IX Congresso Brasileiro de Análise Térmica e Calorimetria
09 a 12 de novembro de 2014 – Serra Negra – SP - Brasil
Desenvolvimento e caracterização físico-química de membranas de gelatina contendo ácido úsnico e
nanopartículas de prata
Luciana G. B. Teixeira, Paula S. Nunes, Maria Joseli M. Jesus, Anny Kelly T. Jesus, Bruna M. H. Souza,
Polliana B. P. Santos, José Joatan R. Júnior, Mairim R. Serafini, Paula P. Menezes, Adriano A. S. Araújo
Resumo
A gelatina e o colágeno têm sido amplamente utilizados em biomateriais, permitindo a incorporação de
fármacos e desenvolvimento de sistemas de liberação controlada. O ácido úsnico é o metabólito liquênico
mais estudado e apresenta propriedades biológicas importantes. Além disso, atua diretamente sobre a
cicatrização de feridas provocadas por queimaduras. A eficácia da prata como agente antimicrobiano em
queimaduras já foi comprovada e com o uso da nanotecnologia é possível aumentar ainda mais o seu
efeito. Nessa perspectiva, o objetivo deste estudo foi desenvolver e caracterizar físico-quimicamente
membranas bioativas de gelatina contendo ácido úsnico e nanopartículas de prata. Inicialmente as
membranas foram analisadas quanto a resistência à tração (TS), alongamento (E), módulo de Young (YM)
e capacidade de intumescimento. Posteriormente, foram feitas caracterizações por calorimetria
exploratória
diferencial
(DSC),
termogravimetria/termogravimetria
derivada
(TG/DTG),
espectrofotometria de absorção na região do infravermelho (FTIR) e microscopia eletrônica de varredura
(MEV). Bandas similares entre as membranas foram observadas, indicando que a polimerização não
afetou a estabilidade do fármaco. Da mesma forma, a termogravimetria e as curvas DSC também se
mostraram bastante semelhantes. As micrografias analisadas por MEV sugerem que os cortes das
membranas contendo nanopartículas de prata apresentam uma constituição mais uniforme. Estes
resultados corroboram com os achados mecânicos e capacidade de absorção de água.
Palavras chaves: Ácido úsnico, Cicatrização, Colágeno, Queimaduras cutâneas, Nanopartículas de prata.
1.
Introdução
As queimaduras constituem um dos traumas mais graves que pode atingir o ser humano, visto que
provoca uma resposta metabólica intensa, com repercussões sistêmicas [1]. O colágeno e a gelatina
podem ser utilizados como biomateriais pela sua excelente biocompatibilidade e biodegradabilidade [2].
O ácido úsnico é um derivado de líquens extensamente pesquisado principalmente devido aos seus efeitos
anti-inflamatório, antioxidante e antimicrobiano [3]. Sistema ácido úsnico/lipossoma é uma excelente
estratégia para superar a baixa solubilidade do composto em água, aumentar a absorção cutânea e
promover a sua liberação controlada [4]. Associadamente, a nanotecnologia permite desenvolver produtos
com características terapêuticas interessantes e melhorar a tolerância tecidual. Dentre os compostos com
atividade bactericida, a prata é, provavelmente, a mais utilizada e efetiva em caso de queimaduras [5].
Nesta perspectiva, esse projeto é justificado pela busca de um produto inovador que atue frente ao
controle da proliferação de microorganismos e acelere as etapas da cicatrização, além de ser
biocompatível, biodegradável e de baixo custo para o tratamento de pacientes queimados.
2.
Material e Métodos
2.1. Materiais
Para a preparação das membranas foi utilizado (+)-ácido úsnico Sigma-Aldrich (98%, cód.
MKBC3299) e gelatina em pó (fornecedor NP Comércio de produtos alimentícios, lote LFP 9766). Para o
preparo dos lipossomas, foi utilizado fosfatidilcolina a 75%, (Lipoid GMBH 75% Lote 776095-1). As
nanopartículas de prata foram preparadas no Departamento de Física da UFS, a partir de um colóide
composto de citrato de sódio, nitrato de prata e água destilada. O colóide formado possui nanopartículas
de prata com tamanhos que variam de 60 a 200 nanômetros, para essa pesquisa ele foi denominado
coloide A. Parte dele foi submetido ao tratamento com laser para a obtenção de nanopartículas ainda
menores, com cerca de 10 nm, este foi chamado colóide B.
