Métodos Físicos de Análise
- ESPECTROFOTOMETRIA
ULTRAVIOLETA / VISÍVEL
Prof. Dr. Leonardo Lucchetti
Mestre e Doutor em Ciências – Química de Produtos Naturais – NPPN/UFRJ
Depto. de Química de Produtos Naturais – Farmanguinhos – Fiocruz
Docente do Programa de Pós-Graduação em Vigilância Sanitária – Instituto Nacional de Controle de Qualidade
em Saúde – Fiocruz
Docente do Curso de Mestrado Profissional em Gestão, Pesquisa e Desenvolvimento na Indústria Farmacêutica
– Farmanguinhos – Fiocruz
Perito Criminal – Polícia Federal – maio/2012
MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Perito Criminal – Polícia Federal – maio/2012
MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Diagrama de Energia: a radiação compreendida no UV-vis está entre 200 – 800nm. Abaixo
de 200nm praticamente todas as moléculas orgânicas absorvem.
Frequência
1019 Hz
1015 Hz
raios cósmicos raios X
UV
UV
Visível
no vácuo próximo
raios γ
0,1nm
IV
próximo
200-400 nm 400-800 nm
1013 Hz
IV
Microondas
2-50 µm
λ
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Espectrofotometria de
Absorção Molecular
Região do visível/UV e IV
Absorbância
Transmitância
Absortividade
Absortividade molar
Espectro de absorção
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Espectrofotometria de
Absorção Molecular
• Aquisição de espectros e/ou quantificação
fotométrica
– curva-padrão (curva de calibração)
– comparação com absorção de solução-padrão
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Vantagens e desvantagens
Devido à “pobreza” de informações, espectros de absorção
UV-vis tem uso limitado na identificação positiva de
substâncias
Escolha do solvente (crítico no UV)
Indicativo de grupos funcionais (proteínas, DNA,
substâncias aromáticas, carbonilas etc.)
Grande ferramenta se acoplada à cromatografia
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Análise quantitativa
Ampla aplicação em sistemas orgânicos e inorgânicos
Grande disponibilidade instrumental e acessível a vários
laboratórios
Sensibilidade típica em torno de 10-5 mol/l, podendo atingir até
10-7 mol/l
Seletividade relativamente alta
Boa exatidão: ~ 1 – 3%
Facilidade na obtenção, tratamento e armazenamento dos
dados
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Determinação da concentração
Curva de calibração
– Observação da lei de Beer
– Determinação experimental do ε
Escolha e preparo do branco (referência) é fundamental
– Composição da amostra: teor e qualidade dos concomitantes
– Presença de equilíbrios secundários
Em casos extremos, a reprodução da amostra é praticamente inviável
– A amostra passa a ser usada como referência! método da
adição de padrão (analito)
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Guia simplificado para análise de espectros UV
A) Banda única de intensidade média - baixa (ε = 100–10.000 M-1cm-1) a λ <
220nm
É geralmente indicativa de uma transição n → σ∗. Aminas, alcoóis, éteres e tióis
contam-se entre as estruturas possíveis, desde que os eletrons não ligantes não
façam parte de um sistema conjugado. Neste caso, será boa prática procurar
bandas N-H, O-H, C-O e S-H no espectro de IV.
Exceção: A transição n → π∗ em grupos –CN aparece nesta região. No
entanto, é fraca (ε < 100) e o grupo –CN identifica-se facilmente no IV.
B) Banda única de fraca intensidade (ε = 10–100 M-1 cm-1) a 250 < λ < 360nm,
sem absorção significativa a λ menor (200–250nm)
É geralmente indicativa de uma transição n → π∗. Como não há absorção a
comprimentos de onda superiores trata-se de um cromóforo simples, tipicamente
não conjugado, em geral contendo um átomo de O, N, ou S. Exemplos: C=O, C=N,
N=N, -NO2, -CO2R, -CO2H, CONH2. O IV e o RMN são também neste caso
excelentes meios de diagnóstico definitivo.
