Expressão de Cinco Diferentes Proteínas de Interesse
Farmacológico em Sementes Transgênicas de Soja [Glycine
max L. (Merril)].
Dissertação de mestrado apresentada à banca
examinadora do Programa de Pós-Graduação
“Stricto Sensu” em Ciências Genômicas e
Biotecnologia da Universidade Católica de
Brasília.
Nicolau Brito da Cunha
Orientador: Elíbio Leopoldo Rech Filho, PhD.
Brasília
2008
-i-
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Nicolau Brito da Cunha
Expressão de Cinco Diferentes Proteínas de Interesse
Farmacológico em Sementes Transgênicas de Soja [Glycine
max L. (Merril)].
Dissertação de mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação “Stricto Sensu”
em Ciências Genômicas e Biotecnologia da
Universidade Católica de Brasília, como
requisito para obtenção do Título de Mestre
em Ciências Genômicas e Biotecnologia.
Orientador: Elíbio Leopoldo Rech Filho, PhD.
Brasília
2008
- ii -
C972e
Cunha, Nicolau Brito da.
Expressão de cinco diferentes proteínas de interesse farmacológico
em sementes transgênicas de soja [Glycine max L. (Merril)] / Nicolau
Brito da Cunha. – 2008.
123 f. : il. ; 30 cm.
Dissertação (mestrado) – Universidade Católica de Brasília, 2008.
Orientação: Elíbio Leopoldo Rech Filho.
1. Soja. 2. Soja – Melhoramento genético. 3. Insulina. 4. Hormônios.
I. Rech Filho, Elíbio Leopoldo, orient. II. Título.
CDU 633.34
Ficha elaborada pela Coordenação de Processamento do Acervo do SIBI – UCB.
- iii -
ATA DE DEFESA
Dissertação de autoria de Nicolau Brito da Cunha, intitulada: “Expressão de Cinco
Diferentes Proteínas de Interesse Farmacológico em Sementes Transgênicas de
Soja [Glycine max L. (Merril)].”, requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em
Ciências Genômicas e Biotecnologia, defendida e aprovada em
, pela
banca examinadora constituída por:
Elíbio Leopoldo Rech Filho, PhD, orientador
(Embrapa, Cenargen)
Natália Cristina Verza Ferreira, PhD, membro externo
(Embrapa, Cenargen)
Octávio Luiz Franco, PhD, membro interno
(Universidade Católica de Brasília)
Brasília
2008
- iv -
Dedico este trabalho a Antônio Brito da Cunha, meu avô.
-v-
AGRADECIMENTOS
Agradeço aos meus pais, Elza e Eduardo, por serem pessoas extraordinárias
e generosas, os grandes responsáveis pela minha educação e minha trajetória, que
me incutiram o hábito da leitura e me proporcionaram o contato diário com uma das
mais completas bibliotecas que eu já tive notícia e a oportunidade de conhecer uma
boa parte do mundo. Tudo isso tem um valor inestimável para mim, muito obrigado.
Agradeço aos meus avós: Erna e Ettore Battaggia (in memoriam) e Lygia e
Antônio Brito da Cunha, queridos incentivadores dos meus estudos, principalmente
meu avô Antônio, o maior cientista que eu já conheci, meu grande amigo e principal
influência, que sempre me enviou livros de São Paulo, hábito que se iniciou desde
minha infância e se estende até hoje, e nunca cobrou a devolução de exemplares
que me “emprestava” quando eu o visitava. Nunca me esquecerei de vocês.
Agradeço à Bárbara, minha companheira e conselheira, que agüentou minha
ausência e horários erráticos no laboratório e sempre me contagiou com seu carinho
e bom-humor. Você é fundamental para mim.
Agradeço aos meus irmãos, Eduardo e Lorena; muito obrigado pela amizade.
Agradeço ao meu orientador Dr. Elíbio Leopoldo Rech Filho, um dos maiores
cientistas com quem eu já tive contato, que aceitou ensinar um garoto novato e
inexperiente há alguns anos atrás e concedeu minha primeira oportunidade
profissional. Somente por esse fato eu jamais o esquecerei. Obrigado pelos
ensinamentos, dicas e conversas desde estrutura de genes e construção de
plasmídeos até questões envolvendo biossegurança, planejamento de experimentos
e sobre os meandros da pesquisa científica. Seu conhecimento, experiência e
principalmente amizade foram cruciais para minha formação e aperfeiçoamento.
Agradeço aos Doutores Francisco José Lima Aragão, Giovanni Rodrigues
Vianna e Cristiano Lacorte, cientistas brilhantes e meus co-orientadores, além de
grandes amigos. Os três são pesquisadores excepcionais, cujo contato foi muito
valioso para minha formação não apenas profissional, mas também intelectual.
Muito obrigado à Elsa, Luís e Warley, sem a experiência e amizade de vocês
muitos dos meus experimentos não sairiam do papel. Tenho um enorme respeito e
admiração pelos três.
Muito obrigado aos meus grandes amigos do Laboratório de Transferência de
Genes, colegas a quem eu admiro e tive o prazer de trabalhar diariamente nos
- vi -
últimos sete anos: Alexandre, Gustavo, Emanuel, Sharon, Júlio, Maria Laine, Kenny,
Lívia, Andréa, Aisy, Érica, Thaís, Margareth, Lílian, Cristiane, Sérgio, Fábio, Luisa,
Betúlia, Paula, Welcimar, Hugo, Angélica, Danielas, Larissa, Ana, Gabriela, Aline,
Nayche, Cristina, Renata, Natália, Raquel e André.
Muito obrigado às doutoras Ana Cláudia e Ana Cristina e aos colegas do
laboratório de microscopia do Cenargen. Sua participação nos experimentos de
imunocitoquímica foi fundamental para a obtenção dos resultados.
Obrigado aos Doutores Marcelo Brígido e Andréa Maranhão, do Laboratótio
de Imunologia Molecular da UnB, por terem cedido bibliotecas de cDNA do FIX
humano e do scFv anti-CD18, além do anticorpo policlonal contra proteína A.
Agradeço à doutora Natália Verza e aos doutores Tatsuya Nagata e Octávio
Luiz Franco por terem sido meus professores e aceito participar da banca
examinadora e da qualificação. Suas críticas e sugestões foram de grande valia para
a condução do trabalho e obtenção de resultados.
Muito obrigado aos professores da UCB, principalmente aos doutores Eliane
Noronha, Betânia Quirino, Georgios Pappas Jr e Ruy Caldas, os quais eu pude
assessorar nas aulas de Bioquímica na graduação da UCB, durante os últimos dois
anos. Aprendi muito com vocês.
Agradeço à Embrapa por custear meus estudos durante o mestrado no
Cenargen.
Agradeço aos pesquisadores e colegas de outros laboratórios do Cenargen e
da minha turma na pós- graduação na UCB.
Agradeço a três grandes professores que eu tive na Universidade de Brasília:
Dr. Fernando Fortes (Biofísica) e os Doutores Jean Kleber e Wenceslau Goedert,
meu grande amigo, mestre de ciência de solos.
Agradeço aos meus grandes amigos de longa data, pessoas muito
importantes e cuja companhia vem de tempos ainda mais remotos ao meu ingresso
no Laboratório de Transferência de Genes: Waldir (parceiro de discos do U2),
Thiago, Felipe, Mário, Gabriel, Paulinho, João Bernardo (quem me apresentou o rock
progressivo), Leonardo, Mariana, Débora, Ester e Kátia Lopes.
- vii -
“Imagine a world in which any protein, either naturally occurring or
designed by man, could be produced safely, inexpensively and in almost
unlimited quantities using only simple nutrients, water and sunlight. This
could one day become reality as we learn to harness the power of plants
for the production of recombinant proteins on an agricultural scale.
Molecular farming in plants has already proven to be a successful way of
producing a range of technical proteins. The first plant-derived
recombinant pharmaceutical proteins are now approaching commercial
approval, and many more are expected to follow.”
Julian, K-C.Ma
The production of recombinant pharmaceutical proteins in plants.
Nature Rev Genetics, october. 2003.
- viii -
RESUMO
Palavras chave: Soja transgênica. Proteínas heterólogas. Biorreatores vegetais. Insulina
humana. Hormônio de crescimento humano. Fator de coagulação sangüínea. Anticorpos
recombinantes.
As plantas superiores representam um sistema conveniente e versátil para a
produção em larga escala de proteínas heterólogas. A confirmação desse potencial tem sido
demonstrada pelo sucesso comercial de sistemas de produção desses polipeptídeos,
baseados na transformação genética das mais variadas espécies vegetais, resultando
atualmente na produção eficiente de mais de 100 diferentes proteínas heterólogas. Uma
porcentagem significativa desse conjunto de polipeptídeos recombinantes engloba aquelas
cujo interesse farmacológico e terapêutico se mostra evidenciado em função das
propriedades bioquímicas apresentadas por essas moléculas, tais como hormônios, fatores
de crescimento, anticorpos e fatores de coagulação sangüinea. Biorreatores vegetais
apresentam inúmeras vantagens em relação a outros sistemas de produção de biofármacos
recombinantes, principalmente no que diz respeito à praticidade, economia e segurança,
apesar de algumas limitações envolvendo homogeneidade do produto, baixa estabilidade
protéica e baixos níveis de expressão ainda se mostrarem recorrentes. Dessa maneira a
escolha de plantas de soja [Glycine max L.(Merril)] como veículos de expressão de
biofármacos de interesse comercial visa não apenas contornar algumas dessas dificuldades
como também aproveitar características extremamente favoráveis para sua utilização como
biorreatores de fármacos protéicos, tais como sua baixa freqüência de alogamia, ausência
de parentes silvestres no Brasil e seu potencial natural de acúmulo protéico nas sementes,
através de uma estratégia de expressão tecido-específico e de endereçamento molecular
desses polipeptídeos para prolongamentos dos retículos endoplasmáticos de células
cotiledonares das sementes, denominados corpos protéicos. Para tanto, foram construídos
diferentes cassetes de expressão em nosso laboratório contendo cinco seqüências
codificadoras de biofármacos com atividade efetora em humanos e de considerável impacto
social: a pró-insulina, o hormônio de crescimento e o fator IX de coagulação sangüínea
humanos; e fragmentos de anticorpos anti-câncer de mama e anti-reperfusão pósisquêmica, sob controle do promotor tecido-específico de sementes da β-faseolina do
feijoeiro-comum (Phaseolus vulgaris L.) ― a mais abundante nas sementes de feijão; além
do peptídeo-sinal da α-coixina de Coix (Coix lacrima-jobi L.), responsável pelo
endereçamento dos polipeptídeos para os corpos protéicos cotiledonares. Após a clonagem
dos cassetes de expressão foram obtidas diferentes linhagens transgênicas de soja através
do processo de biobalística e análises moleculares e bioquímicas foram realizadas para
avaliar o número de cópias dos diferentes transgenes integradas ao genoma de cada
linhagem, a segregação dos transgenes em sucessivas gerações de multiplicação de
sementes em casa de vegetação, os níveis de expressão dos transgenes, a cinética química
de expressão ao longo do ciclo de produção de sementes e a localização subcelular do
acúmulo de proteínas heterólogas nas sementes.
- ix -
ABSTRACT
Key words: Transgenic soybean. Heterologous proteins. Plant-based bioreactors. Human
insulin. Human growth hormone. Coagulation factor. Recombinant antibodies.
Superior plants represent a convenient system for large-scale production of
heterologous proteins. Its potential has been confirmed by the commercial success of such
production systems, based on genetic transformation of a broad range of vegetable species,
resulting in efficient production of more than 100 different heterologous proteins. A
representative percentage of recombinant polypeptides synthesized in transgenic plants is
based in molecules with pharmacological applications, such as hormones, growth factors,
antibodies and coagulation factors. Plant-based bioreactors presents a series of advantages
when compared with other production systems, specially in what concerns of economy,
easy-hand manipulation and biosafety, besides some homogeneity, yeld-production and
stability limitations. The choice for Soybean plants [Glycine max L.(Merril)] for function like
expression vehicles of biopharmaceutical proteins means not only to solve such problems
but to explore natural and favorable abilities presented by these organisms such as low
allogamy frequency, natural absence of related plants in Brazil and its excellence in seed
protein accumulation. Tissue-specific expression and protein targeting of heterologous
proteins to protein bodies can maximize their accumulatin in transgenic seeds. Different
expression cassettes were constructed in our laboratory, with the purpose to express five
different coding sequences of social impact proteins such as the human pro-insulin, growth
hormone and coagulation factor IX, and two recombinant antibodies: sc FvDIR83D4 and antiCD18, under control of the tissue-specific β-Phaseolin promoter (the most abundant In bean
seeds) and α-coixin signal-peptide (subcellular cotiledonar target sequence). After gene
cloning, different soybean transgenic lines were obtained by biobalistics, and molecular and
biochemical analysis were carried out to determine the copy number of transgenic
sequences integrated in plant genome, transgene segregation in alternate generations,
protein accumulation levels, gene expression kinetics during plant cycle and subcellular
targeting.
-x-
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Seqüência nucleotídica e peptídica (em negrito) do peptídeo-sinal da α-coixina.
Figura 2: Seqüência codificadora da pró-insulina humana. Acesso AY899304, GenBank.; e sua
respectiva seqüência de aminoácidos (em negrito).
Figura 3: A) Representação esquemática da pró-insulina humana com os sítios de clivagem das
convertases PC1 e PC2, o peptídeo C, as cadeias A e B e as três pontes dissulfeto estabilizadoras da
estrutura. B) Estrutura terciária da pró-insulina humana; PDB ID: 1sju.
Figura 4: Insulina humana madura após sofrer as clivagens proteolíticas.
Figura 5: Estrutura terciária do hormônio de crescimento humano (hGH). PDB ID: 1hgu.
Figura 6: Seqüência codante do hGH. Acesso NM000515, GenBank.; e sua respectiva seqüência de
aminoácidos (em negrito).
Figura 7: Estrutura terciária do fator IX de coagulação sangüínea humana. PDB ID: irfn. EC
3.4.21.22.
Figura 8: Seqüência codante do FIX humano contendo 1.326 pb, Acesso NM000133, GenBank.; e
sua respectiva seqüência de aminoácidos (em negrito).
Figura 9: Seqüência codante do scFv DIR83D4. Nucleotídeos em preto correspondem à região
variável da cadeia pesada; em vermelho ao peptídio conector de glicina e serina e em azul à porção
variável da cadeia leve. Em negrito é apresentada a seqüência de aminoácidos correspondente.
Figura 10: Seqüência codante do scFv anti-CD18. Nucleotídeos em preto correspondem às regiões
variáveis das cadeias leve e pesada; em vermelho ao sítio da enzima NcoI e em azul à seqüência
nucleotídica parcial da proteína A. Os aminoácidos correspondentes estão em negrito.
Figura 11: Demonstração da construção do plasmídeo de expressão pFASPSproINS (4528 pb).
Figura 12: Demonstração da construção do plasmídeo de expressão pFASGH (4.786 pb).
Figura 13: Oligonucleotídeos utilizados para amplificar o fragmento contendo a seqüência codante do
FIX humano. Em verde se encontram as seqüências dos sítios de restrição, a do peptídeo-sinal de αcoixina se encontra sublinhada e em negrito as de anelamento no cDNA do FIX.
Figura 14: Demonstração da obtenção do fragmento NcoI-PS-FIX-BamHI (1.412 pb).
Figura 15): Demonstração da construção do plasmídeo de expressão pFASPSFIX (5.458 pb).
Figura 16): Demonstração da construção do plasmídeo de expressão pFASPSscFvDIR (4.826 pb).
Figura 17: Oligonucleotídeos utilizados para amplificar o fragmento contendo a seqüência codante do
scFv anti-CD18. Em verde se encontram as seqüências dos sítios de restrição, em sublinhado a do
peptídeo-sinal de α-coixina e em negrito as de anelamento no cDNA do scFv anti-CD18.
Figura 18: Demonstração da obtenção do fragmento EcoRV-PS-Anti-CD18-BamHI (1.046 pb).
Figura 19): Demonstração da construção do plasmídeo de expressão pFASPSAnti-CD18 (5.092 pb).
Figura 20: Fragmento contendo o gene ahas, utilizado como marcador de seleção nos experimentos
de co-transformação de soja.
- xi -
Figura 21: Reação de PCR demonstrando a amplificação de um fragmento de aproximadamente 701
pb interno ao gene da pró-insulina humana. 1 e 2 correspondem às sementes transgênicas das
linhagens 194 e 195; 3 à semente não-transgênica da mesma linhagem 195; 4 à semente
sabidamente não-transformada (controle negativo) controle negativo; 5 à água; 6 ao plasmídeo
pFASPSproINS e 7 ao marcador de peso molecular 1 kb DNA ladder® (Invitrogen).
Figura 22: Reação de PCR demonstrando a amplificação de um fragmento de aproximadamente 328
pb interno ao gene do hGH. 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 11 correspondem a sementes transgênicas das
linhagens 23 /01, 23/03, 23/06, 23/09 e 23/19; 3, 4 e 12 a sementes não-transgênicas das linhagens
23 /01 e 23/19; 13 ao controle negativo; 14 à água; 15 ao plasmídeo pFasGH e 16 ao marcador de
peso molecular 1 kb DNA ladder® (Invitrogen).
Figura 23: Reação de PCR demonstrando a amplificação de um fragmento de aproximadamente 495
pb interno ao gene do FIX humano. 1, 3, 4, 5, 6 e 7 correspondem a sementes transgênicas das
linhagens 01, 07, 51, 73, 101 e 107; 2 à semente não-transgênica da linhagem 01; 8 ao controle
negativo; 9 à água; 10 ao plasmídeo pFASPSFIX e 11 ao marcador de peso molecular 1 kb DNA
ladder® (Invitrogen).
Figura 24: Reação de PCR demonstrando a amplificação de um fragmento de aproximadamente 450
pb interno ao gene do scFv DIR83D4. 1, 2, 3, 4 e 5 correspondem a sementes transgênicas da
linhagem 13/27; 6 ao controle negativo; 7 à água; 8 ao plasmídeo pFASPSscFvDIR83D4 e 9 ao
marcador de peso molecular 1 kb DNA ladder® (Invitrogen).
Figura 25: Reação de PCR demonstrando a amplificação de um fragmento de aproximadamente 517
pb interno ao gene do scFv anti-CD18. 1, 3, 4, 6 e 11 correspondem a sementes transgênicas das
linhagens 12, 26, 61 e 68; 2, 5, 7, 8, 9 e 10 a sementes não-transgênicas das mesmas linhagens; 12
ao controle negativo; 13 à água; 14 ao plasmídeo pFASPSAnti-CD18 e 15 ao marcador de peso
molecular 1 kb DNA ladder® (Invitrogen).
Figura 26: Southern blot de plantas R1 de três linhagens distintas transformadas com o plasmídeo
pFasGH. 1, 2 e 3 correspondem a plantas da linhagem 23/01; 4, 5, 6, 7 e 8 a plantas da linhagem
23/03; 9, 10, 11, 12 e 13 a plantas da linhagem 23/09; 14 a uma planta sabidamente não-transgênica
(controle negativo); 15 ao plasmídeo pFasGH de 4. 786 pb (100 pg); 16 ao marcador de peso
molecular 1 kb DNA ladder® (Invitrogen).
Figura 27: Southern blot de plantas R1 de duas linhagens distintas transformadas com o plasmídeo
pFASPSFIX. 1 corresponde à planta da linhagem 51; 2 à planta da linhagem 171; 3 ao controle
negativo; 4 ao plasmídeo pFASPSFIX de 5.458 pb (100 pg) e 5 ao marcador de peso molecular 1 kb
DNA ladder® (Invitrogen).
Figura 28: Southern blot de plantas R1 da linhagem 13/27 transformada com o plasmídeo
pFASPSscFvDIR. 1, 2, 3, 4 e 5 correspondem a plantas da linhagem transgênica; 6 ao controle
negativo e 7 ao plasmídeo pFASPSscFvDIR de 4.826 pb (100 pg).
Figura 29: Análise de RT-PCR de sementes verdes R2, PCR positivas para o gene do hGH. 1, 2, 3 e
4 correspondem respectivamente às sementes transgênicas das linhagens 23/01, 23/03, 23/09 e
23/19; 5 à semente de uma planta sabidamente não-transformada (controle negativo); 6 à água; 7 ao
plasmídeo pFasGH e 8 ao marcador de peso molecular 1 kb DNA ladder® (Invitrogen).
Figura 30: Análise de RT-PCR de sementes verdes R2, PCR positivas para o gene do FIX. 1, 2 e 3
correspondem respectivamente às sementes transgênicas das linhagens 01, 07 e 171; 4 ao controle
negativo; 5 à água; 6 ao plasmídeo pFASPSFIX e 7 ao marcador de peso molecular 1 kb DNA
ladder® (Invitrogen).
Figura 31: Análise de RT-PCR de sementes verdes R5, PCR positivas para o gene do scFv
DIR83D4. 1 e 2 correspondem a sementes transgênicas da linhagem 13/27; 3 ao controle negativo; 4
à água; 5 ao plasmídeo pFASPSscFvDIR e 6 ao marcador de peso molecular 1 kb DNA ladder®
(Invitrogen).
Figura 32: Detecção do hGH em sementes transgênicas R1. 1, 2 e 3 correspondem respectivamente
a 100 µg de extratos protéicos de sementes das linhagens 23/19, 23/09 e 23/03; 4 a 100 µg de
- xii -
semente sabidamente não-transformada (controle negativo); 5 a 100 ng de hGH purificado de E. coli
e 6 ao marcador de massa molecular All Blue® (Bio-Rad).
Figura 33: Detecção do FIX humano em sementes transgênicas R1. 1, 2 e 3, correspondem
respectivamente a 100 µg de extratos protéicos de sementes das linhagens 01, 07 e 51; 4 e 5 a
sementes da linhagem 171; 6 a 100 µg de controle negativo; 7 a 40 ng de FIX comercial (SIGMA) e 8
ao marcador de massa molecular All Blue®(Bio-Rad).
Figura 34: Detecção do scFv DIR83D4 em sementes transgênicas R5. 1, 2, 3 e 4 correspondem
respectivamente a 100 µg de extratos protéicos de sementes da linhagem 13/27; 5 a 100 µg de
controle negativo; 6 a 300 ng de scFv DIR83D4 purificado de E. coli e 7 ao marcador de massa
molecular All Blue® (Bio-Rad).
Figura 35: Detecção do Anti-CD18 em sementes transgênicas R1. 1 e 2, correspondem a 90 µg de
extratos protéicos de sementes da linhagem 12; 3 e 4 à mesma massa de sementes da linhagem 26;
5 ao controle negativo e 6 ao marcador de massa molecular All Blue® (Bio-Rad).
Figura 36: Avaliação da cinética de expressão do hGH em sementes transgênicas em diferentes
estágios de maturação fisiológica. 1, 2, 3 e 4 correspondem a 80 µg de extratos protéicos de
sementes R1 PCR positivas (linhagem 23/19), que apresentam diferentes níveis de acúmulo do
hormônio.
Figura 37: Avaliação da cinética de expressão do FIX em sementes transgênicas em diferentes
estágios de maturação fisiológica. 1, 2, 3 e 4 correspondem a 80 µg de extratos protéicos de
sementes R1 PCR positivas (linhagem 07), que apresentam diferentes níveis de acúmulo do fator de
coagulação.
Figura 38: Avaliação da cinética de expressão do scFv DIR83D4 em sementes transgênicas em
diferentes estágios de maturação fisiológica. 1, 2, 3 e 4 correspondem a 80 µg de extratos protéicos
de sementes R5 PCR positivas (linhagem 13/27), que apresentam diferentes níveis de acúmulo do
anticorpo.
Figura 39: Imunocitoquímica de seções ultra-finas de cotilédones, mostrando o acúmulo subcelular
da pró-insulina em sementes R1 de soja transgênica. CP = Corpos Protéicos; CO = Corpos de Óleo.
1 e 2 correspondem a sementes transgênicas da linhagem 194; 3 à semente transgênica da linhagem
195 e 4 à semente não-trasngênica (controle negativo).
Figura 40: Imunocitoquímica de seções ultra-finas de cotilédones, mostrando o acúmulo subcelular
do hGH em sementes R1 de soja transgênica. CP = Corpos Protéicos; CO = Corpos de Óleo; PC =
Parede Celular. 1 e 2 correspondem a sementes transgênicas da linhagem 23/19; 3 à semente
transgênica da linhagem 23/09 e 4 à semente não-trasngênica (controle negativo).
Figura 41: Imunocitoquímica de seções ultra-finas de cotilédones, mostrando o acúmulo subcelular
do FIX em sementes R1 de soja transgênica. CP = Corpos Protéicos; CO = Corpos de Óleo. 1 e 2
correspondem a sementes transgênicas da linhagem 07; 3 à semente transgênica da linhagem 171 e
4 à semente não-trasngênica (controle negativo).
Figura 42: Imunocitoquímica de seções ultra-finas de cotilédones, mostrando o acúmulo subcelular
do scFv DIR83D4 em sementes R5 de soja transgênica. CP = Corpos Protéicos; CO = Corpos de
Óleo; PC = Parede Celular. 1, 2 e 3 correspondem a sementes transgênicas da linhagem 13/27 e 4 à
semente não-trasngênica (controle negativo).
Figura 43: Imunocitoquímica de seções ultra-finas de cotilédones, mostrando o acúmulo subcelular
do anti-CD18 em sementes R1 de soja transgênica. CP = Corpos Protéicos; CO = Corpos de Óleo;
MP = Membrana Plasmática; PC = Parede Celular. 1 e 2 correspondem a sementes transgênicas da
linhagem 12; 3 à semente da linhagem 26 e 4 à semente não-trasngênica (controle negativo).
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Proteínas de potencial interesse comercial produzidas em sistema vegetal.
Tabela 2: Importantes proteínas farmacêuticas produzidas em plantas transgênicas.
Tabela 3: Seqüência de oligonucleotídeos utilizados como primers para análise de PCR.
Tabela 4: Pares de primers utilizados e o tamanho dos fragmentos amplificados.
Tabela 5: Linhagens transgênicas de soja obtidas por biobalística.
Tabela 6: Estimativas de concentração de três proteínas heterólogas em sementes transgênicas.