2.2. Preparo das membranas
Foram desenvolvidos três tipos de membranas: membranas contendo gelatina/ácido
úsnico/lipossoma (AUL) e membranas contendo gelatina/ácido úsnico/lipossoma e nanopartículas de
prata (A - aproximadamente 10 nm e B - aproximadamente 60 nm). Para o preparo da membrana
GEL/LIP utilizou-se uma solução contendo 1 g de gelatina em pó em 0,2 g do plastificante
propilenoglicol dispersos em 60 mL de ácido acético 0,5 mol/L e deixou-se em agitação branda por 12
horas. Os lipossomas foram preparados em um balão de fundo redondo dissolvendo 270 mg de
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fosfatidilcolina a 75%, em 30 mL de clorofórmio. Essa solução foi sonicada durante 5 minutos e em
seguida submetida à rota-evaporação. Após o solvente ter sido evaporado, o balão foi mantido na capela
por 12 horas para que o solvente pudesse volatilizar completamente. Após esse tempo é possível
visualizar a formação de um filme lipídico no fundo do balão. Este foi ressuspenso com 40 mL de água
destilada e colocado por 30 minutos em ultrassom. Depois verteu-se essa solução no béquer contendo a
gelatina e deixou-se agitando por mais 12 horas. Para obtenção da membrana bioativa, foi utilizado o
método denominado "casting”, que consiste em verter a dispersão aquosa do polímero em suportes
adequados. Sendo assim, a solução formada foi vertida em placas de petri, com 30 mL cada placa, e
colocados à temperatura ambiente até a secagem.
O processo de obtenção da membrana contendo ácido úsnico a 1% foi semelhante ao processo de
obtenção da membrana GEL/LIP. A etapa de diferenciação foi realizada a partir do acréscimo de 10 mg
de ácido úsnico, respectivamente, no momento inicial do preparo dos lipossomas. Já para a confecção da
membrana com nanopartículas de prata utilizou-se o mesmo processo, porém no momento da mistura do
lipossoma com a gelatina a solução gelatina/ácido úsnico/lipossoma (AUL) foi dividida em béquers e
diferentes quantidades dos coloides de nanopartículas de prata foram adicionadas. As quantidades
utilizadas foram 1, 3 e 5 mL de solução contendo nanopartículas de prata (A e B), respectivamente.
2.3. Análise térmica
As membranas foram caracterizadas por calorimetria exploratória diferencial (DSC) e
termogravimetria/termogravimetria derivada (TG/DTG). As curvas DSC e TG/DTG foram obtidas na
faixa de temperatura entre 25-500°C e 25-900°C, respectivamente, utilizando equipamento da Shimadzu
DSC-60 e TGA-60, sob atmosfera dinâmica de nitrogênio (100 mL/min), razão de aquecimento de
10°C/min, utilizando cápsula de alumínio (DSC) e platina (TG/DTG) contendo aproximadamente 2 mg
de amostra. Os equipamentos foram previamente calibrados e/ou verificados antes dos ensaios no eixo de
temperatura utilizando padrão de oxalato de cálcio com pureza de 99,99%, no caso da TG, e índio
metálico no caso do DSC.
2.4. Espectroscopia de absorção na região do infravermelho (FTIR)
Os espectros de absorção na região do infravermelho foram obtidos no comprimento de onda de 4000500 cm-1, na forma de filmes utilizando sistema de ATR, utilizando equipamento FTIR-Shimadzu modelo
IRTracer-100, em temperatura ambiente.
2.5. Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
As amostras da α-β-CD, MF, MA e CE foram montadas em stubs de alumínio, posteriormente
metalizados com feixes de ouro e visualizadas em um microscópio eletrônico (JEOL modelo JSM-6390LV) em aceleração de voltagem de 12 kV.
