Dulce Marta Schimieguel
Análise da hematopoese em amostras de medula óssea
nas fases pré e pós-mobilização para transplante
autólogo de células-tronco hematopoéticas periféricas
Tese apresentada à Universidade Federal
de
São Paulo – Escola
Medicina,
Paulista
de
para obtenção do Título de
Doutor em Ciências
SÃO PAULO
2009
Dulce Marta Schimieguel
Análise da hematopoese em amostras de medula óssea
nas fases pré e pós-mobilização para transplante
autólogo de células-tronco hematopoéticas periféricas
Tese apresentada à Universidade Federal
de
São Paulo – Escola
Medicina, para
Paulista
de
obtenção do Título de
Doutor em Ciências
Orientador : José Salvador Rodrigues de Oliveira
Co-orientadora: Primavera Borelli
SÃO PAULO
2009
Schimieguel, Dulce Marta. Análise da hematopoese em amostras de medula
óssea nas fases pré e pós-mobilização para transplante autólogo de célulastronco hematopoéticas periféricas. São Paulo, 2009, pp 129 [Tese (Doutor)]
Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina
Hematopoese/ Transplante de Medula Óssea/ Estroma/ Doenças oncohematológicas/ Criopreservação/ CD34+
“Eu sou o caminho, a verdade e a vida"
Jesus Cristo
Aos meus queridos pais Jorge (in memorian) e Lidia
Pela minha vida e pelo seu amor incondicional.
A minhas irmãs Doroti, Dalva e Dalsita
Pelo apoio, carinho e compreensão em todos os
passos de minha vida.
A minhas tias Conegunda e Lúcia
Pelo exemplo de vida e dedicação aos estudos e
à família, grandes incentivadoras, em quem
sempre procurei me espelhar.
Ao Prof. Dr. José Salvador Rodrigues de Oliveira
Meu orientador, que me presenteou com esse
projeto o qual me rendeu tantos frutos e desafios
A Profª.Drª. Primavera Borelli
Minha co-orientadora, grande amiga e fonte
inesgotável de sabedoria e bondade.
AGRADECIMENTOS
Ao Dr. José Orlando Bordin, por ter mediado a minha entrada na disciplina,
propiciando-me esta bela oportunidade em minha carreira acadêmica.
Às professoras da Disciplina, Dra. Maria Stella Figueiredo, Dra. Dayse
Maria Lourenço, Dra Mihoko Yamamoto e Dra Gisele Colleoni por sua
colaboração, sugestões e incentivos.
Às professoras Dra. Helena Bonciani Nader e Dra Alice Teixeira, por terem
permitido a utilização dos laboratórios para o desenvolvimento deste trabalho.
Ao meu grande amigo Carlos, companheiro de todas as lutas, pela sua
inestimável amizade, dedicação e cumplicidade.
Aos meus amigos Juliana, Christiano e Edgar pela generosidade, apoio e
amizade, com a frequente ajuda para tornar realidade este meu trabalho e o de
muitos outros colegas.
Aos meus queridos amigos da USP, Ricardo, Amanda, Karina, Marco
Aurélio e Mariana, excelentes companheiros de trabalho e ótimos parceiros.
Aos meus queridos amigos da Método, Adriana, Danieli, Daniela, Cláudio,
Elton, Clabijo e Edvaldo, pela maravilhosa amizade, incentivo e confiança.
Aos amigos do HU, Mônica, Alice, Rosana, Leonardo, Luciana, Neusa,
Antonio José e Jorge pela fundamental ajuda e compreensão durante essa
jornada.
A Maria Helena e Tiago pela paciência e boa vontade, sempre que
necessitei de sua ajuda.
A enfermeira Bruna, pelo grande auxílio, dedicação e carinho.
Aos funcionários das enfermarias e ambulatórios da Hematologia e TMO,
dos Hospitais São Paulo e Santa Marcelina pela paciência e disponibilidade em
meu auxílio.
A todos os funcionários e pós-graduandos que ajudaram de maneira direta
ou indireta, contribuindo sempre a um ambiente agradável e de amizade que foi
fundamental para a finalização desta tese.
Aos pacientes e pessoas que doaram seu material biológico para a
composição deste trabalho, não só intuito de contribuir para a tese, mas por
acreditar na pesquisa clínica e nos seus benefícios para a ciência.
À FAPESP pelo auxílio financeiro recebido na realização deste projeto.
SUMÁRIO
ÍNDICE DE FIGURAS
ABREVIAÇÕES
RESUMO
ABSTRACT
i
ii
iv
vii
1. INTRODUÇÃO
1.1.
Hematopoese
1.2.
Célula-Tronco Hematopoética (CTH)
1.2.1. Célula-Tronco Mesenquimal (CTM)
1.3.
Microambiente hematopoético
1.3.1. Matriz Extra-Celular
1.3.2. Nicho Hematopoético
1.4.
Moléculas de Adesão Celular
1.4.1. Integrinas
1.4.2. Superfamília das Imunoglobulinas
1.4.3. Selectinas
1.4.4. CD44
1.4.5. Quimiocinas
1.5.
Citocinas e Fatores de Crescimento Hematopoéticos
1.6.
Transplante de Medula Óssea
1.6.1. Criopreservação
1.7.
Mobilização de células progenitoras hematopoéticas
1.8.
Cultura de Medula Óssea de Longa Permanência
1.8.1 Cultura de Medula Óssea de Longa Permanência e
Doenças Onco-Hematológicas
1
1
4
6
8
9
12
14
14
16
16
17
18
18
21
21
22
26
2. OBJETIVOS
30
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1.
Casuística
3.2.
Tratamento de indução de remissão
3.3.
Critérios de inclusão para TMOA
3.3.1. Mieloma Múltiplo
3.3.2. Linfoma Não-Hodgkin (LNH)
3.3.3. Linfoma de Hodgkin (LH)
3.3.4. Leucemias
3.4.
Quimioterapia de mobilização de células-tronco
hematopoéticas (CTHs)
3.5.
Leucoaférese de Grande Volume (LGV)
3.6.
Criopreservação e armazenamento de CTH para TMOA
3.7.
Métodos
3.7.1. Coleta e processamento das amostras
3.7.2. Separação de células CD34+
3.7.3. Culturas de estroma de MO de longa permanência
3.7.3.1. Análise da formação da camada estromal
3.7.3.2. Análise da velocidade de formação da camada estromal
3.7.4. Co-cultura de estroma de MO e Células CD34+
3.7.5. Ensaios clonogênicos
3.7.6. Análise histopatológica das biópsias de medula óssea
31
32
32
32
32
34
34
35
27
36
36
37
39
39
39
39
40
42
42
44
46
3.8.
Análise estatística
46
4. RESULTADOS
4.1.
Tratamento quimioterápico prévio e mobilização
4.2.
Análise da Hematopoese: Formação da camada estromal
4.2.1. Formação da camada estromal e análise histopatológica
da MO
4.2.3. Velocidade de formação da camada estromal
4.3.
Co-cultura e ensaios clonogênicos
4.4.
Criopreservação
4.4.1. Análise comparativa entre amostras criopreservadas e
a fresco e o status de mobilização
4.5. Situação atual dos pacientes estudados
47
45
50
5. DISCUSSÃO
5.1.
Capacidade e velocidade de formação da camada estromal
5.2.
Análise comparativa entre culturas criopreservadas e a fresco
68
68
74
6. CONCLUSÕES
76
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
77
8. ANEXOS
I
II
III
IV
95
95
120
123
128
Tabelas de resultados
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
Protocolos
Publicações
52
59
61
64
66
67
i
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Hierarquia do Sistema Hematopoético
Figura 2. Esquema geral da Matriz Extracelular
Figura 3. Diagrama geral do nicho de células hematopoéticas
Figura 4. Modelo para a mobilização de células-tronco hematopoéticas por GCSF.
Figura 5. Características morfológicas da confluência da camada do estroma em
culturas de medula óssea de longa permanência.
Figura 6. Sistema de escore da distribuição celular em culturas de medula óssea
de longa permanência.
Figura 7. Modelo de co-cultura de estroma de medula óssea e células CD34+.
Figura 8. Análise estrutural de biópsias de medula óssea demonstrando análises
de celularidade global
Figura 9. Análise biópsias de medula óssea demonstrando infiltração neoplásica
e presença de fibrose caracterizada pela reticulina
Figura 10. Velocidade do estabelecimento da camada estromal.
Figura 11. Ensaios clonogênicos após co-cultura de estroma de medula óssea
com células CD34+.
Figura 12. Formação da camada estromal de amostras criopreservadas e a
fresco.
Figura 13. Formação da camada estromal e mobilização.
Resumo
ii
Abreviaturas
AA
AcMo
ABVD
AGM
AH
BFU-E
BFM
BMO
CD
CFU
CFU-E
CFU-Eo
CFU-F
CFU-G
CFU-GEMM
CFU-GM
CFU-Mast
CFU-Meg
CFU-Mix:
CFU-S
CHOP
CMN
CN
CSF
CTH
CTMO
CTSP
D3A7
DHAP
DMSO
DNA
DE
DP
EDTA
EPO
FN
GAGs
G-CSF
GM-CSF
HCAM
HD ARA-C
HE
ICAM
ICE
Anemia aplástica
Anticorpo monoclonal
Adriamicina, bleomicina, vinblastina e dacarbazina
“Aortas, gônadas e mesonefrons”
Ácido hialurônico
Unidade formadora de colônias “burst” de eritrócitos
Protocolo Berlim-Frankfurt-Munique: daunorrubicina, Lasparaginase, metotrexate
Biópsia de medula óssea
Grupo de diferenciação
Unidade formadora de colônias
Unidade formadora de colônias de eritrócitos
Unidade formadora de colônias de eosinófilos
Unidade formadora de colônias de fibroblastos
Unidade formadora de colônias de granulócitos
Unidade formadora de colônias de granulócitos, eritrócitos,
monócitos/macrófagos e megacariócitos
Unidade formadora de colônias de granulócitos e monócitos
Unidade formadora de colônias de basófilos e mastócitos
Unidade formadora de colônia de megacariócitos
Unidade formadora de colônia de granulócitos, monócitos e
eritrócitos.
