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vetor
DNA
SITUAÇÃO DA TRANSGENIA NA
PRODUÇÃO ANIMAL
Animais transgênicos
Animais
diferenciados
M.V. Dra. Fabiana Fernandes Bressan
Genética Básica e Biologia Molecular
2014
-  Transgenia
-  Tecnologia transgênica
Engenharia genética
(produção animal)
Informação
(pesquisa básica e
aplicada)
Produtos
farmacêuticos
(animais
biorreatores)
Aspectos positivos
Aspectos negativos
Estratégias de produção
Estratégias de produção
• Ganho de função (Knock-in)
• Ganho de função (Knock-in)
•  Expressão gênica aumentada
3´
5´
•  Expressão de um gene novo
• Perda de função (Knock-out)
•  Silenciamento gênico – alteração do gene endógeno
Exemplo: hormônio do crescimento (GH)
Promotor
Estratégias de produção
• Perda de função (Knock-out)
GH
•  Recombinação homóloga
•  aprox. 25000 genes
•  1 cópia a mais do GH : 100% a
mais de crescimento
1982: “ Super mice”
Salmão: 3Kg x 1,3Kg em
1,5 anos
1
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Por que produzir animais transgênicos?
-Knockout da miostatina
1) Características de produção animal
–  Proteção contra doenças
Proteção contra mastite:
Resistência ao Staphylococcus
aureus
Produção de lisostafina:
Glandulas mamarias infundidas com
a bactéria
- 14% infectadas nos animais
transgênicos
- 71% infectadas nos animais
controles
Mutação natural da miostatina em
algumas raças: ex. Belgian Blue
Wall et al., 2005 Nature Biotechnology
1) Características de produção animal
–  Proteção contra doenças
1) Características de produção animal
–  Proteção contra doenças
–  Aumento de crescimento, produção
Proteção contra BSE (“vaca louca”):
Sem produção de prions
-  12 animais (machos)
-  Sem produção de prions
-  (sem manisfestação de encefalopatia
espongiforme bovina- BSE )
GH
α-lactalbumina
70% a mais de leite
500g a mais em 21d de lactação
Richt et al., 2007 Nature Biotechnology.
1) Características de produção animal
–  Proteção contra doenças
Por que produzir animais transgênicos?
2) Produção de modelos genéticos de estudos
–  Aumento de crescimento, produção
–  Alteração da composição de carne, leite, ovos, etc.
Xenotransplante: modelo para
não rejeição de órgãos
Daisy: leite sem β-lactalbumina
(hipoalergênico)
-  Falta (knockout) da enzima
α-1,3-galactosyltransferase
Lisa: Lisozima humana no leite
Lai et al., Science 295:1089-1092, 2002.
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2) Produção de modelos genéticos de estudos
(doenças humanas)
Animais biorreatores
•  Produção de proteínas ativas biologicamente humanas:
hormônios, enzimas, imunomoduladores, anticorpos, etc.
• Microorganismos (bactérias): incapazes de modificações pós-traducionais em
proteínas eucarióticas complexas.
Por que produzir animais transgênicos?
3) Produtos farmacológicos (animais biorreatores)
Vantagens da produção de proteínas recombinantes
no leite
•  Fácil/seguro de purificar
•  Sangue de doadores: pouca quantidade e risco de doenças.
•  Grandes quantidades
•  Fonte renovável
• Células animais: caro! (1 biorreator = U$100 milhões) e manutenção instável.
•  Promotores específicos de glândula mamária
•  β-caseína
¡ 
Ovelhas transgênicas para o fator IX de coagulação (SCHNIEKE et al., 1997). Polly (Fator IX de coagulação)
BioSteelTM goat
Nephila clavipes
“aranha da teia dourada”
•  Nexia Biotechnologies
•  No mínimo 6 vezes mais resistente que o aço.
•  Pode esticar 20 x.
•  Resistente a temperaturas extremas: -20 – 330oC.
•  Não reconhecido pelo sistema imune.
•  40 animais
São necessários poucos animais
biorreatores!
Requerimentos mundiais de proteínas humanas e número de
animais transgênicos necessários
Factor VIII de coagulação
humano
Alfa 1- antitripsina
Factor IX de coagulação
humano
- Armadura p/ exército (a prova de balas)
- Fios de sutura
- Linha de pesca
- Tendões e ligamentos artificiais
Albumina sérica
Webster e Pete – “silk milk”
120 g
2 vacas
10 - 25 ovelhas
5.000 kg
33.000 ovelhas
42.000 cabras
2 kg
1000 kg
13 ovelhas
22 suínos
300 vacas
8.300 cabras
Insulina: 25 vacas supre a necessidade da Argentina, que
possui 1,5 milhões de diabéticos
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ATryn – 1º remédio vindo de transgênico
•  Aprovado pelo FDA
Tecnologias para produção de animais
transgênicos
1. Microinjeção pronuclear de DNA
•  3L /dia
•  Antitrombina recombinante
humana
2. Transferência de DNA mediada por
espermatozóides
•  GTC Biotherapeutics
•  2009
3. Transferência nuclear de célula somática
(clonagem)
•  3 Kg de
proteína
purificada /ano
4. Polimorfismos direcionados
Microinjeção pronuclear de DNA exógeno em
zigotos
•  1. Fertilização
Primeiro animal de
produção transgênico no
Brasil
•  Microinjeção
•  2. Visualização dos pro-núcleos e microinjeção do DNA
•  Prof. Vicente de Freitas (Ceará), colaboração
com grupo russo.
•  Fator estimulante de colônias de granulócitos (granulocyte colony-stimulating factor, G-
CSF): fator de crescimento hematopoiético. Usado na medicina humana após radio/
quimioterapia ou transplante de medula.