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
µm: Micrometro
µmoles; Micromoles
µg: Micrograma
µL: Microlitro
µM: Micromolar
A. thaliana: Arabidopsis thaliana
A. tumefaciens: Agrobacterium tumefaciens
Arg 32: Arginina 32
Arg 65: Arginina 65
BAP: 6-Benzilaminopurina
BCIP: 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato
C. jobi: Coix Lacyima jobi
CaMV: Cauliflower mosaic virus
CBMEG: Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética
cDNA: DNA complementar
Cenargem: Centro Nacional de Recursos Genéticos e Biotecnologia
Ci/mol: Curie por mol
CNA: Confederação Nacional da Agricultura
CNPSo: Centro Nacional de Pesquisa de Soja
CO: Corpo de Óleo
CONAB: Companhia Nacional de Abastecimento
CP: Corpo Protéico
CTAB: (brometo de cetil-trimetil-amônio)
C-terminal: Carboxi terminal
cv: Cultivar
dm3: Decímetro cúbico
DNA: Ácido desoxirribonucléico
dNTP: Desoxinucleotídeos 5’-trifosfato
E. coli: Escherichia coli
Embrapa: Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
EPSPS: 5-enol-piruvil-shiquimato-3-fosfato sintase
EPAMIG; Empresa de Pesquisa Agropecuáia de Minas Gerais
ETEC: enterotoxigenic E. coli
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FDA: Food and Drug Administration
FIX: Fator IX de coagulação sangüínea
FVII: Fator VII de coagulação sangüínea
FVIII: Fator VIII de coagulação sangüínea
FX: Fator X de coagulação sangüínea
FXI: Fator XI de coagulação sangüínea
FXIII: Fator XIII de coagulação sangüínea
GenBank: NIH genetic sequence database
Gly4: Glycine 4
GUS: Glucuronidase
ha: Hectare
HBV: Hepatitis B virus
HCl: Ácido clorídrico
HCMV: Human cytomegalovirus
hGH: human growth hormone
HMGR2: hidroxi-3-metilglutaril-Coa-redutase de tomate
Kb: Kilobases
KCl: Cloreto de potássio
kDa: Kilodalton
Kg: Kilograma
KH2PO4: Dihidrogenofosfato de potássio
LT-B: subunidade B da toxina termolábil
LTG: Laboratório de Transferência de Genes
M: Molar
Ma: miliampere
mg/L: miligrama por litro
Mg: Miligrama
MgCl2: Cloreto de magnésio
mM: Milimolar
MP: Membrana Plasmática
mRNA: RNA mensageiro
MS: Murashige & Skoog
Na2HPO4: Fosfato de sódio dibásico
NaCl: Cloreto de sódio
NBT: Nitro blue tetrazolium
ND: Não Determinado
ng/µL: Nanograma por microlitro
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ng: Nanograma
N-terminal: Amino terminal
ºC: Graus Celsius
Pb: Pares de bases
PC: Parede Celular
PCR: Reação em cadeia da polimerase
PDB: Protein Data Bank
pH: Potencial hidrogeniônico
PIB: Produto Interno Bruto
PST: Proteínas Solúveis Totais
PSTF: Proteínas Solúveis Totais de Folhas
RE: Retículo Endoplasmático
RNA: Ácido ribonucléico
scFv: single-chain fragment variable
Ser1: Serine 1
sp.: specie
TBSV: Tomato bushy stunt virus
T-DNA: DNA de transferência
U: Unidade enzimática
UCB: Universidade Católica de Brasília
UnB: Universidade de Brasília
Unicamp: Universidade Estadual de Campinas
US$: Dólar
UV: Ultra Violeta
V: Volts
VH: domínio variável da cadeia pesada
VL: domínio variável da cadeia leve
- xvii -
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS .............................................................................................................vi
RESUMO..................................................................................................................................ix
ABSTRACT............................................................................................................................... x
LISTA DE FIGURAS ..............................................................................................................xi
LISTA DE TABELAS ............................................................................................................xiv
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ............................................................................. xv
1) INTRODUÇÃO..................................................................................................................... 1
1.1) A cultura da soja.............................................................................................................. 1
1.1.1) A planta .................................................................................................................... 1
1.1.2) Composição nutricional ........................................................................................... 2
1.1.3) Importância econômica ............................................................................................ 3
1.1.4) Melhoramento genético............................................................................................ 3
1.2) Sistemas de expressão de proteínas heterólogas ............................................................. 5
1.3) Propriedades gerais de biorreatores vegetais .................................................................. 9
1.4) Tipos de biorreatores vegetais....................................................................................... 13
1.4.1) Plantas agroinfiltradas ............................................................................................ 14
1.4.2) Plantas infectadas por vírus transgênicos............................................................... 14
1.4.3) Suspensão de células transgênicas ......................................................................... 15
1.4.4) Plantas transgênicas ............................................................................................... 16
1.5) Técnicas de transformação genética de plantas.............................................................17
1.6) Transformação genética de soja ....................................................................................20
1.7) Plantas transgênicas como biorreatores de fármacos: “Plant Molecular Pharming” .... 21
1.7.1) Biofármacos humanos ............................................................................................ 24
1.7.2) Anticorpos recombinantes...................................................................................... 25
1.7.3) Subunidades de vacinas recombinantes ................................................................. 27
1.8) Estratégias moleculares para aumento de produção de proteínas heterólogas em plantas
.............................................................................................................................................. 28
1.8.1) Estratégias a nível transcricional............................................................................ 29
1.8.2) Minimização do silenciamento pós-trancricional ..................................................30
1.8.3) Otimização da tradução..........................................................................................31
1.8.4) Estabilidade protéica pós-traducional .................................................................... 32
1.9) Promotores tecido-específicos: expressão de proteínas heterólogas em sementes ....... 32
1.9.1) O promotor da β-faseolina de feijão....................................................................... 34
1.10) Endereçamento subcelular - Protein Targeting ...........................................................35
1.10.1) Endereçamento para o apoplasto..........................................................................36
1.10.2) Endereçamento para o retículo endoplasmático...................................................36
1.10.3) Endereçamento para os cloroplastos ....................................................................38
1.10.4) Endereçamento para os corpos protéicos ............................................................. 39
1.11) O peptídeo-sinal de α-coixina ..................................................................................... 40
1.12) A pró-insulina humana ................................................................................................ 41
1.13) O hormônio de crescimento humano ― hGH............................................................. 45
1.14) O fator IX de coagulação sangüínea humana ― FIX ................................................. 48
1.15) O anticorpo scFv DIR83D4 ........................................................................................52
1.16) O anticorpo scFv anti-CD18 ....................................................................................... 55
2) OBJETIVOS ....................................................................................................................... 59
2.1) Objetivo geral................................................................................................................ 59
2.2) Objetivos específicos.....................................................................................................59
3) JUSTIFICATIVAS.............................................................................................................. 60
- xviii -
4) MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................................... 61
4.1) Construção dos vetores plasmidiais de expressão......................................................... 61
4.1.1) Construção do vetor pFasPSProins ........................................................................ 61
4.1.2) Construção do vetor pFasGH ................................................................................. 62
4.1.3) Construção do vetor pFasFIX ................................................................................ 63
4.1.4) Construção do vetor pFASPSscFvDIR ..................................................................66
4.1.5) Construção do vetor pFASPSAnti-CD18............................................................... 67
4.2) Obtenção do fragmento contendo o gene ahas.............................................................. 70
4.3) Transformação de soja .................................................................................................. 70
4.3.1) Esterilização de sementes e preparo do material vegetal .......................................70
4.3.2) Bombardeamento ................................................................................................... 71
4.3.3) Indução de multibrotação ....................................................................................... 71
4.3.4) Seleção dos explantes............................................................................................. 71
4.4) Reação em cadeia da polimerase (PCR) ....................................................................... 72
4.5) Avaliação da progênie................................................................................................... 73
4.5.1) Análise por Southern blot....................................................................................... 74
4.5.2) Análise por RT- PCR ............................................................................................. 74
4.5.3) Análises por western blot ....................................................................................... 75
4.5.4) Análises de imunocitoquímica ............................................................................... 76
5) RESULTADOS .................................................................................................................. 78
5.1) Linhagens transgênicas obtidas..................................................................................... 78
5.2) Análise das progênies por PCR..................................................................................... 79
5.3) Análise das progênies por Southern blot....................................................................... 81
5.4) Análise das progênies por RT- PCR ............................................................................. 82
5.5) Análise de western blot de sementes transgênicas ........................................................ 84
5.6) Estimativa de acúmulo do hGH, FIX e scFv DIR83D4 em sementes transgênicas......86
5.7) Cinética de acúmulo das proteínas heterólogas............................................................. 86
5.8) Ensaios de imunocitoquímica de sementes maduras .................................................... 88
6) DISCUSSÃO ...................................................................................................................... 94
7) CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS ............................................................................ 103
8) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................. 104
- xix -
1) INTRODUÇÃO
1.1) A cultura da soja
1.1.1) A planta
A soja é uma planta herbácea pertencente à classe Dicotyledoneae,
subclasse Archichlamydeae, ordem Rosales, subordem Leguminosinae, família
Leguminosae, subfamília Papilionaceae, tribo Phaseoleae, gênero Glycine L.,
subgênero Glycine (Moench) e espécie Glycine max (L.) (Gazzoni, 1994).
Seu centro de origem primário é a região centro-sul da China, sendo a
Manchúria ― região do nordeste chinês onde se deu o processo de domesticação
da cultura ― seu centro de origem secundário (Xu et al., 1989).
É uma espécie diplóide (2n = 40) (Vernetti, 1983), essencialmente autógama
(Kar & Sen, 1991), com flores perfeitas, cujos órgãos masculinos e femininos são
protegidos pela corola, o que minimiza a possibilidade de ocorrência de polinização
cruzada entre flores de plantas distintas.
Apesar de o fluxo gênico entre plantas não ser descartado o mesmo é
bastante restrito, uma vez que a freqüência de polinização cruzada, realizada por
insetos ― principalmente abelhas, é menor que 1% (Abud et al., 2007).
Dentre as espécies silvestres ou nativas pertencentes ao gênero Glycine que
possuem a capacidade de intercruzamento com Glycine max, nenhuma ocorre
naturalmente no Brasil (Abud et al., 2003).
A soja é uma planta extremamente versátil, capaz de associar seu sistema
radicular com bactérias do solo (Rhizobium sp., Bradyrhizobium sp.) fixadoras de
nitrogênio atmosférico para a biossíntese de moléculas aminadas, como bases
nitrogenadas, aminoácidos e co-enzimas, reduzindo a necessidade de utilização de
fertilizantes nitrogenados (Castro et al., 1993).
Essa propriedade não só desonera sensivelmente a produção, como reduz os
riscos de contaminação do solo, da água e do próprio agricultor com uréia, amônia e
outras moléculas constituintes dessa classe de fertilizantes.
-1-
Outra característica importante dessa leguminosa é a sua sensibilidade ao
fotoperíodo, expressa na modulação temporal da fase vegetativa do seu ciclo
fenológico em função do tempo e da intensidade de iluminação diários.
Períodos superiores a treze horas diárias de luz incidente resultam em
aumento de emissão de ramos e folhas a partir de gemas laterais localizadas no
colmo da planta.
Como a diferenciação de tecidos florais e conseqüentemente de vagens
ocorre justamente nas junções entre os ramos e as folhas, a produção de sementes
por planta pode ser aumentada sobremaneira em condições controladas em casa de
vegetação (Kantolic & Slafer, 2007).
Devido em grande parte à diversidade de germoplasma da cultura, o ciclo
fenológico da soja varia de 70 dias para as cultivares precoces até 200 dias para as
tardias. Dependendo da região brasileira o mesmo pode variar entre 100 e 160 dias,
dando origem a diversos grupos de cultivares, classificadas quanto à época de
maturação em precoces, semiprecoces, médias, semitardias e tardias (Lima et al.,
2007).
1.1.2) Composição nutricional
De acordo com dados do Centro Nacional de Pesquisa de Soja (CNPSo, 2004
- www.cnpso.embrapa.br), a composição nutricional do grão corresponde a 19% de
lipídios, 23% de carboidratos, 15% de fibra alimentar e 38% de proteínas.
Em função do alto conteúdo protéico estocado na semente a soja é
caracterizada como uma acumuladora natural de proteínas de reserva utilizadas
para a nutrição parcial do embrião ainda no estágio de plântula, durante a fase de
germinação.
Além de importante fonte protéica a soja, juntamente com o milho, a colza e o
girassol, é classificada agronomicamente como pertencente ao grupo das
oleaginosas e utilizada tanto no consumo humano quanto no arraçoamento de
bovinos, suínos e aves.
-2-
1.1.3) Importância econômica
Em função da grande versatilidade de utilização do grão, a demanda e o
consumo mundial da soja e de seus derivados industriais superam 180 milhões de
toneladas/ano, o que justifica sua posição como uma das principais commodities
mundiais.
Uma característica que justifica essa posição é o fato de que o preço de
comercialização da cultura é determinado pela negociação nas principais bolsas
internacionais de mercadorias antes mesmo do plantio da safra de sucessão.
O agronegócio brasileiro movimentou em 2006 mais de 540 bilhões de reais,
valor correspondente a 23,3% do Produto Interno Bruto (PIB) nacional, sendo o
complexo-soja (grão, farelo e óleo) o segmento mais importante do setor e principal
estabilizador
da
balança
comercial
do
país
(CNA,
2007
-
http://www.cna.org.br/cna/index.wsp).
O Brasil é o segundo produtor mundial de soja com 58,4 milhões de toneladas
produzidas na safra de 2006, o que representa cerca de 24% da produção mundial.
A área plantada nesse ano atingiu 20,68 milhões de hectares ― 1,3% maior
que no ano anterior ― e a produtividade média alcançou 2,82 kg/ha (CONAB, 2007 http://www.conab.gov.br/conabweb/download/safra/estudo_safra.pdf).
Os Estados Unidos são os maiores produtores do grão, com uma produção
equivalente a 86,77 milhões de toneladas na safra 2006/2007 (CNPSo, 2007).
Desde 1994 o complexo-soja é o principal item na pauta das exportações
brasileiras, posicionando o país na liderança mundial de exportações do grão, com
25 milhões de toneladas exportadas (CNA, 2007).
A movimentação financeira em torno das exportações de soja brasileira foi
estimada em US$ 9.3 bilhões em 2006, refletindo claramente o sucesso e a
competitividade do produto brasileiro no mercado internacional (CNA, 2007).
1.1.4) Melhoramento genético
Nas últimas três décadas o Brasil experimentou uma sensível expansão de
suas fronteiras agrícolas. Isso se deve em grande parte ao desenvolvimento de
cultivares de soja adaptadas às baixas latitudes e a condições edafo-climáticas das
mais diversas regiões do país.
-3-
Atualmente o cultivo da soja atinge desde o estado de Roraima até o Rio
Grande do Sul, apresentando um aumento significativo do cultivo extensivo na
região do Cerrado.
Os principais objetivos do melhoramento genético da soja, que originalmente
na década de 70 visavam à adaptação às condições edafo-climáticas de diferentes
regiões brasileiras, gradualmente se converteram na obtenção de ganhos de
produtividade e uma maior estabilidade do rendimento da cultura.
Além disso, ganhou destaque também a necessidade de maior adaptação
das plantas a condições ambientais adversas, a efetiva resistência/tolerância a
doenças e pragas e a redução da sensibilidade ao fotoperíodo.
A obtenção de variabilidade genética para exploração nos programas de
melhoramento brasileiros tem se baseado na seleção de parentais para cruzamentos
e retrocruzamentos com base nas regiões nacionais e em métodos de
melhoramento típicos para plantas autógamas, como a seleção de plantas
individuais com teste de progênie e os métodos de seleção populacionais e
genealógicos (CNPSo, 2004).
Dentre as cultivares melhor adaptadas para a região Centro-Oeste
desenvolvidas pela Embrapa, juntamente com parceiras como a EPAMIG (Empresa
de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais), destaca-se a de ciclo médio (completo
em até 130 dias após a semeadura) Conquista, que possui características voltadas
para a manutenção da estabilidade do rendimento ― como resistência a
fitopatógenos que causam sérios prejuízos ao produtor e perdas na cultura,
principalmente os causadores de doenças fúngicas como o Oídio (Sphaerotheca
fugilinea), a Mancha “olho-de-rã” (Cercospora sojina) e o Cancro da haste
(Phomopsis phaseoli f. sp.; Diaporthe phaseolorum f. sp. meridionalis) e também
doenças bacterianas como a Pústula bacteriana (Xanthomonas campestris).
As cultivares de soja lançadas mais recentemente pela Embrapa, tais como a
de ciclo precoce (até 120 dias após a semeadura) BR-16, possuem características
especiais para o consumo humano e para a indústria de alimentos, refletindo uma
demanda crescente por produtos com maior valor agregado (CNPSo, 2004).
O atual direcionamento dos esforços dos melhoristas de soja se concentra na
redução de custos de produção e numa maior agregação de valor ao produto,
visando o aumento da lucratividade da cultura.
-4-
1.2) Sistemas de expressão de proteínas heterólogas
Entende-se como proteína heteróloga aquela produzida em organismos
diferentes daqueles de sua origem (Cançado, 2002).
Há um grande número de diferentes sistemas de expressão de proteínas
heterólogas, dentre os quais os que utilizam células de bactérias, de leveduras,
cultura de células de plantas, insetos e mamíferos; além de plantas e animais
transgênicos.
O sistema mais amplamente utilizado é o bacteriano, cujos rendimentos de
produção de proteínas recombinantes são os maiores já descritos dentre todos os
demais. Células bacterianas transgênicas em meio de cultura apresentam rapidez de
biossíntese, baixos custos e alta capacidade de escalonamento de produção (Leite
et al., 2001).
Esse sistema apresenta desvantagens principalmente no que diz respeito à
expressão de proteínas que requerem processamentos e modificações póstraducionais complexas (principalmente glicosilação) e que necessitem da
manutenção de suas estruturas originais íntegras, sem adições ou remoções de
resíduos de aminoácidos que possam comprometer sua função e especificidade
naturais (Twyman et al., 2003).
Há ainda a possibilidade de proteínas recombinantes expressas em células
bacterianas serem tóxicas para o organismo, resultando em baixos níveis de
produção.
Geralmente as proteínas expressas em bactérias retém o resíduo de
metionina ― derivado do resíduo de formil-metionina adicionado no início do
processo de tradução ― na extremidade amino-terminal. A remoção do radical formil
é realizada de maneira eficiente pela bactéria, o que não ocorre com o resíduo de
metionina (Spector et al., 2003).
As causas para a não-remoção da metionina estão relacionadas à natureza
do resíduo adjacente na porção N-terminal e ao nível de expressão da proteína
heteróloga.
Resíduos adjacentes grandes e possuidores de carga dificultam a remoção e
o processamento da metionina terminal, enquanto que o alto rendimento de
produção da proteína heteróloga satura o processo, diminuindo a eficiência de
remoção independentemente da natureza do aminoácido vizinho (Leite et al., 2001).
-5-
Para solucionar esse problema foram desenvolvidas estratégias visando à
remoção do resíduo de metionina em polipeptídios recombinantes produzidos em
sistema bacteriano. A utilização da enzima metionil-aminopeptidase catalisa
eficientemente a remoção da metionina terminal in vitro. Pode-se também expressar
essa enzima conjuntamente com a proteína recombinante de interesse na célula
bacteriana (Spector et al., 2003).
Com a finalidade de não onerar o processo de remoção foram desenvolvidas
estratégias alternativas como a inclusão, na extremidade N-terminal, de seqüências
denominadas líderes de secreção, as quais permitem a remoção do fragmento
adicional no espaço periplasmático mediante o direcionamento da proteína
recombinante para essa região (Wong, 1995).
Outra estratégia alternativa é a utilização de proteínas de alta massa
molecular fusionadas à extremidade amino-terminal que removem as inclusões (no
caso o resíduo de formil-metionina) na proteína recombinante (Tang et al., 2004).
Apesar de eficientes, essas estratégias promovem um sensível decréscimo no
rendimento de produção de proteína recombinante.
Outra desvantagem dos sistemas de expressão bacterianos é a formação de
agregados de proteínas desnaturadas, denominados corpúsculos de inclusão
(Garcia-Fruitos et al., 2007), os quais protegem as proteínas recombinantes.
A utilização de agentes desnaturantes para a solubilização das proteínas
“engaioladas” pode resultar em danos estruturais e dificuldades de recuperação das
cadeias polipeptídicas, além de representar um sensível aumento nos custos de
processamento pós-síntese.
Além das desvantagens mencionadas anteriormente, a possibilidade de
contaminação de amostras por endotoxinas bacterianas e os custos moderados com
a estocagem de biorreatores bacterianos representam importantes fatores que
devem ser levados em consideração na escolha de um sistema-alvo para a
produção de polipeptídeos heterólogos complexos (Ma et al., 2003).
O mais antigo sistema de expressão eucariótico é o que utiliza células de
levedura, notadamente as da espécie Saccharomyces cerevisiae, o qual vem sendo
substituído pela produção em Pichia pastoris, a espécie eucariótica que apresenta
os maiores rendimentos médios de produção de proteína recombinante.
Assim como os sistemas de expressão bacterianos, os que utilizam células de
levedo são relativamente econômicos, mas apresentam as desvantagens de
-6-
freqüentemente hiperglicosilarem as proteínas recombinantes e de as mesmas
serem instáveis e insolúveis quando produzidas abundantemente (Twyman et al.,
2003).
A adição de resíduos de prolina próximos aos sítios-alvo de glicosilação de
levedura e estruturalmente distantes de domínios importantes para a função da
proteína heteróloga nascente, parece inibir o processo de adição catalítica de
glicanos N-ligados, tipicamente promovida tanto por Saccharomyces cerevisiae
quanto por Pichia pastoris (Roitsch & Lehle, 1989).
A humanização de células de leveduras geneticamente modificadas, através
do nocaute de genes codificadores de glicosidases específicas do organismo
unicelular e a introdução e expressão de genes de glicosilação humana é a mais
recente e eficiente estratégia para solucionar esse problema, apesar de encarecer
significativamente o processo (Hamilton et al., 2006).
O sistema de expressão que utiliza células de inseto transgênicas baseia-se
na infecção das mesmas por baculovirus geneticamente modificado, o qual possui,
integrado ao seu genoma, o cassete de expressão contendo o gene codificador da
proteína de interesse controlado por um potente promotor viral e pelo seu terminador
correspondente (Stoger et al., 2005).
Esse sistema permite o enovelamento e a montagem protéica corretos, além
da promoção de modificações pós-traducionais como glicosilação e γ-carboxilação,
sendo indicado para a produção de glicoproteínas recombinantes de interesse
clínico, tais como antígenos virais, hormônios, fatores de crescimento e coagulação
sangüínea.
A utilização de células de mamíferos como veículos de expressão de
proteínas recombinantes complexas também já foi demonstrada ser eficiente e
interessante para essa finalidade (Capell & Christou, 2004).
Entretanto, a utilização de ambos implica na necessidade da manutenção das
células transgênicas sob condições especiais proporcionadas por meios de cultura
complexos e a utilização de reatores sofisticados, o que acaba por onerar
drasticamente o processo.
Além disso, esses sistemas apresentam outras desvantagens em comum,
como baixos rendimentos e longo tempo de produção de proteínas heterólogas, a
baixa capacidade de escalonamento de biossíntese, altos custos de armazenamento
-7-
e a possibilidade de contaminação das amostras com vírus, príons e oncogenes
animais (Hamilton et al., 2006).
Eucariotos superiores transgênicos vêm sendo apontados como possíveis
alternativas para a produção de proteínas de interesse farmacológico, uma vez que
os níveis de expressão e a qualidade do produto final em termos estruturais e de
processamento pós-traducional são bastante elevados (Leite et al., 2001).
Um dos sistemas propostos baseia-se na secreção dessas proteínas no leite
de caprinos, ovinos, suínos, coelhos e bovinos transgênicos (Larrick & Thomas,
2001), os quais possuem integrados aos seus genomas os genes de interesse
controlados por promotores que restringem a expressão da proteína heteróloga às
células das glândulas mamárias.
Alguns fármacos importantes para a saúde humana já foram eficientemente
produzidos nesse sistema, como o ativador de plasminogênio tecidual (Gordon et al.,
1987; Pittius et al., 1988), os fatores VIII e IX da coagulação sangüínea (Chrenek et
al., 2007; Clark et al., 1989) e a uroquinase (Meade et al., 1990).
A principal inconveniência da utilização de biorreatores animais é a restrição
da produção do fármaco recombinante às fêmeas em fase de lactação.
Para solucionar esse problema foi demonstrada a possibilidade de secreção
das proteínas heterólogas na urina de animais transgênicos portando as seqüências
codificadoras sob controle de promotores tecido-específicos.
Essas seqüências regulatórias restringem a expressão protéica às células
endoteliais da bexiga desses animais. Camundongos transgênicos secretando o
hormônio de crescimento humano em sua urina representam a primeira
demonstração concreta dessa possibilidade (Kerr et al., 1998).
Dentre todos os sistemas de expressão desenvolvidos até o momento os que
utilizam animais transgênicos representam o conjunto mais caro, tanto do ponto de
vista produtivo quanto de estocagem, com maior tempo de produção e menor
capacidade de escalonamento de biossíntese de proteínas heterólogas (Twyman et
al., 2003).
Outra grande limitação da utilização desse tipo de sistema é o risco de
contaminação da amostra por vírus animais e príons (Larrick & Thomas, 2001), o
que exige a purificação rigorosa das proteínas recombinantes secretadas.
As atenções voltam-se então para sistemas de expressão de fármacos
recombinantes que sejam eficientes e que possibilitem tanto o dobramento e a
-8-
montagem corretos de proteínas heterólogas complexas, como o correto
processamento
pós-traducional
dessas
moléculas
e
que
possuam,
comparativamente, vantagens em termos de biossegurança e menor custo de
produção em larga escala – características típicas de biorreatores vegetais.
1.3) Propriedades gerais de biorreatores vegetais
A produção de proteínas heterólogas em sistema vegetal tem se mostrado
atraente por diversos aspectos relacionados tanto a benefícios econômicos quanto
qualitativos.
O sucesso comercial de alguns produtos da primeira geração de plantas
transgênicas, que acabam de chegar ao mercado, e o avançado estágio de
desenvolvimento de muitos outros ― sintetizados em inúmeras espécies de plantas
superiores ― confirmam o enorme potencial desse sistema de expressão.
Os vegetais se constituem num dos sistemas mais econômicos para a
produção em larga escala de proteínas de interesse farmacológico, representando
de 2 a 10% dos custos de sistemas de fermentação eucarióticos, cerca de 0,1% dos
de cultura de células de mamíferos (Twyman et al., 2003) e uma redução de 10 a 50
vezes em relação ao custo final do sistema bacteriano (Kusnadi et al., 1997).
Essa economia se deve principalmente à eliminação do uso de fermentadores
caros, ao fato de os vegetais representarem a biomassa de menor custo da
natureza, à capacidade de escalonamento da produção, ao estabelecimento prévio
das práticas de colheita, transporte, armazenamento e processamento do material
vegetal, à possibilidade de compartimentalização das proteínas em organelas típicas
de células vegetais, à presença de órgãos naturais de armazenamento de proteínas
― como sementes, tubérculos e rizomas ― e à eliminação ou redução da
necessidade de purificação sofisticada da proteína recombinante quando o tecido
armazenador é consumido in natura (Kusnadi et al., 1997).
Sistemas vegetais de produção de fármacos possibilitam ainda a modulação e
o escalonamento da produção protéica de acordo com a demanda pelo polipeptídeo
e o ciclo da cultura ― geralmente mais curto que o de mamíferos de grande porte
secretores no leite ou urina.
-9-
Basicamente os métodos de purificação e “downstream processing” de
proteínas recombinantes são similares independentemente do sistema de produção
utilizado, representando mais de 85% do custo total de produção desses fármacos
(Twyman et al., 2003).
A ausência de patógenos comuns ao homem e às plantas representa uma
clara fonte de redução de custos além de uma vantagem qualitativa e de
biossegurança, uma vez que a necessidade de purificação acurada dos
polipeptídeos recombinantes produzidos em sistema vegetal é bastante reduzida se
comparada aos produzidos em células de mamíferos e microorganismos, fontes
carreadoras potenciais de toxinas e diversos outros contaminantes (Giddings, 2001).
Além disso, plantas cujas folhas, frutos, tubérculos e sementes são
consumidos in natura são potenciais candidatos a funcionarem como biofábricas de
antígenos de imunização humana e veterinária, constituindo promissores veículos de
expressão de subunidades de vacinas (Floss et al., 2007).