Unidade formadora de colônias do baço (spleen)
Ciclofosfamida, hidroxidaunorubicina, vincristina, prednisolona
Células mononucleares
Controles normais
Fator estimulante de colônias
Células-tronco hematopoéticas
Células-tronco de medula óssea
Célula-tronco do sangue periférico
Daunoblastinax3, Arabinosídeo-cx7
Dexametasona, alta dose de arabinosídeo-C (ARA-C)
Dimetilsulfóxido
Ácido desoxirribonucléico
Doença estável
Doença progressiva
Ácido tetra-acético etilenodiamina
Eritropoetina
Fibronectina
Glicosaminoglicanos
Fator estimulante de colônias de granulócitos
Fator estimulante de colônias de granulócitos e monócitos
Molécula de adesão do homing
Dexametasona, alta dose de arabinosídeo-C (ARA-C)
Hematoxilina e Eosina
Moléculas de adesão intercelular
Iofosfamida, carboplatina e etoposídeo
Resumo
IL-3
IL-6
IL-8
LeuCAM
LGV
LLA
LLC
LMA
LMC
LH
LN
LNH
LNH-DGCB
LTBMC
MAC
M-CSF
MEC
MM
MMP
MO
N-CAM
PECAM
PGs
Ph1
QT
RC
RNA
RP
RT
rhGM-CSF
SCF
SDF-1
SMD
SP
ST
TCTH
TGF-β
TMO
TMOA
TPS
VAD
VCAM
VLA
Interleucina 3
Interleucina 6
Interleucina 8
Moléculas de adesão de leucócitos
Leucoaférese de grande volume
Leucemia linfóide aguda
Leucemia linfóide crônica
Leucemia mielóide aguda
Leucemia mielóide crônica
Linfoma de Hodgkin
Laminina
Linfoma Não-Hodgkin
Linfoma Não-Hodgkin difuso de grandes células B
Cultura de medula óssea de longa permanência
Molécula de adesão celular
Fator estimulante de colônias de monócitos
Matriz extracelular
Mieloma múltiplo
Metaloproteinase de matriz
Medula óssea
Molécula de adesão da célula neural
Molécula de adesão da célula endotelial plaquetária
Proteoglicanos
Cromossomo Filadélfia
Quimioterapia
Remissão completa
Ácido ribonucléico
Remissão parcial
Radioterapia
Fator estimulante de colônias de granulócitos e monócitos
recombinante humano
Fator estimulante de célula-tronco
Fator-1 derivado do estroma
Síndrome mielodisplásica
Sangue periférico
Sangue Total
Transplante de células-tronco hematopoéticas
Fator transformador de crescimento beta
Transplante de Medula Óssea
Transplante de Medula Óssea Autólogo
Trombospondina
Vincristina, doxorrubicina e dexametasona
Molécula de adesão vascular
Antígeno de ativação tardia
iii
Resumo
iv
RESUMO
O Transplante de Medula Óssea Autólogo (TMOA) é uma terapia
consolidada para tratamento de doenças hematológicas como linfomas, mielomas
e leucemias. As células-tronco hematopoéticas (CTHs) podem ser obtidas
diretamente da medula óssea (MO) ou do sangue periférico por meio de estímulo
com quimioterapia e fatores de crescimento. Frequentemente pacientes
submetidos a este procedimento mobilizam as CTHs de forma insatisfatória. O
microambiente medular e a hematopoese estão intimamente relacionados com o
sucesso deste tipo de tratamento, uma vez que a ontogênese da hematopoese
depende de estímulos produzidos pelas células do microambiente medular. Os
processos relacionados à adesão celular, as alterações do estroma e da matriz
extracelular podem estar danificados em pacientes com MO inicialmente
comprometida por células clonais, submetidos a esquemas de quimioterapia e
radioterapia convencionais. Estudos relacionados à estrutura e funcionalidade do
estroma medular e das CTHs foram realizados para elucidar os possíveis danos
causados ao microambiente hematopoético e sua correlação com a recuperação
hematológica de curto e longo prazo após os transplantes de medula óssea.
Neste estudo, avaliou-se o potencial proliferativo, a capacidade de
sustentação da hematopoese e os efeitos da criopreservação em amostras de
MO de portadores de doenças onco-hematológicas submetidos ao TMOA. Foram
avaliados 22 pacientes, com idade variando entre 16 e 60 anos (média de 37,2
anos). Destes, 5 eram portadores de Linfoma Não-Hodgkin (LNH), 6 de Linfoma
de Hodgkin (LH), 4 de Mieloma múltiplo (MM) e 7 de leucemias. Os controles
foram provenientes de 10 doadores normais de transplante de medula óssea
alogênico com idade variando entre 26 e 45 anos. Foram empregadas culturas de
medula
óssea
de
longa-permanência,
ensaios
clonogênicos
e
análise
histopatológica da MO em dois momentos distintos, pré e pós-mobilização com o
intuito de observar se a quimioterapia associada ao fator de crescimento causaria
algum dano nas CTHs ou no estroma medular. Observou-se diminuição da
formação da camada estromal após a mobilização nas amostras dos controles (p
=0,03), sugerindo que a medula óssea normal seja mais afetada pelo efeito
imediato do G-CSF, ou que ocorra migração mais expressiva das células
progenitoras hematopoéticas da MO para o sangue periférico. As amostras de
Resumo
v
pacientes apresentaram menor capacidade de formação da camada estromal em
relação aos controles, indicando danos ao microambiente medular causados pelo
tratamento quimioterápico prévio. Não foram detectadas diferenças funcionais nas
amostras de pacientes durante o período de mobilização, não se relacionando a
capacidade de formação do estroma com a terapêutica citotóxica empregada na
mobilização. A presença de fibrose, infiltração e celularidade diminuída na MO
contribuíram em parte para a diminuição da capacidade de formação da camada
estromal sugerindo fortemente que os danos maiores estão relacionados ao
estroma medular possivelmente causados pelo tratamento quimioterápico prévio.
Nos ensaios clonogênicos apenas os estromas obtidos de amostras de pacientes
pós-mobilização e co-cultivados com células CD34+ apresentaram atividade
proliferativa nestes ensaios, com exceção do controle normal co-cultivado com
célula CD34+ autóloga. Em relação ao processo de criopreservação não foi
observada diferença entre as fases pré e pós-mobilização nas amostras de
pacientes e controles, o que pode sugerir que este procedimento não afete a
funcionalidade do estroma. Entretanto, as amostras de controles apresentaram
diminuição significativa na formação da camada estromal na fase pós-mobilização
em relação às amostras de pacientes, principalmente nas amostras a fresco,
podendo-se sugerir que a situação do estroma medular de pacientes com
doenças onco-hematológicas anteriores à mobilização possa apresentar um efeito
protetor aos agentes criopreservadores. Estes achados sugerem que a existência
de um estroma doente torna-o menos suscetível ao processo de mobilização e
criopreservação.
Abstract
vi
ABSTRACT
Autologous hematopoietic stem cell transplantation (auto-HSCT) has
proved efficient to treat hematopoietic malignancies such as lymphomas, leukemia
and multiple myeloma. Stem cells can be obtained directly from bone marrow or
be recruited to enter in the blood stream in response to chemotherapy and
hematopoietic growth factors. However, some patients fail to show adequate yield
of mobilized HSCs lowering the chances for a successful auto-HSCT. For
definitive hematopoiesis to occur, HSCs must interact with a suitable
microenvironment, including stromal cells, extracellular matrix and soluble factors.
A large number of groups have been trying to elucidate the mechanisms related to
mobilization, structural and functionality of marrow stroma and HSC were done to
elucidate possible damage caused on marrow microenvironment and their
correlation with the short and long time hematological recovery.
In
this study,
it was evaluated
proliferate potential, capacity of
hematopoiesis support and the cryopreservation effects in bone marrow samples
from patients with hematological malignancies submitted to auto-HSC. Were
evaluated 22 patients diagnosed with hematological malignancies, aged 16 to 60
(37,2 average) years, including 5 non-Hodgkin‟s lymphoma (NHL) , 6 Hodgkin‟s
disease (HD), 4 multiple myeloma (MM), 5 acute myeloid leukemia (AML), 1 acute
lymphoblastic leukemia (ALL) and 1 chronic lymphocytic leukemia (CLL). Ten
allogeneic bone marrow donors were the control group with 26 to 45 years old.
Were used long-term bone marrow cultures, clonogenical assays and bone
marrow histopathology analysis at pre and post mobilization, with the purpose to
observe if chemotherapy with growth factor will cause some damage to the
hematopoietic stem cells or marrow stroma. It was observed stromal layer
formation decreased at control samples after mobilization (p =0, 03), suggesting
that normal bone marrow was more affected by G-CSF effect , or hematopoietic
progenitor cells from bone marrow migrate expressively for the whole blood.
Patients‟ samples showed lower stromal layer formation in the control group,
showing marrow microenvironment damage caused by previous chemotherapy or
disease. It was not detected functional differences in patients‟ samples during
mobilization, no relation with capacity of stroma formation during the citotoxic
Abstract
vii
therapy used in mobilization. Fibrosis, infiltration and cell decrease in bone marrow
contribute to reduce the stromal layer formation capacity, suggesting that the main
damages are related to marrow stroma. About the clonogenical assays only the
obtained stromal layers by post-mobilization patients and CD 34+ co-cultivate cells,
showing proliferative activity in these assays, with exception of the autologous CD
34+ co-cultivate control group cells. Related to cryopreservation process, it was not
observed difference between pre and post phases at control and patients‟
samples, which suggest that this procedure not affect marrow stroma functionality.
However, the control samples showed significant decrease in stromal layer
formation at the post-mobilization phase in relation to the patients‟ sample, mainly
in fresh samples, can suggest that the situation of marrow stroma patient with
hematological malignancies before the mobilization can show one effective
protection to cryopreserved agents. This finding suggests that have sick stromas
that make it less susceptible to mobilization and cryopreservation process.
Introdução
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Hematopoese
O sangue contém vários tipos de células que possuem características
morfológicas e funções biológicas distintas. Eritrócitos são células anucleadas
com função de transporte de oxigênio e gás carbônico. Granulócitos e monócitos
são células com importante papel na resposta inflamatória e fagocitose. Linfócitos
são responsáveis pela imunidade e produção e anticorpos. Plaquetas fazem parte
do sistema de coagulação sanguínea. A despeito dessa variedade de tipos
celulares e funções, todas as células sanguíneas originam-se de uma única
célula:
a
célula-tronco
hematopoética,
em
um
processo
denominado
hematopoese (Metcalf, 2007; Metcalf et al.,1995; Mayani et al., 2003).
Hematopoese é um complexo processo que envolve uma série de eventos
celulares e moleculares, nos quais uma pequena população de células-tronco
hematopoéticas é capaz de formar continuamente, após várias multiplicações e
diferenciações as células hematopoéticas maduras como os leucócitos, as
hemácias e as plaquetas (Metcalf, 2007; Huang et al., 2007; Metcalf et al.,1995;
Verfaillie, 1993).
O sistema hematopoético pode ser dividido em três compartimentos: O
primeiro
compartimento,
mais
primitivo,
consiste
em
células-tronco
hematopoéticas pluripotentes indiferenciadas com alta capacidade de autorenovação e de proliferação (Metcalf, 2007, Huang et al.,2007; Lichtman et
al.,2006; Chan & Watt, 2001).
O segundo compartimento consiste em células progenitoras em vários
graus de diferenciação com pouca ou nenhuma capacidade de auto-renovação.
São células “comprometidas” com as diversas linhagens celulares denominadas
de unidades formadoras de colônia (CFU – colony forming unit).
Neste
compartimento estão os precursores das células das linhagens linfóides
(precursor linfóide comum), e mielóide: CFU-GEMM (unidade formadora de
colônias de granulócitos, eritrócitos, monócitos/macrófagos e megacariócitos);
BFU-E e CFU-E (unidade formadora de colônias de eritrócitos); CFU-Meg
(unidade formadora de colônia de megacariócitos); CFU-Mast (unidade formadora
Introdução
2
de colônias de basófilos e mastócitos); CFU-Eo (unidade formadora de colônias
de
eosinófilos);
CFU-GM
(unidade
formadora
de
colônias
de
granulócitos/monócitos); e CFU-G e CFU-M (unidade formadora de colônias de
granulócitos e monócitos) (Metcalf, 2007; Metcalf et al.,1995; Huang et al.,2007;
Lichtman et al.,2006 2001; Chan & Watt 2001).
