginosa PA7
Azotobacter
P.stutzeri A1501
1.00
P.mendocina ymp
P.putida KT2440
1.00
1.00
1.00P.putida F1
1.00 P.putida GB-11
1.00
1.00
P.putida W619
P.entomophila L48
1.00
P.fluorescens Pf-5
1.00
P.fluorescens Pf0-1
1.00
P.syringae DC3000
1.00
P.syringae B728a
1.00
P.syringae 1448A
Mycobacterium bovis
¨ 
¨ 
¨ 
C. Nishibe, A.B.C. Castelão, R.D. Costa, B.J. Pinto, L. Varuzza, A.A. Cataldi, A.
Bernardelli, F. Bigi, F.C. Blanco, M.J. Zumárraga, N.F. Almeida, and F.R. Araújo
Draft Genome Sequence of Mycobacterium bovis 04-303, a Highly Virulent Strain
from Argentina
Genome Announcements 2013, 1(6), 1:e00931-13
C.P.Araújo, A.L.A.R.Osório, K.S.G.Jorge, C.A.N.Ramos, A.F.S.Filho, C.E.S.Vidal, E.Roxo,
C.Nishibe, N.F.Almeida, A.A.F.Júnior, M.R.Silva, J.D.B.Neto, V.D.Cerqueira,
M.J.Zumárraga and F.R.Araújo
Detection of Mycobacterium bovis in bovine and bubaline tissues using nested-PCR
for TbD1
PLOS ONE March 2014, Vol. 9, Issue 3, e91023
A.B.C.Castelão, C.Nishibe, A.Moura, A.P.de Alencar, M.A.Issa, M.A.Hodon,
P.M.P.C.Mota, E.B.Sales, A.A.Fonseca-Junior, N.F.Almeida, F.R.Araújo
Draft Genome of AN5 Strain of Mycobacterium bovis, used for Production of
Purified Protein Derivative
Genome Announcements 2014, 2(2):e00277
Próximos passos
¨ 
Primers específicos
¤  characteristic
string
¤  árvore de sufixo generalizada
Characteristic strings
S1
S2
Sr
T
Encontrar a menor subcadeia de T que ocorre em
S1 S2 … Sr com pelo menos k diferenças
Outros próximos passos
¨ 
Genômica comparativa de todos os isolados
sequenciados
¤  SNPs
¤  Famílias
de proteinas,
¤  Pseudogenes
¤  Meta informações
Colegas
Flábio R. Araújo
Pesquisador – Embrapa Gado de Corte
Ana Beatriz Castelão
Aluna de doutorado
Luciana Montera
Pesquisadora – Facom-UFMS
Christiane Nishibe
Aluna de doutorado
Nariélly Farias
Aluna de mestrado
Rodrigo Andrade Cardoso
Aluna de mestrado
Financiamento
Campo Grande, MS
Campo Grande, MS
¨ 
Não é verdade que tem só índio e jacaré
Campo Grande, MS
¨ 
Não é verdade que tem só índio e jacaré
¨ 
Tem também onça, arara, tuiuiu, capivara, …
Bonito, MS
Campo Grande, MS
UFMS
Facom-UFMS
¨ 
¨ 
¨ 
¨ 
5 cursos de graduação na área de
computação
Doutorado
Mestrado acadêmico
Mestrado Profissional
¤  Embrapa
¨ 
¨ 
¨ 
Gado de Corte
Aprox. 1200 alunos
51 professores
20 técnico-administrativos
Obrigado
facom.ufms.br/~nalvo
!
[email protected]!