Do ponto de vista qualitativo fatores como a alta conservação do processo de
síntese, secreção e modificação pós-traducional ― enovelamento protéico,
oligomerização, glicosilação no Retículo Endoplasmático (RE) e processamento no
Complexo de Golgi ― em sistemas vegetais e animais, havendo somente diferenças
quanto ao padrão de glicosilação, aproximam bastante o modo como essas
proteínas são sintetizadas e processadas nos organismos vegetais e no humano.
As diferenças em termos de glicosilação são devidas à síntese de cadeias
laterais de glicanos no aparelho de Golgi, representadas pela incapacidade de
plantas de adicionarem resíduos terminais de galactose e ácido siálico às proteínas
nascentes e também à adição de grupos de carboidratos xilose-β (1→2) e fucose-α
(1→3), ausentes em mamíferos (Ma et al., 2003).
Essas pequenas diferenças em termos de estrutura de glicanos podem
potencialmente alterar a atividade, a biodistribuição e a longevidade de proteínas
heterólogas expressas em plantas, além de induzir respostas alérgicas ao
consumidor e fenômenos de baixa aceitação pela opinião pública.
Entretanto, epitopos ligados a carboidratos raramente são alergênicos e
esses mesmos resíduos de glicanos são encontrados em glicoproteínas presentes
na dieta humana há décadas, o que torna altamente improvável sua associação à
alergenicidade.
- 10 -
Estudos em que camundongos tiveram um anticorpo contendo resíduos de
glicanos específicos de plantas administrado à sua dieta, não apresentaram
qualquer evidência de reação imune anti-glicano (Chargelegue et al., 2000).
Estratégias para a humanização do padrão de glicosilação de proteínas
recombinantes já foram elaboradas e aplicadas com sucesso.
O silenciamento dos genes codificadores das enzimas específicas de plantas
fucosiltransferase e xilosiltransferase proporcionou a síntese de proteínas ausentes
de fucose e xilose pelo musgo Physcomitrella patens (Warner, 2000).
A
utilização
in
vitro
das
enzimas
humanas
purificadas
β1→4-
galactosiltransferase e sialiltransferase foi eficiente para promover a modificação de
glicosilação de anticorpos recombinantes produzidos por plantas transgênicas (Blixt
et al., 2002).
Plantas de tabaco transgênico expressando simultaneamente a β1→4galactosiltransferase e um anticorpo recombinante foram utilizadas para a
recuperação de aproximadamente 30% de anticorpos corretamente galactosilados,
uma fração similar àquela produzida por células de hibridomas (Bakker et al., 2001).
A adição in vivo de ácido siálico em proteínas recombinantes originária de
plantas transgênicas ainda é improvável uma vez que esses organismos não
possuem a via metabólica de precursores desse glicano.
A produção em plantas transgênicas de anticorpos secretórios funcionais,
moléculas diméricas de alta massa molecular que contém, além das quatro cadeias
típicas de imunoglobulinas, dois componentes polipeptídicos adicionais (dez
monômeros ao todo), é um resultado espantoso uma vez que dois tipos diferentes
de células são requeridas para a oligomerização desses anticorpos em mamíferos e
apenas uma em sistema vegetal (Ma et al., 1995; Larrick & Thomas, 2001).
Isso representa a clara capacidade de plantas transgênicas em realizar a
síntese, o enovelamento e a montagem corretos até mesmo de proteínas grandes e
complexas como anticorpos, conservando estrutura e função idênticas às das
proteínas nativas humanas (Schillberg et al., 2002).
Alguns exemplos de proteínas de interesse comercial produzidas em plantas
transgênicas podem ser observados na tabela 1.
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Tabela 1. Proteínas de potencial interesse comercial produzidas em sistema vegetal.
Proteína
Massa Molecular
Recombinante
(kDa/subunidade)
Origem
Planta
Nível de
Hospedeira
produção.
Referência
(Proteínas
Solúveis Totais PST)
α-Amilase
55.2
Bacillus
Tabaco
0.3% (folhas)
Pen et al., 1992
licheniformis
Quimosina
30
Bovina
Tabaco
0.1-0.5%
Willmitzer et al., 1992
Ciclodextrina
76
Klebsiella
Batata
<0.01% (tubérculos)
Oakes et al., 1991
Batata
ND
van den Elzen et al.,
pneumoniae
Glucoamilase
74
Aspegillus niger
1991
Hirudina
11
Hirudo medicinalis
Canola
1% (sementes)
Parmenter et al., 1995
Cadeias γ e κ de
45 e 27
Camundongo
Tabaco
1. 3% (folhas)
Hiatt et al., 1989
β-interferon
20
Homo sapiens
Tabaco
0.000017%
Edelbaum et al., 1992
Levansucrase
49.9
B. subtilis
Tabaco
ND
Ebskamp et al., 1994
S. mutans
Batata
hibridoma
Lisozima
14.4
Galinha
Tabaco
0.003% (folhas)
Trudel et al., 1992
Fitase
80
Aspegillus niger
Tabaco
14.4% (folhas)
Verwoerd et al., 1995
Ricina
34
Mamona
Tabaco
0.25% (folhas)
Sehnke et al., 1994
Xilanase
37
Clostridium
Tabaco
4.1% (folhas)
Herbers et al., 1995
Tabaco
>2% (folhas)
Scheller et al., 2001
thermocellum
Seda
>100
Nephila clavipes
Batata
ND, não-determinado.
Além desses polipeptídeos muitos outros já foram produzidos em plantas
transgênicas, incluindo proteínas com aplicações médicas, como a β-caseína e a
lactoferrina humanas, utilizadas para complementar a dieta de recém-nascidos
(Chong et al., 1997; Chong & Langridge, 2000).
Polímeros como a elastina bovina e o colágeno humano também já foram
produzidos respectivamente em cloroplastos e folhas de plantas de tabaco, mas o
primeiro apresentou níveis desapontadores de biossíntese (mesmo com altos níveis
de síntese de mRNAs correspondentes) e o segundo baixa estabilidade térmica,
apesar de ser espontaneamente processado e montado em sua típica estrutura
complexa de tripla hélice (Guda et al., 2000; Ruggiero et al., 2000).
A baixa estabilidade foi justificada pela ausência de resíduos de hidroxiprolina
na estrutura primária original, remediada pela co-expressão da enzima prolil-4hidroxilase utilizando o mesmo biorreator vegetal (Merle et al., 2002).
- 12 -
Algumas plataformas visando à produção de proteínas heterólogas em larga
escala em sistema vegetal já foram desenvolvidas, entretanto apenas dois produtos
recombinantes já foram submetidos a todos os testes e fases regulatórias e
chegaram ao mercado – nenhum deles biofármacos.
A empresa líder em produção comercial de proteínas de cereais Prodigene
Inc. (http://www.prodigene.com) utilizou plantas de milho transgênicas para a
obtenção dos dois produtos mencionados: avidina e β-glucuronidase (Hood et al.,
1997; Witcher et al., 1998) e visa explorar futuramente o potencial de acúmulo de
outras
proteínas,
como
subunidades
de
vacinas,
anticorpos
e
enzimas
recombinantes como a aprotinina e a lacase nessas plantas (Fischer et al., 2004).
Apesar das vantagens evidentes a produção de proteínas recombinantes em
plantas esbarra em problemas comuns às espécies já utilizadas para essa
finalidade, principalmente os baixos níveis de expressão do transgene e acúmulo
dos polipeptídeos recombinantes e também problemas associados individualmente a
cada espécie-alvo, como a baixa estabilidade protéica pós-colheita e dificuldades de
transformação e de manipulação.
Alguns desses problemas podem ser contornados utilizando-se diferentes
estratégias moleculares visando à maximização da expressão gênica e o acúmulo
dos polipeptídeos recombinantes, conforme será abordado mais adiante.
1.4) Tipos de biorreatores vegetais
Os biorreatores vegetais desenvolvidos até o presente momento se dividem
em duas categorias principalmente no que diz respeito ao tipo de expressão da
proteína heteróloga desejada: os de expressão transiente e os de expressão estável.
No primeiro grupo enquadram-se as plantas agroinfiltradas e aquelas
infectadas por vírus transgênicos. No segundo encontram-se as suspensões de
células geneticamente modificadas e plantas transgênicas propriamente ditas.
- 13 -
1.4.1) Plantas agroinfiltradas
A expressão transiente é geralmente utilizada para verificar a eficiência de
atividade da construção gênica empregada em experimentos de transformação
genética e para validar a estrutura e função de pequenas quantidades de proteína
recombinante (Twyman et al., 2003).
Entretanto, a infiltração de folhas de plantas por meio de vácuo ou de
seringas, utilizando suspensões de Agrobacterium tumefaciens recombinantes, pode
resultar na transformação transiente de várias células e na obtenção de altos níveis
de expressão poucos dias após a realização do experimento (Kapila et al., 1997).
Apesar do pouco tempo de manutenção dos níveis de expressão
(principalmente em função da substituição de células transformadas por outras nãotransgênicas), alguns relatos da utilização desse método para a produção de
proteínas heterólogas em larga escala já foram descritos.
Voinnet e colaboradores (2003) demonstraram que a redução dos níveis de
expressão de transgenes nesse sistema ocorre também por silenciamento gênico e
que o acúmulo de diferentes proteínas, utilizando plantas agroinfiltradas coexpressando a proteína p19 do Tomato bushy stunt virus (TBSV), um polipeptídeo
inibidor de silenciamento gênico, resultaram num incremento dos valores iniciais de
produção em até cinqüenta vezes.
A agroinfiltração de folhas de alfafa pôde ser escalonada em até 7.500 folhas
por semana por pesquisadores da empresa Medicago Inc (http://medicago.com),
resultando na produção de mais de cem microgramas de proteína recombinante a
cada semana (D'Aoust et al., 2005).
1.4.2) Plantas infectadas por vírus transgênicos
Outra tecnologia emergente é a expressão transiente de proteínas
heterólogas baseada na utilização de vírus de plantas como vetores de expressão.
As vantagens desse sistema incluem o curto tempo de início de expressão, a
capacidade de infecção sistêmica proporcionada pelos vírus, levando à produção da
proteína heteróloga em todas as células da planta e a capacidade de utilização de
- 14 -
mais de um vetor na mesma planta, o que permite a montagem de proteínas
multiméricas num mesmo ambiente (Fischer et al., 2004).
Plantas infectadas por vírus recombinantes já foram utilizadas para a
produção de proteínas candidatas a vacinas e anticorpos (McCormick et al., 2003).
1.4.3) Suspensão de células transgênicas
Culturas de células de plantas podem ser utilizadas para a produção de
proteínas heterólogas em alternativa aos sistemas de expressão transientes e a
plantas transgênicas.
Elas combinam os méritos de sistemas de expressão que utilizam plantas
completas (como os mecanismos de síntese, processamento pós-traducional e
montagem) com aqueles de culturas de células de microorganismos (capacidade
intrínseca de secreção protéica).
A transformação genética dessas células se dá geralmente através de
introdução de genes exógenos por biobalística e freqüentemente são utilizados
peptídeos-sinais nas construções gênicas capazes de destinar os polipeptídeos
nascentes para a via secretória, culminando na extrusão dos mesmos para o
sobrenadante da cultura (Hellwig et al., 2004).
Outro destino possível dessas proteínas é a retenção celular. Tanto a
secreção quanto a retenção dependem da estratégia de produção a ser empregada,
do grau de purificação desejado, do emprego de peptídeos sinais e da
permeabilidade da parede celular em relação às proteínas produzidas em questão
― polipeptídeos entre 20 e 30 kDa tendem a atravessar a parede facilmente
enquanto moléculas maiores tendem a ficar retidas (Twyman et al., 2003).
O alto grau de restrição física da biossíntese de proteínas heterólogas e a
possibilidade de produção sob boas práticas de manipulação ― tais como o controle
preciso de condições de crescimento, a utilização de ambientes estéreis, de meios
de cultura e tampões bem definidos e a exigência de protocolos de purificação
representam as grandes vantagens qualitativas desse sistema, embora algumas
delas encareçam a produção final (Twyman et al., 2003).
Células de folhas de tabaco são as mais utilizadas até o momento para essa
finalidade, mas as de folhas de soja, tomate, arroz e de raízes de tabaco já foram
empregadas para a secreção de mais de 20 diferentes proteínas heterólogas, dentre
elas anticorpos, interleucinas, eritropoietina e antígenos vacinais (Doran, 2000).
- 15 -
Entretanto, poucas proteínas recombinantes produzidas em suspensões
celulares apresentaram rendimentos de biossíntese satisfatórios para viabilizar sua
produção comercial, o que constitui o principal fator limitante para uma maior
popularização desse sistema de expressão.
1.4.4) Plantas transgênicas
Uma planta transgênica é aquela que contém um ou mais genes que foram
inseridos no seu genoma por meios que não o da via sexual (Brasileiro, 1998).
A seqüência gênica inserida pode ser originária de um organismo nãorelacionado diretamente à planta receptora, inclusive oriundo de espécies que não
possuam compatibilidade sexual ou que sejam evolutivamente muito distantes da
planta transgênica em questão.
Na grande maioria dos casos a escolha de biorreatores vegetais para a
produção de qualquer classe de proteína heteróloga incide preferencialmente sobre
a transformação estável e regeneração de plantas transgênicas (Fischer et al.,
2004).
Além
dos
aspectos
comuns
aos
sistemas
de
expressão
vegetais
apresentadas anteriormente, plantas transgênicas possuem pelo menos três
características que as distinguem dos demais biorreatores vegetais: a regeneração
de indivíduos geneticamente transformados completos, a partir de uma ou poucas
células transgênicas; a integração estável do transgene ao genoma vegetal e a
presença de órgãos vegetativos evolutivamente projetados para o acúmulo de
proteínas.
Como as plantas transgênicas são regeneradas in vitro a partir de células
germinativas ou totipotentes previamente transformadas, os indivíduos resultantes
do processo possuem todas as suas células constituintes portadoras da seqüência
nucleotídica exógena, podendo transmitir cópias do transgene original aos seus
descendentes pelos mesmos princípios que regem a hereditariedade em plantas
não-transgênicas (Chapman & Burke, 2006).
Salvo a ocorrência de quimeras (indivíduos portadores de partes transgênicas
e não-transgênicas), a integração de transgenes ao genoma vegetal e a evidência
de que os órgãos responsáveis pela fecundação e produção de sementes (ovários e
anteras) também são geneticamente transformados, permitem a obtenção de
- 16 -
linhagens transgênicas sob condições controladas em casa de vegetação ou no
campo, a partir de eventos transformantes primários obtidos em laboratório.
Além disso, o fenótipo da progênie (incluindo a eficiência de síntese e
capacidade de manutenção da integridade das proteínas heterólogas) pode ser
monitorado e avaliado em sucessivas gerações da cultura e as plantas obtidas
podem inclusive ser cruzadas com linhagens não-transgênicas de interesse
agronômico (Lee & Natesan, 2006).
Dessa
maneira,
plantas-elite
altamente
produtivas,
agronomicamente
eficientes, homozigotas para o gene de interesse e capazes de sintetizar
quantidades satisfatórias de polipeptídeos recombinantes podem ser obtidas quando
os
eventos
transformantes
são
assistidos
por
programas
adequados
de
melhoramento genético.
Como nesses casos os grãos de pólen de plantas transgênicas também
carreiam cópias dos transgenes, questões complexas envolvendo biossegurança e
regulamentação devem ser levadas em consideração na elaboração de estratégias
de obtenção de biorreatores vegetais.
A possibilidade de restrição da expressão de transgenes em órgãos como
sementes e tubérculos, locais naturais de acúmulo de proteínas, por meio da
utilização de promotores tecido-específicos, funciona não apenas como uma
estratégia eficiente para minimizar questões envolvendo fluxo gênico intra e interespecífico, como também para garantir um aumento de acúmulo de proteínas
heterólogas, a redução de custos de produção e facilitar a purificação dessas
moléculas, como será discutido de maneira mais aprofundada adiante (Daniell,
2002).
1.5) Técnicas de transformação genética de plantas
A obtenção de plantas transgênicas representa uma das maiores conquistas
proporcionadas pelo advento da tecnologia do DNA recombinante.
A transformação genética de plantas pode ser compreendida como a
introdução controlada de genes oriundos de diferentes espécies animais, vegetais
ou de microorganismos, em um genoma vegetal receptor, independentemente da
fecundação (Brasileiro, 1998).
- 17 -
Pode-se afirmar que a obtenção de plantas transgênicas apóia-se em três
conjuntos amplos de técnicas celulares e moleculares: a tecnologia do DNA
recombinante, comumente conhecida como engenharia genética; a morfogênese in
vitro associada a técnicas de cultura de tecidos e técnicas de transferência de genes
entre diferentes organismos.
As técnicas de engenharia genética permitem a construção e a clonagem de
vetores plasmidiais bacterianos de expressão gênica a serem introduzidos no núcleo
ou no interior de organelas de plantas que contenham seu próprio genoma, como
mitocôndrias e cloroplastos.
Os plasmídeos íntegros ou fragmentados contêm as seqüências codantes de
proteínas heterólogas devidamente flanqueadas por seqüências regulatórias
distintas, como promotores; peptídeos-sinais e terminadores, constituindo o cassete
de expressão a ser estavelmente integrado ao genoma vegetal.
Um dos fatores limitantes para a transformação genética de plantas é o
estabelecimento de um protocolo eficiente de cultura de tecidos e de regeneração de
plantas in vitro, mediante a utilização de meios de cultura nutritivos e reguladores de
crescimento apropriados.
O cultivo de embriões com sua região meristemática apical preservada ou
simplesmente dos próprios meristemas apicais ou axilares, em meio de cultura
contendo citocininas, foi descrita como um eficiente indutor de organogênese direta
de parte aérea, capaz de regenerar plantas transgênicas eliminando a necessidade
de passagem do tecido por fases intermediárias de desdiferenciação ― como calo,
por exemplo (Sharma et al., 2004; Sairam et al., 2003).
Outro fator crucial para a transformação genética de plantas é a transferência
de genes de interesse oriundos de outros organismos para células vegetais
potencialmente precursoras de um órgão ou um embrião.
Convencionalmente para a produção de plantas transgênicas essa introdução
tem sido feita de duas formas: através da infecção dos tecidos-alvos por
Agrobacterium tumefaciens recombinantes ― método preferencialmente empregado
para a transformação genética da maioria das plantas dicotiledôneas ― ou pelo
bombardeamento dos explantes com micropartículas contendo o DNA portador dos
genes de interesse adsorvido superficialmente (biobalística).
- 18 -
Este último método foi o empregado no presente trabalho e, além de
demonstrar menor dependência genotípica, é o mais utilizado para a transformação
genética de leguminosas, como soja e alfafa e de cereais, como arroz, trigo e milho.
O processo de biobalística preconiza a aceleração de microprojéteis (de 0,2 a
4 µm de diâmetro) recobertos com seqüências específicas de ácidos nucléicos, a
uma velocidade final de 1.500 km/h sobre os explantes ou células em suspensão
(Sanford et al., 1987).
Os microprojéteis, de ouro ou tungstênio, penetram de maneira não-letal a
parede celular e a membrana citoplasmática, alojando-se aleatoriamente nas
organelas celulares.
O DNA exógeno é então dissociado das micropartículas pela ação citosólica e
integrado ao genoma vegetal por recombinação homóloga.
O sistema que utiliza gás hélio sob alta pressão é o que apresenta maior
eficiência na obtenção de altas freqüências de transformação pelo método de
bombardeamento, além de ser amplamente utilizado para a transformação genética
de uma grande variedade de espécies vegetais (Rech et al., 1997).
O processo de regeneração de plantas em transformação genética via
biobalística reduz a possibilidade de ocorrência de variação somaclonal, uma vez
que o tecido não é submetido necessariamente à fase de calo, reduzindo o período
de contato entre o explante e fitoreguladores.
Dessa maneira a obtenção de transformantes se torna mais rápida e segura,
sendo essa a principal vantagem sobre o sistema que utiliza estirpes de A.
tumefaciens (Irvine et al., 1991).
Além disso, o sistema de biobalística permite a redução do tempo de cultura
in vitro, proporcionando a realização de testes moleculares e bioquímicos para a
identificação de transformantes e de polipeptídeos com maior precocidade. (Vianna,
2002).
Como resultado da ação integrada entre os três conjuntos de técnicas
principais que constituem o processo de transformação genética de plantas, é
possível construir vetores plasmidiais contendo genes de interesse, realizar a
introdução dos mesmos em células e explantes vegetais, verificar a integração das
seqüências exógenas ao genoma da espécie vegetal em questão e expressá-las de
forma estável em sucessivas gerações, a fim de se obter proteínas heterólogas em
quantidades significativas.
- 19 -
1.6) Transformação genética de soja
Segundo Irvine e colaboradores (1991), os sistemas de introdução de genes
mais utilizados em soja são o via Agrobacterium e a biobalística.
Os grupos de Hinchee e McCabe, ambos em 1988, foram os primeiros a
registrar trabalhos sobre transformação de soja, sendo que o primeiro utilizou o
sistema Agrobacterium, visando a obtenção de plantas regeneradas a partir de nós
cotiledonares, resistentes à canamicina e expressando a enzima β-glucuronidase e o
segundo utilizou o sistema biobalístico, obtendo apenas plantas quiméricas.
Vários pesquisadores têm buscado ativamente o aperfeiçoamento destes
sistemas, mas maioria dos protocolos publicados apresenta baixa eficiência de
transformação e restrições quanto a sua execução, limitando sua utilização em
função da variedade de soja disponível (Barwale et al., 1986; Finer & McMullen,
1991; Hooykaas & Schilperoort, 1992; Hansen et al., 1994).
Em 1995 Padgette e colaboradores desenvolveram uma linhagem-elite de
soja transgênica contendo o gene mutado codificador da enzima 5-enol-piruvilshiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS) de Agrobacterium tumefaciens, capaz de
tolerar altas doses do herbicida Round up®.
O desenvolvimento do produto, patenteado pela empresa norte-americana
Monsanto (http://www.monsanto.com/), representou um marco na transgenia de
plantas e nas relações de aceitação da tecnologia tanto por pesquisadores e
produtores agrícolas quanto pela opinião pública (embora os pontos-de-vista não
tenham sido exatamente coincidentes).
Apenas três anos depois a enzima fitase de Aspergillus sp. foi expressa com
sucesso em sementes de soja transgênica (Denbow et al., 1998).
No mesmo ano, o primeiro biofármaco produzido em soja, um anticorpo
monoclonal humanizado anti-herpes simplex vírus (HSV) foi expresso de maneira
constitutiva em sementes da planta por Zeitlin e colaboradores (1998), assim como a
proteína β-caseína bovina sob controle de um promotor de uma lecitina de soja
(Philip et al., 2001).
Para que haja sucesso em um sistema de transformação genética de soja, é
necessário que ocorra eficiência não só na introdução do gene de interesse, mas
também nas fases de seleção e regeneração de células transformadas (Vianna,
2002).
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O gene marcador ahas previamente isolado de Arabidopsis thaliana, o qual
codifica a enzima ácido-aceto-hidroxi-sintase (AHAS) ― fundamental na via de
biossíntese de aminoácidos essenciais como valina, isoleucina e leucina em plantas
superiores ― contém uma mutação na posição 653 pb capaz de ocasionar a troca
de uma serina por uma asparagina na cadeia polipeptídica.
Essa alteração permite que o princípio ativo do herbicida Imazapyr® (Arsenal),
que atua na região meristemática apical da planta, não reconheça seu sítio de
acoplamento na seqüência peptídica, resultando na tolerância das plantas
transformadas a esse agroquímico e a todos os outros herbicidas da classe das
Imidazolinonas (Sathasivan et al., 1991).
O estabelecimento de um protocolo de transformação genética utilizando o
gene ahas combinado à citocinina 6-benzilaminopurina (BAP), indutora de
multibrotação em meristemas apicais de embriões de soja bombardeados com
genes de interesse, resultou no aumento da freqüência de transformação desses
explantes em comparação a outros protocolos desenvolvidos anteriormente,
independentemente da variedade de soja utilizada (Aragão et al., 1999).
Esse sistema passou a ser utilizado com sucesso para a seleção de plantas
transgênicas obtidas pelo grupo do Laboratório de Transferência de Genes do
Centro Nacional de Recursos Genéticos e Biotecnologia da Embrapa (Cenargen)
desde 1996.
1.7) Plantas transgênicas como biorreatores de fármacos: “Plant
Molecular Pharming”
A utilização da engenharia genética como ferramenta do melhoramento
assistido de plantas foi inicialmente voltada para a melhoria de características
agronômicas, tais como a resistência a doenças e pragas, a tolerância a diferentes
formas de estresses bióticos e abióticos, a obtenção de maior tempo de prateleira
dos frutos, a promoção de modificações nos padrões de cores de flores ornamentais
e a obtenção de macho-esterilidade (Daniell, 1999).
Desde que a primeira planta transgênica foi produzida por pesquisadores da
Universidade de Washington (EUA), em associação com a Universidade de Gent
(Bélgica) e a empresa americana Monsanto em 1983 ― uma planta de tabaco
contendo um gene bacteriano de resistência à canamicina ― esforços de inúmeros
- 21 -
pesquisadores nos mais variados centros de investigação científica vêm sendo
direcionados para potencializar a utilização de vegetais superiores como veículos de
expressão de uma enorme gama de proteínas heterólogas, com as mais diversas
funções biológicas (Kusnadi et al., 1997).
Uma tendência mais atual e que se fortalece na medida em que aumenta a
demanda mundial por biofármacos é a utilização de plantas transgênicas como
veículos para a produção de polipeptídeos utilizados como reagentes diagnósticos,
vacinas e drogas.
Essa
aplicação
representa
uma
vertente
relativamente
recente
da
biotecnologia denominada “Plant Molecular Pharming”, quando o polipeptídeo
produzido apresenta interesse farmacêutico (Fischer et al., 2004).
Nos últimos dez anos mais de 100 fármacos protéicos, dentre eles anticorpos,
antígenos vacinais, hormônios, soroalbumina humana, peptídeos anticoagulantes e
enzimas já foram produzidos em diversas espécies vegetais (tabela 2).
Tabela 2. Importantes proteínas farmacêuticas produzidas em plantas transgênicas.