2.6 Capacidade de intumescimento
O intumescimento das membranas foi medido pela técnica de imersão, segundo o método descrito
por Hasani-Sadrabadi e colaboradores (2011). As membranas com área de 2x2 cm 2 foram imersas em
tampão fosfato pH 7,4 com temperatura do meio de 37 ± 2°C. As amostras foram pesadas antes e após o
intumescimento com o fluido, avaliadas em diferentes tempos (0, 20, 40, 60, 90, 120, 180 e 240 minutos).
Após cada tempo, as amostras foram retiradas do meio e o excesso de líquido da superfície foi removido
com o auxílio de papel filtro e posteriormente pesadas. A quantidade de líquido absorvido pelas amostras
foi expressa em ganho de massa em gramas e percentual de ganho de peso. Todas as medidas foram
realizadas em triplicata.
2.7 Ensaios Mecânicos
Os ensaios mecânicos foram realizados utilizando um analisador de textura (TAXT-Stable Micro
System). A resistência à tração (TS), alongamento (E) e módulo de Young (YM) foram determinados
utilizando amostras das membranas de 25 mm x 10 mm em conformidade com a norma ASTM D882
(ASTM, 1995).
3. Resultados e Discussão
Sistemas contendo ácido úsnico/lipossomas adicionados a nanopartículas de prata mostram-se
promissores para o desenvolvimento de membranas para o tratamento de queimaduras devido as suas
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propriedades cicatrizantes e antimicrobianas. As membranas produzidas nesse trabalho mostraram-se
finas, de superfície regular, levemente amareladas, moderada opacidade e boa flexibilidade.
Os resultados de TG mostraram-se similares entre todas as membranas, sendo caracterizados por
três perdas de massa nas seguintes faixas de temperatura: 25-150°C, 150°-435°C e 435-600°C, com
percentuais aproximados de 10, 61 e 5%, respectivamente. Comparando-se o percentual total de perda de
massa entre as membranas contendo prata e a membrana controle contendo apenas ácido úsnico pode-se
observar uma diferença em torno de 2% da perda de massa total. Nas curvas TG também observou-se
diferença no teor de umidade entre a membrana controle (m= 10,6%) e as membranas com prata (m=
8,2%) (Figura 1).
Da mesma forma que a termogravimetria, as curvas DSC também se mostraram bastante
semelhantes. Pequenas diferenças foram observadas principalmente na comparação entre o grupo controle
(contendo apenas ácido úsnico) e os grupos contendo nanopartículas de prata. Assim como a TG, pode-se
observar na membrana controle um evento endotérmico mais evidente caracterizando maior quantidade
de água (Figura 2).
Fig. 1. Curva TG/DTG das membranas na razão
de aquecimento de 10oC.min-1 em atmosfera de
nitrogênio.
Fig. 2. Curvas DSC das membranas na razão de
aquecimento de 10oC.min-1 em atmosfera de
nitrogênio.
Os espectros de FTIR do ácido úsnico livre e membranas contendo nanopartículas de prata são
descritos na Figura 3 para fins de comparação. A banda em 1629 cm-1 refere-se a grupos conjugados e
grupos doadores de elétrons em anéis aromáticos. Nesta banda é possível verificar um deslocamento
maior do pico na região espectral em virtude de ligações entre o átomo de prata e a proteína presente na
matriz da membrana, principalmente na concentração de 5 mL (B). De maneira geral, o perfil dos
espectros em ATR são similares aqueles da matriz inerte contendo apenas ácido úsnico (AUL), o que
sugere que a incorporação de nanopartículas de prata não afetou a estabilidade química das membranas.
Fig. 3 Espectro de absorção da região do infravermelho. 1A, 3A e 5A - 1, 3 e 5 mL de nanopartículas de prata com 60
nm, respectivamente. 1B, 3B e 5B – 1, 3 e 5mL de nanopartículas de prata com 10 nm, respectivamente.
As micrografias analisadas por MEV são apresentadas na Fig. 4. As imagens demonstraram
estruturas densas, típicas de membranas contendo proteínas, como já visto em membranas com proteínas de
amaranto [6]. No estudo descrito por Nunes et al., 2010, membranas contendo colágeno e ácido úsnico
também revelaram densidade e formações porosas difusas no material.