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Guia simplificado para análise de espectros UV
C) Duas bandas de intensidade média (ε = 1.000–10.000 M-1 cm-1), ambas com
λmax > 200 nm
Esta situação é geralmente indicativa da presença de um sistema aromático. Se
for esse o caso, poderá ser observada uma estrutura mais fina na banda de maior
comprimento de onda em solventes não polares. Quando os anéis aromáticos são
substituídos, a absortividade molar é superior a 10.000, sobretudo se o substituinte
aumentar a extensão do sistema conjugado.
Nos compostos aromáticos polinucleares (PAHs) e heterocíclicos aparece uma
terceira banda a cerca de 200nm.
D) Bandas de intensidade elevada (ε = 10.000–20.000 M-1cm-1) a λmax > 210nm
Podem corresponder a cetonas α,β-insaturadas, dienos ou polienos. Quanto mais
extenso for o sistema conjugado, maior é o comprimento de onda do máximo de
absorção.
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Guia simplificado para análise de espectros UV
E) Cetonas, ácidos, ésteres, amidas e outros compostos simples contendo
sistemas π e eletrons não ligantes
Surgem duas bandas de absorção: n → π∗ (λmax > 300nm, intensidade baixa) e π →
π∗ (λmax < 250nm, intensidade elevada). Em sistemas conjugados (ex.enonas) a
banda π → π∗ sofre um desvio batocrômico e aumenta de intensidade, podendo
obscurecer a banda n → π∗.
F) Compostos fortemente corados (i.e., com absorção no visível)
Nestes casos poderá existir um sistema conjugado longo ou um cromóforo policíclico
aromático. Os compostos benzenoides podem ser corados se tiverem substituintes
com conjugação ao sistema aromático. Os compostos não aromáticos requerem em
geral pelo menos 4–5 cromóforos conjugados para ocorrer absorção na zona do
visível. No entanto, alguns compostos simples com grupos nitro, azo, nitroso, αdiceto, polibromo e poliiodo podem ser corados.
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Procedimento prático
Seleção do comprimento de onda
– máximo do pico máxima sensibilidade
– mínimo desvio da lei de Beer ε ~ constante
Variáveis que influenciam a absorbância
– solvente
– pH da solução
– temperatura
– força iônica
– presença de interferentes
Manuseio das cubetas (células)
– par casado de cubetas (calibração)
– limpeza com tecido embebido em metanol grau espectroscópico
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Terminologia
Deslocamento batocrômico: para maior λ (influência de solventes ou de um
grupo cromóforo ou auxócromo que se junta ou retira à molécula de referência
Deslocamento hipsocrômico: para menor λ
Deslocamento hipercrômico: para maior absorção (função de concentração e
espessura da solução)
Deslocamento hipocrômico: para menor absorção (função de concentração e
espessura da solução)
Grupos cromóforos: Grupos funcionais que absorvem radiação na faixa de
trabalho do UV-VIS.
Grupos auxócromos: Grupos saturados que, quando ligados a um cromóforo,
modificam o comprimento de onda e a intensidade da absorção
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Alguns cromóforos
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Regras de Fieser-Woodward (dienos e polienos conjugados)
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Regras de Fieser-Woodward (dienos e polienos conjugados)
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Regras de Fieser-Woodward (carbonilas conjugadas)
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Regras de Fieser-Woodward (cabonilas conjugadas)
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Espectrofotometria UV
Produto da interação de matéria e energia
Relação direta e proporcional com a concentração
Estrutura molecular define a frequência de maior absorção
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Espectrofotometria UV
Energia incidente será sempre mais intensa que a emergente, e a
atenuação pode ser atribuída a:
- reflexões da interface entre o ar e a parede da cubeta e entre a
solução e a parede da cubeta
- dispersão por partículas presentes na solução
- absorção da energia pelo meio
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Espectrofotometria UV
Absortividade (a): quociente entre absorbância (A) e o produto entre
concentração (c), expressa em g/l e caminho ótico (b), expresso em cm
Absortividade molar (E): quociente entre absorbância (A) e produto
entre concentração (c), expressa em mol/l e caminho ótico (b), expresso em
cm
Extinção específica (E1%): quociente entre absorbância e produto entre
concentração (c), expressa em g/100ml e caminho ótico (b), expresso em
cm
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Leis da Fotometria
Lei de Lambert: quando a energia radiante atravessa uma solução, a
quantidade de energia transmitida diminui exponencialmente em relação ao
aumento da espessura atravessada
Lei de Beer: quando a energia radiante atravessa uma solução, a
quantidade de energia transmitida diminui exponencialmente com o aumento
da concentração da solução
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Daí...