Proteína
Planta
Características
Referências
Tabaco e
Primeira proteína humana expressa em plantas
Barta et al., 1986; Staub et
Girassol
Primeira proteína humana expressa em cloroplastos (7% PSTF)
al., 2000
Albumina
Tabaco e
Primeira proteína nativa completa expressa em plantas (0.1%
Fernandez-San-Millan et
sérica humana
batata
PST).Altos níveis de expressão em cloroplastos (11% PSTF)
al., 2003; Sijmons et al.,
hospedeira
Biofármacos humanos
hGH
1990
α-interferon
Arroz e nabo
Primeira proteína humana produzida em arroz
Zhu et al., 1994
Eritropoetina
Tabaco
Primeira proteína humana produzida em suspensão de células
Matsumoto et al., 1995
Fosfatase
Tabaco
Secretada por folhas e raízes
alcalina
Borisjuk et al., 1999;
Komarnytsky et al., 2000
Aprotinina
Milho
Primeira proteína humana produzida em milho
Delaney, 2002
Antitripsina α1
Arroz
Primeira utilização de células de arroz em suspensão como
Terashima et al., 1999
biorreatores
Anticorpos recombinantes
IgG1
Tabaco
Primeiro anticorpo produzido em plantas; IgG sérico obtido pelo
Hiatt et al., 1989
cruzamento de plantas que expressavam as cadeias leves e
pesadas individualmente
IgM
Tabaco
Primeiro IgM expresso em plantas e endereçado para os
Düring et al., 1990
cloroplastos
SIgA/G
Tabaco
Primeiro anticorpo secretório produzido em plantas; obtido pelo
(anti-adesina S.
cruzamento seqüencial de quatro linhagens portadoras dos
mutans)
componentes individuais; o mais avançado fármaco derivado de
Ma et al., 1998
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plantas até o momento
scFv-briodina 1
Tabaco
(anti-CD 40)
Primeiro scFv farmacêutico produzido em sistema vegetal
Francisco et al., 1997
(suspensão de células)
IgG (HSV)
Soja
Primeira proteína farmacêutica produzida em soja
Zeitlin et al., 1998
LSC (HSV)
Chlamydomo
Primeiro exemplo de fármaco produzido em alga
Mayfield et al., 2003
Primeira candidata à vacina produzida em vegetais; terceira
Mason et al., 1992
nas
reinhardtii
Subunidades de vacinas
Proteína de
Tabaco
envelope Vírus
vacina derivada de plantas a atingir estágio de testes clínicos
hepatite B
Glicoproteína do
Tomate
vírus da raiva
Primeiro exemplo de vacina “comestível” expressa em planta
McGarvey et al., 1995
também comestível
Enterotoxina
Tabaco e
Primeira vacina produzida em planta a atingir estágio de testes
termolábil de E.
batata
clínicos
Batata
Segunda vacina produzida em planta a atingir estágio de testes
Tacket et al., 1998
coli
Proteína do
capsídeo de
Tacket et al., 2000
clínicos
Norwalk virus
Autoantígeno do
Tabaco e
Primeira vacina originária de planta para uma doença auto-
Diabetes
batata
imune
Subunidade B da
Tabaco e
Primeira vacina expressa em cloroplastos
Daniell et al., 2001
toxina da Cólera
batata
Subunidades B e
Batata
Primeiro antígeno recombinante multivalente derivado de planta,
Yu and Langridge, 2001
A2 da toxina da
sintetizado para a proteção simultânea contra várias doenças
Cólera,
entéricas
Ma et al., 1997
enterotoxina de
Rotavirus A e
fusões de antígeno
enterotoxigênico
de fímbria de E.
coli
Glicoproteína S do
Tabaco e
Primeiro exemplo de proteção induzida via alimentação em um
vírus da
milho
animal
Lamphear et al., 2002
gastroenterite
HSV, herpes simplx vírus; IgG, imunoglobulina G; IgM, imunoglobulina M; LSC, long single chain; scFv, single-chain FV
fragment; SIgA, secretory immunoglobulin A; PSTF, proteínas solúveis totais de folhas.
Ma et al., 2003.
Notadamente os principais polipeptídeos farmacológicos já produzidos em
plantas se agrupam em três categorias: biofármacos humanos, anticorpos
recombinantes e subunidades de vacinas recombinantes.
- 23 -
1.7.1) Biofármacos humanos
A primeira proteína farmacêutica humana relevante produzida em plantas foi o
hormônio de crescimento humano (hGH), apenas três anos após a obtenção da
primeira planta transgênica (Barta et al., 1986).
Nesse trabalho o hormônio humano foi expresso fusionado à enzima nopalina
sintase de Agrobacterium tumefaciens e representou um divisor de águas para o que
se convencionou denominar “Plant Molecular Pharming”.
Desde então muitas proteínas de origem humana, como hemoderivados,
outros hormônios, enzimas e citocinas já foram produzidas em espécies vegetais.
Um exemplo notório é a albumina sérica humana, molécula cuja demanda
mundial atinge as 500 toneladas por ano e que foi produzida em biorreator vegetal
em 1990 (Sijmons et al., 1990).
Até a segunda metade da década de 90 a grande maioria de biofármacos
humanos era sintetizada em plantas de tabaco, extraídas diretamente das folhas e
geralmente apresentavam baixos níveis de produção, em torno de 0.1% do teor de
proteínas solúveis totais (PST) (Ma et al., 2003).
Os fatores mais importantes que explicam esses níveis são a baixa
capacidade de dobramento e a instabilidade protéica proporcionados pelo ambiente
foliar nessas plantas.
Diferentes estratégias foram desenvolvidas para solucionar o problema e
exemplos de “protein targeting” e expressão desses polipeptídeos fusionados a
proteínas abundantemente expressas, além da escolha de outras espécies vegetais
como cereais e soja, se mostraram bastante promissoras.
A oleaginosa “Safflower” (Carthamus tinctorius), por exemplo, vem sendo
utilizada como veículo para a produção de altos níveis de insulina humana e da
apolipoproteína
APO
A1
pela
companhia
SemBioSys
Genetics
Inc.
(http://www.sembiosys.com) , num sistema de fusão à proteína oleosina, presente
em corpos oleaginosos das sementes da planta (Fischer et al., 2004).
Uma lipase humana recombinante, Merispase®, produzida em plantas de
milho
pela
empresa
francesa
Meristem
Therapeutics
(http://www.meristem-
therapeutics.com/), também vem sendo testada para o catabolismo in vitro de
lipídeos e para o tratamento de sintomas da fibrose cística.
- 24 -
Até o momento, este é um forte candidato a chegar ao mercado em médio e
longo prazo, uma vez que o medicamento se encontra em fase de otimização da
formulação e de sua fármaco-cinética (Kusnadi et al., 1997).
1.7.2) Anticorpos recombinantes
A produção de imunoglobulinas em plantas transgênicas (“plantibodies”)
representa um dos maiores desafios da tecnologia, uma vez que essas moléculas
possuem uma estrutura complexa, que necessita de um ambiente oxidativo para o
estabelecimento de pontes dissulfeto estabilizadoras das cadeias leves e pesadas
entre si.
Uma outra dificuldade é o fato de o reconhecimento correto de antígenos só
se tornar possível quando o dobramento e a montagem protéicos ocorrem
corretamente e também a adição catalítica de glicanos é similar à original.
Anticorpos recombinantes também representam moléculas multifuncionais do
ponto de vista médico, uma vez que podem ser empregadas para o diagnóstico
precoce, a prevenção e o tratamento de doenças.
Apesar de plantas de tabaco terem sido extensamente utilizadas para a
produção de anticorpos, sementes de cereais e de leguminosas começam a
despertar maior interesse para essa finalidade.
Além de anticorpos completos, derivados de imunoglobulinas como
fragmentos Fab, scFvs, “diabodies”, “minibodies”, domínios variáveis simples, fusões
anticorpos-proteínas “tags”
e até mesmo anticorpos secretórios, já foram
sintetizados utilizando a maquinaria celular de diversas espécies vegetais, (Ma et al.,
2003).
Nos últimos anos análises e comparações intensivas têm sido realizadas para
determinar a otimização de parâmetros de expressão de plantibodies em diversas
espécies, resultando freqüentemente em rendimentos de produção acima de 1%
PST (Twyman et al., 2003).
O desenvolvimento de alguns plantibodies alcançou estágios pré-clínicos
avançados e essas imunoglobulinas provavelmente serão os primeiros biofármacos
produzidos em plantas a atingirem caráter comercial.
- 25 -
Um exemplo é o anticorpo secretório quimérico CaroRX®, um IgA/G produzido
em linhagens transgênicas de tabaco de propriedade da empresa Planet
Biotechnology
(http://www.planetbiotechnology.com/products.html#carorx),
obtido
através do cruzamento de plantas que expressavam individualmente cada uma das
quatro cadeias polipeptídicas correlatas.
Esse anticorpo se encontra em fase II de testes clínicos e é capaz de
reconhecer a principal proteína de adesão de Streptococcus mutans, agente
patogênico oral responsável pelo desenvolvimento de cáries dentárias em humanos.
Sua aplicação tópica após a remoção da bactéria ajuda a prevenir a recolonização
dentária por muitos meses (Ma et al., 1998).
O anticorpo recombinante PIPP® foi desenvolvido em plantas transgênicas de
tabaco e é capaz de detectar a atividade da gonadotrofina coriônica humana (hCG),
uma glicoproteína hormonal normalmente produzida pela placenta exclusivamente
durante a gravidez, cuja produção em mulheres não-gestantes está relacionada à
presença de tumores do aparelho reprodutivo (Kathuria et al., 2002).
A versatilidade de utilização de anticorpos recombinantes pode ser verificada
uma vez que o PIPP® é funcionalmente eficiente tanto para o diagnóstico e terapia
de câncer relacionado à hCG quanto para testes bastante acurados de gravidez
(Kathuria et al., 2002).
Outro plantibody interessante é a Avicidina® (NeoRx - http://www.neorx.com)
um IgG que reconhece uma molécula de adesão celular truncada (EpCAM),
específica de epitélio do aparelho digestório que funciona como marcador de câncer
de colo retal.
Produzido em milho transgênico, esse IgG foi o primeiro anticorpo de origem
vegetal a ser administrado em humanos e demonstrou efetivamente atividade anticâncer mas, por causar diarréia como efeito colateral, foi abandonado pelas
empresas NeoRx e Monsanto ainda em fase de testes clínicos (Ma et al., 2003).
O scFv 38C13®, produzido em plantas de tabaco infectadas por vírus
transgênico, é derivado de linfócitos B malignos da linhagem de células 38C13 de
linfoma de camundongo.
Uma vez administrado a animais sadios, resultou na produção de anticorpos
capazes de reconhecer especificamente células 38C13 e protegê-los contra injeções
letais de células cancerosas (McCormick et al., 1999).
- 26 -
A possibilidade de adaptação desse scFv como indutor de produção de
anticorpos contra marcadores tumorais de linfócitos B humanos malignos vem sendo
avaliada pela empresa californiana Large Scale Biology Corp (http://www. lsbc.com).
1.7.3) Subunidades de vacinas recombinantes
O desenvolvimento de vacinas recombinantes de origem vegetal representa
avanços importantes tanto do ponto de vista tecnológico quanto potencialmente
social.
A autenticidade estrutural de biofármacos vegetais foi finalmente comprovada
em 1992, quando o antígeno de superfície do vírus da hepatite B (HBV), a primeira
vacina recombinante, foi expressa em plantas transgênicas de tabaco e induziu
resposta imune após ser injetada em camundongos (Mason et al., 1992; Thanavala
et al., 1995).
Outras espécies vegetais logo pareceram mais atraentes que tabaco para
servirem de veículos de expressão de subunidades de vacinas, principalmente
folhosas como a alface, além de frutas e tubérculos.
A maior vantagem apresentada por essas espécies é o fato de serem
consumidas in natura, não-cozidas ou parcialmente processadas, o que as eleva
como candidatos em potencial para carrearem proteínas estimuladoras do sistema
imune humano (Ma et al., 2005).
O carro-chefe para a produção de vacinas no momento são tubérculos de
batata transgênica.
Plantas de batata e folhas de alface transgênicas também já foram utilizadas
para a expressão de antígeno do vírus da hepatite B (Richter et al., 2000; Kapusta et
al., 1999).
A produção da proteína VP6 do capsídeo do rotavírus em batatas
transgênicas já se mostrou eficiente para a imunização contra gastroenterite aguda
viral em camundongos (Yu & Langridge, 2003).
Dois antígenos de patógenos humanos importantes também já foram
acumulados em tubérculos de batata: a subunidade B da toxina termolábil (LT-B) de
E. coli enterotoxigênica (ETEC), e a proteína do capsídeo do Norwalk vírus (Tacket
et al., 1998; Tacket et al., 2000).
- 27 -
Ambos apresentaram estruturas multiméricas ativas sob condições do trato
gástrico humano e foram sintetizados em altos níveis e oligomerizados corretamente
no interior de células dos tubérculos.
Testes clínicos com LT-B recombinante mostraram que o consumo de batatas
cruas contendo 0,3 a 10 mg do antígeno foram suficientes para a produção de altas
concentrações de anticorpos sistêmicos e na mucosa de camundongos (Tacket et
al., 1998).
Tomates são mais palatáveis que tubérculos crus de batata e já foram
empregados para sintetizar uma vacina contra o vírus da raiva, mas apresentaram
baixa capacidade de manutenção da estabilidade protéica, resultando em
rendimento abaixo de 3 µg de vacina por grama de peso seco (McGarvey et al.,
1995).
A distribuição mundial de cultivo e o consumo por adultos e crianças fazem de
bananas um excelente veículo para imunização potencial principalmente em países
pobres. Apesar disso ainda não há resultados animadores em estudos sobre a
utilização dessa fruta como biofábrica de vacinas recombinantes até o momento.
1.8) Estratégias moleculares para aumento de produção de
proteínas heterólogas em plantas
Um dos fatores mais importantes que determinam a viabilidade de produção
de proteínas heterólogas em plantas é a obtenção de quantidades satisfatórias dos
polipeptídeos.
O rendimento absoluto de produção depende da maximização de eficiência
de todos os estágios da expressão gênica e da estabilidade protéica propriamente
dita.
As recentes estratégias visando o aumento de eficiência desses processos
atuam sobre a transcrição gênica, o processamento pós-transcricional, a tradução e
a estabilidade protéica pós-traducional.
- 28 -
1.8.1) Estratégias a nível transcricional
•
Escolha de promotores e terminadores
Para a obtenção de altos níveis de expressão os dois elementos mais
importantes são o promotor e o terminador de transcrição (Ma et al., 2003).
Promotores eucarióticos “fortes” são aqueles que proporcionam altos níveis
de produção de mRNAs em função de sua seqüência ser portadora de sítios de
início de transcrição, sítios específicos de fácil acoplamento de fatores de transcrição
e da RNA polimerase II, a presença abundante de elementos “enhancers” e a fácil
modulação de elementos “silencers” (Ow et al., 1987).
Os promotores constitutivos fortes mais amplamente utilizados para
expressão heteróloga em dicotiledôneas são o CaMV 19S e 35S, derivados dos
transcritos 19S e 35S do cauliflower mosaic vírus (CaMV).
Em monocotiledôneas o promotor da ubiquitina 1 de milho (ubi-1) também é
bastante popular e eficiente para a expressão de proteínas heterólogas em cereais
(Twyman et al., 2003).
Terminadores amplamente utilizados incluem o 35S CaMV, o dos genes nos e
ssu respectivamente de Agrobacterium tumefaciens e de ervilha – Pisum sativum
(Ma et al., 2003).
Promotores induzíveis, que permitem a regulação externa por estímulos
químicos e físicos despontam como ferramentas interessantes para maximização da
expressão gênica a nível transcricional, uma vez que a restringem temporalmente.
Um promotor de batata-doce (Ipomoea batatas) ativado por peroxidase foi
utilizado para a produção de 30 vezes mais GUS em plantas transgênicas de tabaco
submetidas à presença de peróxido de hidrogênio, à exposição pós-colheita e à luz
ultra-violeta do que o promotor 35S CaMV (Kim et al., 2003).
A indução rápida de biossíntese de proteínas heterólogas em tabaco foi
obtida pela utilização do promotor da enzima hidroxi-3-metilglutaril-Coa-redutase de
tomate (HMGR2), ativado por estresse mecânico induzido por práticas de colheita,
um sistema desenvolvido pela já extinta empresa americana Crop Tech Corp
(Padidam, 2003).
- 29 -
•
Minimização do Silenciamento transcricional
O Silenciamento gênico é um grupo de fenômenos epigenéticos que levam à
inibição da expressão gênica em nível transcricional e pós-transcricional.
Diversos mecanismos levam à interrupção ou inibição da síntese de mRNAs
em plantas, dentre eles a presença de seqüências procarióticas de DNA, típicas do
backbone do plasmídeo utilizado em transformação genética, a metilação em nível
de DNA, o “efeito de posição” relacionado ao local de integração do transgene no
genoma vegetal, a estrutura do lócus de integração, a presença de múltiplas cópias
ou cópias “supérfluas” do transgene, seqüências com potencial para a formação de
“hairpin” e de RNA dupla-fita, além de retroalimentação negativa de promotores ―
evento comum quando os produtos finais da expressão gênica são enzimas
recombinantes (Finnegan & McElroy, 1994).
Algumas estratégias já se mostraram eficientes para eliminar ou reduzir esses
problemas, como a utilização de vetores “limpos” de seqüências procarióticas,
ausentes de obstáculos ao acoplamento da RNA polimerase II e que possam levar à
formação de mRNA dupla- fita; técnicas para a integração de cópias únicas do
transgene ao genoma vegetal; a adição de seqüências flanqueadoras do tipo
“scaffold attachment regions” e integração sítio-dirigida; a escolha de germoplasma
com baixa atividade de metilação; além da redução de "feedback” negativo de
promotores pela expressão da enzima-alvo em um compartimento celular diferente
do qual se encontra seu substrato (Meyer & Saedler, 1996).
1.8.2) Minimização do silenciamento pós-transcricional
O processamento de transcritos primários è crucial para a obtenção de altos
níveis de proteína heteróloga.
Apesar de a grande maioria dos experimentos de transformação genética de
plantas utilizar seqüências codantes na forma de cDNA, originárias de bibliotecas
construídas a partir de mRNAs devidamente processados, a presença de íntrons no
transgene pode aumentar significativamente a estabilidade dos mRNAs (Töpfer et
al., 1993).
- 30 -
Essa aplicação já foi comprovada no aumento da expressão de genes
endógenos de monocotiledôneas, principalmente em plantas de milho (Maas et al.,
1991).
Os sítios de poliadenilação também exercem grande influência sobre a
estabilidade de mRNAs e sobre os níveis de expressão gênica em células vegetais.
A detecção e a eliminação, quando possível, de sítios específicos de
reconhecimento que contribuem para o decaimento de mRNAs em alguns
terminadores, também pode ser utilizada como ferramenta para evitar o
silenciamento pós-transcricional (Abler & Green, 1996).
1.8.3) Otimização da tradução
O correto funcionamento da iniciação da tradução é um fator-limitante para o
nível de acúmulo de proteínas heterólogas.
A sobreposição do sítio de iniciação da tradução com a seqüência consenso
de Kozak do mRNA é um grande otimizador dos níveis de tradução, mesmo
havendo pequenas diferenças estruturais nessas seqüências em animais e vegetais,
algo importante quando o objetivo é expressar genes humanos em plantas
transgênicas (Kawaguchi & Bailey-Serres, 2005).
A taxa de tradução também pode variar em função da disponibilidade de
RNAs de transferência de aminoácidos específicos para determinados códons na
célula vegetal.
A modificação do chamado “codon usage” através de mutações silenciosas
sítio-dirigidas ou da obtenção de seqüências codantes sintéticas previamente
modificadas ou naturalmente variáveis, pode ser bastante útil para aumentar
sobremaneira a tradução de mRNAs eucarióticos (Cornelissen et al., 1993).
As seqüências-líderes de diferentes transcritos de plantas comprovadamente
influenciam o aumento dos níveis de acúmulo de proteínas recombinantes em
biorreatores vegetais.
Elas podem ser adaptadas caso-a-caso para diferentes
combinações gene/planta hospedeira a fim de maximizar a eficiência de tradução
(Gallie, 1996).
- 31 -
1.8.4) Estabilidade protéica pós-traducional
Os níveis de transcrição e tradução estão relacionados à eficiência de
biossíntese de proteínas heterólogas. Outra variável deve ser levada em
consideração para a estimativa do rendimento de produção ou acúmulo de
biofármacos protéicos: seu nível de degradação após a biossíntese, ou seja, seu
grau de estabilidade (Stoger et al., 2005).
As estratégias moleculares que atuam sobre a estabilidade de proteínas,
aliadas à escolha de promotores, correspondem aos avanços mais eficientes em
termos
de
aumentos
reais
de
rendimento
de
produção
de
biofármacos
recombinantes e incluem duas abordagens distintas não-excludentes: a utilização de
promotores tecido-específicos ― principalmente os associados a genes endógenos
de sementes ― e o endereçamento subcelular dos polipeptídeos (“protein
targeting”).
1.9) Promotores tecido-específicos:
heterólogas em sementes
expressão
de
proteínas
Promotores tecido-específicos são seqüências regulatórias que restringem a
expressão gênica espacialmente a apenas uma ou mais partes da planta, podendo
também regular indiretamente a expressão a nível temporal quando o órgão
destinado ao acúmulo de proteínas heterólogas é associado apenas a um período
do ciclo da cultura (ex. flores e sementes).
Uma série de promotores tecido-específicos já foram extensamente
caracterizados, como os que controlam a expressão de uma zeína de sementes de
milho, da glutenina de trigo, da glutelina de arroz e de proteínas de semente de
ervilhas (Ma et al., 2003).
A expressão de proteínas heterólogas especificamente em sementes implica
em uma série de vantagens naturalmente proporcionadas por esses órgãos.
Como os custos de processamento e purificação são inversamente
proporcionais à concentração do produto em relação à biomassa vegetal, o acúmulo
de altos níveis de proteínas heterólogas em um volume reduzido propicia uma
diminuição significativa dos custos de produção de biofármacos recombinantes
(Stoger et al., 2002).
- 32 -
Apesar de promotores constitutivos permitirem altos níveis de expressão de
proteínas heterólogas em sementes, os polipeptídeos também se encontram em
folhas, pólen e raízes, o que pode afetar de maneira adversa o desenvolvimento de
partes vegetativas da planta, aumentar o risco de exposição da proteína tanto à
herbivoria quanto a insetos polinizadores e a microorganismos da rizosfera, além de
abrir margem para maiores questionamentos em termos de regulamentação e
biossegurança (Commandeur et al., 2003).
A restrição de acúmulo de proteínas heterólogas em sementes ajuda a reduzir
esses riscos e também a diminuir a possibilidade de toxidez potencial do
polipeptídeo à planta (Kusnadi et al., 1997).
Entretanto o sucesso dessa estratégia necessita da ocorrência do
florescimento e da fecundação durante o ciclo reprodutivo da planta para a obtenção
de sementes, enquanto que proteínas produzidas em órgãos vegetativos podem ser
colhidas anteriormente à produção de pólen, eliminando a possibilidade de
ocorrência de fluxo gênico via flores (Lee and Natesan, 2006).
O cultivo de plantas transgênicas em casa de vegetação e a utilização de
plantas autógamas como a soja, o arroz e o feijão, podem ajudar a diminuir a
probabilidade de fluxo gênico mesmo quando promotores tecido-específicos são
empregados para a expressão de proteínas heterólogas nas sementes.
Uma das grandes desvantagens da produção de biofármacos protéicos em
folhas é o fato de os tecidos desses órgãos serem ricos em água e compostos
fenólicos, resultando em um ambiente altamente instável e degradativo, além de
haver a necessidade de congelamento ou desidratação do material após a colheita
para a extração e purificação das proteínas-alvo (Stoger et al., 2005).
Durante a colheita e extração de polipeptídeos recombinantes expressos
nesse ambiente, a alta atividade hidrolítica natural e a presença de proteases
associadas a esses tecidos podem proporcionar uma redução drástica dos níveis de
acúmulo dessas moléculas (Ma et al., 2005).
Diferentemente
de
folhas,
as
sementes
são
locais
naturais
de
armazenamento de altas concentrações de proteínas de reserva, utilizadas na
nutrição do embrião nos estágios iniciais do desenvolvimento fisiológico da plântula
(Stoger et al., 2005).
Esses órgãos apresentam não apenas um ambiente bioquímico apropriado,
desprovido de compostos fenólicos e com baixa concentração de hidrolases, como
- 33 -
também apresenta tecidos especializados para o acúmulo protéico altamente estável
por longos períodos de tempo mesmo à temperatura ambiente, o que reduz a
necessidade de condições especiais de armazenamento (Leite et al., 2001).
Stöger e colaboradores (2000) demonstraram que anticorpos expressos em
sementes de cereais permaneceram estáveis por pelo menos três anos de
armazenamento em temperatura ambiente, sem perda detectável de sua atividade.
Sementes de tabaco transgênicas foram utilizadas como veículo de
expressão de um anticorpo modificado (Fiedler & Conrad, 1995) e de um antígeno
do Human cytomegalovirus (HCMV) (Tackaberry et al., 1999) mediante a regulação
de um promotor tecido-específico de sementes.
O mesmo tipo de promotor foi utilizado para a produção de altos níveis da
enzima recombinante (1,3-1,4)-β-glucanase em sementes de cevada transgênica.
(Horvath et al., 2000).
Jaeger e colaboradores (2002) utilizaram um promotor tecido-específico,
modulador da expressão de uma arcelina de sementes de feijão, para acumular 36
vezes mais (36% PST) um fragmento de anticorpo monoclonal em sementes de
Arabidopsis thaliana do que a mesma proteína sob controle do promotor constitutivo
35S do CaMV (1%TSP).
Dessa maneira, os promotores tecido-específicos de genes codificadores de
proteínas de reserva constituem uma excelente ferramenta a ser empregada em
sistemas de expressão de proteínas recombinantes em plantas.
1.9.1) O promotor da β-faseolina de feijão
A proteína do feijoeiro-comum (Phaseolus vulgaris L.) β-faseolina ― a mais
abundante dentre todas as proteínas de reserva de sementes dessa planta ― é um
polipeptídeo oligomérico com 3 subunidades; α (53 kDa), β (48 kDa) e γ (46 kDa);
cujo promotor gênico foi inicialmente caracterizado por van der Geest e
colaboradores (1996) e estudado por diversos outros autores.
Essa seqüência de 891 pb dirige o acúmulo da β-faseolina especificamente
para os cotilédones responsáveis por nutrir o embrião em sementes de feijão.
Apesar de se mostrar inadequado para viabilizar a expressão da proteína no
endosperma de sementes de algumas monocotiledôneas, esse promotor foi eficiente
- 34 -
para o acúmulo da enzima β-glucuronidase (GUS) no endosperma de sementes de
tabaco transgênico (Bustos et al., 1989).
Também em sementes de tabaco transgênico foi verificada a modulação da
atividade do promotor da β-faseolina pela variação da concentração exógena de
ácido abscísico, sacarose e íons Ca2+ em meio de cultura contendo embriões
expressando o gene uidA (Bustos et al., 1998), além do aumento do conteúdo de
lisina nessas sementes através da expressão da proteína CP 3-5 sob controle desse
mesmo promotor (Keeler et al., 1997).
Ainda sob controle dessa seqüência regulatória Ginzberg e colaboradores
(2004) obtiveram plantas de tomate transgênicas expressando altos níveis de
streptavidina nas sementes.
A hemaglutinina humana também já foi expressa utilizando-se o promotor da
β-faseolina, acumulada nos vacúolos de folhas de tabaco transgênico através de
“protein targeting” (Voelker et al., 1989).
1.10) Endereçamento subcelular - Protein Targeting
Peptídeos-sinais N ou C-terminais podem ser fusionados a proteínas
heterólogas a fim de direcioná-las para locais específicos na célula. Essas
seqüências podem destinar proteínas para a mitocôndria, vacúolos, cloroplastos ou
retê-las no retículo endoplasmático, e geralmente são clivadas após a chegada do
polipeptídeo de interesse à organela de destinação (Bednarek & Raikhel, 1992).
O endereçamento subcelular exerce um papel fundamental nos níveis de
acúmulo de proteínas heterólogas, uma vez que o compartimento celular em que
elas se encontram influencia diretamente os processos de dobramento, montagem e
de modificações pós-traducionais, além de evitar a degradação imediata e a
interferência dos polipeptídeos com o metabolismo da célula ― eventos bastante
freqüentes no citosol (Fischer et al., 2004).