O terceiro compartimento consiste em células maduras, comprometidas,
morfologicamente identificáveis, subdivididas em populações com atividade
mitótica e pós-mitótica de granulócitos, monócitos, linfócitos eritrócitos e
plaquetas (Metcalf,2007, Metcalf et al.,1995; Huang et al.,2007; Lichtman et
al.,2006; Chan & Watt 2001) (Figura 1).
A manutenção da hematopoese normal, ou seja, o equilíbrio da proliferação
e diferenciação celular ocorre por intermédio de interações entre as células-tronco
hematopoéticas e seus receptores de membrana, as células estromais produtoras
dos fatores de crescimento, os componentes da matriz extracelular (MEC) e os
fatores solúveis. O microambiente hematopoético é o local na medula óssea
(humanos e camundongos) e baço (camundongos) onde ocorrem estas
interações célula-célula e célula-matriz (Huang 2007; Lichtman et al.,2006; Chan
& Watt 2001; Klein,1995).
Introdução
PROGENITORES
LINFÓIDE E
MIELÓIDE
CÉLULAS PROGENITORAS
COMPROMETIDAS
3
CÉLULAS MADURAS
Linfócitos T
Célula Pré-T
PLC
Linfócitos B
Plasmócitos
Célula Pré-B
Eritrócitos
BFU-E
CTH
CFU-E
Megacariócitos/
Plaquetas
CFU- GEMM
CFU-Meg
Auto-renovação
Basófilos/
Mastócitos
CFU-Mast
Eosinófilos
CFU-Eo
Neutrófilos
CFU-G
Monócitos/
Macrófagos/
CFU-GM
CFU-M
Osteoclastos
CFU-Oc (?)
Figura 1. Hierarquia do Sistema Hematopoético: No primeiro compartimento
estão as células-tronco hematopoéticas (CTHs) com alta capacidade de autorenovação, proliferação e diferenciação. No segundo compartimento encontramse as células já comprometidas com as linhagens linfóides e mielóides. Progenitor
linfóide comum (PLC) e progenitor mielóide/CFU-GEMM (unidade formadora de
colônias de granulócitos, eritrócitos, monócitos/macrófagos e megacariócitos);
BFU-E e CFU-E (unidade formadora de colônias de eritrócitos); CFU-Meg
(unidade formadora de colônia de megacariócitos); CFU-Mast (unidade formadora
de colônias de basófilos e mastócitos); CFU-Eo (unidade formadora de colônias
de
eosinófilos);
CFU-GM
(unidade
formadora
de
colônias
de
granulócitos/monócitos); e CFU-G e CFU-M (unidade formadora de colônias de
granulócitos e monócitos). No terceiro compartimento localizam-se as células
maduras.
(Modificado de Metcalf, D. Stem Cells 2007;25:2390-95)
Introdução
4
1.2 Célula-Tronco Hematopoética (CTH)
As células-tronco hematopoéticas (CTHs) são definidas pela sua
capacidade de auto-renovação, proliferação e pela multipotência, capacidade de
originar células sanguíneas maduras, diferenciadas, de diferentes linhagens como
eritrócitos, granulócitos, macrófagos, plaquetas e linfócitos (Papayannopoulou &
Scadden, 2008; Kiel & Morrison, 2008; Metcalf, 2007; Wheton & Sponcer, 1998).
As CTHs são células mononucleares pequenas com pouco RNA (ácido
ribonucléico) citoplasmático e morfologicamente indiferenciadas. Sua identificação
é realizada através de antígenos de superfície específicos e testes de
funcionalidade (Metcalf, 2007;Gangenahalli et al.,2006; Wilson & Trumpp, 2006;
Chan & Watt, 2001).
Técnicas de citometria de fluxo (FACS – Fluorescence Activated Cell
Sorter) que utilizam anticorpos monoclonais permitem a detecção de marcadores
de superfície celular restritos às diversas linhagens celulares. Estes marcadores
de linhagem celular são utilizados para identificação e quantificação das CTHs e
no auxílio diagnóstico de doenças onco-hematológicas (Orford & Scadden, 2008;
Metcalf ,2007; Gangenahalli, 2006).
O antígeno CD34, inicialmente denominado anticorpo anti-My10, uma
fosfoglicoproteína de membrana de aproximadamente 115kD, foi detectado nas
células hematopoéticas mais primitivas capazes de reconstituir a hematopoese
em animais letalmente irradiados (Gangenahalli,2006; Chan & Watt,2001;
Berenson et al.,1988). As células que contém o antígeno CD34 foram
denominadas células CD34+. À medida que estas células amadurecem, perdem o
antígeno CD34, diminuindo dessa forma a capacidade de adesão ao estroma e
diferenciando-as imunofenotipicamente das células mais maduras (Orford &
Scadden, 2008; Metcalf, 2007; Gangenahalli, 2006). Sob condições normais, as
células CD34+ constituem aproximadamente 0,06% do total de células nucleadas
circulantes e 0,5% a 5% das células da medula óssea normal (Gangenahalli,
2006). Outras células um pouco mais maduras também expressam o antígeno
CD34. Dessa forma a verdadeira CTH, ou seja, a célula-tronco hematopoética
mais primitiva representa somente uma pequena subpopulação de células CD34 +,
tanto na medula óssea como no sangue periférico (Orford & Scadden, 2008;
Introdução
5
Gangenahalli, 2006; Wilson & Trumpp, 2006). Além do antígeno CD34, outros
marcadores de superfície e determinados corantes tem sido utilizados para a
caracterização do fenótipo das CTHs. Atualmente as células hematopoéticas mais
primitivas podem ser definidas como CD34+, CD38-, CD33-, Thy-1low, CD71-,
CD45RAlow, lin- (ausência de marcadores linhagem-específicos), Rhlow (corante
fluorescente rodamina 123), Ho 33342low (corante de ácido nucléico) (Orford &
Scadden, 2008; Wagner 2007; Gangenahalli, 2006; Albo et al.,2004).
Outro antígeno presente nas células hematopoéticas progenitoras é o
CD133 (inicialmente denominado AC133), uma glicoproteína transmembrana de
aproximadamente 120kDa. Além das CTHs, o CD133 é expresso em células
progenitoras neurais e células-tronco embrionárias, algumas leucemias e tumores
cerebrais. Baixos níveis de expressão são detectados no rim, pâncreas, placenta
e fígado fetal. Recentes estudos demonstraram que as células CD133+ podem ser
induzidas a se diferenciarem em células endoteliais in vitro.
Além disso, as
células-tronco neurais humanas podem ser diretamente isoladas usando um
anticorpo anti-CD133 (Kobari et al.,2001; Yu et al.,2002; Huang et al.,2007).
Além da caracterização imunofenotípica estudos funcionais são utilizados
para auxiliar na distinção das CTHs. Os primeiros estudos realizados na década
de 60, por Till e McCulloch demonstraram a multipotência e capacidade de autorenovação da célula-tronco. Neste modelo foi demonstrada a capacidade de
reconstituição do sistema hematopoético de camundongos letalmente irradiados
após o transplante de células da medula óssea de camundongos singênicos
normais. Estes resultados indicaram a presença, no baço, de células
indiferenciadas capazes de originar uma grande quantidade (10 7células) de
células hematopoéticas, as CFU-S: unidades formadoras de colônia do baço (S =
spleen), que são células mais primitivas capazes de gerar qualquer tipo de células
hematopoéticas (Papayannopoulou & Scadden,2008; Metcalf, 2007; Till &
McCulloch,1961).
Em estudos in vitro, a multipotência é facilmente observada através do
cultivo das células em meio semi-sólido contendo fatores de crescimento, que
resulta na formação de colônias dos diferentes tipos de células hematopoéticas
como as colônias CFU-G, CFU-GM, CFU-M, CFU-E e CFU-Meg (Orford &
Scadden, 2008; Papayannopoulou & Scadden, 2008).
Introdução
6
Outro método de estudo in vitro para avaliar a funcionalidade das CTHs foi
inicialmente descrito por Dexter et al. (1977) e demonstrou a capacidade das
CTHs de sustentarem a hematopoese por várias semanas num sistema de cultura
de estroma de longa permanência, a partir da formação de uma camada estromal
originada de células obtidas da MO, sem a necessidade da adição de fatores de
crescimento (Papayannopoulou & Scadden, 2008; Zhao et al.,2004; Dexter et
al.,1977). O modelo de Dexter confirmou a teoria de que as células estromais
secretam moléculas da matriz extracelular e fatores solúveis necessários para a
proliferação, maturação e manutenção da hematopoese, e que existe um contato
íntimo
entre
as
células
hematopoéticas
e
o
microambiente
medular
(Papayannopoulou & Scadden, 2008; Zhao et al., 2004; Dexter et al.,1977).
A multipotencialidade da CTH também está associada à sua
capacidade de fixação ao microambiente hematopoético. O contato direto célulacélula e célula-estroma são mediados por moléculas de adesão localizadas na
membrana destas células e seus respectivos receptores localizados nas células
hematopoéticas, nas células endoteliais e nas proteínas da MEC, como a
fibronectina, laminina e trombospondina (Papayannopoulou & Scadden, 2008;
Whetton & Sponcer,1998).
1.2.1 Célula-Tronco Mesenquimal (CTM)
As células-tronco mesenquimais (CTMs) foram primeiramente descritas por
Friedenstein et al. (1966) e consistiam em células indiferenciadas de medula
óssea que aderiam à placa de cultura, apresentavam aspecto fibroblastóide,
formavam colônias e eram capazes de se diferenciar in vitro em diversas
linhagens celulares como ossos e cartilagem. Devido ao seu aspecto, tais células
precursoras foram inicialmente denominadas CFU-F (unidades formadoras de
colônias de fibroblastos) (Dazzi et al., 2006; Dennis & Chabord, 2002; Bianco et
al., 2001).
A caracterização das CTMs pode ser realizada através de marcadores
imunofenotípicos, porém não existem ainda marcadores específicos para este tipo
celular, sendo os antígenos utilizados, comuns a outras linhagens celulares.
Introdução
7
Desta forma para sua identificação são empregados painéis de anticorpos que
incluem marcadores de linhagem e diferenciação específicos, moléculas de
adesão, matriz extracelular e receptores de fatores de crescimento, cujos
antígenos estão presentes na superfície das CTMs (Dazzi et al., 2006). Além do
fenótipo, estudos de co-expressão de genes específicos para linhagens celulares
distintas e caracterização funcional são empregados na sua identificação, sendo
estas células capazes de se diferenciar in vitro em células das linhagens
osteogênica, adipogênica e condrogênica (Silva et al., 2003; Dennis & Chabord,
2002; Bianco et al., 2001).
A medula óssea é hoje a fonte de CTMs mais acessível e melhor estudada,
apresentando
uma
baixa
frequência
deste
tipo
celular,
estimada
em
aproximadamente 0,01 a 0,0001% das células nucleadas da MO. As CTMs
também são encontradas no sangue periférico após mobilização com fator de
crescimento G-CSF (fator de crescimento de granulócitos), sangue fetal, fígado,
placenta
e
líquido
amniótico.
Estas células foram
ainda
isoladas
em
concentrações variáveis em sangue de cordão umbilical, e em menor proporção,
em sangue periférico de adultos normais e mulheres grávidas (Dazzi et al., 2006).