Io
I
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Um pouquinho de fórmulas...
log Io / I = a . b
A= a . c
A = a . c. l
Io = intensidade da luz incidente
I = intensidade da luz transmitida
a = constante característica da solução
b = espessura (cm) da camada atravessada pela luz
A = absorbância
a = constante característica da solução
c = concentração da solução atravessada pela luz
l = caminho ótico
LAMBERT
BEER
LAMBERT-BEER
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Requisitos para análises: amostragem
- Soluções diluídas: 0,4mg/mL ou menos, dependendo do
εmáx no λmáx
- Solventes devem ser “transparentes” na faixa de comprimento de onda a
ser analisada: não se pode obter o “espectro de diferença” de um solvente que
absorve muito pois, nestas condições, a quantidade de luz que atravessa a amostra
é mínima
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Aplicações do UV/vis em análises forenses
1- Como técnica acoplada ao CLAE (detecção);
2- Análise de tintas, corantes, explosivos, alimentos, bebidas etc;
3- Peritagens e análises in loco;
5- Análise de marcadores biológicos.
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Instrumentação UV-vis
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Alguns cromóforos comuns
MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Alguns cromóforos comuns: alquenos conjugados
MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Alguns cromóforos comuns: carbonilas conjugadas
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Alguns cromóforos comuns: benzenos monossubstituídos
MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Exemplos de espectros de absorção
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
Fatores que afetam as propriedades de absorção de um cromóforo
pH
O pH do solvente determina o estado de ionização de cromóforos ionizáveis
(protonação e desprotonação pelo H+)
Polaridade (depende da estrutura do cromóforo e do tipo de transição)
Para cromóforos polares, é frequente (especialmente se a molécula contém O,
N, ou S) que λmáx ocorra para um comprimento de onda menor em solventes
polares hidroxílicos (H2O, álcoois) que em solventes não polares.
Efeitos da orientação
Características geométricas (simetria, organização) frequentemente têm fortes
efeitos sobre εmáx. O melhor exemplo é o hipocromismo de ácidos nucléicos.
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
QUESTÕES DE CONCURSOS
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
5- Com relação à espectroscopia de absorção no ultravioleta (UV), assinale as
alternativas abaixo como CERTO ou ERRADO. (Perito Criminal/ PC/ ES – 2007).
a) A eficiência de absorção de energia da luz para cada cromóforo está relacionada
com seu peso molecular.
b) Ligações peptídicas absorvem no UV de 300 a 400 nm.
c) Os métodos de espectroscopia em UV podem ser empregados na avaliação da
estrutura de proteínas.
d) A absorção molar de um substrato cromóforo raramente se altera na ligação com
a proteína.
e) O sistema éxciton está relacionado com a estabilidade de elétrons.
(PERITO CRIMINAL – ENG.QUÍMICA – SSP - 2003
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
PERITO CRIMINAL – NÍVEL SUPERIOR – SSP/PE - 2006
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
A espectrometria na região do visível é uma técnica bastante utilizada para análise
quantitativa de diversos compostos orgânicos de interesse na área de toxicologia.
Indique dentre as alternativas abaixo a que NÃO se refere a essa técnica:
a) a espectrometria baseia-se na absorção da radiação pela amostra, absorção
esta que é proporcional à concentração;
b) para quantificação escolhemos a faixa linear, segundo a lei de Lambert-Beer;
c) comprimento de onda selecionado entre 200 e 400nm;
d) o comprimento de onda selecionado entre 400 e 750nm;
e) no espectrofotômetro a leitura pode ser obtida sob a forma de transmitância ou
absorbância.
(PERITO LEGISTA – TOXICOLOGIA – PF)
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MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE
PERITO CRIMINAL – NÍVEL SUPERIOR – SSP/PE - 2006
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