1a tentativa em 2003
12 doadoras
Saanen
SO e
lavagem
uterina
Zigotos c/
PN: 500 a
1000 cópias
do gene
2/4
embriões
em 17
receptoras
1 prenhe,
2 cabritos,
0 tg.
Transferência de DNA mediada por
espermatozóides
Primeiro animal de
produção transgênico no
Brasil
•  Microinjeção
•  Prof. Vicente de Freitas (Ceará), colaboração
com grupo russo.
2a tentativa em 2007
24 doadoras
Saanen
SO e
lavagem
uterina
129 zigotos
c/ pronúcleo
3/6
embriões
em 27
receptoras
10 prenhes,
12 cabritos,
1
transgênico
oócito
4
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Transferência de DNA mediada por
espermatozóides
ICSI – Injeção intracitoplasmática de espermatozóide
oócito
Transgenia – desvantagens e riscos
Ovinos
1.  Inseminação
laparoscópica
2. Fertilização in vitro
(FIV)
3. ICSI
1. Inserção aleatória do transgene no genoma
hospedeiro
•  expressão transgênica imprevisível
0% tg
0% tg
>90% tg
Em conclusão, nossos resultados
mostram que em ovinos, sob as condições
estudadas, ICSI é o único método capaz de
produzir embriões expressando genes
exógenos quando utilizados espermatozóides
como vetores.
Pereyra-Bonet et al., J. Reprod. Dev. 2011.
Transgenia – desvantagens e riscos
Transgenia – desvantagens e riscos 2. Tempo para formação de rebanhos muito alto em
animais de produção
3. Baixa eficiência. • Camundongos: ciclo de 5 dias, gestação de 21 dias, desmame 21
dias: 2-3 meses para a obtenção dos animais fundadores
• Suínos: 114 dias de gestação, 21-28 dias lactação, puberdade entre
6-9 meses: > 2 anos para rebanho
• Bovinos: 280 dias de gestação, meses de lactação, puberdade em ~ 2
•  Microinjeção: •  2% de camundongos transgênicos •  0,1 a 0,5% de suínos •  < 0,01 a 0,1% em caprinos, ovinos e bovinos anos, 1 animal nascido por vez: > 5 anos
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Transferência nuclear de célula somáNca (TNCS) ou clonagem Solução – clonagem ? •  possibilita a inserção de modificações precisas no genoma de animais de produção e sua prole. •  assegura que toda a prole nascida será efeNvamente transgênica Gluca: produzirá glucocerebrosidase (para tratamento da
Síndrome de Gaucher)
2008
Células-tronco pluripotentes induzidas
- iPS (induced pluripotent stem cells)
A diferenciação celular pode influir na
clonagem
Terapia celular
Células
embrionárias
clonagem
Animal jovem
clonagem
Animal adulto
Sucesso na clonagem
Diferenciação celular
clonagem
• Supera problemas como rejeição e
destruição de embriões
Célula somática,
ex.: célula de pele
•  4 genes
• Oct4
• Sox2
• C-myc
• Klf4
Célula
pluripotente
Pesquisa
Figura adaptada de Rao; Nature Methods 8, 389–390 (2011)
hepatócito
neurônio
Células
musculares
•  2006/2007
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A diferenciação celular pode influir na
clonagem
Células iPS
Sucesso na clonagem
Diferenciação celular
clonagem
oócito
Célula . ex.:
célula de pele
Célula
pluripotente - iPS
Animal adulto
O “lado negro” da tecnologia transgênica
O “lado negro” da tecnologia transgênica
•  Animais biorreatores:
•  Produção animal:
Animais maiores: alterações fisiológicas
•  alta expressão de proteína recombinante = indícios de
fisiologia mamária comprometida!
•  Problemas nas articulações
•  Lactação com começo tardio, pico normal e término precoce •  Secreção lipídica compromeNda •  Menor expressão de caseínas •  Foco nas proteínas que não podem ser produzidas em micro-­‐organismos ou células! •  Anormalidades ósseas
•  Metabolismo alterado (elevado)
•  Úlceras gástricas
transgênico
controle
•  Infertilidade
Efeitos foram mimetizados em animais normais através do tratamento
prolongado com altas doses de GH
Pursel et al., 1989; Nancarrow et al., 1991 Atualidade: geração de mutação induzida
Miostatina (GDF8)
controle
mutação
•  “introgressão de variações genéticas” ou “mutagênese
dirigida”
Piemontês
Whippet
Belgian Blue
O exemplo da musculatura dupla...
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Geração de mutação induzida
•  Inserção aleatória x inserção dirigida (específica)
•  Reparo direcionado por homologia
Transgênicos na alimentação animal
•  1996: tomate Flavr Savr (Calgene-Monsanto)
•  2010: 10% da plantação mundial é de OGMs.
•  Zinc Fingers (ZFNs), TALENs, CRISPR/CAS9
•  Endonucleases capazes de introduzir pequenas inserções ou
deleções (poucos pares de base - indels) em locais específicos do
genoma.
Porcentagem
transgênicos x
convencionais - 2012
Soja
Transgênicos na alimentação animal
Algodão
Milho
Canola
Transgênicos na alimentação animal
•  1996: tomate Flavr Savr (Calgene-Monsanto)
•  1996: tomate Flavr Savr (Calgene-Monsanto)
•  2010: 10% da plantação mundial é de OGMs.
•  2010: 10% da plantação mundial é de OGMs.
- 100 bilhões de animais: sem efeito na
saúde, produtividade e perfil nutricional dos
produtos derivados
[email protected]
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