Na medula óssea as CTMs formam o estroma hematopoético ou estroma
medular, formado por fibroblastos, macrófagos e adipócitos, que fornece um
ambiente propício para a proliferação, diferenciação e maturação das células
hematopoéticas, através da secreção de fatores solúveis hematopoéticas e
componentes da matriz extracelular (Ezoe et al., 2004; Dennis & Charbord, 2002).
Nos últimos anos vários os estudos envolvendo este tipo de célula foram
realizados devido ao seu valor como modelo de estudos moleculares de
diferenciação
e
potencial
terapêutico
para
reparação
de
tecidos
e
imunomodulação (Dazzi et al., 2006; Silva et al., 2003; Dennis & Chabord, 2002;
Bianco et al., 2001).
Introdução
8
1.3 Microambiente Hematopoético
O microambiente hematopoético é constituído por um componente celular,
do qual fazem parte os fibroblastos, adipócitos, macrófagos, células musculares
lisas, células reticulares e endoteliais; e pela matriz extracelular (MEC) que
contém
as
proteínas
adesivas
fibronectina,
laminina,
trombospondina,
hemonectina, os colágenos tipo III e IV, glicosaminoglicanos como o heparan e o
condroitin sulfato e ácido hialurônico e pelos fatores solúveis como as citocinas e
os fatores de crescimento (Sacchetti et al., 2007; Moore & Lemischka ,2006; Nervi
et al., 2006; Lichtman et al.,2006; Nardi & Alfonso,1999; Klein,1995).
As células estromais produzem fatores solúveis que influenciam na
diferenciação, proliferação e maturação das células hematopoéticas, como
também produzem e secretam componentes da matriz extracelular como
laminina, colágeno e glicosaminoglicanos (Ezoe et al., 2004; Dennis & Charbord,
2002;Gordon, 1988; Bentley et al.,1988; Keating & Gordon,1988; Gallagher et
al.,1983). Tais interações foram demonstradas em culturas de células de medula
óssea de longa permanência (LTBMC – Long Term Bone Marrow Culture), onde
as células estromais formam camadas aderentes e heterogêneas, que promovem
as condições de crescimento e diferenciação para as células hematopoéticas in
vitro (Ezoe et al.,2004;Dennis & Charbord, 2002;Metcalf et al.,1995).
Células endoteliais: compõem uma camada celular que cobre totalmente a
superfície interna dos sinusóides, e formam uma barreira de controle do sistema
contra partículas e substâncias químicas que entram e saem dos espaços
hematopoéticos. Através do contato célula-célula e da secreção de peptídeos,
influenciam na diferenciação de células osteoprogenitoras e na regulação da
hematopoese (Kiel & Morrison, 2008; Lichtman et al.,2006; Dennis & Charbord,
2002;Torok-Storb,1988; Nardi & Alfonso,1999).
Células reticulares adventícias: compreendem um importante componente
celular do estroma da MO e localizam-se em torno dos sinusóides venosos
formando uma camada que cobre parcialmente o lado do endotélio abluminal.
Estudos morfológicos indicam que uma das principais funções é a regulação da
migração das células maduras para a circulação sanguínea (Kiel & Morrison,
2008; Bianco et al.,2001;Torok-Storb,1988).
Introdução
9
Adipócitos: ocupam a grande parte da cavidade medular, suas funções não são
muito claras, mas estudos in vitro indicam que elas são capazes de produzir
fatores de crescimento. Outra função dos adipócitos é controlar mecanicamente o
volume hematopoético: danos na hematopoese estão associados com o aumento
do acúmulo de inclusões de gordura, e por outro lado a hematopoese acelerada
está associada com a perda de vacúolos de gordura para aumentar o espaço
físico para as células hematopoéticas (Lichtman et al.,2006; Bianco et al.,
2001;Torok-Storb, 1988).
Macrófagos: segundo maior componente celular do estroma, topograficamente
localiza-se em três sítios diferentes na MO: macrófagos centrais: ilhas
eritroblásticas, macrófagos perisinais: lado abluminal, e ainda dispersos entre as
células-tronco hematopoéticas (Travlos, 2006; Nardi & Alfonso,1999).
Osteoblastos: Derivam de um precursor comum das células mesenquimais e sua
ação direta na regulação da proliferação das CTHs na superfície endosteal, foi
recentemente evidenciada através de estudos onde a ablação condicional dos
osteoblastos resultou em uma significante redução da hematopoese na MO. Estes
dados sugerem que os osteoblastos são células chaves no nicho hematopoético e
que as moléculas expressas por estas células devem ter atividades ainda
desconhecidas na regulação da hematopoese. (Kiel e Morrison, 2008;Zhu et
al.,2007; Ballen, 2007; Moore & Lemischka, 2006; Yin & Li, 2006; Wilson &
Trumpp 2006; Nilsson et al.,2005; Dennis & Charbord, 2002).
1.3.1 Matriz Extracelular (MEC)
A matriz extracelular (MEC) é uma rede complexa composta por quatro
grandes
classes
de
macromoléculas:
colágenos,
proteoglicanos
(PGs),
glicosaminoglicanos (GAGs) e pelas glicoproteínas adesivas (fibronectina,
laminina e trombospondina), que proporcionam sustentação da estrutura tecidual,
secreção de citocinas e fatores de crescimento e adesão das células
hematopoéticas (Bi et al, 2005; Ezoe et al., 2004; Klein,1995). Figura 2
Colágenos: Colágenos são glicoproteínas fibrosas, insolúveis e mais abundantes
que as demais moléculas da MEC e estão envolvidos na hemostasia,
cicatrização,
adesão
e
migração
celular
(Koide,2007).
O
Introdução
10
estroma
do
microambiente medular sintetiza colágenos tipo I, III, IV, V e VI. A inibição da
síntese do colágeno em um modelo murino de culturas de longa permanência in
vitro levou a uma redução de progenitores hematopoéticos, demonstrando o
importante papel desta proteína na regulação da hematopoese (Klein,1995).
Proteoglicanos
e
glicosaminoglicanos:
compreendem
um
grupo
de
macromoléculas da matriz extracelular que, interagindo entre si ou com células do
tecido conectivo, auxiliam na manutenção da integridade estrutural do tecido e
ainda fazem parte da regulação do crescimento celular, migração e diferenciação
(Kahari, 1991).
Os GAGs são polímeros lineares de açúcar constituídos por
unidades dissacarídicas repetitivas. Essa variedade estrutural resulta nos
seguintes GAGs: heparina, heparam sulfato, condroitim-4-sulfato, condroitim-6sulfato, dermatam sulfato, queratam sulfato e ácido hialurônico. Com exceção do
ácido hialurônico, os demais GAGs ocorrem nos tecidos, ligados covalentemente
a proteínas, formando os PGs (Sampaio & Nader, 2006; Lindahl et al.,1994;
Mathews,1975).
Fibronectina (FN): é uma glicoproteína presente no plasma (forma solúvel) e na
MEC de muitos tecidos (forma insolúvel). Na medula óssea, a FN é sintetizada
por células estromais, principalmente fibroblastos, e media a adesão de várias
linhagens de células hematopoéticas. A adesão à FN ou a ligação celular aos
seus fragmentos estimulam a proliferação e migração de progenitores
hematopoéticos, e a proliferação de progenitores comprometidos e células já
diferenciadas, parecendo ser este o mecanismo mais importante de regulação da
proliferação e migração das CTHs da medula óssea para o sangue periférico
(Vicent & Mechti, 2005; Peled et al.,2000; Shofield et al.,1998; Nojima et al.,
1990).
Laminina (LN): A laminina pertence à família das macromoléculas multifuncionais
presentes na membrana basal, são as proteínas não-colagênicas mais
abundantes na MEC (Aumailley & Gayraud,1998). A LN possui grande interação
adesiva com células CD34+ e apresenta atividade mitogênica para células
progenitoras hematopoéticas, o que acontece de forma muito similar à adesão da
FN (Gu et al.,2003).
Introdução
11
Trombospondina (TPS): é uma glicoproteína sintetizada e secretada por uma
ampla variedade de células, incluindo plaquetas, fibroblastos, células de músculo
liso, células endoteliais, células da glia, queratinócitos e megacariócitos.
Semelhante à fibronectina e à laminina, a TPS participa do processo de
proliferação, diferenciação e migração das células hematopoéticas (Frazier et
al.,1987; Long & Dixit,1990).
COLÁGENO
FIBRONECTINA
LAMININA
PROTEOGLICANOS
INTEGRINAS
Figura 2: Matriz Extracelular (MEC). Esquema demonstrando as interações
entre a membrana celular e os componentes da MEC. As proteínas adesivas
como a laminina, fibronectina e os colágenos e suas ligações com os
proteoglicanos e as integrinas presentes na membrana celular.
Modificado de Lodish et al.Molecular Cell Biology, 2004.
Introdução
12
1.3.2 Nicho Hematopoético
As
células-tronco
hematopoéticas
localizam-se
em
regiões
anatomicamente distintas da MO denominadas “nichos”. Estruturalmente os
nichos são compostos por um microambiente medular, formado por células
estromais e componentes da MEC que fornecem nutrientes capazes de manter o
balanço entre auto-renovação e proliferação das CTHs (Papayannopoulou &
Scadden, 2008; Moore & Lemischka, 2006; Yin & Li, 2006; Wilson & Trumpp,
2006; Arai et al.,2005). Figura 3
O conceito de “nicho” de células-tronco hematopoéticas foi inicialmente
sugerido por Shofield (1978), que propôs que as CTHs mantém um íntimo contato
com a região do endósteo, e que o contato célula-célula seria responsável pela
aparente
capacidade
ilimitada
de
proliferação
ou
inibição
das
CTHs
(Papayannopoulou & Scadden, 2008; Ballen, 2007; Moore & Lemischka, 2006;
Yin & Li, 2006; Wilson & Trumpp, 2006; Arai et al.,2005; Nilsson et al.,2001;
Shofield,1978).
Em roedores e humanos, a hematopoese é preferencialmente localizada na
região paratrabecular da MO, onde o remodelamento ósseo é ativo, envolvendo
os
osteoclastos,
mobilização
e
ativação
de
osteoblastos,
produção
e
mineralização do osteóide e subseqüente estabilização do osso. As células
reticulares adjacentes estão ligadas às células endosteais por moléculas de
adesão e junções do tipo “gap”, e contribuem para a modulação fisiológica da
função de suporte hematopoético (Moore & Lemischka, 2006; Yin & Li, 2006;
Wilson & Trumpp, 2006; Balduíno et al.,2005).
Nilsson et al (2001) demonstraram a evidência da localização espacial do
nicho na região endosteal. Em um modelo murino de transplante de medula
óssea, aproximadamente uma hora após a infusão de células hematopoéticas
primitivas (Lin-), observaram que a maioria das CTHs dos doadores localizaramse na região central da medula óssea, e rapidamente se redistribuíram
preferencialmente próximas à região endosteal da MO.
Adams et al.(2006), demonstraram através de estudos murinos que os íons
cálcio presentes em grande quantidade na superfície endosteal, interagem com
receptores expressos pelas CTHs, agindo como potente regulador do aumento
Introdução
13
destas células no nicho. Estes estudos sugerem uma nova estratégia de
tratamento utilizando drogas que modulem os receptores de cálcio, aumentando a
proliferação das CTHs transplantadas no nicho hematopoético ou, em
contrapartida na mobilização das CTHs da MO para o sangue periférico.