A adição de peptídeos-sinais para o acúmulo eficiente em organelas
proporcionou maiores níveis de produção de proteínas heterólogas em muitos
estudos em que elas naturalmente eram pouco expressas devido à sua toxidez (Pen
et al., 1993; Hood & Jilka, 1999).
- 35 -
Comumente quatro destinos subcelulares são os principais alvos de
compartimentalização para a produção de biofármacos: o apoplasto, o retículo
endoplasmático, os cloroplastos e os corpos protéicos de sementes.
1.10.1) Endereçamento para o apoplasto
Após a síntese protéica no retículo endoplasmático rugoso, se nenhuma
seqüência de endereçamento é associada à proteína nascente, seu destino final é o
apoplasto precedido pela passagem através da via secretória (Twyman et al., 2003).
Dependendo da massa molecular o polipeptídeo pode ser secretado ou retido
no apoplasto, o que acarreta em importantes aplicações para sistemas de culturas
de células em suspensão.
Schillberg e colaboradores (1999) compararam a estabilidade de anticorpos
completos idênticos, cujo acúmulo fora direcionado para o citosol e para o apoplasto
de folhas de tabaco transgênico e constataram que a via secretória constitui um
conjunto de ambientes mais apropriados para o dobramento e montagem desse tipo
de proteína complexa, uma vez que os níveis de acúmulo no apoplasto foram muito
maiores que os do citosol.
Há algumas exceções quanto ao papel da via secretória para o melhor
destino subcelular de anticorpos, principalmente quando são considerados fatores
intrínsecos presentes em cada imunoglobulina e o seu nível de interação com o
compartimento subcelular em que se encontram, refletindo diretamente no grau de
estabilidade dessas moléculas (Schouten et al., 2002).
A principal desvantagem do endereçamento para o apoplasto é o fato de que
as proteínas heterólogas obrigatoriamente são processadas antes no complexo de
Golgi, ambiente onde ocorre a adição de glicanos típicos de plantas, o que pode
levar a perda de autenticidade estrutural e funcional dos polipeptídeos.
1.10.2) Endereçamento para o retículo endoplasmático
O retículo endoplasmático de células vegetais superiores constitui um
ambiente oxidativo, com baixa concentração de proteases e presença de
chaperonas em abundância ― como a proteína Bip ― capazes de promover o
- 36 -
correto dobramento e montagem de proteínas heterólogas complexas, além de
pontes dissulfeto, contribuindo decisivamente para a manutenção da estabilidade
estrutural dessas moléculas (Bruyns et al., 1996).
Além disso, a glicosilação protéica ocorre primeiramente nesse ambiente e
seu correto processamento é crucial para a manutenção da função de muitas
proteínas de origem humana (Ma et al., 2003).
A passagem de proteínas pelo retículo é o destino inicial de polipeptídeos
encaminhados à via secretória e a retenção dessas moléculas no lúmen dessa
organela foi demonstrada como mais recomendável para o acúmulo de maiores
quantidades de proteínas recombinantes em plantas que o próprio apoplasto e o
citosol (Zimmermann et al., 1998).
Conrad e colaboradores (1998) determinaram que a quantidade de anticorpos
recombinantes fusionados na porção C-terminal ao tetrapeptídeo H/KDEL ― um dos
mais populares peptídeos-sinais atualmente empregados para a retenção de
proteínas heterólogas no lúmen do retículo endoplasmático ― foi de 2 a 10 vezes
maior que aqueles expressos em diferentes espécies vegetais na ausência do
peptídeo-sinal.
A utilização do H/KDEL também foi responsável pelo aumento acentuado no
acúmulo da proteína DIP B (similar à teia de aranha), em células das folhas de
Arabidopsis thaliana, resultando em 8,5 % de proteínas solúveis totais nesses
órgãos (Yang et al., 2005).
Polipeptídeos expressos em sementes de cereais permaneceram estáveis até
três anos após armazenamento em temperatura ambiente, sem perda significativa
de atividade em função da baixa atividade proteolítica nesses compartimentos
(Larrick & Thomas, 2001).
Outra
vantagem
do
chamado
“protein
targeting”
para
o
retículo
endoplasmático de sementes é o fato de que proteínas retidas nessa organela não
passam pelo processamento no complexo de Golgi, aspecto fundamental para a
produção de proteínas heterólogas e anticorpos recombinantes em especial
(Sriraman et al., 2004).
- 37 -
1.10.3) Endereçamento para os cloroplastos
A introdução de genes no genoma cloroplasmático ao invés do núcleo
também vem se mostrando interessante nos últimos anos para a obtenção de altos
níveis de proteínas heterólogas nessas organelas (Daniell, 2002).
A obtenção de plantas transplastômicas geralmente é realizada por
biobalística e apresenta inúmeras vantagens; como o alto número de cópias do
transgene
associadas
à
enorme
quantidade
de
cloroplastos
em
células
fotossintetizantes (o que freqüentemente leva a altos níveis de expressão gênica); a
ausência de silenciamento gênico e a possibilidade de expressão conjunta de vários
genes regulados por operons; o alto grau de compartimentalização proporcionado
pelo sistema de membranas da organela, o que limita a possibilidade de degradação
protéica e de toxidez para a planta; além da ausência de DNA cloroplasmático
funcional em grãos de pólen (Fischer et al., 2004).
Plantas de tabaco e a alga Chlamydomonas reinhardtii são os grandes
modelos vegetais para a transformação genética rotineira de cloroplastos.
A albumina sérica humana já foi expressa em cloroplastos de tabaco a um
nível superior a 11% PST (Fernandez-San-Millan et al., 2003).
Essa estratégia também possibilitou o acúmulo das toxinas do cólera e do
tétano acima de 25% PST nessa mesma planta (Daniell et al., 2001; Tregoning et al.,
2003).
Também em cloroplastos de tabaco, Leelavathi e colaboradores (2003)
conseguiram obter um sucesso de 85% recuperação de uma xilanase termoestável
expressa a 6% PST em tecido foliar.
Os altos níveis de expressão gênica em cloroplastos, a possibilidade de
purificação facilitada após a separação dessas organelas do material inicial e
aspectos de biossegurança são tão promissores nesse sistema que em 2003 a
“venture”
americana
Chlorogen
(http://www.chlorogen.com)
foi
fundada
exclusivamente para a exploração comercial de biofármacos utilizando essa
tecnologia em tabaco (Twyman et al., 2003).
Apesar dos pontos altos mencionados há limitações inerentes à esse sistema.
A incapacidade de realização de modificações pós-traducionais em cloroplastos,
incluindo glicosilação, torna restritiva a utilização dessas organelas para a expressão
de proteínas complexas (Daniell, 2002).
- 38 -
Outra questão importante é a possibilidade de transferência horizontal in vitro
de genes cloroplasmáticos de plantas transplastômicas para bactérias (Kay et al.,
2002).
A produção de anticorpos em batatas por transformação genética nuclear,
utilizando um peptídeo-sinal de endereçamento posterior da proteína heteróloga
para os cloroplastos, local onde o anticorpo inibiu enzimas de adição de ramificações
glicosídicas em grãos de amido, pode funcionar como uma estratégia adicional para
evitar o fluxo horizontal de transgenes presentes no genoma cloroplasmático
(Jobling et al., 2003).
1.10.4) Endereçamento para os corpos protéicos
Os
corpos
protéicos
são
prolongamentos
derivados
do
retículo
endoplasmático especializados no acúmulo de proteínas de reserva. Funcionam
como cisternas que ocupam um grande volume citoplasmático e evolutivamente
sofreram adaptações resultantes na alta capacidade de compartimentalização de
grandes volumes de proteínas e de maximização da integridade desses
polipeptídeos (Zheng et al., 1992).
Essas inclusões globulares são encontradas em células cotiledonares de
sementes de tabaco, de leguminosas como a soja e o feijão, além de gramíneas
como o trigo e a cevada e se originam no momento em que começa a biossíntese de
proteínas de reserva nos tecidos responsáveis por nutrir o embrião (Yoo and
Chrispeels, 1980).
Dessa maneira há um sensível aumento do número e da disponibilização de
corpos protéicos ao longo do processo de maturação fisiológica dos grãos dessas
espécies.
Uma vez que esses vacúolos altamente especializados não sofrem qualquer
tipo de fusão com lisossomos, seu lúmen apresenta pH próximo do neutro e
praticamente a ausência de aminopeptidases, fatores que os caracterizam como um
ambiente subcelular onde a degradação protéica é mínima e um excelente alvo para
o endereçamento de polipeptídeos heterólogos quando o objetivo principal da
transformação genética é a manutenção da estabilidade dessas moléculas (Takaiwa
et al., 2007).
- 39 -
Os corpos protéicos de sementes de soja contêm aproximadamente 70% das
proteínas do grão, sendo que a maior parte dessa porcentagem refere-se à proteína
de reserva glicinina, a mais abundante dentre os polipeptídeos presentes nessas
sementes (Tombs, 1967).
Algumas moléculas já foram estavelmente acumuladas com sucesso em
corpos protéicos de soja, dentre elas a enzima D-mio-inositol-3-fosfato-sintase
(MIPS), envolvida na biossíntese de ácido fítico nas sementes (Hegema et al., 2001);
uma proteína δ-zein de reserva de milho (Kim & Krishnan, 2004) e a subunidade B
da toxina termolábil de Escherichia coli (LT-B) (Moravec et al., 2007).
1.11) O peptídeo-sinal de α-coixina
O peptídeo-sinal de uma α-coixina (22 kDa) da poácea Coix (lacrima-jobi), é
uma seqüência do tipo “tag” de 62 pb (figura 1), previamente caracterizada como um
endereçador subcelular N-terminal de polipeptídeos nascentes para corpos protéicos
de sementes dessa planta (Ottoboni et al., 1993).
5`
M A
T
K
I
F
A
L
L
V
L
L A
L S
A
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T
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Figura 1: Seqüência nucleotídica e peptídica (em negrito) do peptídeo-sinal da α-coixina.
O “Laboratório de Genética de Plantas” do Centro de Biologia Molecular e
Engenharia Genética (CBMEG) da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp)
vem desenvolvendo, desde 1990, diferentes cassetes de expressão para avaliar a
produção de proteínas heterólogas no endosperma de sementes de cereais,
incluindo construções contendo o peptídeo-sinal de sementes de C. jobi.
Dentre as proteínas expressas com sucesso pelo grupo da Unicamp,
utilizando o endereçador subcelular, estão o hormônio de crescimento e a próinsulina humanos em sementes de tabaco e de milho transgênicos (Leite et al.,
2000; De Lucca, 2003), um fragmento simples de anticorpo anti-câncer de mama e a
enzima β-glucuronidase também expressos em sementes de tabaco transgênico
(Cançado, 2002; DeRose et al., 1996).
- 40 -
1.12) A pró-insulina humana
A insulina humana é um pequeno hormônio composto por 51 aminoácidos,
com um peso molecular de 5,8 kDa, sintetizada pelas células Beta das ilhotas de
Langerhans do pâncreas.
Essa proteína é responsável pelo controle da absorção de açúcar presente na
corrente sangüínea, através do mecanismo de transdução de sinal que ativa
receptores de glicose presentes na membrana plasmática de hepatócitos e células
musculares, capazes de captar moléculas excedentes para serem estocadas como
glicogênio (Goldman et al., 1979 ).
O hormônio é secretado como um precursor de 86 aminoácidos ― a próinsulina (8 kDa e ponto isoelétrico aproximado de 5,8) ― cujo gene se encontra no
lócus p15.5 no cromossomo 11 e possui uma seqüência codante de 396 pb (figura
2).
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P S S R S V P R A F A S D H C P S A M A
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E G S L Q K R G I V E Q C C T S I C S L
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Y Q L E N Y C N - T Q
Figura 2: Seqüência codificadora da pró-insulina humana. Acesso AY899304, GenBank.; e sua
respectiva seqüência de aminoácidos (em negrito).
A pró-insulina humana possui uma cadeia polipeptídica simples, estabilizada
por três pontes dissulfeto e organizada em três segmentos distintos: o peptídeo C e
as cadeias A e B, conforme ilustra a figura 3.
- 41 -
A
PC2
B
Peptídeo C
Pró-insulina
Cadeia A
PC1
Cadeia B
Figura 3: A) Representação esquemática da pró-insulina humana com os sítios de clivagem das
convertases PC1 e PC2, o peptídeo C, as cadeias A e B e as três pontes dissulfeto estabilizadoras da
estrutura. B) Estrutura terciária da pró-insulina humana; PDB ID: 1sju.
Duas endoproteases, PC1 e PC2 catalisam a ocorrência de clivagens
proteolíticas nas terminações carboxila do aminoácidos Arg 32 e Arg 65 da cadeia
polipeptídica (Steiner et al., 1996 ).
Com a remoção do peptídio C, dois pares de aminoácidos básicos expostos
nas
novas
extremidades
são
posteriormente
removidos
pela
ação
de
carboxipeptidases adicionais, produzindo a insulina madura (figura 4) no interior das
vesículas do complexo de Golgi, local de armazenamento natural do hormônio
processado. (Kaufmann et al., 1997 )
Insulina
Cadeia A
Cadeia B
Figura 4: Insulina humana madura após sofrer as clivagens proteolíticas.
O diabetes mellitus é uma doença metabólica, caracterizada por hiperglicemia
em função da deficiência de secreção de insulina, da ação ineficiente do hormônio
ou de ambos.
- 42 -
A variante tipo 1 da doença é resultante da deficiência de síntese de insulina
em função da perda ou inativação das células Beta do pâncreas, causadas pelo
ataque auto-imune promovido por células T do sistema imunológico (Rother, 2007).
O tipo 2 ocorre em função da redução da sensibilidade celular à ação da
insulina ou resistência ao hormônio, sendo relacionado a disfunções dos receptores
presentes na membrana celular das células-alvo (Zimmet et al., 2001).
Essa patologia é de enorme importância social e econômica, uma vez que
afeta cerca de 151 milhões de pessoas adultas em todo o mundo (4,6% da
população mundial), 8,6 milhões só na América do Sul (International Diabetes
Federation- IDF, 2007, http://www.idf.org/).
Ambos os tipos são crônicos e apenas o tipo 2 apresenta cura, mediante
intervenção cirúrgica desenvolvida recentemente.
O tratamento do diabetes mellitus consiste na administração de insulina
exógena para pacientes do tipo 1 e numa combinação de recomendações para
diabéticos do tipo 2, que incluem: dieta controlada, suplementação de drogas orais
que diminuem a mobilização de glicose a partir de glicogênio hepático, exercícios
físicos regulares e injeção de insulina quando a eficácia de medicação oral é
reduzida (Adler & Turner, 1999).
Desde 1922 a insulina destinada ao tratamento do diabetes era purificada a
partir do pâncreas de suínos e bovinos e apresentava baixa estabilidade, razoável
similaridade com a molécula humana e grande potencial carreador de contaminantes
patogênicos, principalmente vírus de mamíferos (Patlak, 2002).
A fim de substituir o hormônio purificado de mamíferos (comumente utilizado
por pacientes diabéticos até o início dos anos 80), numerosos esforços para a
produção da segunda molécula humana recombinante em sistemas heterólogos
surtiram efeito em 1978, quando um grupo de cientistas liderado por David Goeddel
da empresa de biotecnologia Genentech (fundada pelo prêmio Lemelson e um dos
“pais” da engenharia genética Herb Boyer) e do City of Hope National Medical
Center na Califórnia,
conseguiu obter quantidades razoáveis da molécula
recombinante, produzida em células de E.coli transgênica contendo a seqüência
nucleotídica de 333 pb do hormônio humano integrada ao seu genoma (Goeddel et
al., 1979).
- 43 -
Em 1982 é concedida a liberação da insulina humana recombinante
(Humulin®) pelo FDA (Food and Drug Administration, http://www.fda.gov/) visando
sua administração regular em pacientes diabéticos americanos.
Desde então se intensificaram as pesquisas para o desenvolvimento de
drogas recombinantes mais eficazes, resultando em produtos altamente eficientes
como a Humalog® (Lilly), a Lantus® (Aventis) e a Levemir® (Novo Nordisk); além de
outros sistemas de administração complementares a injeções subcutâneas, como as
bombas de hormônio e as insulinas inaláveis Exubera® (Pfizer) e AERx iDMS® (Novo
Nordisk).
Inúmeros artigos relatando a produção heteróloga aperfeiçoada dessa
proteína em bactéria e em outros organismos transgênicos já foram publicados.
Um sistema de expressão da pró-insulina fusionada a uma cauda “his-tag” Nterminal auxiliou o processo de purificação do hormônio a partir de corpúsculos de
inclusão bacterianos indesejados, problema recorrente de biorreatores procarióticos
(Nilsson et al., 1996).
Kjeldsen e colaboradores (1999) foram os primeiros a expressar a pró-insulina
recombinante em eucariotos, utilizando células de Pichia pastoris e Saccharomyces
cerevisiae.
A remoção da seqüência nucleotídica que codifica os 35 aminoácidos do
peptídeo C, e a inclusão de um heptapeptídio conector das cadeias A e B permitiu a
expressão da insulina por vírus recombinantes empregados com sucesso na terapia
genética de camundongos diabéticos tipo 1 (Lee et al., 2000).
Trabalhos mais recentes citados anteriormente envolvem a produção da próinsulina humana em sementes de tabaco e milho transgênicos (De Lucca, 2003),
além da produção em peixes como carpas (Cirrhinus molitorella) (Zhang et al., 2006)
salmão (Salmo salar) (Wilkinson et al., 2004) e para o tratamento eficiente de
camundongos transgênicos com diabetes do tipo 2 (Pennisi et al., 2006).
O pró-hormônio também foi expresso fusionado à Green Fluorescent Protein
(GFP) de Aequorea victoria em céluas de E. coli (Shi et al., 2006) e em sementes
transgênicas de Arabidopsis thaliana quando, após purificação cromatográfica,
apresentou atividade similar à insulina recombinante produzida em sistema
bacteriano, (Nykiforuk et al., 2006).
- 44 -
1.13) O hormônio de crescimento humano ― hGH
O hormônio de crescimento humano (hGH), também conhecido como
somatotropina, é uma proteína de cadeia simples, constituída por 191 aminoácidos,
estabilizada por duas ligações do tipo ponte dissulfeto, com uma massa molecular
de aproximadamente 22 kDa e ponto isoelétrico aproximado de 5,3 (figura 5) (Filikov
et al., 2002).
Figura 5: Estrutura terciária do hormônio de crescimento humano (hGH). PDB ID: 1hgu.
Essa
molécula
é
sintetizada,
estocada
e
secretada
pelas
células
somatotrópicas da parte anterior da glândula pituitária e desempenha papel
importante no ciclo celular e no crescimento de células somáticas através de seu
efeito sobre o metabolismo de proteínas, carboidratos e lipídeos.
O gene que codifica o hGH se localiza no lócus 17q24.2 do cromossomo 17 e
possui uma seqüência codante de 654 pb (figura 6).
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M A T G S R T S L L L A F G L L C L P W
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- 45 -
S V F A N S L V Y G A S D S N V Y D L L
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T F L R I V Q C R S V E G S C G F Figura 6: Seqüência codante do hGH. Acesso NM000515, GenBank.; e sua respectiva seqüência
de aminoácidos (em negrito).
A capacidade de biossíntese de hGH decai naturalmente a partir dos 20 anos
de idade, mas a ausência ou baixa produção do hormônio na infância e
adolescência, principalmente em função de mutações genéticas, é a causadora do
nanismo hipopituitário pediátrico (Hindmarsh & Brook, 1987).
Até 1985 praticamente todo o hGH disponível para o tratamento de nanismo e
de uma série de doenças associadas à deficiência do hormônio era obtida pela
extração e purificação da proteína de cadáveres humanos.
Apesar de todos os riscos implícitos na utilização da droga em função de sua
origem, não havia alternativa tecnológica e economicamente viável para o
tratamento eficiente do déficit do hormônio.
O gene do hGH foi clonado e expresso em células de E.coli pela primeira vez
em 1979 e o hormônio se tornou a terceira proteína-fármaco produzida em um
organismo transgênico, um marco da biotecnologia atingido pelo grupo pertencente
à mesma Genentech que havia produzido insulina recombinante apenas 1 ano
antes, liderado pelos pesquisadores John Baxter e, novamente, David Goeddel
(Fiddes et al., 1979; Goeddel et al., 1979).
A utilização do hormônio recombinante foi liberada pelo FDA para tratamento
infantil em 1985 e em adultos em 1996.
Desde então inúmeras drogas injetáveis à base de hGH recombinante
sintetizado em E. coli foram produzidas a nível comercial, tais como: Nutropin®
(Genentech), Humatrope® (Lilly), Genotropin® (Pfizer), Norditropin® (Novo), Saizen®
(Merck Serono), Onmitrope® (Sandoz) e Nutropin Depot®.
Apesar de o nanismo ser considerado uma doença rara pelo Human Growth
Foundation (http://www.hgfound.org/) – afeta menos de 200.000 pessoas na
população americana – os custos relacionados ao seu tratamento ainda são altos
- 46 -
mesmo utilizando a droga recombinante, em torno de US$ 4.000 a 20.000 por ano
(http://www.doctorshealthsupply.com/hgh/), o que sinaliza para a necessidade de
desenvolvimento de plataformas de produção recombinante mais eficientes e que
reduzam os custos do medicamento.
Há poucos dados sobre o consumo de hGH no Brasil, mas estima-se a
existência de cerca de 10.000 pacientes em idade escolar que necessitam de doses
do hormônio a um custo médio de 4.000 reais/mês, com uma demanda anual de um
milhão de doses do hormônio importadas a um custo de 15 milhões de dólares por
ano (Revista Fapesp, Dezembro/02, número 82).
A expressão do hGH de maneira aprimorada em bactéria ou em outros
organismos transgênicos já foi alcançada por muitos grupos dos mais variados
centros de pesquisa e de diversas universidades.
O hormônio já foi obtido com 90% de pureza após secreção para o
periplasma de células de E. coli (Becker & Hsiung, 1986) e altos níveis de expressão
já foram relatados utilizando células de Bacillus subtilis (Franchi et al., 1991).
Um gene sintético codificador do hGH também foi expresso utilizando células
de levedura, atingindo a produção de mais de dez moléculas do hormônio por célula
transformada (Tokunaga et al., 1985).
Outros exemplos interessantes são a utilização de baculovirus para mediar a
produção do hormônio em células de larva de bicho da seda (Bombyx mori) e em
cultura de células de inseto (Kadonookuda et al., 1995; Cholin et al., 1996); o
acúmulo de 8% e 10% (PST) de hGH, respectivamente nos cloroplastos de folhas de
Nicotiana tabacum e no apoplasto de células de folhas de Nicotiana benthamiana
(Staub et al., 2000; Gils et al., 2005).
Duas isoformas do hGH, com 20 e 22 kDa respectivamente, foram expressas
estável e transientemente em culturas de células de ovário de hamsters chineses e
foram eficientes para promover a diferenciação de células precursoras em adipócitos
propriamente ditos (Rincon-Limas et al., 1993).
Russell e colaboradores (2005) expressaram o hGH em cultura de células de
tabaco e em sementes de milho e observaram menor degradação proteolítica e
maior acúmulo e manutenção da atividade do hormônio nas sementes do cereal do
que em sistema de suspensão celular.
Trabalhos mais recentes envolvendo mamíferos transgênicos também
obtiveram grande êxito em expressar corretamente e abundantemente o hGH.
- 47 -
Sanchez e colaboradores (2004) obtiveram alta concentração do hormônio
secretado no leite de camundongos e de cabras transformadas por um vetor viral.
Animais transgênicos de maior porte apresentaram rendimentos de produção
do hormônio impressionantes: vacas transgênicas expressaram 5 g de hGH por litro
de leite ordenhado (Salamone et al., 2006), porcas secretaram 25 ng por ml de leite
(Hens et al., 2000) e coelhos produziram 50 µg de hGH por ml de leite e 0,6 ng por
mL de sangue (Limonta et al., 1995).
Recentemente linhagens puras de camundongas transgênicas foram obtidas
utilizando-se o promotor da β-actina de galinha e superexpressaram o hGH,
atingindo um rendimento de até 17 µg do hormônio por ml de leite (von Waldthausen
et al.).
1.14) O fator IX de coagulação sangüínea humana ― FIX
O fator IX de coagulação sangüínea (FIX) é um zimogênio da classe das
serino-proteases, pertencente à família de peptidases S1, dependente de vitamina K
e que apresenta uma cadeia polipeptídica única, dividida em duas regiões: uma leve
e a outra pesada; totalizando 461 aminoácidos, três pontes dissulfeto e uma massa
molecular e ponto isoelétrico aproximados de 55 kDa e 5,2 (figura 7).
Figura 7: Estrutura terciária do fator IX de coagulação sangüínea humana. PDB ID: irfn. EC 3.4.21.22.
Essa glicoproteína é sintetizada e armazenada no fígado e secretada
posteriormente no sangue, onde desempenha um papel-chave nas vias intrínseca e
- 48 -
extrínseca de coagulação sangüínea, quando acoplada a cofatores lipídicos e íons
de cálcio (Bristol et al., 1993).
A participação do FIX na complexa cascata de reações envolve diretamente
mais duas serino-proteases: os fatores XI (FXI) e X (FX).
Após a ativação do FIX pelo FXI previamente ativado, um peptídeo de 11 kDa
é removido da cadeia do primeiro pela clivagem de duas ligações peptídicas,
expondo o sítio com função proteolítica presente na porção pesada da cadeia.
Essa modificação estrutural torna o FIX capaz de catalisar a hidrólise de uma
ligação peptídica envolvendo uma arginina e uma isoleucina do FX, possibilitando
que este último atue na ativação de duas proteínas essenciais para a coagulação
sangüínea: a pró-trombina e o fibrinogênio (Osterud & Rapaport, 1977).
A informação genética do FIX é armazenada em um dos maiores e mais
complexos genes humanos já caracterizados e mapeados, localizado no lócus
Xq27.1-q27.2.1 no braço longo do cromossomo X.
O gene completo possui 35 kb de extensão, 8 exons e uma longa seqüência
codante de 1.326 pb (figura 8).
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L N E R W I S K V N
Figura 8: Seqüência codante do FIX humano contendo 1.326 pb, Acesso NM000133, GenBank.;
e sua respectiva seqüência de aminoácidos (em negrito).
Mutações genéticas que levem à disfunção ou à ausência de síntese do FIX
causam o segundo tipo de hemofilia mais comum, o B (“Christmas disease’), doença
recessiva ligada ao X que afeta 1 em cada 30.000 homens (Roth et al., 2001).
Até a segunda metade de 2007 o tratamento para a hemofilia do tipo B era
realizado apenas a partir de FIX purificado do fígado ou derivado do sangue de
cadáveres humanos.
Nesse ano a multinacional americana Wyeth lançou comercialmente na
América do Norte e Europa a proteína recombinante produzida em larga escala a
partir de células de ovário de hamsters chineses (http://www.benefix.com/),
configurando a primeira incursão do FIX heterólogo destinado ao tratamento de
hemofilia B.
Apesar do ineditismo dessa iniciativa ainda predomina a utilização terapêutica
do fator de coagulação hemoderivado que, apesar de eficiente, é caro e apresenta
enormes riscos de contaminação dos pacientes por príons causadores da doença de
Creutzfeldt-Jakob (vCJD), parvovirus, vírus causadores dos diferentes tipos de
- 50 -
hepatite e AIDS, além de manifestações de trombose, coagulação intravascular
disseminada e alterações da função imune (Shapiro et al., 2005).