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Por fim é possível notar que os cortes das membranas contendo nanopartículas com 10 nm, 1B, 3B
e 5B sugerem uma constituição mais uniforme, quando comparadas às membranas com nanopartículas de
prata maiores, ou seja, 60 nm. Vimala et al., 2010 caracterizaram compostos de curcumina e quitosana e, do
mesmo modo, as membranas com prata mostraram-se mais homogêneas.
AUL
1B
3B
5B
1A
3A
5A
Fig. 4. Microscopia eletrônica de varredura da superfície das membranas 1A, 3A e 5A (1, 3 e 5 mL de nanopartículas
de prata com 60 nm) e 1B, 3B e 5B (1, 3 e 5 mL de nanopartículas de prata com 10 nm).
A capacidade de intumescimento é um dos parâmatros mais importantes de uma membrana que
apresenta como característica promover ação antibacteriana, cicatrizante e preservação do ambiente da
pele, principalmente esta última que diz respeito a sua capacidade em reter água. Essa habilidade permite
a absorção de moderada quantidade do exsudato da ferida, o que auxilia e acelera a cicatrização da pele
[7].
O grau de intumescimento foi aplicado neste estudo para determinar o nível de hidratação das
membranas obtidas. Esses ensaios demonstraram, conforme a Figura 5 que o comportamento das
membranas produzidas foi semelhante, e sofreu influência do meio. As membranas iniciaram o
intumescimento após a imersão com ganho de massa em aproximadamente 400% e 800%. A maioria das
membranas mantiveram intumescimento ascendente, havendo ganho de massa gradativo e controlado em
relação à massa inicial durante todo o ensaio. Porém, a membrana 1 mL (A) apresentou uma curva em
cerca de 50 minutos, que indica perda de massa rápida, que se mantém por mais ~ 100 minutos de teste.
Além disso, é possível notar que a membrana correspondente a 1 mL (B) apresenta menor grau de
intumescimento dentre as demais. No entanto, podemos sugerir que a adição da nanopartícula de prata na
membrana de gelatina propiciou aumento da capacidade de intumescimento, provavelmente pela presença
de grupos hidrofílicos adicionais ao colágeno hidrolisado - gelatina, indicando a incorporação do
composto utilizado. Essa condição também é sugestiva de ocorrer aumento de área ativa disponível na
malha polimérica, facilitando a absorção da água pelos grupos químicos hidrofílicos.
Segundo Assis e Albertini, 2010, à medida que aumentam as interações água – polímero, as forças
de interação entre as cadeias poliméricas diminuem. As cadeias, então, apresentam maior mobilidade.
Numa observação macroscópica do processo de intumescimento, a velocidade de penetração da água no
sistema matricial condiciona o modo de liberação do fármaco.
Labouta e Schneider, 2013 afirmaram que curativos para cicatrização de feridas incorporados a
nanopartículas de prata apresentam a vantagem de proporcionar liberação controlada e prolongada da
prata a área da ferida.
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Figura 5. Capacidade de intumescimento de membranas contendo ácido úsnico e nanopartículas de prata. 1A, 3A e 5A
(1, 3 e 5 mL de nanopartículas de prata com 60 nm) e 1B, 3B e 5B (1, 3 e 5 mL de nanopartículas de prata com 10 nm).
O modelo de ensaio mecânico foi realizado com as membranas contendo nanopartículas de prata.
As Tabelas 1 e 2 ilustram, esquematicamente, que a medida que se aumenta a concentração de prata nas
membranas aumenta-se também sua espessura. Os valores que se referem ao alongamento não mostraram
diferenças significativas entre as membranas dentro de um mesmo grupo para diferentes concentrações de
prata. Em relação a tensão foi observada apenas diferença significativa para a membrana que utilizou 1 mL
da solução contendo nanopartículas de prata com 60 nm no mesmo grupo, essa diferença refletiu também
no módulo de Young.
Tabela 1. Comparação entre os parâmetros de avaliação mecânica quanto à concentração de prata no grupo
utilizando nanopartículas de prata em torno de 60 nm.