Osteoblastos
CTH
Vasos sangüíneos
Osso
Células
estromais
Progenitores
MEC
Figura 3. Nicho de células hematopoéticas: Diagrama esquemático dos
componentes celulares e do nicho de células hematopoéticas na medula óssea. A
medula óssea está intrinsecamente ligada com as CTHs, e sua população mais
primitiva localiza-se próxima à superfície do endósteo da trabécula óssea, onde
os osteoblastos parecem estar diretamente relacionados com a regulação da
hematopoese.
(Modificado de Moore & Lemischka. Science 2006;311:880-85)
Introdução
14
1.4 Moléculas de Adesão Celular
Moléculas de adesão celular (MAC) são proteínas de superfície celular
secretadas por leucócitos, células endoteliais MEC, que participam da interação
entre as CTHs e o microambiente hematopoético e estão envolvidas na retenção
das células na MO e na migração para o sangue periférico (Lataillade et al.,2004;
Williams et al.,199; Whetton & Sponcer, 1998; Timens,1995).
A presença das moléculas de adesão é mais evidente em células
hematopoéticas jovens e vai diminuindo à medida que as células vão
amadurecendo, facilitando dessa forma a migração das células maduras como
neutrófilos, eosinófilos e eritrócitos para a circulação periférica. Estas moléculas
são ativadas por citocinas que atuam em receptores celulares aumentando o
processo de migração transendotelial no recrutamento de leucócitos para os sítios
inflamatórios e na mobilização periférica da CTH (Cashen et al.,2007;
Gangenahalli et al.,2006; Lataillade et al.,2004; Whetton & Sponcer, 1998).
As moléculas de adesão são classificadas em famílias: a família das
integrinas, encontrada nos granulócitos, monócitos, linfócitos e plaquetas;
superfamília das imunoglobulinas, que possuem receptores inseridos na
membrana de macrófagos, plaquetas e linfócitos T; família das selectinas, que se
ligam a carboidratos localizados na membrana dos leucócitos e das células
endoteliais; o CD44 e as quimiocinas (Chan & Watt, 2001; Lichtman et al.,2006
2001; Timens, 1995).
1.4.1 Integrinas
Integrinas são proteínas heterodímeras (17 subunidades α e 8 subunidades
β), que medeiam importantes funções celulares incluindo o desenvolvimento
embrionário, diferenciação celular e interações entre células hematopoéticas ou
inflamatórias com o microambiente medular (Gangenahalli et al.,2006; Winkler &
Lévesque, 2006; Wagers et al.,2002; Chan & Watt, 2001; Whetton & Graham,
1999). Estruturalmente diferentes cadeias α ligam-se a uma mesma cadeia β.
Desta forma, classificam-se as integrinas em três subfamílias principais: β1 ou
VLA-antígenos de apresentação tardia (very late antigen); β2 ou LeuCAM-
Introdução
15
moléculas de adesão de leucócitos; e β3 ou citoadesinas. São glicoproteínas
transmembranas que necessitam de um processo de ativação para conectar-se
ao seu receptor (Wagers et al.,2002; Chan & Watt, 2001; Timens,1995).
Ambas as subunidades α e β interagem com ligantes que incluem as
proteínas da MEC (colágenos, trombospondina, laminina, vitronectina, fator de
Von Willebrand, etc.) e aos membros da superfamília das imunoglobulinas
(moléculas de adesão intercelular 1, 2 e 3: ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3 e molécula
de adesão vascular: VCAM). Existe pelo menos seis tipos de moléculas VLA,
sendo o VLA-4 (41) e VLA-5 (51) com expressão fenotípica do CD29/CD49d
e CD29/CD49e, respectivamente, consideradas as mais importantes (Chan &
Watt 2001; Timens,1995).
As integrinas estão diretamente envolvidas na diferenciação celular, tráfego
de leucócitos, agregação plaquetária, ativação celular, organização tecidual,
mobilização e homing das CTHs (Cashen et al.,2007; Katayama et al.,2004;
Wagers et al.,2002; Chan & Watt, 2001; Whetton & Graham, 1999; Timens,1995).
A maioria das CTHs expressa o VLA-4 (α4β1) cujo receptor é a molécula de
adesão vascular (VCAM-1) e a fibronectina (FN). A atividade adesiva do VLA-4
pode ser regulada por citoquinas presentes no microambiente medular como fator
estimulante de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), fator estimulante de CTH
(stem cell factor - SCF), interleucina-3 (IL-3) e fator de crescimento beta-1
transformador (TGF-β1), sugerindo ter papel fundamental na regulação da
hematopoese (Nervi et al.,2006; Katayama et al.,2004; Lapidot & Petit, 2002;
Chan & Watt, 2001).
O VLA-4 medeia a interação entre a CTH e o estroma medular sendo de
relevância funcional para a hematopoese e para a mobilização periférica e
migração medular das CTHs (Cashen et al.,2007; Nervi et al.,2006; Winkler &
Lévesque, 2006; Katayama et al.,2004; Lapidot & Petit, 2002; Wagers et al.,2002;
Chan & Watt, 2001).
As CTHs circulantes expressam VLA-4 em baixas quantidades quando
comparadas as CTHs presentes na medula óssea. A mobilização das CTHs para
o sangue periférico parece não depender somente do nível de expressão das
integrinas, mas também do seu estado funcional (Cashen et al.,2007; Nervi et
Introdução
16
al.,2006; Winkler & Lévesque, 2006; Katayama et al.,2004; Papayannopoulou,
2004; Whetton & Sponcer, 1998).
O papel da VLA-5 (α5β1) ainda é pouco conhecido, mas parece estar
envolvido na regulação da adesão celular com a MEC e também na migração
celular. As CTHs expressam o VLA-5 cujo receptor também é a fibronectina,
porém o VLA-4 é mais rapidamente requerido para a migração celular
(Gangenahalli et al.,2006; Lichtman et al.,2006; Chan & Watt, 2001).
1.4.2 Superfamília das Imunoglobulinas
Imunoglobulinas da superfamília são glicoproteínas transmembranas
cálcio independentes. As moléculas de adesão pertencentes a essa classe
também estão envolvidas em vários processos da hematopoese (Cashen et
al.,2007; Nervi et al.,2006; Winkler & Lévesque, 2006; Whetton & Graham, 1999).
Os membros dessa família são: molécula de adesão intercelular 1 - ICAM-1
(fenótipo CD54) que é ligante para o LFA-1(molécula de adesão associada a
função leucocitária). Molécula de adesão da célula vascular- VCAM (CD106),
ligante para o VLA-4. Molécula de adesão da célula endotelial plaquetáriaPECAM-1 (CD31). Molécula de adesão da célula neural-N-CAM (CD56) (Winkler
& Lévesque, 2006; Katayama et al.,2004; Chan & Watt, 2001; Williams et
al.,1991). Recentemente foi demonstrado que outra molécula de adesão, a
MadCAM (molécula de adesão ligada à mucosa), ligante da integrina α 4β7,
também tem um papel importante na migração celular e do homing das CTHs
(Katayama et al.,2004).
1.4.3 Selectinas
As moléculas de adesão da família das selectinas contêm três membros. A
selectina plaquetária (P-selectina - CD62P), expressa em plaquetas e células
endoteliais e a selectina endotelial (E-selectina – CD62E), expressa em células
endoteliais. Estas duas selectinas tem sua expressão induzida pela sinalização da
resposta inflamatória, sendo auxiliares no extravasamento de leucócitos para o
sangue periférico (Nervi et al.,2006; Lichtman et al.,2006; Chan & Watt ,2001).
Introdução
17
O terceiro membro, a L-selectina (CD62L) é expresso em leucócitos
maduros e nas CTHs. Progenitores mielóides (CFU-GM) incluindo a população de
células CD34+ expressam altos níveis de L-selectina, enquanto que os
progenitores eritróides expressam baixos ou indetectáveis níveis de L-selectina.
As CTHs mais primitivas (CD34+, CD38-) expressam níveis baixos ou
intermediários destas moléculas (Chan & Watt, 2001).
Entre os receptores para L-selectina incluem o GlyCAM-1 (molécula de
adesão celular dependente de glicosilação)
expresso em linfonodos; CD34
marcador de superfície das CTHs e MadCAM-1 uma glicoproteína semelhante à
mucina encontrada em tecido endotelial venoso de linfonodos de mucosa (Chan &
Watt, 2001). O tetrassacarídeo sialo Lewisk (sLex) foi identificado como ligante
para a P e E-selectinas. Outro ligante é a P-selectina glicoproteína ligante-1
(PSGL-1), que é uma glicoproteína presente em células mielóides maduras
(neutrófilos e monócitos) e em linfócitos.
1.4.4 CD44
Outra molécula envolvida em eventos adesivos é CD44, também
denominada molécula de adesão do homing (HCAM). Este receptor é expresso
nas células hematopoéticas e não-hematopoéticas e atua no homing e adesão à
MO em conjunto com as moléculas de adesão VLA-4 e ICAM-1 e ICAM-3
(Lichtman et al.,2006; Nervi et al.,2006; Chan & Watt, 2001).
O CD44 é o principal receptor do ácido hialurônico (AH) e sua expressão
está diminuída em CTHs mobilizadas, sugerindo um papel importante na adesão
das CTHs à matriz extracelular e às células estromais e na mobilização celular
para a circulação periférica (Nervi et al.,2006; Chan & Watt, 2001).
Estudos do nosso grupo (dados não publicados) demonstraram que após a
mobilização das CTHs da MO para o sangue periférico, os níveis séricos de AH
estão aumentados e que a expressão do CD44 está diminuída nas células CD34+.
O aumento dos níveis de AH nos pacientes portadores de doenças oncohematológicas que foram considerados maus mobilizadores, sugerem que este
seja um fator de predisposição ao insucesso durante o processo de mobilização
das CTHs.
Introdução
18
1.4.5 Quimiocinas
Quimiocinas fazem parte da superfamília das citocinas de baixo peso
molecular, 8 a 15 kDa, classificadas em duas subfamílias de acordo com o
aminoácido presente: CXC ou CC (Nervi et al,2006; Lataillade et al, 2004). Os
receptores CXC (CXCR) ligam-se as quimiocinas do tipo CXC, e os receptores
CC (CCR) ligam-se as quimiocinas do tipo CC (Lataillade et al,2004). Ambos
regulam o tráfego de células imunes efetoras como os macrófagos, células
dendríticas, eosinófilos, células “natural killers”, neutrófilos, eosinófilos e basófilos
para os locais de infecção e inflamação (Nervi et al.,2006; Lataillade et al.,2004;
Lapidot & Petit, 2002).
O SDF-1 (fator-1 derivado do estroma) também denominado CXCL12, é
um membro da família das -quimiocinas do tipo CXC produzida por células
estromais da MO que se liga ao seu receptor, o CXCR-4 uma proteína
transmembrana presente nas células CD34+ (Cashen et al, 2007; Lapidot &
Petit,2002).