Em 1982, a seqüência codante do FIX foi clonada em bactéria pela primeira
vez (Kurachi & Davie, 1982) e quatro anos mais tarde Kaufman e colaboradores
conseguiram expressar, purificar e caracterizar o FIX humano produzido em células
de ovários de hamsters chineses.
Outros sistemas recombinantes de expressão do FIX humano já foram
desenvolvidos, como camundongos transgênicos secretando o hormônio no leite
(Jallat et al., 1990), suspensão de fibroblastos bovinos (Liu et al., 1993) e cultura de
células-tronco do sistema hematopoiético (Chen et al., 2006) e de células de rim de
hamsters bebês (Wajih et al., 2005).
A transferência in vivo de um plasmídeo contendo o gene codificador do FIX
humano se mostrou eficiente para elevar a produção da molécula em células do
fígado de camundongos (Miao et al., 2001).
Partículas de adenovirus também foram utilizadas para transformar células de
músculos esqueléticos de camundongos e cães com hemofilia B (Arruda et al.,
2004), além de células do fígado de macacos (Rhesus macaques) (Nathwani et al.,
2002).
Até o presente momento o FIX recombinante não foi sintetizado em escala
comercial, ao contrário do que ocorre com os fatores VII, VIII, X, e XIII, produzidos
por vários conglomerados diferentes que controlam juntos um mercado em
expansão que começa a marginalizar a produção de hemoderivados.
Apenas no setor de produção de FVIII recombinante, as vendas de drogas
das empresas Bayer, Baxter e Wyeth atingiram juntas US$ 2,8 bilhões em 2007
(http://www.medicalnewstoday.com/articles/63055.php).
Recentemente uma avaliação envolvendo 25 pacientes brasileiros tratados
com FVII recombinante e uma droga similar hemoderivada constatou que a primeira
promoveu coagulações com 100% de eficiência e em média 14 vezes mais
rapidamente do que a droga convencional (57% de eficiência), a um custo completo
de tratamento de US$ 7.590 por paciente, quase a metade dos 13.500 dólares
gastos por indivíduo tratado com o hemoderivado (Ozelo et al., 2007).
Apesar da disponibilidade e do tratamento com alguns fatores recombinantes
ser relativamente mais eficiente e mais barato para promover a coagulação
sangüínea em hemofílicos, seu uso terapêutico ainda possui um custo proibitivo em
- 51 -
países em desenvolvimento como o Brasil, o que sinaliza para a necessidade de
obtenção de sistemas de expressão heteróloga dessas moléculas que permitam
uma redução do preço final da droga ao consumidor.
1.15) O anticorpo scFv DIR83D4
O sc FvDIR83D4 é um fragmento de cadeia simples da porção variável do
anticorpo monoclonal AcM 83D4 (isotipo IgM e subtipo κ), com massa molecular de
29 kDa e ponto isoelétrico estimado em 7,0; cuja extremidade N-terminal do domínio
variável da cadeia pesada (VH) foi fusionado à extremidade C-terminal do domínio da
cadeia leve (VL), sendo ambos interligados por um peptídeo conector de glicina e
sernina (Gly4-Ser1)3 (Babino et al., 1997 ).
O antígeno tumoral Tn é uma molécula truncada de natureza glicídica
identificada pela primeira vez como um produto da doença poliaglutinabilidade
permanente ou síndrome Tn (Bird et al., 1971).
Essa doença é caracterizada pela exposição de antígenos dessa natureza na
superfície de células sangüíneas, resultando na aglutinação de hemácias.
Pequenas quantidades do antígeno Tn também foram encontradas em
mucinas,
constituintes
protéicos
de
grande
parte
do
muco
que
recobre
superficialmente o lúmen de órgãos epiteliais (Cançado, 2002).
As mucinas atuam protegendo fisicamente a membrana plasmática das
células desses órgãos contra o ambiente extracelular, constituindo também um
mecanismo molecular de defesa adicional dos epitélios (Moniaux et al., 2001).
Essas proteínas apresentam grande variabilidade estrutural sendo agrupadas
em diversas famílias.
Algumas características são recorrentes a todas às famílias de mucinas, tais
como a presença de certos domínios peptídicos repetidos seqüencialmente ― onde
a presença de resíduos de serina e treonina é abundante ― além de um complexo
padrão de tradução de mRNAs (Moniaux et al., 2001).
Dentre as mucinas previamente identificadas, aquelas codificadas pelo gene
polimórfico muc1, constituem a família de maior utilidade clínica como marcador
tumoral, particularmente de câncer de mama humano (Petrakou et al., 1998).
- 52 -
As MUC1 foram descritas inicialmente como produtos de secreção de células
epiteliais envolvidas na produção de leite humano e representam o principal
componente protéico da superfície luminal de células das glândulas mamárias
(Petrakou et al., 1998).
A estrutura funcional dessas glicoproteínas está organizada em três domínios
distintos: uma cauda citoplasmática, uma região transmembrana e um extenso
domínio extracelular constituído por repetições em tandem de 20 aminoácidos.
Nessas regiões repetitivas há uma alta concentração de oligossacarídeos Oligados a hidroxilas livres de resíduos de serina e treonina.
A primeira etapa da síntese dos oligossacarídeos O-ligados em mucinas
corresponde à adição de N-acetil-galactosamina (GalNac) às hidroxilas livres
laterais.
Em células sadias essa etapa é seguida pela produção de estruturas
denominadas Core 1 ou antígeno TF, e Core 3, através da adição de um resíduo de
galactose (Gal) ou N-acetil-glicosamina (GlcNac) ao esqueleto carbônico de GalNac
(van den Steen et al., 1998).
Glicosilações adicionais são então realizadas, estendendo as projeções
laterais de oligossacarídeos (Cho et al., 1997).
Em determinados tipos de células cancerosas as mucinas freqüentemente
são expressas abundantemente e seu padrão de glicosilação sofre alterações.
Em processo de câncer algumas das etapas da O-glicosilação são inibidas,
principalmente a adição de galactose e N-acetil-glicosamina, resultando na
truncagem da molécula e na formação do antígeno tumoral Tn, o qual pode ainda
receber uma molécula de ácido N-acetil-neuramínico (antígeno sialil-Tn) (Springer,
1984).
O anticorpo AcM83D4 que deu origem ao scFv DIR83D4 é altamente eficiente
no reconhecimento de antígenos tumorais Tn e foi produzido a partir da linhagem de
hibridomas de mama MCF-7
(Babino et al., 1997 ) e também no sangue de
camundongos imunizados com suspensões celulares de seções epiteliais de
tumores mamários (Pancino et al., 1990).
Esse anticorpo reconhece outros tipos de tumores produtores do antígeno Tn,
como os de ovário e colo retal, sem apresentar reatividade em tecidos sadios
(Charpin et al., 1992), sendo que o reconhecimento do antígeno requer no mínimo
dois resíduos adjacentes de Tn (Osinaga et al., 2000).
- 53 -
Outra característica importante é que o acúmulo do antígeno Tn já foi
verificado em tecidos em início de transformação maligna, caracterizando-o também
como marcador pré-tumoral dos mesmos tipos de cânceres humanos previamente
mencionados (Babino et al., 2000).
O scFv DIR83D4 já foi produzido em bactéria e teve sua eficiência de
reconhecimento do antígeno Tn demonstrada através de ensaios de ELISA (Babino
et al., 1997 ).
Cançado (2002) conseguiu acumular esse mesmo anticorpo em sementes de
tabaco transgênico a partir da integração de um cassete de expressão contendo sua
seqüência codante de 746 pb (figura 9) fusionada ao promotor da γ-kafirina de sorgo
e ao peptídeo-sinal da α-coixina citado anteriormente.
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Q V Q L Q Q S D A E L V K P G A S V K I
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S C K A S G Y T F T D H A I H W V K Q K
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P E Q G L E W I G Y F S P G N G D I K Y
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G N Y D Y W G Q G T T L T L P S G G G G
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D F T L S I N S V E S E D I A D Y Y C Q
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H T N S W P T T F G G G P K L E I K L E
Figura 9: Seqüência codante do scFv DIR83D4. Nucleotídeos em preto correspondem à região
variável da cadeia pesada; em vermelho ao peptídio conector de glicina e serina e em azul à porção
variável da cadeia leve. Em negrito é apresentada a seqüência de aminoácidos correspondente.
Segundo a American Cancer Society (http://www.cancer.org/downloads/
/STT/BCFF-Final.pdf), somente nos Estados Unidos foi estimada a incidência de
- 54 -
62.000 novos casos de câncer de mama e de 42.000 mortes em 2007, o que
representa uma estatística alarmante de aumento de ocorrência da doença quando
comparada aos dados do ano anterior.
De acordo com o mesmo instituto, com relação aos sete estágios de
desenvolvimento do câncer de mama, as chances de sobrevivência do paciente
após cinco anos decorridos do diagnóstico do tumor equivalem a 98% se a detecção
ocorrer no primeiro estágio, o que reforça a necessidade de adoção de medidas de
detecção precoce da doença.
Além disso, a utilização de anticorpos carreadores fusionados a agentes
terapêuticos, que direcionam especificamente os princípios ativos aos locais de
ocorrência dos tumores, representam uma perspectiva futura de aumento de eficácia
e de segurança no tratamento a longo prazo de diversos tipos câncer.
O scFv DIR83D4 recombinante constitui um excelente candidato em potencial
para atuar em kits diagnósticos precoces de câncer de mama, dada sua capacidade
de reconhecimento do antígeno tumoral Tn, tipicamente acumulado em tumores em
início de formação nesse órgão.
Com a finalidade de produzir o anticorpo scFv DIR83D4 anti-Tn em sementes
de plantas transgênicas de soja, foi estabelecida uma parceria e colaboração entre o
Laboratório de Transferência de Genes (Cenargen), o Centro CBMEG – Unicamp e
o Laboratório de Oncologia Básica da Faculdade de Medicina de Montevidéu
(Uruguai).
1.16) O anticorpo scFv anti-CD18
Há pelo menos três décadas as doenças do aparelho circulatório representam
a principal causa de morte no Brasil.
Segundo dados do Ministério da Saúde (http://hiperdia.datasus.gov.br/), as
doenças cardiovasculares são responsáveis por 1.150.000 internações/ano, com um
custo aproximado de 475 milhões de reais aos cofres públicos.
A hipertensão arterial, que atinge aproximadamente 7,5 milhões de
brasileiros, e o diabetes mellitus representam os principais fatores de risco que
levam às doenças do aparelho circulatório.
- 55 -
Entre suas complicações mais freqüentes encontram-se o infarto agudo do
miocárdio, o acidente vascular cerebral, a insuficiência renal crônica e a insuficiência
cardíaca.
Ainda considerando dados do Ministério da Saúde, as mortes em decorrência
de infarto agudo do miocárdio corresponderam a mais de 27% do total de óbitos
ocorridos no Brasil em 2007.
A lesão de repefusão do músculo miocárdio é causada pelo acúmulo de
neutrófilos ativos nesse tecido após diminuição da oxigenação e infarto, levando
freqüentemente à inflamação tecidual e à morte (Engler et al., 1986).
A aderência de neutrófilos ao endotélio vascular é um evento-chave para o
processo de transmigração e influxo no miocárdio lesionado e ocorre pelo
reconhecimento celular mediado por proteínas denominadas “integrinas de adesão”
CD11 e β-2 CD18, presentes na membrana plasmática dessas células e pela
molécula endotelial de adesão intercelular 1 (ICAM-1) (Albelda et al., 1994).
Uma vez aderidos, os neutrófilos penetram o espaço subendotelial e liberam
mediadores inflamatórios que contribuem para a danificação do tecido após evento
de isquemia (Albelda et al., 1994).
Anticorpos monoclonais anti-CD18 possuem a capacidade de reconhecimento
e ligação à integrina CD18 dos neutrófilos, bloqueando sua adesão ao endotélio
vascular e prevenindo o surgimento de lesões cardíacas associadas a essas células
(Diacovo et al., 1996).
Coelhos pré-tratados com anticorpos anti-CD18 sofreram redução da área de
extensão do infarto e de injúrias no músculo cardíaco após eventos de má
oxigenação tecidual, além de apresentarem maiores chances de sobrevivência após
choque hemorrágico e maior grau de prevenção de lesões de reperfusão tanto no
coração quanto no intestino e pulmões (Vedder et al., 1988; Horgan et al., 1990).
O anticorpo scFv anti-CD18 é um fragmento de cadeia simples da porção
variável do anticorpo monoclonal anti-CD18 (IgG1), com 36 kDa de massa molecular
e ponto isoelétrico aproximado de 9,1.
Essa imunoglobulina é codificada por uma seqüência nucleotídica de 763 pb,
clonada em fusão com um sítio de NcoI e com a seqüência parcial de 202 pb
codificadora de um dos principais domínios da proteína A de Staphylococcus aureus
(figura 10).
- 56 -
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Q V Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V
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S C K A S G Y T F N R F W I E W V R Q A
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P G Q G L E W M G E I L P G S G S P N Y
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T E L
Figura 10: Seqüência codante do scFv anti-CD18. Nucleotídeos em preto correspondem às regiões
variáveis da cadeias leve; em azul aos da cadeia pesada; em vermelho ao peptídio conector de
glicina e serina; em laranja ao sítio da enzima NcoI e em verde à seqüência nucleotídica parcial da
proteína A. Os aminoácidos correspondentes estão em negrito.
Essa imunoglobulina foi previamente caracterizada como um efetor eficiente
da redução tanto da intensidade com que aneurismas da artéria aorta se expandem
em camundongos quanto da reperfusão pós-isquêmica após infarto do miocárdio em
cachorros (Ricci et al., 1996; Arai et al., 1996).
O grupo de pesquisadores do Laboratório de Imunologia Molecular da
Universidade de Brasília (UnB), prevendo o enorme potencial que o anticorpo scFv
anti-CD18 apresenta para o tratamento clínico em humanos com insuficiência
- 57 -
cardíaca e problemas circulatórios, propôs a humanização dessa proteína visando a
validação da sua capacidade terapêutica.
Desta maneira, Caldas e colaboradores (2003) conseguiram resultados
bastante promissores com a humanização do anticorpo anti-CD 18 para futuro
tratamento em pacientes humanos.
Sementes transgênicas de soja podem ser veículos eficientes para a
produção do scFv anti-CD18 humanizado, visando a ampliação de sua aplicação
clínica principalmente em função da redução de custos de produção que esse
vegetal pode oferecer.
- 58 -
2) OBJETIVOS
2.1) Objetivo geral
O objetivo principal do presente trabalho foi expressar a pró-insulina humana,
o hGH, o FIX da coagulação sangüínea humana e os fragmentos de anticorpos scFv
DIR83D4 e scFv anti-CD 18 em sementes de soja transgênica.
2.2) Objetivos específicos
•
Avaliar
os
níveis
de
expressão
dessas
proteínas
nas
sementes,
proporcionados pelo cassete de expressão, contendo o promotor da βfaseolina.
•
Estudar a modulação temporal e avaliar a estabilidade das proteínas
heterólogas nas sementes após alguns anos de armazenamento.
•
Caracterizar, do ponto de vista subcelular, a compartimentalização dos
polipeptídeos nos corpos protéicos cotiledonares, avaliando a eficiência da
estratégia de “protein targeting” proporcionada pelo peptídeo-sinal de αcoixina.
- 59 -
3) JUSTIFICATIVAS
A importância da estratégia empregada é justificada não apenas quando se
avalia o papel terapêutico e o potencial econômico encerrados nos cinco
biofármacos recombinantes estudados, bem como na magnitude e impacto social
causados pelo nanismo, a hemofilia B, o diabetes mellitus, o câncer de mama e as
isquemias cardiovasculares em todos os setores da sociedade.
A possibilidade em longo prazo do desenvolvimento tanto de linhagens-elite
de plantas transgênicas, quanto de plataformas de produção comercial dessas
moléculas ― utilizando as mais variadas combinações de diferentes promotores
tecido-específicos e peptídeos-sinais ― necessita primeiramente de estudos
acadêmicos preliminares de prospecção e avaliação de promotores e de estratégias
de expressão gênica, bem como do modo como se comportam a nível estrutural e
funcional cada uma das proteínas heterólogas mencionadas produzidas em soja.
Alternativas terapêuticas eficientes e de custo mais reduzido serão cruciais
para o aumento da sobrevivência e da qualidade de vida dos pacientes num futuro
não tão distante.
Plantas
transgênicas
como
biorreatores
de
fármacos
protéicos,
principalmente a soja como organismo emergente nesses sistemas, se encaixam no
cenário descrito como ferramentas úteis, capazes de auxiliar o alcance desses
objetivos.
- 60 -
4) MATERIAIS E MÉTODOS
4.1) Construção dos vetores plasmidiais de expressão
4.1.1) Construção do vetor pFasPSProins
Para a construção do vetor de expressão da pró-insulina humana, um
fragmento de 483 pb contendo a seqüência codante da proteína e do peptídeo-sinal
de α-coixina foi retirado do vetor pRT-PGK-PSpróINS (4.732 pb), com as enzimas
NcoI e BamHI, e inserido no vetor Beta P/Beta T previamente digerido com as
mesmas enzimas, nos sítios presentes no múltiplo sítio de clonagem entre o
promotor e o terminador da β-faseolina, gerando o vetor pFasPSProins de 4.528 pb
(figura 11).
- 61 -
Hind III (1)
1
Lac Z
Xba I (198)
1
PGK
AMP
Beta P/Beta T
4046bp
Eco RV (915)
Eco RI (1136)
pRT-PgK-PSpróINS
Term Beta P
AMP
4732bp
ORI
Prom Beta P
Hind III (2547)
Nco I (1211)
Bal I
Kpn I
PS-Coix
(62pb)
Pró-Ins
(396 pb)
BamHI (1656)
Sma I
Pst I
Eco RI
Nco I
Pst I
Eco RV
Kpn I
Stu I
Sal I
XhoI (1711)
ORI
Pst I (1298)
T-35S
Bam HI (1694)
Xba I (1698)
Hind II (1928)
Linearização do vetor
BetaP/Beta T com Nco I e
Bam HI.
Retirada do fragmento
contendo a seq. PS Coix e
proIns com Nco I e Bam HI.
Eco RI (654)
1
Ligação do fragmento
PSCoix/proIns no vetor
BetaP/Beta T entre o promotor e o
terminador da β-Phaseolina nos
sítios de Nco I e Bam HI.
AMP
Lac Z
pFASPSproINS
Term
B-P
ProINS
(396pb)
4528bp
PS-Coix
(62pb)
ORI
Prom
B-P
Xho I (2961)
Hind III (2547)
Bam HI (1174)
Sma I
Pst I
Eco RI (1199)
Pst I (1570)
Nco I (1656)
Pst I
Eco RV
Kpn I
Stu I
Sal I
XhoI (1681)
Figura 11: Demonstração da construção do plasmídeo de expressão pFASPSproINS (4528 pb).
4.1.2) Construção do vetor pFasGH
O vetor de expressão do hGH foi obtido a partir da retirada de um fragmento
de 740 pb contendo a seqüência codante da proteína e do peptídeo-sinal de αcoixina a partir do vetor pRT-PGK-PShGH (4.990 pb), com as enzimas NcoI e
BamHI.
Esse fragmento foi inserido no vetor Beta P/Beta T previamente digerido com
NcoI e BamHI, nos sítios presentes no múltiplo sítio de clonagem entre o promotor e
o terminador da β-faseolina, gerando o vetor pFasGH de 4.786 pb (figura 12).
- 62 -
Hind III (1)
1
AMP
Lac Z
Xba I (198)
1
PGK
Beta P/Beta T
4046bp
Eco RV (915)
AMP
Eco RI (1136)
pRT-PgK-PShGH
Term Beta P
PS-Coix
(62pb)
Nco I (1211)
Pst I (1298)
4990bp
ORI
Prom Beta P
Hind III (2547)
hGH
(654 pb)
BamHI (1656)
Sma I
Pst I
Eco RI
Nco I
Pst I
Eco RV
Kpn I
Stu I
Sal I
XhoI (1711)
ORI
T-35S
Bam HI (1951)
Xba I (1998)
Hind II (2221)
Retirada do fragmento
contendo a seq. PS Coix e
hGH com Nco I e Bam HI.
Linearização do vetor
BetaP/Beta T com Nco I e
Bam HI.
Eco RI (396)
1
Lac Z
Term
B-P
Ligação do fragmento PSCoix/Hgh
no vetor BetaP/Beta T entre o
promotor e o terminador da βPhaseolina nos sítios de Nco I e
Bam HI.
AMP
pFASGH
hGH
(654 pb)
BamHI (916)
Sma I
Pst I
Eco RI (941)
Sma I (1071)
4786bp
PS-Coix
(62pb)
ORI
Prom
B-P
Xho I (2961)
Hind III (2547)
Pst I (1570)
Nco I (1656)
Pst I
Eco RV
Kpn I
Stu I
Sal I
XhoI (1681)
Figura 12: Demonstração da construção do plasmídeo de expressão pFASGH (4.786 pb).
4.1.3) Construção do vetor pFasFIX
O fragmento de 1.326 pb contendo a seqüência codante do FIX humano foi
amplificada a partir do DNA plasmidial de um clone constituinte de uma biblioteca de
cDNA humano, previamente construída pela equipe do Laboratório de Imunologia
Molecular da UnB a partir de mRNAs isolados de tecido hepático.
Os oligonucleotídeos de anelamento específico no cDNA do FIX humano
FIXPSNcoI e FIXBamHI (figura 13) foram utilizados na reação de amplificação e
adicionaram um sítio de NcoI, seguido pelo peptídeo sinal de α-coixina na
- 63 -
extremidade 5` do fragmento e BamHI na extremidade 3`, conforme mostra a figura
14.
Primer FIXPSNcoI
Nco I
5`ACCATGGCTACCAAGATATTTGCCCTCCTTGTGCTCCTTGCTCTTTCAGCGAGCGCTACAACTGCGACAG
TTTTTCTTGATCATGA 3`
Primer FIXBamHI
Bam HI
5`AGGATCCTTAAGTGAGCTTTGTTTTTT 3`
Figura 13: Oligonucleotídeos utilizados para amplificar o fragmento contendo a seqüência codante do
FIX humano. Em verde se encontram as seqüências dos sítios de restrição, a do peptídeo-sinal de αcoixina se encontra sublinhada e em negrito as de anelamento no cDNA do FIX.
Biblioteca de cDNA.
1
1
1
clone
1
clone
3000
3000
clone
3000
1
clone
1
clone
3000
clone
3000
3000
1
1
FIXPSNco I
clone
3000
clone
3000
5`
Biblioteca de cDNA humano
contendo clones portadores da
seq. do FIX.
Nco I
5`c
catgg 3`
3`ggtac c 5`
FIX
(1326pb)
3`
FIX BamHI
Amplificação da seq. FIX
com os primers
FIXPSNco I e FIX
BamHI.
PSCoix
(62pb)
FIX
(1326pb)
Bam HI
5`g
gatcc 3`
3`cctag g 5`
Obtenção de fragmentos contendo, a partir da extremidade 5`, um sítio de Nco I
seguida do peptídeo sinal de Coix, da seq. do FIX e de um sítio de Bam HI.
- 64 -
Figura 14: Demonstração da obtenção do fragmento NcoI-PS-FIX-BamHI (1.412 pb).
O fragmento NcoI-PS-FIX-BamHI foi então clonado no vetor Beta P/Beta T
previamente digerido com NcoI e BamHI, nos sítios presentes no múltiplo sítio de
clonagem entre o promotor e o terminador da β-faseolina, gerando o vetor
pFasPSFIX de 5.458 pb (figura 15).
1
AMP
Lac Z
Beta P/Beta T
4046bp
Nco I
Eco RI (1136)
PS Coix
Term Beta P
(62pb)
ORI
Prom Beta P
Bam HI
FIX
(1326pb)
BamHI (1656)
Sma I
Pst I
Eco RI
Nco I
Hind III (2547)
Pst I
Eco RV
Kpn I
Stu I
Sal I
XhoI (1711)
Linearização do vetor
BetaP/Beta T com Nco I e
Bam HI.
Eco RI (524)
AMP
1
Lac Z
Term
B-P
ORI
Ligação do fragmento PSCoix/FIX
no vetor BetaP/Beta T entre o
promotor e o terminador da βPhaseolina nos sítios de Nco I e
Bam HI.
Bam HI (1044)
Sma I
Pst I
Eco RI (1069)
pFASPSFIX
5458bp
Sma I (1199)
Xho I (3761)
FIX
(1326 pb)
Hind III (3346)
Prom
B-P
PS-Coix
(62pb)
Pstu I (2370)
Nco I (2456)
Pst I
Eco RV
Kpn I
Stu I
Sal I
Xho I (2481)
Figura 15: Demonstração da construção do plasmídeo de expressão pFASPSFIX (5.458 pb).
- 65 -
4.1.4) Construção do vetor pFASPSscFvDIR
Para a construção do vetor de expressão do scFv DIR83D4, um fragmento de
805 pb contendo a seqüência codante da proteína e do peptídeo-sinal de α-coixina
foi retirado do vetor pRT-PSscFv (5.062 pb), com as enzimas NcoI e BamHI, e
inserido no vetor Beta P/Beta T previamente digerido com as mesmas enzimas, nos
sítios presentes no múltiplo sítio de clonagem entre o promotor e o terminador da βfaseolina, gerando o vetor pFASPSscFvDIR de 4.826 pb (figura 16).
Hind III (1)
1
AMP
Lac Z
Xba I (198)
1
PGK
Beta P/Beta T
4046bp
Eco RI (1136)
AMP
pRT-PSscFv
Term Beta P
5062bp
ORI
Prom Beta P
Hind III (2547)
BamHI (1656)
Sma I
Pst I
Eco RI
Nco I
Pst I
Eco RV
Kpn I
Stu I
Sal I
XhoI (1711)
PS-Coix
(62pb)
Eco RV (915)
Nco I (1211)
Bal I
Kpn I
Pst I (1298)
scFvDIR
(718pb)
ORI
T-35S
Bam HI (2016)
Hind II (2221)
Xba I (2020)
Retirada do fragmento
contendo a seq. PS Coix e
ScFvDIR83D4 com Nco I e
Bam HI.
Linearização do vetor
BetaP/Beta T com Nco I e
Bam HI.
Eco RI (396)
1
Ligação do fragmento
PSCoix/ ScFvDIR83D4 no
vetor BetaP/Beta T entre o
promotor e o terminador da
β-Phaseolina nos sítios de
Nco I e Bam HI.
Lac Z
Term
B-P
AMP
Bam HI (876)
Sma I
Pst I
Eco RI (901)
pFASPSscFvDIRscFvDIR
(718pb)
4826bp
PS-Coix
(62pb)
ORI
Prom
B-P
Xho I (2961)
Hind III (2547)
Pst I (1570)
Nco I (1656)
Pst I
Eco RV
Kpn I
Stu I
Sal I
XhoI (1681)
Figura 16: Demonstração da construção do plasmídeo de expressão pFASPSscFvDIR (4.826 pb).
- 66 -
4.1.5) Construção do vetor pFASPSAnti-CD18
O fragmento de 960 pb contendo a seqüência codante do scFv anti-CD18 foi
amplificada a partir do DNA plasmidial de um clone bacteriano constituinte de uma
biblioteca de cDNA do scFv anti-CD18 humanizado, previamente construída pelo
grupo do Laboratório de Imunologia Molecular da UnB.