Espessura (mm)
Alongamento (µm)
Tensão (MPa)
Módulo de Young (MPa)
1A
0,044 ± 0,010#
1,133 ± 0,504
64,731 ± 8,606#
473,400 ± 92,088#
#
*
3A
0,045 ± 0,003
0,837 ± 0,515
24,770 ± 12,26
321,124 ± 77,195#*
*
*
5A
0,063 ± 0,005
1,175 ± 0,148
28,811 ± 3,132
247,496 ± 30,454*
Tabela 2. Comparação entre os parâmetros de avaliação mecânica quanto à concentração de prata no grupo
utilizando nanopartículas de prata em torno de 10 nm.
1B
3B
5B
Espessura (mm)
0,048 ± 0,005#
0,049 ± 0,010#
0,061 ± 0,008*
Alongamento (µm)
1,525 ± 0,9794
1,337 ± 0,611
1,137 ± 0,966
Tensão (MPa)
33,574 ± 11,976
33,465 ± 10,705
18,765 ± 9,3972
Módulo de Young (MPa)
255,116 ± 80,207
278,463 ± 76,238
254,681 ± 201,49
A Tabela 3 mostra que os resultados obtidos a partir da comparação entre os diferentes tamanhos
de nanopartículas de prata para uma mesma concentração, ou seja, 1 mL x 1 mL, por exemplo, é possível
verificar que houve diferença significativa apenas entre tensão e módulo de Young para as membranas que
utilizaram 1 mL de solução.
Tabela 3. Comparação entre os parâmetros de avaliação mecânica quanto à concentração de prata entre os
grupos utilizando nanopartículas de prata com 60 e 10 nm.
1A
1B
Espessura (mm)
0,0449 ± 0,0107
0,0487 ± 0,0058
Alongamento (µm)
1,1333 ± 0,5046
1,5250 ± 0,9794
Tensão (MPa)
64,7315 ± 8,6064#
33,5748 ± 11,9764*
Módulo de Young (MPa)
473,4003 ± 92,0884#
255,1169 ± 80,2073*
3A
3B
0,0450 ± 0,0038
0,0498 ± 0,0100
0,8375 ± 0,5153
1,3375 ± 0,6116
24,7708 ± 12,2673
33,4658 ± 10,7059
321,1245 ± 77,1957
278,4638 ± 76,2386
5A
5B
0,0636 ± 0,0059
0,0616 ± 0,0081
1,1750 ± 0,1488
1,1375 ± 0,9665
28,8110 ± 3,1327
18,7656 ± 9,3972
247,4968 ± 30,4549
254,6812 ± 201,4998
Vimala et al., 2010 afirmaram que polímeros naturais tem aplicabilidade limitada para o
tratamento de queimaduras em virtude de suas pobres propriedades mecânicas. Porém, seu estudo
utilizando membranas de curcumina incorporada em quitosana e nanopartículas de prata mostraram melhor
resistência mecânica quando esses compostos foram associados.
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4. Conclusão
O presente estudo demonstra um método promissor para o desenvolvimento de membranas que
combinam nanopartículas de prata a um composto natural, o ácido úsnico, o qual nos fez encontrar um
potencial agente antimicrobiano e cicatrizante. É possível afirmar que as nanopartículas foram incorporadas
ao polímero como visto na análise térmica e imagens colhidas por microscopia eletrônica de varredura.
Os análogos dos compostos utilizados foram observados no espectro do infravermelho,
indicando a presença dos fármacos no sistema. Além disso, as membranas expressam boa resistência
mecância e eficaz capacidade de absorção de água. No entanto, novos estudos são necessários para avaliar
concluir as etapas de caracterização e iniciar os testes de avaliação do efeito biológico.
Agradecimentos
Agradecemos a CAPES, CNPq, e FAPITEC/SE pelo suporte financeiro nesta pesquisa. Ao apoio dos
professores Dra. Maria Lúcia Vieira Moreno, Dr. Cláudio Pereira Figueira e a Profa. Adriana Lanfredi
Rangel pelas imagens da MEV obtidas no Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz da Fundação Oswaldo CruzFIOCRUZ, Salvador.
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