O SDF-1 é uma quimiocina caracterizada como um fator estimulante de
crescimento de células pré-B, que potencialmente atrai diferentes tipos de células,
incluindo as CTHs que expressam o receptor CXCR-4 na membrana celular
(Winkler & Lévesque, 2006; Lataillade et al.,2004; Lapidot & Petit, 2002). O
complexo SDF-1/CXCR-4 está diretamente relacionado com a migração celular
para o sangue periférico e com o homing das CTHs (Cashen et al.,2007; Winkler
& Lévesque, 2006; Lataillade et al.,2004; Lapidot & Petit, 2002).
1.5 Citocinas e Fatores de Crescimento Hematopoéticos
Citocinas são glicoproteínas que medeiam e regulam a resposta imune,
inflamação
e
hematopoese.
São
produzidas
em
resposta
a
estímulos
imunológicos e se ligam aos receptores de membrana específicos modificando
funções celulares como proliferação, ativação e secreção de moléculas efetoras
(Nervi et al.,2006; Lichtman et al.,2006).
Os fatores de crescimento hematopoéticos são citocinas que atuam na
formação,
regulação
e
em
várias
atividades
funcionais
das
células
Introdução
19
hematopoéticas progenitoras ou maduras como quimiotaxia, degranulação,
ativação e citoxicidade. Nesta categoria englobamos as interleucinas, linfocinas,
monocinas, interferons e fatores estimuladores de colônias (Lichtman et al.,2006;
Barreda et al.,2004).
Os fatores estimulantes de colônias (CSF- colony stimulating factor) vem
sendo estudados nos últimos 30 anos e suas propriedades são essenciais no
desenvolvimento das várias linhagens de células hematopoéticas. Dentre eles
estão o fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF:macrophage colonystimulating factor), o fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF:
granulocyte colony-stimulating factor), o fator estimulador de colônias de
granulócitos e macrófagos (GM-CSF: granulocyte-macrophage colony-stimulating)
e o fator estimulador de colônias de multilinhagens, melhor denominado de
interleucina-3 (multi-CSF ou IL-3) (Barreda et al.,2004; Vadhan-Raj et al.,1988).
M-CSF é o principal regulador da sobrevida, proliferação e diferenciação de
macrófagos e seus precursores, e tem também efeito sinérgico com outras
citocinas na proliferação de progenitores hematopoéticos imaturos. O M-CSF é
sintetizado por vários tipos de células incluindo as células endoteliais, fibroblastos,
células estromais da MO e osteoblastos (Barreda et al.,2004).
GM-CSF é uma glicoproteína produzida por várias células como: linfócitos
B e T, células endoteliais, células mesoteliais, mastócitos, fibroblastos macrófagos
e osteoblastos, que estimula a proliferação e diferenciação de células
hematopoéticas comprometidas com as linhagens de neutrófilos de macrófagos
em vários estágios de desenvolvimento. Ele regula as atividades funcionais de
granulócitos e monócitos maduros in vivo e in vitro (Wognun 1994; Vadan-Raj
1988). O GM-CSF recombinante humano (rhGM-CSF) não somente estimula a
formação de granulócitos e monócitos, mas também a formação de colônias
multipotentes
de
granulócitos,
monócitos,
eritrócitos
e
megacariócitos,
aumentando dessa forma a população mielóide (Vadan-Raj et al.,1988; Barreda et
al.,2004).
O G-CSF é produzido por monócitos, células endoteliais e fibroblastos,
regula a produção e acelera o processo maturativo de neutrófilos e sua liberação
da medula óssea para o sangue periférico. Precursores tardios da linhagem
neutrofílica e o próprio neutrófilo maduro são considerados alvo de atuação do G-
Introdução
20
CSF. Seus receptores são encontrados em todas as células da linhagem
granulocítica e também em monócitos (Lichtman et al.,2006; Barreda et al.,2004).
Além da ação fisiológica, o G-CSF atua no processo de mobilização das
CTHs. Durante a hematopoese não-estimulada, somente um pequeno número de
progenitores hematopoéticos circula no sangue periférico. A administração de
citocinas, como G-CSF, associadas ou não a drogas citotóxicas, como
ciclofosfamida, proporciona um aumento brutal no número de progenitores
hematopoéticos circulantes. Como conseqüência, o sangue periférico tem se
tornado uma importante fonte de progenitores hematopoéticos para uso em
transplantes de medula óssea autólogos e alogênicos (Cashen et al.,2007; Nervi
et al.,2006).
A IL-3, um produto dos linfócitos T age estimulando a proliferação e
diferenciação
de
células
precursoras
hematopoéticas,
como
também,
aumentando a função de células mielóides maduras. Atua sobre unidades
formadoras de colônias de granulócitos-macrófagos (CFU-GM), unidades
formadoras de colônias de eritrócitos (CFU-E), unidades formadoras de colônias
de megacariócitos (CFU-Meg) e unidades formadoras de granulócitos, eritrócitos,
macrófagos e megacariócitos (CFU-GEMM), caracterizando sua atividade em
progenitores mais primitivos comprometidos com a linhagem mielóide (Barreda et
al.,2004).
A eritropoetina (EPO) é um hormônio glicoprotéico produzido nas células
do interstício do parênquima renal, externamente à membrana basal tubular,
principalmente na região interna do córtex e região externa da medula renal.
Estas células especializadas produtoras de EPO também foram encontradas em
pequena quantidade no parênquima hepático (Lichtman et al.,2006). O
mecanismo de produção da EPO é regulado pelo nível de hipóxia tecidual, em
resposta à anemia, através do aumento das células produtoras de EPO e não por
um aumento da síntese deste hormônio por um número pré-fixado de células
(Lichtman
et
al.,2006).A
EPO
promove
diferenciação
eritróide
atuando
principalmente nos progenitores eritróides imaturos (BFU-E e CFU-E), nas células
mais diferenciadas como os (proeritroblastos e eritroblastos), induzindo o
aumento da massa eritróide (Lichtman et al.,2006; Dybedal & Jacobsen, 995).
Introdução
21
1.6 Transplante de Medula Óssea
O transplante de medula óssea (TMO) visa enxertar a célula-tronco
hematopoética com o objetivo de corrigir defeitos qualitativos ou quantitativos da
medula óssea. O princípio do TMO é erradicar a doença de base através de
quimioterapia ou radioterapia mieloablativa, destruindo as células presentes na
medula óssea e posteriormente infundindo as células-tronco hematopoéticas que
irão repovoar a MO do hospedeiro (Levesque & Winkler, 2008; Devetten &
Armitage, 2007; Elfenbein & Sackstein, 2004; Baron & Storb ,2004; Cottler-Fox et
al.,2003; Gazitt, 2001;Thomas et al.,1975).
Atualmente a nomenclatura usualmente empregada é transplante de
células-tronco hematopoéticas (TCTH), uma vez que a fonte de células mais
utilizada são as células-tronco do sangue periférico (Levesque & Winkler ,2008)
obtidas após um tratamento que aumenta o tráfego das CTHs da medula óssea
para o sangue periférico (Devetten & Armitage, 2007; Jansen et al.,2005;
Elfenbein & Sackstein, 2004; Baron & Storb ,2004;Thomas et al.,1975).
Nos últimos 30 anos o TCTH vem sendo utilizado no tratamento de
doenças hematológicas malignas e não-malignas, imunodeficiências, erros inatos
do metabolismo e tumores sólidos. O transplante pode ser singênico, quando o
doador é um gêmeo univitelínico; alogênico, quando a célula provém de outro
doador aparentado ou não; e autólogo, quando a célula enxertada é do próprio
paciente (Jansen et al.,2005; Elfenbein & Sackstein, 2004; Baron & Storb,
2004:Thomas et al.,1975).
1.6.1. Criopreservação
A aplicação da criobiologia na preservação celular iniciou-se em 1949 com
o congelamento de esperma utilizando glicerol como agente crioprotetor (Polge et
al.,1949). Subsequentemente, este procedimento foi aplicado por Barnes & Loutit
(1955) na criopreservação de células hematopoéticas. Desde então novos
protocolos e agentes crioprotetores vem sendo utilizados em aplicações clínicas,
utilizando células hematopoéticas coletadas no sangue periférico ou medula
Introdução
22
óssea (MO), na grande maioria dos transplantes de medula óssea autólogo e
alguns alogênicos (Almici et al.,2003, Balint et al.,1999).
O princípio dos procedimentos de criobiologia é minimizar a injúria tecidual
durante o processo de congelamento. A injúria celular pode ser causada pela
desidratação celular intensa e/ou cristalização de gelo intracelular .Os agentes
crioprotetores diminuem o gradiente osmótico e a diferença de pressão de vapor
entre os meios intra e extracelular (Balint et al.,1999).
O
procedimento
padrão
utilizado
hoje
para
criopreservar
células
hematopoéticas utiliza DMSO (Dimetilsulfóxido) como agente crioprotetor em
concentrações (2-10%), em um sistema de congelamento gradual e subseqüente
armazenamento em nitrogênio líquido (-196ºC).
A
funcionalidade
das
células
hematopoéticas
criopreservadas
e
posteriormente descongeladas pode ser verificada por meio de técnicas de
detecção de viabilidade, cultura de células em meio líquido e culturas de longa
permanência.
1.7 Mobilização de Células-tronco Hematopoéticas
A administração de altas doses de quimioterapia ou radioterapia seguida
do transplante das CTHs proporciona aos pacientes com doenças oncohematológicas, uma rápida recuperação do sistema hematopoético e imunológico
(Levesque & Winkler, 2008; Cottler-Fox et al.,2003; Gazitt,2001).
Tradicionalmente as CTHs são obtidas por múltiplas aspirações na crista
ilíaca da medula óssea. No entanto, no final da década de 70 e início da década
de 80, a descoberta que as CTHs poderiam ser estimuladas a migrar em grande
quantidade da medula óssea para o sangue periférico, onde poderiam ser
facilmente coletadas, mudou radicalmente a prática clínica dos transplantes
(Levesque & Winkler,2008; Nervi et al.,2006; Cottler-Fox et al.,2003; Lapidot &
Petit, 2002).
O recrutamento das células progenitoras da medula óssea para o sangue
periférico durante o tratamento com quimioterapia ou citocinas é um procedimento
clínico chamado de mobilização. Este método imita a resposta da medula óssea
aos sinais de estresse durante danos ou inflamações, originando aumento da
Introdução
23
liberação fisiológica das células-tronco hematopoéticas da reserva medular e
migração transendotelial (Winkler & Levesque,2006; Cottler-Fox et al.,2003;
Lapidot & Petit, 2002).
Atualmente as células-tronco hematopoéticas mobilizadas são a fonte de
escolha para transplantes autólogos e alogênicos, sendo empregadas na grande
maioria (>90%) dos transplantes (Levesque & Winkler, 2008; Cottler-Fox et
al.,2003). Estudos randomizados (Hartmann et al.,1997; Schmitz et al.,1996;
Beyer et al.,1995) comparando a origem das células-tronco periféricas
mobilizadas e de medula óssea demonstraram vantagens no emprego das CTHs
mobilizadas, como a menor duração das citopenias, maior rapidez na “pega”
medular, melhora na reconstituição imune e redução da morbidade (Levesque &
Winkler, 2008; Cashen et al.,2007; Winkler & Levesque, 2006; Nervi et al.,2006;
Cottler-Fox et al.,2003; Lapidot & Petit, 2002; Gazitt ,2001).