Os oligonucleotídeos de anelamento específico no cDNA do anticorpo
CD18PSEcoRV e CD18BamHI (figura 17) foram utilizados na reação de amplificação
e adicionaram um sítio de EcoRV, seguido pelo peptídeo sinal de α-coixina, na
extremidade 5` do fragmento e BamHI na extremidade 3`, conforme mostra a figura
18.
Primer CD18PSEcoRV
Eco RV
AGATATCATGGCTACCAAGATATTTGACCTCCTTGTGCTCCTTGCTCTTTCAGCGAGCGCTACAACTGC
GCGGGCTCAAGTTCAGTTG
CD18BamHI
Bam HI
AGGATCCGAGCTCGGTACCTTAAGC
Figura 17: Oligonucleotídeos utilizados para amplificar o fragmento contendo a seqüência codante do
scFv anti-CD18. Em verde se encontram as seqüências dos sítios de restrição, em sublinhado a do
peptídeo-sinal de α-coixina e em negrito as de anelamento no cDNA do scFv anti-CD18.
- 67 -
Biblioteca de cDNA.
1
1
1
1
clone
3000
clone
clone
3000
3000
1
clone
1
clone
1
3000
clone
clone
3000
3000
3000
1
CD18PSEco RV
clone
3000
5`
Amplificação da seq.
anti-CD18 com os
primers CD18PSEco RV
e CD18 BamHI.
Biblioteca de cDNA humano
contendo clones portadores da
seq. do anti-CD18.
Eco RV
5`ngat
Anti-CD-18
(960pb)
PS Coix
atcn 3`
3`ncta tagn 5`
(62pb)
Anti-CD-18
(960pb)
3`
CD18 BamHI
Bam HI
5`g
gatcc 3`
3`cctag g 5`
Obtenção de fragmentos contendo, a partir da extremidade 5`, um sítio de Eco RV
seguida do peptídeo sinal de Coix, da seq. do Anti-CD18 e de um sítio de Bam HI.
Figura 18: Demonstração da obtenção do fragmento EcoRV-PS-Anti-CD18-BamHI (1.046 pb).
O fragmento EcoRV-PS-Anti-CD18-BamHI foi então clonado no vetor Beta
P/Beta T previamente digerido com EcoRV e BamHI, nos sítios presentes no múltiplo
sítio de clonagem entre o promotor e o terminador da β-faseolina, gerando o vetor
pFasPSAnti-CD18 de 5.092 pb (figura 19).
- 68 -
1
AMP
Lac Z
Beta P/Beta T
4046bp
Eco RV
Eco RI (1136)
Bam HI
PS Coix Anti-CD18
Term Beta P
(62pb)
ORI
Prom Beta P
Hind III (2547)
(960pb)
BamHI (1656)
Sma I
Pst I
Eco RI
Nco I
Pst I
Eco RV
Kpn I
Stu I
Sal I
XhoI (1711)
Linearização do vetor
BetaP/Beta T com Eco RV e
Bam HI.
AMP
1
Bam HI (890)
Sma I
Pst I
Eco RI (915)
Lac Z
Ligação do fragmento
PSCoix/anti-CD18 no vetor
BetaP/Beta T entre o promotor e o
terminador da β-Phaseolina nos
sítios de Eco RV e Bam HI.
ORI
pFASPSAnti-CD18
5092bp
Term
B-P
Bam HI (1410)
Sma I
Pstu I
Eco RI (1435)
Xho I (3761)
CD-18
(960pb)
Hind III (3346)
Prom
B-P
PS-Coix
(62pb)
Pstu I (2370)
Nco I (2456)
Pst I
Eco RV
Kpn I
Stu I
Sal I
Xho I (2481)
Figura 19: Demonstração da construção do plasmídeo de expressão pFASPSAnti-CD18
(5.092 pb).
- 69 -
4.2) Obtenção do fragmento contendo o gene ahas
Com o objetivo de ser utilizado como gene marcador de seleção, o gene
ahas foi retirado do vetor pAC 321® de 8.400 pb (Cyanamid) pela digestão com
XbaІ nas posições 73 pb e 6.440 pb, liberando o cassete contendo o promotor
ahas, o gene ahas e o terminador ahas (frag ahas) (figura 20), o qual foi utilizado
em co-transformação juntamente com o vetores plasmidiais mostrados
anteriormente nos experimentos de biobalística.
pAC 321®
PvuII
Ampicili
lac M
f1(-)
XbaI
PvuII
prom.
ahas
gene
ahas
ColE1
term.
ahasXbaI
Frag. ahas.
Figura 20: Fragmento contendo o gene ahas, utilizado como marcador de seleção nos
experimentos de co-transformação de soja.
4.3) Transformação de soja
4.3.1) Esterilização de sementes e preparo do material vegetal
Sementes
maduras
das
cultivares
BR16
e
Conquista
foram
superficialmente esterilizadas em etanol 70% por 1 minuto, seguidas por imersão
em 1% de hipoclorito de sódio por 20 minutos e lavadas três vezes em água
destilada estéril, permanecendo nessas condições por 16 a 18 horas.
Os eixos embrionários foram excisados das sementes e seus meristemas
apicais expostos pela remoção dos primórdios foliares.
Os eixos embrionários
foram então posicionados em placas de cultura de 5 cm de diâmetro contendo 12
mL de meio de bombardeamento [meio basal de sais MS (Murashige & Skoog,
1962), 3% de sacarose e 0,8% fitagel Sigma, pH 5,7] com a região apical
direcionada para cima.
- 70 -
4.3.2) Bombardeamento
O bombardeamento dos eixos embrionários com os vetores plasmidiais e o
fragmento ahas foi conduzido como previamente descrito por Aragão e
colaboradores (1996).
4.3.3) Indução de multibrotação
A
multibrotação
dos
meristemas
apicais
dos
eixos
embrionário
bombardeados foi induzida pela transferência e completa imersão dos mesmos
em placa de vidro de 10 cm de diâmetro contendo 15 mL de meio de indução
[meio basal de sais MS , suplementado com 10,0 mg/L benzilaminopurina (BAP),
3% de sacarose e 0,6% ágar Sigma, pH 5,7], imediatamente após o
bombardeamento.
Após a transferência os embriões foram acondicionados no escuro, a
28ºC por 16 horas.
4.3.4) Seleção dos explantes
Após o período de indução os explantes foram transferidos para um frasco
de vidro do tipo “baby food” contendo 20 mL do meio de seleção (MS meio basal
de sais, 3% de sacarose, 500 nM do herbicida imazapyr e 0,7% de ágar Sigma,
pH 5,7) e cultivados a 28ºC sob um fotoperíodo de 16 horas (50 µmoles m -2 s-1).
A partir do momento em que o sistema radicular dos explantes encontrouse
plenamente
desenvolvido
(cerca
de
30
dias)
os
mesmos
foram
individualizados em copos plásticos de 7,0 cm de diâmetro, contendo 0,2 dm3 de
solo fertilizado e transferidos para casa de vegetação sob condições de 25ºC,
umidade relativa de 80% e intensidade luminosa de 350 µmoles m
-2
s-1, onde
permaneceram protegidos por um envoltório plástico transparente na primeira
semana de aclimatação.
Após a identificação por PCR das plantas efetivamente transformadas, as
mesmas foram transferidas para vasos plásticos contendo 5 dm3 de solo
- 71 -
fertilizado e isoladas das plantas não transformadas em outra casa de vegetação,
sob condições propícias para produção de sementes.
4.4) Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Para análise de PCR dos eventos potencialmente transformados e das
progênies, o DNA das plantas selecionadas com o herbicida foi isolado de discos
foliares de acordo com metodologia de Doyle & Doye (1987), utilizando-se CTAB
2X (brometo de cetil-trimetil-amônio).
Cada reação de PCR foi realizada em volume de 25 µL, contendo 10 mM
Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 160 µM de cada dNTP, 200 nM de
cada primer, 2U de Taq polimerase (GIBCO BRL) e cerca de 20 ng de DNA
plasmidial.
O “mix” foi coberto com óleo mineral, desnaturado por 5 minutos a 95°C
em um termociclador (MJ thermal cycler-EUA), e amplificada por 35 ciclos (95°C
por 1 minuto, 55°C por 1 minuto e 73°C por 1 minuto) com um ciclo final de 7
minutos a 72°C.
A reação foi aplicada em gel de agarose 1% e visualizada em luz ultravioleta (UV) por coloração com brometo de etídio.
Foram utilizados 12 oligonucleotídeos (primers) para verificar a presença
dos transgenes nas plantas obtidas (Tabelas 3 e 4).
Tabela 3. Seqüência de oligonucleotídeos utilizados como primers para análise de PCR.
Primer
Seqüência 5`- 3`
Orientação
AHAS 500c
GTG GCT ATA CAG ATA CCT GG
Complementar
AHAS p124
ACT AGA GAT TCC AGC GTC AC
Normal
PSSCFVRev
TGA GAA GCC TTG GAG AAC
Complementar
PSSCFVFwa
TGA AGC AGA AGC CTG AAC
Normal
HGH 601c
CCTTGTCCATGTCCTTCC
Complementar
HGH 273
ATCCAACCTAGAGCTGCTCC
Normal
pCons3
CTTATCTGGGAACTACTCACAC
Complementar
pCons5
CCCTCGTACGCCTATGCAC
Normal
- 72 -
FIX AL 751c
TAACGATAGAGCCTCCACAG
Complementar
FIX AL 256
GATGGAGATCAGTGTGAGTC
Normal
CD 18 AL 583C
TGTGCACCAAGCGTTGGCTA
Complementar
CD18 AL 66
GGCTCAAGTTCAGTTGGTTC
Normal
Tabela 4. Pares de primers utilizados e o tamanho dos fragmentos amplificados.
Primer
Fragmento amplificado
Gene
pCons3
701 pb
pró-insulina
328 pb
hgh
495 pb
fix
450 pb
ScFvDIR83D4
517 pb
cd18
pCons5
HGH 273
HGH 601c
FIX AL 256
FIX AL 751c
PSSCFVFwa
PSSCFVRev
CD18 AL 66
CD 18 AL 583C
4.5) Avaliação da progênie
Cinco gerações de plantas de soja PCR positivas para o gene do scFv
DIR83D4 foram cultivadas em casa de vegetação. Já as demais plantas positivas
para outros genes avançaram duas gerações nas mesmas condições.
Lotes de sementes das progênies de todas as plantas transgênicas foram
avaliados por PCR. Apenas as transgênicas foram plantadas ou analisadas
molecular ou bioquimicamente conforme indicado a seguir:
- 73 -
4.5.1) Análise por Southern blot
O DNA genômico de plantas da primeira geração (R1) PCR positivas para os
genes do hGH, FIX e scFv DIR83D4 foi isolado de acordo com o protocolo
estabelecido por Dellaporta e colaboradores (1983).
O Southern blot foi realizado segundo protocolo estabelecido por Sambrook e
colaboradores (1989).
Cerca de 15 µg de DNA foram digeridos com a enzima HindIII (150 unidades),
separados em gel de agarose 1% e transferidos para uma membrana de nylon
Hybond® N + (Amersham).
Para a hibridização foram utilizadas respectivamente sondas de 750, 885 e
890 pb, de anelamento interno nos próprios genes hgh, fix e scFvdir83d4, marcadas
com α32P dCTP (3000 Ci/mol) usando o kit de marcação
Ready-To-Go DNA
®
Labeled (GE Healthcare) de acordo com as recomendações do fabricante.
4.5.2) Análise por RT- PCR
Sementes verdes R2 e R5 (no caso do scFv DIR83D4) de plantas PCR
positivas com 60 dias completos foram analisadas para a presença de transcritos
dos genes hgh, fix e scfvdir83d4.
Os RNAs totais de 250 mg de sementes verdes foram isolados segundo o kit
Micro-to-Midi Total RNA Purification System® (Invitrogen).
O DNA genômico remanescente foi eliminado pela digestão das amostras de
RNA pela ação de 2 U de DNAse 1® (Ambion).
Os cDNAs foram construídos a partir de 2 µg de RNA total utilizando-se o kit
SuperScript II RNase H- Reverse Transcriptase® (Invitrogen) de acordo com as
recomendações do fabricante.
Após a construção dos cDNAs foram realizadas reações de PCR conforme
descrito anteriormente.
- 74 -
4.5.3) Análises por western blot
Os extratos protéicos totais de sementes R1 e R5 (scFv DIR83D4) maduras
PCR positivas para os genes pró-insulina, hgh, fix, scfvdir83d4 e anti-cd18 foram
isolados e quantificados de acordo com o protocolo descrito por Marcellino e
colaboradores (1998)
Os mesmos foram separados por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDSPAGE, “stacking gel” 5% e “resolving gel” 15%) e transferidos para membranas de
nitrocelulose C Extra® (Hybond) utilizando o transblot SD-eletrotransfer® (Bio-Rad)
sob 100 mA constantes e 15 V regulados.
As membranas foram bloqueada com 50 mL de solução de leite em pó 5% em
TBS 1X (Tris base 0,02 M e NaCl 0,137 M, pH 7,6) por 16 horas a 4°C e incubadas
por 4 hs à temperatura ambiente com os respectivos anticorpos primários anti-soro
policlonais produzidos em coelho, diluídos em 10 mL de solução de bloqueio: antipró-insulina (dil. 1 : 1.000 - 0,5 ng/µL), anti-hGH (dil. 1 : 2.500 - 0,2 ng/µL); antihuman FIX (dil. 1 : 3.000 - 4 ng/µL), anti-scFv DIR83D4 (dil. 1 : 2.500 – 0,48 ng/µL)
e anti-proteina A (dil. 1 : 2.000 - 0,25 ng/µL).
Após lavagem com PBS 1X (Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,7 mM, NaCl 140 mM
e KCl 2,7 mM) os blots foram incubados em solução anti-soro anti-IgG de coelho
(produzido em cabra) conjugado com fosfatase alcalina (Bio-Rad) numa diluição de
1: 5.000 (0,2 ng/ µL).
Os blots foram revelados com o substrato quimioluminescente CSPD®
(Applied Biosystems) de acordo com as indicações do fabricante e com filmes
fotográficos Kodak Standard® (Kodak).
Também para a revelação foram utilizados 10 mL do tampão de revelação
(200 µL de NaCl 5 M; 1 mL de Tris 3 M, pH 9,5; 50 µL de MgCl2 1 M) acrescido dos
substratos cromogênicos para fosfatase alcalina NBT 50 mg/mL (Nitro blue
tetrazolium em dimetil formamida 70%) e BCIP 25 mg/mL (5-bromo-4-cloro-3-indolil
fosfato em dimetil formamida 70%).
Para a estimativa dos níveis de expressão do hGH, FIX e scFv DIR83D4 em
sementes transgênicas R1 de diferentes linhagens, foram realizados western blots
semi-quantitativos com 80 µg de extratos protéicos em triplicata de cada amostra e
30, 90, 150 e 20 ng das respectivas proteínas comerciais ou produzidas e
- 75 -
purificadas a partir de E.coli (controles positivos), separados individualmente em
membranas, uma para cada proteína heteróloga.
Os procedimentos de eletroforese, eletro transferência, bloqueio, incubação
com anticorpos e revelação foram os mesmos já descritos anteriormente.
Os filmes fotográficos foram digitalizados e as bandas relativas às amostras e
aos controles positivos foram analisadas utilizando-se o programa Muli-Gauge®
(FujiFilm).
Foram elaboradas curvas-padrões para cada série de controles-positivos,
relacionando a respectiva quantidade de pixels de cada banda e sua massa
molecular em µg.
Essas curvas foram utilizadas para estimar a massa percentual das proteínas
heterólogas contidas nas sementes transgênicas.
Western blots fenológicos foram realizados também com linhagens hGH, FIX
e scFv DIR83D4, utilizando respectivamente sementes transgênicas R2 e R5 em 4
diferentes estágios de maturação fisiológica, colhidas com 15 dias de diferença ao
longo do ciclo da cultura.
4.5.4) Análises de imunocitoquímica
Sementes maduras transgênicas R1 de linhagens pró-insulina, hGH, FIX, e
anti-CD18 e R5 de scFv DIR83D4 foram cortadas manualmente em pedaços
pequenos e fixadas por 4 horas a 4°C em solução contendo paraformaldeído 2% e
glutaraldeído 0,5% em tampão cacodilato 0,05 M, pH 7,2.
Após a fixação os segmentos foram lavados três vezes, cada uma por 15
minutos no mesmo tampão e desidratados por 5 horas com etanol sob
concentrações crescentes de 30%, 50%, 70%, 95% e 100%, 1 hora para cada
concentração, a -20°C sob vácuo.
Após a desidratação os segmentos foram infiltrados durante 3 horas com
soluções de concentrações crescentes de resina LR White® (SPI Supplies), diluída
em etanol, variando de 30% a 100%, e 8 horas em resina pura.
A inclusão foi realizada com a embebição dos pedaços de sementes em
solução contendo 1,98 g de benzoilperóxido e 5 gotas do acelerador de
- 76 -
polimerização da própria resina em 100 mL de resina LR White® pura, e incubados a
4°C sob luz UV por 72 horas.
Seções ultra-finas foram obtidas com ultra-micrótomo e coletadas em telas de
níquel de 400 mesh.
Para a reação de imunocitoquímica as telas foram incubadas por 1 hora à
temperatura ambiente com PBST 1X (Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,7 mM, NaCl 140
mM , KCl 2,7 mM, Tween 20 0,5% e albumina sérica bovina 2% ), e por 2 horas com
os anticorpos anti-pró-insulina (dil. 1: 10 - 5 ng/µL), anti-hgh (1 : 100 - 5 ng/µL), antihuman FIX (1 : 500 - 24 ng/µL), antiscFv DIR83D4 ( 1 : 100 - 12 ng/µL) e anti-antiCD18 (1 : 30 - 16,6 ng/µL) diluídos em PBST 1X.
Após lavagem por 1 hora em PBS 1X (Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,7 mM,
NaCl 140 mM e KCl 2,7 mM) as telas foram incubadas em solução contendo
proteína A conjugada com ouro (Gold Conjugate Protein A® – SPI Supplies) numa
diluição de 1 : 20 (20 nM) por 2 horas.
Após lavagem por 1 hora em PBS 1X as amostras foram secas por 24 horas,
contrastadas com acetato de uranila 1% em PBS 0,1 M e observadas no
Microscópio de Transmissão Eletrônica Zeiss EM 900® (Carl Zeiss).
- 77 -
5) RESULTADOS
5.1) Linhagens transgênicas obtidas
Nos experimentos de biobalística foram bombardeadas as regiões dos
meristemas apicais de eixos embrionários de sementes de soja cv. Conquista e cv
BR16.
Foram obtidas 2 linhagens transgênicas com o gene da pró-insulina humana,
5 com o do hGH, 11 com o do FIX humano, 1 com o do scFv DIR83D4 e 4 com o do
scFv anti-CD18 (tabela 5).
Tabela 5. Linhagens transgênicas de soja obtidas por biobalística.
N° embriões
bombardeados
450
1000
1100
600
1000
Linhagem
Gene
Cultivar
194
195
23 /01
23/03
23/06
23/09
23/19
01
07
51
73
106
171
177
211
216
94
170
13/27
12
26
68
61
pró-insulina
pró-insulina
hgh
hgh
hgh
hgh
hgh
fix
fix
fix
fix
fix
fix
fix
fix
fix
fix
fix
scfvddir83d4
anti-cd18
anti-cd18
anti-cd18
anti-cd18
Conquista
Conquista
Conquista
Conquista
Conquista
Conquista
Conquista
BR 16
BR 16
BR 16
BR 16
BR 16
BR 16
BR 16
BR 16
BR 16
BR 16
BR 16
Conquista
BR 16
BR 16
BR 16
BR 16
PCR
Planta R0
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
- 78 -
5.2) Análise das progênies por PCR
A presença dos transgenes na geração R1 das diferentes linhagens foi
detectada por PCR utilizando-se os pares de primers mencionados na tabela 4,
conforme ilustram as figuras 21, 22, 23, 24 e 25.
1
2
3
4
5
6
7
701 pb
Figura 21: Reação de PCR demonstrando a amplificação de um fragmento de aproximadamente 701
pb interno ao gene da pró-insulina humana. 1 e 2 correspondem às sementes transgênicas das
linhagens 194 e 195; 3 à semente não-transgênica da mesma linhagem 195; 4 à semente
sabidamente não-transformada (controle negativo) controle negativo; 5 à água; 6
ao plasmídeo
®
pFASPSproINS e 7 ao marcador de peso molecular 1 kb DNA ladder (Invitrogen).
1
2
3
6 11
7 128 13914101511
41 52 6 3 7 48 59 10
16 12 13 14
328 pb
Figura 22: Reação de PCR demonstrando a amplificação de um fragmento de aproximadamente 328
pb interno ao gene do hGH. 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 11 correspondem a sementes transgênicas das
linhagens 23 /01, 23/03, 23/06, 23/09 e 23/19; 3, 4 e 12 a sementes não-transgênicas das linhagens
23 /01 e 23/19; 13 ao controle negativo; 14 à água; 15 ao plasmídeo pFasGH e 16 ao marcador de
peso molecular 1 kb DNA ladder® (Invitrogen).
- 79 -
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11
495 pb
Figura 23: Reação de PCR demonstrando a amplificação de um fragmento de aproximadamente 495
pb interno ao gene do FIX humano. 1, 3, 4, 5, 6 e 7 correspondem a sementes transgênicas das
linhagens 01, 07, 51, 73, 101 e 107; 2 à semente não-transgênica da linhagem 01; 8 ao controle
negativo; 9 à água; 10 ao plasmídeo pFASPSFIX e 11 ao marcador de peso molecular 1 kb DNA
ladder® (Invitrogen).
1
2
3
5
4
6
7
8
9
450 pb
Figura 24: Reação de PCR demonstrando a amplificação de um fragmento de aproximadamente 450
pb interno ao gene do scFv DIR83D4. 1, 2, 3, 4 e 5 correspondem a sementes transgênicas da
linhagem 13/27; 6 ao controle negativo; 7 à água; 8 ao plasmídeo pFASPSscFvDIR83D4 e 9 ao
marcador de peso molecular 1 kb DNA ladder® (Invitrogen).
1
2
3
4
5
6
7
8 9 10
11 12 13
14 15
517 pb
Figura 25: Reação de PCR demonstrando a amplificação de um fragmento de aproximadamente 517
pb interno ao gene do scFv anti-CD18. 1, 3, 4, 6 e 11 correspondem a sementes transgênicas das
linhagens 12, 26, 61 e 68; 2, 5, 7, 8, 9 e 10 a sementes não-transgênicas das mesmas linhagens; 12
ao controle negativo; 13 à água; 14 ao plasmídeo pFASPSAnti-CD18 e 15 ao marcador de peso
molecular 1 kb DNA ladder® (Invitrogen).
- 80 -
5.3) Análise das progênies por Southern blot
As figuras 26, 27 e 28 ilustram as análises de hibridização dos DNAs
genômicos de plantas R1 PCR positivas com sondas marcadas radioativamente.
1 2 3 4
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
4.7 kb
Figura 26: Southern blot de plantas R1 de três linhagens distintas transformadas com o plasmídeo
pFasGH. 1, 2 e 3 correspondem a plantas da linhagem 23/01; 4, 5, 6, 7 e 8 a plantas da linhagem
23/03; 9, 10, 11, 12 e 13 a plantas da linhagem 23/09; 14 a uma planta sabidamente não-transgênica
(controle negativo); 15 ao plasmídeo pFasGH de 4. 786 pb (100 pg); 16 ao marcador de peso
molecular 1 kb DNA ladder® (Invitrogen).
1
2
3
4 5
5.4 kb
Figura 27: Southern blot de plantas R1 de duas linhagens distintas transformadas com o plasmídeo
pFASPSFIX. 1 corresponde à planta da linhagem 51; 2 à planta da linhagem 171; 3 ao controle
negativo; 4 ao plasmídeo pFASPSFIX de 5.458 pb (100 pg) e 5 ao marcador de peso molecular 1 kb
DNA ladder® (Invitrogen).
- 81 -
1
2
3
4
5
6
7
4.8 kb
Figura 28: Southern blot de plantas R1 da linhagem 13/27 transformada com o plasmídeo
pFASPSscFvDIR. 1, 2, 3, 4 e 5 correspondem a plantas da linhagem transgênica; 6 ao controle
negativo e 7 ao plasmídeo pFASPSscFvDIR de 4.826 pb (100 pg).
5.4) Análise das progênies por RT- PCR
A verificação da expressão a nível transcricional dos genes hgh, fix e
scfvdir83d4 foi realizada por meio de reações de RT-PCR de sementes R2 e R5
imaturas conforme ilustrado nas figuras 29, 30 e 31.
1
2
3
4
5
6
7
8
328 pb
Figura 29: Análise de RT-PCR de sementes verdes R2, PCR positivas para o gene do hGH. 1, 2, 3 e
4 correspondem respectivamente às sementes transgênicas das linhagens 23/01, 23/03, 23/09 e
23/19; 5 à semente de uma planta sabidamente não-transformada (controle negativo); 6 à água; 7 ao
plasmídeo pFasGH e 8 ao marcador de peso molecular 1 kb DNA ladder® (Invitrogen).
- 82 -
1
2
3
5
4
6
7
495 pb
Figura 30: Análise de RT-PCR de sementes verdes R2, PCR positivas para o gene do FIX. 1, 2 e 3
correspondem respectivamente às sementes transgênicas das linhagens 01, 07 e 171; 4 ao controle
negativo; 5 à água; 6 ao plasmídeo pFASPSFIX e 7 ao marcador de peso molecular 1 kb DNA
ladder® (Invitrogen).
1
2
3
4
5
6
450 pb
Figura 31: Análise de RT-PCR de sementes verdes R5, PCR positivas para o gene do scFv DIR83D4.
1 e 2 correspondem a sementes transgênicas da linhagem 13/27; 3 ao controle negativo; 4 à água; 5
ao plasmídeo pFASPSscFvDIR e 6 ao marcador de peso molecular 1 kb DNA ladder® (Invitrogen).
- 83 -
5.5) Análise de western blot de sementes transgênicas
A análise da expressão a nível traducional dos transgenes hgh, fix,
scfvdir83d4 e anti-cd18 e a comprovação do acúmulo das proteínas heterólogas em
sementes transgênicas R1 e R5 pode ser verificada nas figuras 32, 33, 34 e 35.
1
2
3
4
5
6
22 kDa
Figura 32: Detecção do hGH em sementes transgênicas R1. 1, 2 e 3 correspondem respectivamente
a 100 µg de extratos protéicos de sementes das linhagens 23/19, 23/09 e 23/03; 4 a 100 µg de
semente sabidamente não-transformada (controle negativo); 5 a 100 ng de hGH purificado de E. coli
e 6 ao marcador de massa molecular All Blue® (Bio-Rad).
1
2
3
4
5
6
7
8
55 kDa
Figura 33: Detecção do FIX humano em sementes transgênicas R1. 1, 2 e 3, correspondem
respectivamente a 100 µg de extratos protéicos de sementes das linhagens 01, 07 e 51; 4 e 5 a
sementes da linhagem 171; 6 a 100 µg de controle negativo; 7 a 40 ng de FIX comercial (SIGMA) e 8
ao marcador de massa molecular All Blue®(Bio-Rad).