Os agentes utilizados na mobilização das células-tronco induzem a
expansão, ativação e/ou degranulação de células mielóides da medula óssea,
levando à liberação de enzimas proteolíticas dos neutrófilos que clivam as
ligações das CTHs com as células estromais, resultando na mobilização destas
células da MO para o sangue periférico (Levesque & Winkler ,2008; Nervi et
al.,2006; Cottler-Fox et al.,2003).
Os primeiros agentes utilizados para mobilizar as CTHs foram drogas
citotóxicas, que suprimem o tecido hematopoético, estimulando a proliferação das
CTHs remanescentes para repovoar a medula óssea. É durante este período de
recuperação medular que o número de CTHs aumenta no sangue periférico
(Levesque & Winkler, 2008; Winkler & Levesque, 2006; Nervi et al.,2006).
Durante a última década, os conhecimentos sobre os mecanismos da
mobilização celular foram aperfeiçoados, através da descoberta das moléculas de
adesão e seus receptores, citocinas e fatores de crescimento, e sua correlação
com adesão e migração das células hematopoéticas da MO. Estes estudos
proporcionaram utilização concomitante à quimioterapia, ou de forma isolada, de
citocinas como o G-CSF, GM-CSF e interleucina-8 (IL-8) (Cashen et al.,2007;
Winkler & Levesque, 2006; Papayannopoulou, 2004).
O G-CSF recombinante humano é o agente mais comumente utilizado na
mobilização da CTHs. A segurança e eficácia do uso desta citocina são
Introdução
24
sustentadas por 20 anos de uso, sendo bem tolerado pelos pacientes e doadores
apresentando poucos efeitos colaterais (Levesque & Winkler ,2008; Cashen et
al.,2007; Gazitt, 2001). Entretanto, uma proporção significativa de doadores de
medula óssea de TCTH alogênico (5-10%) mobiliza mal em resposta ao G-CSF.
Esta proporção aumenta consideravelmente (>40%) em coleta autóloga,
dependendo da doença de base, da intensidade e da duração do tratamento
quimio/radioterápico prévio (Levesque & Winkler, 2008; Cashen et al.,2007;
Winkler & Levesque, 2006). Dessa forma, muitos esforços foram feitos para
elucidar os mecanismos moleculares que mantém a CTH na medula óssea. A
ativação destes mecanismos interfere na migração das células progenitoras
hematopoéticas da medula óssea para o sangue periférico (Levesque &
Winkler,2008).
O processo de mobilização inicia-se por ativação de neutrófilos e
osteoclastos, induzida por quimioterapia ou citocinas como o G-CSF (Cottler-Fox
et al.,2003; Lapidot & Petit, 2002). Ocorre aumento da proliferação dos neutrófilos,
que
secretam
enzimas
proteolíticas
como
a
elastase,
catepsina
G
e
metaloproteinases de matriz (MMP-9 e MMP-2), que clivam as ligações entre as
moléculas de adesão das CTHs (VLA-4) e seus receptores no estroma (VCAM-1),
facilitando a liberação e a migração transendotelial das CTHs da medula óssea.
Outra citocina, o SDF-1 que também participa na mobilização mediada por GCSF, induz os osteoclastos a secretarem metaloproteinases de matriz (MMP-9),
agindo de forma sinérgica e concomitante à ação dos neutrófilos (Levesque &
Winkler, 2008; Cashen et al.,2007; Winkler & Levesque, 2006; Nervi et al.,2006;
Cottler-Fox et al.,2003; Lapidot & Petit, 2002; Gazitt, 2001). Figura 4
Introdução
25
CONDIÇÕES NORMAIS (A)
CÉLULAS SANGUÍNEAS MADURAS
SANGUE
ENDOTÉLIO VASCULAR
MEDULA ÓSSEA
NEUTRÓFILOS
MEC
CXCR4
+
CD34
SDF-1
VCAM-1
VLA-4
CÉLULAS ESTROMAIS
OSTEOBLASTOS
ENDÓSTEO
OSSO
MOBILIZAÇÃO (B)
CTHs MOBILIZADAS
SANGUE
MEDULA ÓSSEA
NEUTRÓFILOS
MEC
G-CSF
PROLIFERAÇÃO
ELASTASE
CATEPSINA G
MMPS
VLA-4
VCAM-1
OSTEOBLASTOS
CÉLULAS ESTROMAIS
ENDÓSTEO
OSSO
Figura 4: Modelo para a mobilização de CTHs por G-CSF. Em condições
normais (A), as células-tronco localizam-se próximas às células estromais
aderidas por ligações com as moléculas de adesão celular como a VLA-4/VCAM1. Durante a mobilização (B), G-CSF induz a proliferação dos neutrófilos e
liberação de proteases (elastase, catepsina G, e metaloproteinases-MMPs), que
participam na degradação das interações das CTHs com as moléculas de adesão
e migração para o sangue periférico.
Modificado de: Lapidot & Petit, 2002.
Introdução
26
1.8 Cultura de Medula Óssea de Longa Permanência
As culturas de medula óssea de longa permanência foram primeiramente
descritas por Dexter et al (1977). Este modelo fundamentou o cultivo de células
obtidas da medula óssea de camundongos e depositadas em meio de cultura,
sem adição de citocinas, gerando uma camada de células aderentes e algumas
em suspensão, sendo capazes de se manterem viáveis por várias semanas
(Galotto et al.,1999; Wilkins & Jones,1995). Nesta padronização foram
estabelecidos parâmetros como número de células plaqueadas, temperatura e
intervalo de troca de parte do meio de cultura. Observou-se que na primeira e
segunda semana havia uma redução do número de células em suspensão, pois
as células mais maduras morriam e as mais imaturas aderiam à placa e se
diferenciavam. As células aderentes foram inicialmente denominadas de células
mononucleares fagocíticas, células planas formando uma camada confluente
(fibroblastos e macrófagos) e posteriormente surgiram células apresentando
vacúolos de lipídeos (adipócitos) (Dexter et al.,1977).
Na década de 80, Gartner & Kaplan (1980) estabeleceram um modelo de
culturas de longa permanência de células humanas baseado na descrição inicial
de Dexter. Confirmaram que era possível manter estas culturas por longos
períodos e que a quantidade de progenitores hematopoéticos, analisados através
de ensaios clonogênicos se mantinha principalmente na camada aderente.
A introdução deste sistema de culturas de longa permanência denominado
LTBMC (long term bone marrow culture) tornou-se uma ferramenta importante
nos estudos funcionais das CTHs e sua relação com o microambiente
hematopoético. Inicialmente, entre o quinto e o vigésimo dia de cultivo, ocorre a
formação da camada de células aderentes, denominada estroma. O contato das
células aderentes do estroma com os progenitores hematopoéticos produz os
estímulos necessários para a manutenção da hematopoese, como a secreção e
citocinas e proteínas constituintes da MEC. Desta forma, a camada de estroma
propicia o crescimento de células hematopoéticas progenitoras que podem ser
quantificadas e analisadas funcionalmente através de ensaios clonogênicos
(Lanza et al., 2001; Galotto et al.,1999; Wilkins & Jones, 1995; Marsh et al., 1991;
Eaves et al., 991).
Introdução
27
Desta forma obtém-se in vitro, um microambiente que se assemelha às
características presentes na medula óssea de onde estas células foram extraídas
e proporciona estudos relacionados à hematopoese em diferentes condições, que
podem ser relacionadas com processos fisiológicos ou patológicos (LópezHolgado et al.,2005; Lanza et al.,2001; Galotto et al.,1999; Wilkins & Jones, 1995;
Marsh et al.,1991; Eaves et al.,1991).
1.8.1 Cultura de Medula Óssea de Longa Permanência e Doenças OncoHematológicas
O sistema de LTBMC foi utilizado por Marsh et al.(1991) para avaliar os
danos do estroma hematopoético e das CTHs em pacientes com anemia
aplástica. Por meio de cultivos cruzados de estroma normal com CTHs de
pacientes com anemia aplástica e estromas de pacientes com anemia aplástica
com CTHs normais, observaram que todos os pacientes apresentaram falhas na
função das CTHs sem alterações no estabelecimento do estroma.
Domenech et al.(1994) avaliaram através das LTBMC e ensaios
clonogênicos a hematopoese de pacientes portadores de doenças oncohematológicas e tumores sólidos. Eles demonstraram que altas doses de
quimioterapia administradas durante o transplante de medula óssea autólogo
causavam danos prolongados no sistema hematopoético, mesmo após a
recuperação das contagens de células no sangue periférico. Estes dados
sugeriram que a quimioterapia não causava danos as CTHs, mas sim ao estroma
hematopoético.
Del Cañizo et al.(1999) utilizando LTBMC e ensaios clonogênicos,
confirmaram em parte os estudos de Domenech et al.(1994). Neste estudo além
da perda da capacidade de formação do estroma, observaram que os
progenitores hematopoéticos também estavam reduzidos, sugerindo que estes
danos à hematopoese influenciavam a recuperação de granulócitos e plaquetas
após o transplante.
Recentemente López-Holgado et al.(2005) demonstraram através de
LTBMC e ensaios clonogênicos a influência do sexo no estabelecimento do
estroma em amostras de MO obtidas de doadores normais. Eles observaram que
Introdução
28
o sexo masculino teve um melhor desempenho na formação da confluência, o que
pode ser devido ao maior número de células precursoras hematopoéticas no
sangue periférico após o processo de mobilização. Outro fato importante
observado foi que as culturas estabelecidas com o produto da aférese após a
mobilização tiveram um melhor desempenho quando comparadas àquelas
estabelecidas com células da medula óssea, indicando uma maior quantidade de
CTHs no produto de aférese.
Defeitos
quantitativos
e
qualitativos
em
células
hematopoéticas
progenitoras são proeminentes descobertas em síndromes mielodisplásicas
(SMD). Recentes estudos demonstraram que células hematopoéticas da medula
óssea de pacientes com SMD possuem uma alta proliferação com um número
grande de células eritróides, mielóides e megacariocíticas comprometidas com a
síntese de DNA (ácido desoxirribonucléico). Esta observação está relacionada
com o aumento da celularidade na medula óssea dos pacientes com SMD, mas
não se associa às citopenias periféricas associadas com estas doenças. Uma
explicação para este paradoxo é que as células hematopoéticas não saem do
compartimento da medula óssea porque morrem depois que entram na circulação
periférica (Aizawa et al.,1999; Alvi et al.,2001; Borojevic et al.,2004).
O Mieloma Múltiplo é uma doença onco-hematológica caracterizada pela
proliferação monoclonal de células plasmáticas. Ainda não está completamente
definido o mecanismo pelo qual estas células permanecem na medula óssea e
qual o papel do microambiente.
Muitos estudos demonstram que diferentes
citocinas estão envolvidas na proliferação de células do mieloma tanto in vitro
como in vivo. (Faid et al.,1996; Bloem et al.,1998). Contudo, sabe-se hoje que
dentre as doenças onco-hematológicas, o mieloma múltiplo apresenta maior grau
de danos no microambiente hematopoético e uma grande resistência à terapia
citotóxica, provavelmente relacionada com o mecanismo de interação entre a
MEC, as integrinas e as células hematopoéticas (van Marion et al.,2003; Cheung
& Van Ness, 2001; Damiano et al.,1999).