- 84 -
1
3
2
4
5
6
7
29 kDa
Figura 34: Detecção do scFv DIR83D4 em sementes transgênicas R5. 1, 2, 3 e 4 correspondem
respectivamente a 100 µg de extratos protéicos de sementes da linhagem 13/27; 5 a 100 µg de
controle negativo; 6 a 300 ng de scFv DIR83D4 purificado de E. coli e 7 ao marcador de massa
molecular All Blue® (Bio-Rad).
1
2
3
4
5
6
42 kDa
Figura 35: Detecção do Anti-CD18 em sementes transgênicas R1. 1 e 2, correspondem a 90 µg de
extratos protéicos de sementes da linhagem 12; 3 e 4 à mesma massa de sementes da linhagem 26;
5 ao controle negativo e 6 ao marcador de massa molecular All Blue® (Bio-Rad).
- 85 -
5.6) Estimativa de acúmulo do hGH, FIX e scFv DIR83D4 em
sementes transgênicas
Os níveis de acúmulo das três proteínas heterólogas em sementes de soja
transgênicas R1 foi estimado por western blots semi-quantitativos (tabela 6):
Tabela 6. Estimativas de concentração de três proteínas
heterólogas em sementes transgênicas.
Gene
Linhagem
Acúmulo (%)
hgh
23 /01
0,07
23/03
0,05
23/06
0,03
23/09
0,16
23/19
0,8
01
0,023
07
0,085
51
0,15
73
ND
94
ND
106
ND
170
ND
171
ND
177
ND
211
ND
216
ND
13/27
0.93
fix
scfvdir83d4
ND: não determinado
5.7) Cinética de acúmulo das proteínas heterólogas
A produção e o acúmulo do hGH, do FIX e do scFv DIR83D4 foi avaliada ao
longo do ciclo fenológico da soja.
- 86 -
Experimentos de western blots foram realizados tendo como material vegetal
sementes R1 e R5 com 15 dias de diferença de maturação fisiológica, conforme
mostram os resultados das figuras 36, 37 e 38.
hGH.
1
2
3
4
Loading control
Western blot
PCR
75
dia
s
90
10
dia
s
5d
ias
12
0
dia
s
Figura 36: Avaliação da cinética de expressão do hGH em sementes transgênicas em diferentes
estágios de maturação fisiológica. 1, 2, 3 e 4 correspondem a 80 µg de extratos protéicos de
sementes R1 PCR positivas (linhagem 23/19), que apresentam diferentes níveis de acúmulo do
hormônio.
FIX.
1
2
3
4
Loading control
Western blot
PCR
75
dia
s
90
dia
s
10
5d
ias
12
0d
ias
Figura 37: Avaliação da cinética de expressão do FIX em sementes transgênicas em diferentes
estágios de maturação fisiológica. 1, 2, 3 e 4 correspondem a 80 µg de extratos protéicos de
sementes R1 PCR positivas (linhagem 07), que apresentam diferentes níveis de acúmulo do fator de
coagulação.
- 87 -
scFvDIR83D4.
1
2
3
4
Loading control
Western blot
PCR
75
d ia
s
90
d ia
s
10
5d
ias
12
0d
ias
Figura 38: Avaliação da cinética de expressão do scFv DIR83D4 em sementes transgênicas em
diferentes estágios de maturação fisiológica. 1, 2, 3 e 4 correspondem a 80 µg de extratos protéicos
de sementes R5 PCR positivas (linhagem 13/27), que apresentam diferentes níveis de acúmulo do
anticorpo.
5.8) Ensaios de imunocitoquímica de sementes maduras
A localização espacial e o endereçamento subcelular das proteínas
heterólogas, promovido pelo peptídeo-sinal de α-coixina, foram verificados por
análises de imunocitoquímica (figuras 39, 40, 41, 42 e 43).
- 88 -
CP
CO
CO
CP
CP
CO
CP
CO
CP
CP
1
2
CO
CP
CP
CP
CO
CP
CO
CO
3
CP
4
Figura 39: Imunocitoquímica de seções ultra-finas de cotilédones, mostrando o acúmulo subcelular da pró-insulina
em sementes R1 de soja transgênica. CP = Corpos Protéicos; CO = Corpos de Óleo. 1 e 2 correspondem a
sementes transgênicas da linhagem 194; 3 à semente transgênica da linhagem 195 e 4 à semente nãotrasngênica (controle negativo). As setas indicam a presença da proteína A conjugada com ouro e
conseqüentemente o reconhecimento da pró-insulina humana pelo anticorpo anti-pró-insulina.
- 89 -
CP
CP
CP
CO
CO
CP
CO
CP
CO
CO
CO
1
2
CP
CP
PC
CO
CO
CO
CO
CO
CP
CP
CO
3d)
4
Figura 40: Imunocitoquímica de seções ultra-finas de cotilédones, mostrando o acúmulo subcelular do hGH em
sementes R1 de soja transgênica. CP = Corpos Protéicos; CO = Corpos de Óleo; PC = Parede Celular. 1 e 2
correspondem a sementes transgênicas da linhagem 23/19; 3 à semente transgênica da linhagem 23/09 e 4 à
semente não-trasngênica (controle negativo). As setas indicam a presença da proteína A conjugada com ouro e
conseqüentemente o reconhecimento do hGH pelo anticorpo anti-hGH na parede celular cotiledonar de soja.
- 90 -
CP
CO
CO
CP
CP
CO
CP
CP
CP
CO
CP
CO
1
2
CO
CP
CP
CP
CO
CP
CP
CO
CO
CO
CO
CP
3
4
Figura 41: Imunocitoquímica de seções ultra-finas de cotilédones, mostrando o acúmulo subcelular do FIX em
sementes R1 de soja transgênica. CP = Corpos Protéicos; CO = Corpos de Óleo. 1 e 2 correspondem a sementes
transgênicas da linhagem 07; 3 à semente transgênica da linhagem 171 e 4 à semente não-trasngênica (controle
negativo).
- 91 -
CO
CP
CO
CO
CO
CP
CP
CP
CP
PC
CO
CP
1
2
CP
CP
CO
CP
CO
CP
CP
CO
CO
PC
PC
CO
CO
3
4
Figura 42: Imunocitoquímica de seções ultra-finas de cotilédones, mostrando o acúmulo subcelular do scFv DIR83D4
em sementes R5 de soja transgênica. CP = Corpos Protéicos; CO = Corpos de Óleo; PC = Parede Celular. 1, 2 e 3
correspondem a sementes transgênicas da linhagem 13/27 e 4 à semente não-trasngênica (controle negativo). As
setas indicam a presença da proteína A conjugada com ouro e conseqüentemente o
reconhecimento do
scFvDIR83d4 pelo anticorpo anti-scFvDIR83D4.
- 92 -
CO
CO
CO
CO
CP
CP
CO
CO
CP
2
1
CO
CO
CO
CP
CP
MP
PC
CO
CO
CO
3
4
Figura 43: Imunocitoquímica de seções ultra-finas de cotilédones, mostrando o acúmulo subcelular do anti-CD18
em sementes R1 de soja transgênica. CP = Corpos Protéicos; CO = Corpos de Óleo; MP = Membrana Plasmática;
PC = Parede Celular. 1 e 2 correspondem a sementes transgênicas da linhagem 12; 3 à semente da linhagem 26 e
4 à semente não-trasngênica (controle negativo). As setas indicam a presença da proteína A conjugada com ouro
e conseqüentemente o reconhecimento do scFv anti-CD18 pelo anticorpo anti-Proteína A.
- 93 -
6) DISCUSSÃO
Nos experimentos de transformação genética foram obtidas linhagens
transgênicas de soja contendo todos os 5 transgenes individualmente. Cada grupo
de linhagens de um transgene específico apresentou uma eficiência de
transformação genética diferente: 0,44% para o gene da pró-insulina humana; 0,5%
para o do hGH; 1% para o do FIX; 0,16% para o do scFv DIR83D4 e 0,4% para o do
Anti-CD18.
Esses valores podem ser atribuídos tanto a diferentes condições de
laboratório, como o preparo e a utilização de reagentes para o bombardeamento e a
manipulação dos explantes em cultura de tecidos, quanto a elementos genéticos
intrínsecos a cada evento transformante, relacionados à expressão do gene ahas
para seleção com o herbicida imazapyr® e a interação entre cada transgene com o
genoma das cultivares BR16 e Conquista.
Nos
experimentos
de
co-transformação
não
foram
obtidas
plantas
transgênicas contendo apenas cópias do gene ahas e ausência dos demais
transgenes, o que indica que todos os eventos transformados continham, além do
gene de interesse, uma ou mais cópias do gene ahas e que a seleção ocorreu
exclusivamente pela ação do herbicida e não fruto de escapes fortuitos.
A obtenção de progênies R1 transgênicas em todas as linhagens sugeriu que
a integração genômica dos transgenes foi estável e passível de herança quando do
avanço de gerações em casa de vegetação – algo bastante evidente com a
linhagem 13/27, que atingiu a R5 em estufa.
Essa característica é essencial para o melhoramento genético assistido e
para a introgressão da capacidade de produção das proteínas heterólogas em
outras variedades de soja desenvolvidas mais recentemente.
As análises de PCR mostraram que tanto os eventos transformantes
primários (plantas-mães de cada linhagem) obtidos em laboratório, quanto as
progênies apresentaram amplificações de fragmentos dos cassetes de expressão
decorrentes do anelamento específico com os respectivos primers.
Em todas as reações os padrões de migração eletroforética dos fragmentos
amplificados nas amostras corresponderam àqueles esperados pelos locais de
anelamento dos primers (checadas em comparação com o padrão de marcador de
- 94 -
peso molecular 1 kb DNA Ladder), e também pela comparação com os padrões
apresentados pelos próprios plasmídeos correspondentes (controles positivos).
Os controles negativo e positivo apresentaram o padrão de amplificação
esperado, o que sugere que não houve contaminação no processo de extração e
manipulação do DNA genômico dos eventos transgênicos.
Foram
observados
também
diferentes
padrões
de
segregação
dos
transgenes tanto entre linhagens contendo um mesmo transgene quanto entre
aquelas contendo diferentes, sendo que apenas as linhagens 194 (pró-insulina);
23/03, 23/09 (Hgh); 07 e 211 (FIX) e 55 (scFv anti-CD18) apresentaram segregação
mendeliana.
Isso indica que a maioria dos eventos transformantes e das progênies portava
um alto número de cópias dos respectivos transgenes, o que foi corroborado pelo
menos entre algumas das linhagens hGH, FIX e scFv DIR83D4 com os resultados
de Southern blot de suas progênies R1.
As linhagens hGH analisadas por essa técnica: 23/01, 23/03 e 23/09,
apresentaram respectivamente pelo menos 8, 4 e 3 cópias do transgene cada, além
de padrões de altura de bandas diferentes entre as linhagens e próximos dentro das
linhagens.
Foi possível detectar pelo menos 5 e 4 cópias do transgene fix nas progênies
R1 51 e 171 e 4 cópias do scfvdir83d4 na progênie 13/27.
Não foi possível realizar análises de Southern blot em linhagens da próinsulina e do scFv anti-CD18, uma vez que suas plantas não apresentavam folhas
no período de disponibilidade de radioatividade para marcação de sondas.
Além disso a extração de DNA genômico de boa qualidade para a digestão
com enzimas de restrição a partir de sementes é bastante difícil em função do alto
teor e carboidratos e lipídeos nesses órgãos.
Conforme analisado anteriormente, a presença de cópias “supérfluas” e
organizadas em tandem pode refletir diretamente nos níveis de produção das
proteínas heterólogas.
Com análises futuras de Southern blot de gerações mais avançadas, será
possível monitorar a segregação de cópias dos transgenes e associar padrões de
segregação específicos com maiores e menores níveis de expressão gênica.
A obtenção de linhagens cujos transgenes estejam em homozigose
(caracterizado por cópias no mesmo lócus e pela presença de uma única banda em
- 95 -
experimentos de Southern blot) é algo desejado futuramente, uma vez que esses
eventos em muitos casos estão associados a maiores níveis de expressão
transcricional.
Plantas que apresentavam sementes imaturas puderam ser analisadas por
RT-PCR. A escolha por sementes verdes se justifica pelo fato de o metabolismo de
ácidos nucléicos, em especial RNA, apresentado em estágio de pré-maturação
fisiológica de sementes ser bastante ativo, ao contrário de sementes maduras, cujo
metabolismo geral é basal.
Apenas linhagens portando os genes hgh, fix e scfvdir83d4 apresentaram
sementes imaturas na época de realização dos experimentos e puderam ter a sua
expressão a nível transcricional analisada.
Em todas as reações os controles positivos e negativos funcionaram,
sugerindo que não houve contaminação de manipulação nem de resquícios de
mRNAs e os produtos de amplificação apresentaram tamanhos correspondentes
aos controles plasmidiais esperados.
Dentre as linhagens hGH analisadas aparentemente o nível de transcrição foi
crescente para as sementes R2 das linhagens 23/01, 23/03, 23/09 e 23/19.
Isso pode ser observado pela intensidade de amplificação dos cDNAs das
respectivas amostras, sugerindo que bandas mais intensas representam amostras
com maiores quantidades de cDNAs para a amplificação, conseqüência direta de
maior disponibilidade de seus mRNAs correspondentes.
Dentre as três sementes R2 de linhagens FIX: 51, 94 e 171, a última
apresentou um ligeiro aumento em termos de expressão a nível transcricional
quando comparada às demais, algo que dificilmente pode ser afirmado quando
avaliadas as intensidades de bandas do RT-PCR de sementes da linhagem 13/27
(scFv DIR83D4), aparentemente muito similares.
Esses resultados sugerem que há alguma variação de expressão a nível
transcricional entre sementes das diferentes linhagens transgênicas obtidas mas
menores diferenças envolvendo sementes de uma mesma linhagem (como a 13/27).
Estudos estatísticos mais abrangentes envolvendo um maior número de
sementes para a comparação dos níveis de transcrição dentro e entre linhagens
poderão auxiliar a melhor compreensão de como esse evento de expressão gênica
se comporta em cada linhagem.
- 96 -
Além da transcrição, a expressão a nível traducional foi avaliada nas
progênies de linhagens para todos os transgenes.
As sementes R1 das duas linhagens 194 e 195, portadoras do gene da próinsulina humana, não apresentaram níveis detectáveis das proteínas pela técnica de
western blot.
A explicação provável para esse e outros resultados discutidos adiante se
deve à cronologia de obtenção das linhagens e de sementes transgênicas para
análise.
As linhagens 194 e 195 foram obtidas em junho de 2000 e suas sementes R1
ficaram estocadas à temperatura ambiente e somente no primeiro semestre de 2006
foram analisadas por western blot.
Mesmo havendo expressão a nível traducional do gene da pró-insulina e o
correto processamento do endereçamento subcelular, é provável que a proteína
tenha sido parcialmente degradada em função do tempo e das condições de
armazenamento extremamente prolongado.
A linhagem 13/27 do scFv DIR83D4 é a segunda mais antiga, foi obtida em
laboratório em maio de 2002. Apesar de suas sementes também terem sido
estocadas à temperatura ambiente (assim como as de todas as demais linhagens
transgênicas), foram obtidas 5 gerações dessa linhagem em casa de vegetação, o
que permitiu a utilização de sementes obtidas mais recentemente nos experimentos
bioquímicos.
As linhagens do hGH, do FIX e do scFv anti-CD18 foram obtidas entre março
de 2003 e junho de 2004.
O acúmulo dessas três proteínas heterólogas e do scFv DIR83D4 foi
observado em sementes transgênicas das respectivas progênies nos experimentos
de western blot.
As alturas das bandas apresentadas aparentemente correspondem às
massas esperadas descritas na literatura e compatíveis com os controles positivos
(22 kDa para o hGH, 55 kDa para o FIX, 29 kDa para o scFv DIR83D4 e 42 kDa
para o anti-CD18 fusionado à uma fração da proteína A).
Isso sugere que provavelmente houve a clivagem e remoção do peptídeosinal de α-coixina no retículo endoplasmático de células das sementes de soja e que
o endereçamento subcelular ocorreu eficientemente.
- 97 -
Amostras protéicas de sementes não-transgênicas (controles negativos)
apresentaram pouco ou nenhum “background”, sendo que quando este foi mais
evidente (como no western blot de sementes scFv anti-CD18), bandas presentes no
controle negativo eram comuns às amostras transgênicas e em alturas diferentes da
massa molecular esperada.
Ainda com relação ao western blot do anticorpo anti-CD18, foi detectada uma
proteína com massa ligeiramente superior a 36 kDa , em torno de 42 kDa,
provavelmente referente aos 7 kDa adicionais da cadeia parcial da proteína A,
expressa fusionada ao anticorpo original.
A detecção das proteínas heterólogas com as massas moleculares
aparentemente
corretas
evidencia
que
os
anticorpos
policlonais
primários
apresentaram um grau de confiabilidade bastante razoável em termos de sua
especificidade de reconhecimento das proteínas heterólogas.
Um fato curioso foi que das sete linhagens transgênicas FIX e das cinco
transgênicas scFv anti-CD18 analisadas por western blot, apenas quatro do primeiro
grupo (01, 07, 51 e 171) e duas do segundo (12 e 26) apresentaram expressão a
nível traducional.
Aparentemente eventos de silenciamento gênico a nível transcricional e póstranscricional podem explicar esse resultado embora o primeiro caso não seja o
mais correto para as linhagens 01, 07 e 171, uma vez que ambas apresentaram
expressão transcricional nos experimentos de RT-PCR.
O padrão de migração eletroforética do scFv DIR83D4 produzido em
sementes de soja foi relativamente diferente do apresentado pelo anticorpo
produzido em bactéria (controle positivo).
Aparentemente a massa molecular do controle positivo foi maior, resultando
em menor capacidade de migração ao longo do gel de poliacrilamida.
Essa diferença de massa pode ser explicada pelo fato de células de E.coli
apresentarem maior dificuldade de realização do dobramento do fragmento de
anticorpo que células vegetais e pelo fato da a cadeia pesada da isoforma
bacteriana apresentar aminoácidos discrepantes de maior massa molecular nas
regiões de complementaridade (CDRs) da cadeia pesada.
Quanto ao scFv anti-CD18, apesar do aparecimento de bandas nas amostras
protéicas de sementes transgênicas com a massa molecular esperada, não
dispúnhamos do próprio anticorpo purificado ou produzido comercialmente para
- 98 -
comparar sua massa molecular às das amostras recombinantes, o que limita nossa
possibilidade em apenas inferir sua correta detecção nesse experimento.
Também por esse motivo, foram estimadas as concentrações relativas nas
sementes transgênicas apenas das proteínas heterólogas previamente identificadas
por western blot e que dispunham de controle positivo para a realização das curvaspadrões: hGH, FIX e scFv DIR83D4.
O acúmulo de hGH variou de 0,03 a 0,8% do conteúdo protéico das
sementes; os do FIX de 0,023 a 0,15% e o do scFv DIR83D4 foi de 0,93%.
As eficiências de produção e acúmulo obtidas são próximas dos valores
habitualmente apresentados por outras plantas transgênicas utilizadas como
biorreatores vegetais e transformadas nuclearmente.
Apesar disso, valores próximos de 1% são animadores e sinalizam que a
obtenção de um número maior de linhagens transgênicas, pela intensificação dos
experimentos de biobalística, aumentaria as chances de ocorrência de um evento
transformante-elite, com alta capacidade de expressão e produção propriamente
ditas dessas proteínas.
Não houve possibilidade de avaliação do acúmulo do FIX humano em outras
linhagens por motivo de baixa disponibilidade de anticorpo-policlonal anti-FIX
humano.
A modulação da expressão a nível traducional do hGH, do FIX e do scFv
DIR83D4 em sementes transgênicas foi verificada por western blots fenológicos ao
longo do período de 45 dias durante a fase de enchimento de grãos.
O acúmulo do hGH pôde ser detectado já aos 75 dias em semente da
linhagem 23/19, pela presença de uma banda de baixa intensidade no western blot.
Houve um aumento considerável de expressão aos 90 dias e um leve decréscimo
aos 105 dias, mantendo-se aproximadamente inalterado aos 120 dias com o
completo amadurecimento da semente.
Praticamente não houve detecção do FIX aos 75 dias, mas aos 90 já havia
sinal de acúmulo, intensificado aos 105 dias e que se manteve estável até os 120
dias.
Já as sementes da linhagem 13/27 apresentaram um padrão de acúmulo
crescente do scFv DIR83D4 ao longo do período. De praticamente indetectável aos
75 dias e com leve aumento aos 90, passou a apresentar uma banda pouco intensa
aos 105 que praticamente dobrou de intensidade aos 120 dias.
- 99 -
As cinéticas de acúmulo sugerem que, para cada linhagem testada, há
diferentes épocas de colheita onde ocorre maximização da produção de cada
proteína heteróloga: aos 90 dias para o hGH, a partir dos 105 dias para o FIX e
apenas aos 120 dias para o scFv DIR83D4.
Apesar de diferentes entre si as cinéticas de expressão traducional
observadas sugerem que houve um aumento e conseqüente estabilização do
acúmulo da proteínas recombinantes em paralelo com o amadurecimento do grão.
Como a disponibilização de corpos protéicos destinados ao acúmulo de
proteínas de reserva nas sementes aumenta à medida que elas atingem a
maturidade fisiológica, é possível concluir que a expressão traducional das três
proteínas heterólogas nesses órgãos esteja diretamente relacionada ao maior
número de corpos protéicos disponíveis para compartimentalizá-las.
Esse padrão corrobora o padrão de expressão temporal e espacial esperados
pela estratégia molecular adotada no trabalho: a utilização de um promotor tecidoespecífico de sementes, no caso o da β-faseolina de feijão, associado ao
endereçamento subcelular promovido pelo peptídeo-sinal de α-coixina.
Os resultados obtidos com as análises imunocitoquímicas sobre cortes ultrafinos confirmaram que o peptídeo-sinal de α-coixina foi eficiente para o
endereçamento subcelular da maior parte das proteínas heterólogas expressas nas
sementes para os corpos protéicos, inclusive permitindo a detecção da pró-insulina
humana.
O nível de acúmulo dessa proteína nessas organelas foi o menor apresentado
dentre todas as análises de imunocitoquímica realizadas, o que leva a crer que ou
ocorreram fenômenos genéticos intrínsecos à interação do transgene com o genoma
da planta ― que podem ter levado ao silenciamento parcial dos transgenes ― ou
que o endereçamento subcelular foi menos eficiente nesse caso, já que a maior
parte de pró-insulina detectável se encontrava fora dos corpos protéicos, ambiente
mais propício à degradação proteolítica.
Outra possibilidade é de que houve influência decisiva do armazenamento por
seis anos à temperatura ambiente na velocidade de degradação protéica, ou até
mesmo que todas as hipóteses levantadas tenham atuado conjuntamente para
explicar os baixos níveis de acúmulo do hormônio.
Tanto o hGH quanto o FIX apresentaram um padrão de acúmulo distribuído
primariamente por todo o lúmem dos corpos protéicos cotiledonares, com muito
- 100 -
poucas proteínas na periferia e praticamente ausentes no interior de corpos de óleo.
Houve inclusive a detecção de uma quantidade significativa de hGH presente na
parede celular em uma das imunomarcações.
Já seções de sementes transgênicas expostas ao anti-scFv DIR83D4
policlonal apresentaram menor intensidade de marcação com proteína A conjugada
com ouro do que as observadas para as duas proteínas anteriores, mas o padrão se
repetiu: a maior concentração do anticorpo foi observada dentro dos corpos
protéicos e poucas marcações estavam associadas aos corpos de óleo.
A localização subcelular do scFv anti-CD18 foi a que apresentou os
resultados mais divergentes dos demais, uma vez que houve o reconhecimento de
agregados do anticorpo notadamente no interior dos corpos protéicos e, em alguns
casos, no citosol.
Poucos agrupamentos também puderam ser identificados na parede celular,
mas aparentemente a marca de acúmulo do scFv anti-CD18 nas linhagens 12 e 26 é
mesmo a formação de agregados protéicos principalmente no lúmen dos corpos
protéicos.
Em todas as seções pouca ou nenhuma marcação inespecífica ocorreu em
sementes não-transgênicas ou nas próprias regiões onde apenas havia colóide e
não tecidos propriamente ditos.
Também foram realizadas duas repetições do experimento, à exceção do
scFv DIR83D4, utilizando sementes de pelo menos duas linhagens para os demais
transgenes, a fim de aumentar a confiabilidade dos resultados observados.
Os resultados das repetições corroboraram aqueles obtidos originalmente,
havendo apenas diferenças sutis no nível de acúmulo das respectivas proteínas
heterólogas quando da mudança da linhagem analisada.
Algo bastante interessante a ser ressaltado é a eficiência da estratégia
molecular
empregada para preservar a estabilidade protéica a nível de
produção/acúmulo das proteínas heterólogas, uma vez que a expressão gênica
direcionada para as sementes (via promotor da β-faseolina) e o “protein targeting”
para os corpos protéicos cotiledonares (pelo peptídeo-sinal de α-coixina) permitiu a
detecção de proteínas armazenadas há pelo menos quatro anos e meio (não se
levando em conta os baixos rendimentos das linhagens da pró-insulina humana).
Esse período de manutenção de estabilidade é maior que o relatado na
literatura e as condições de armazenamento, tais como temperatura ambiente e
- 101 -
ausência de controle mais sofisticado de umidade, servem para ressaltar ainda mais
o potencial do emprego dessa combinação de seqüências regulatórias quando um
dos focos principais da análise é a estabilidade protéica.
- 102 -
7) CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
Foi possível observar que as seqüências regulatórias utilizadas no trabalho
foram eficientes ao controlar a expressão e o endereçamento subcelular para os
corpos protéicos cotiledonares de sementes transgênicas de pelo menos quatro das
cinco proteínas heterólogas estudadas.
Apesar de os níveis de expressão terem sido baixos (mas coerentes com os
apresentados pela maioria dos biorreatores vegetais cuja integração dos transgenes
é nuclear) há a possibilidade de compensação dessa desvantagem pela estabilidade
de compartimentalização protéica e pela capacidade de multiplicação da biomassa
de sementes através da manipulação do fotoperíodo das plantas de soja em casa de
vegetação.
Em paralelo vêm sendo realizadas a extração e purificação desses
polipeptídeos em cromatografia multidimensional para posterior análise de
espectrometria de massa e “peptide mass fingerprint”.
Essas técnicas permitirão obter frações com relativamente menores
quantidades de contaminantes protéicos, lipídicos e glicosídicos e avaliar mais
precisamente as massas moleculares, a ocorrência de modificações póstraducionais desejáveis e indesejáveis e comparar a seqüência de aminoácidos na
estrutura primária das proteínas heterólogas com as nativas, a fim de checar se
houve a manutenção estrutural sem adições ou remoções de aminoácidos.
Os resultados permitirão a realização de testes biológicos específicos com
cada polipeptídeo recombinante, para avaliar se sua aparente integridade estrutural
será refletida em manutenção de suas funções biológicas.
Numa perspectiva a longo prazo e bastante otimista, esse sistema de
expressão que utiliza sementes de soja pode vir a desempenhar um papel de
plataforma de produção de fármacos protéicos, desde que a redução de custos e a
obtenção de altos níveis de expressão sejam alcançados com o aperfeiçoamento de
estratégias moleculares de expressão de transgenes.
A prospecção de outros promotores e peptídeos-sinais mais eficientes que os
empregados no presente trabalho pode vir a preencher essa lacuna de maneira
satisfatória.
- 103 -
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