Interações anormais entre células hematopoéticas em desenvolvimento e
seu microambiente podem, ao menos em parte, causar a saída prematura de
blastos nas leucemias, mas ainda não foi confirmado se um microambiente
medular “leucêmico” existe. (van Golisga et al.,2007; Corazza et al.,2004;
Introdução
29
Bruserud & Gjertsen, 2000; Greenberger, 1992; Liesveld et al.,1991; Liesveld et
al.,1994; Reuss-Borst et al.,1995; Reuss-Borst et al.,1992; Teixidó et al.,1992).
Os esforços em entender estas relações funcionais entre o microambiente
e as células progenitoras hematopoéticas, são básicos para estabelecer os
mecanismos da hematopoese nas doenças onco-hematológicas. O conhecimento
do processo que envolve a adesão celular, as alterações do estroma da MEC e a
migração das células CD34+, diante do contexto de pacientes com MO
inicialmente comprometida por células clonais, submetidos a esquemas de
quimioterapia
e
radioterapia
convencionais,
contribuirá
em
respostas
+
esclarecedoras no rendimento de células CD34 para o TCTH autólogo.
Frequentemente os portadores de doenças onco-hematológicas se
submetem ao TMOA como terapia de consolidação ou de salvação. Em nossa
experiência em TMO observou-se que alguns pacientes, em especial aqueles
mais intensamente tratados, curiosamente não mobilizam células CD34 + de forma
satisfatória, necessitando de realização de coleta de medula óssea por múltiplas
aspirações em centro cirúrgico. Entretanto, outros pacientes submetidos a
condições semelhantes obtem bom rendimento destas células. A literatura
pertinente não é conclusiva quanto às verdadeiras causas destas falhas,
especula-se o papel do tratamento quimioterápico que resultaria em diminuição
do pool de células progenitoras hematopoéticas.
Poucos estudos referem-se às consequências das ações proteolíticas que
possam ocorrer no microambiente hematopoético, causadas pelo uso de fatores
de
crescimento
durante
o
período
de
mobilização
de
células-tronco
hematopoéticas (Cashen et al., 2007; Elfenbein & Sackstein, 2004). Levando em
conta este fato, propusemos um modelo de análise funcional com intuito de
avaliar possíveis danos causados pelo tratamento quimioterápico prévio ao
transplante de medula óssea autólogo, ou pela terapêutica associada ao fator de
crescimento G-CSF empregada na mobilização de células CD34 + e sua
correlação com o sucesso ou insucesso deste procedimento.
Objetivos
30
2. OBJETIVOS
Devido a falha de mobilização ocorrer em número considerável de portadores
de doenças onco-hematológicas submetidos a transplante de medula óssea
autólogo, propôs-se a avaliação dos danos ao estroma e dos efeitos da
criopreservação nas células mononucleares de medula óssea no processo de
mobilização de células CD34+.
1. Análise do estroma da medula óssea nas fases pré e pós-mobilização
através de ensaios funcionais in vitro relacionados ao estabelecimento,
velocidade de formação e manutenção do estroma.
2. Correlação entre os achados da análise do estroma com as alterações
histopatológicas com o sucesso da mobilização e rendimento de células
CD34+ no processo de leucoaférese.
3. Avaliação dos efeitos da criopreservação nas células mononucleares totais
e CD34+ de medula óssea durante o período de mobilização.
Materiais e Métodos
31
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Casuística
Foram avaliados 22 pacientes, com idade variando entre 16 e 60 anos
(média de 37,2 anos). Destes, 5 eram portadores de Linfomas Não-Hodgkin
(LNH), 6 Linfomas de Hodgkin (LH), 4 mieloma múltiplo (MM), 5 Leucemias
Mielóides Agudas (LMA), 1 Leucemia Linfóide Aguda (LLA) e 1 (Leucemia
Linfóide Crônica (LLC). O tempo entre o diagnóstico e a mobilização foi de 4 a 60
meses. Dez pacientes estavam em remissão completa, 11 em remissão parcial e
um apresentava doença avançada (Tabela 1). Todos os pacientes tinham
indicação de TMOA previamente avaliados pelos grupos de transplante de
medula óssea (TMO) dos Hospitais São Paulo (HSP) e Hospital Santa Marcelina
(HSM), no período de novembro/05 a maio/2006 contabilizando, doze do HSP e
dez do HSM. Os controles foram provenientes de 10 doadores normais de
transplante de medula óssea alogênico com idade variando entre 26 e 45 anos,
sendo seis do HSM e quatro do HSP. O protocolo de pesquisa foi aprovado pelo
comitê de éticas das duas instituições envolvidas (Número de protocolos: 0241/02
e 012/02, respectivamente).
Tabela 1. Características dos pacientes estudados no período de indicação para TMOA.
Média
Diagnóstico
Nº de
de
Pacientes
idade
Sexo
Tempo de
Estágio da Doença
Diagnóstico
(anos)
M
F
RC
RP
DP
(meses)
Doadores
10
36,6
6
4
-
-
-
-
Leucemias
7
27,7
4
3
5
1
1
11,1
Linfomas
11
37.6
7
4
3
8
-
18
4
52,7
4
0
3
1
-
21,7
11
10
1
50%
45%
5%
Mieloma
Múltiplo
Total
32
38,6
21
11
RC: Remissão completa; RP: Remissão Parcial; DP: Doença Progressiva.
16,9
Materiais e Métodos
32
3.2 Tratamento de indução de remissão
O tratamento quimioterápico de indução de remissão seguiu protocolos
mundiais (Barlogie et al.,1988; Barlogie & Alexanian,1986; Miller et al.,1988;
Fisher et al.,1987; Bonadonna & Santoro,1983; DeVita et al.,1983; Armitage et
al.,1980; Jones et al.,1979; Bruserud & Gjertsen, 2000). Os dados de tratamento
de cada paciente são mostrados na tabela 2.
3.3 Critérios de inclusão para TMOA
Os critérios de inclusão para TMOA são descritos abaixo, classificados de acordo
com os diferentes tipos de doenças.
3.3.1 Mieloma Múltiplo (MM)
1. Diagnóstico de acordo com SWOG (Southwest Oncology Group Study) e
estadiamento clínico de acordo com Durie-Salmon (Durie & Salmon,1975).
2. Tratamento anterior com no mínimo 4 ciclos de quimioterapia (QT) tipo VAD
(Vincristina
/ Adriamicina / Dexametasona) (Barlogie & Alexanian,1986, Lokhorst
et al.,1999).
3. Ao término da QT, os pacientes foram avaliados quanto à resposta clínica,
considerando:
a) Remissão completa (RC): se houve total desaparecimento da gamopatia
monoclonal no soro ou na urina e menos do que 5% de plasmócitos em biópsia
de MO, mantidos por um período mínimo de dois meses.
b) Remissão parcial (RP): quando houve redução de pelo menos 75% da carga
tumoral inicial incluindo proteinúria de Bence-Jones inferior a 100mg/dia e menos
do que 10% de plasmócitos em aspirado ou biópsia de MO.
c) Doença estável (DE): foi considerada quando a redução da carga tumoral
inicial foi inferior a 75%, porém sem sinais de progressão.
d) Doença progressiva (DP): quando ocorreu aumento da carga tumoral igual ou
superior a 25%, na vigência de QT. Estes indivíduos foram classificados como
refratários ao tratamento. Nestes pacientes foram administrados mais 2 ciclos de
VAD e realizado novo reestadiamento clínico.
Materiais e Métodos
33
Tabela 2. Dados de quimioterapia de indução de remissão, número de ciclos, tempo entre
diagnóstico e mobilização e status da doença por paciente no período pré-mobilização para
TMOA.
T DIAG
DOENÇA
SEXO
IDADE
MOB
STATUS
TRATAMENTO PRÉVIO
Nº CICLOS
(MESES)
LNH
F
33
13
LNH
M
42
LNH
M
48
LNH
M
LNH
DH
DA
DOENÇA
CHOP (6)
6
RC
17
CHOP (6)+ R-ICE(3) +G-CSF
11
RP
13
CHOEP (6)+ DHAP(2)+ICE(3)
11
RP
34
18
CHOEP (6x), RTX, DHAP (4x)
10
RP
M
42
18
CHOP (x10), R-ICE (4x)
14
RC
F
20
28
9
RP
DH
F
24
24
ABVD(8) + DHAP (5)
13
RC
DH
M
25
31
ABVD(6)+ (Gencitabina +cisplatina)(6)
12
RP
DH
M
49
13
ABVD(6)+ (ICE)(3)
8
RC
DH
F
23
11
ABVD (8x) + ICE(4x)
12
RP
DH
M
30
13
ABVD (8)
9
RP
LLA-L3
M
20
7
BFM-LLA-L3
6 BLOCOS
RC
4
DP
ABVD (6)+ ICE (3) (Falha de MOB com
ICE)
D3A7(falha de indução),
2xMEC+CSA(remissão completa),
LMA-M1
M
16
NR
LMA-M2
M
24
4
D3A7(2) + HD ARA-C (2)
4
RC
LMA -M0
F
42
5
D3A7(2) + HD ARA-C (1)
3
RC
LLC atípica
M
50
14
R-CHOP
6
RC
F
25
9
3
RC
LMA-M2
F
17
28
D3A7 (2) + ARA-c (2g/m²x6)x3
5
RC
MM
M
60
10
Dexametasona
3
RC
MM
M
50
8
VAD+Talidomida+RTX analgésica
6
RP
MM
M
60
60
VAD(6) + Talidomida+Dexametasona
8
RP
MM
M
41
9
VAD( 6)
6
RP
intensificação: 1x(alta dose da ARAc+VP-16+CSA),
LMA pós
SMD
D3A7(1x), Ida3A7(1x), alta dose ARAC (1x)
LNH: Linfoma Não-Hodgkin; DH: Doença de Hodgkin; LLA: Leucemia Linfóide Aguda; LMA:
Leucemia Mielóide Aguda; LLC: Leucemia Linfóide Crônica; SMD: Síndrome mielodisplásicas;
MM: Mieloma Múltiplo; T DIAG MOB: tempo entre diagnóstico e mobilização; CHOP:
ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisolona; CHOEP: ciclofosfamida, doxorrubicina,
vincristina etoposídeo e prednisolona; DHAP: dexametasona, alta dose de arabinosídeo-C (ARAC); ABVD: adriamicina, bleomicina, vinblastina e dacarbazina; BFM: protocolo Berlim-FrankfurtMunique:
daunorrubicina,
L-asparaginase,
metotrexate
R-ICE:
rituximabe
-
iofosfamida,
carboplatina e etoposídeo; RT: radioterapia; HD ARA-C: dexametasona, alta dose de
arabinosídeo-C
(ARA-C);
D3A7:
(Daunoblastinax3,
Arabinosídeo-cx7);
VAD:
vincristina,
doxorrubicina e dexametasona; RC: Remissão completa; RP: Remissão Parcial; DP: Doença
progressiva.
Materiais e Métodos
34
3.3.2 Linfoma Não-Hodgkin (LNH)
1. Foram candidatos ao TMOA àqueles pacientes com LNH agressivos em
primeira recaída QT sensível ou àqueles em primeira RC com índice de
prognóstico internacional (IPI) > 3.
2. Os pacientes tiveram o diagnóstico histológico e imunohistoquímico de acordo
com a classificação da “Organização Mundial de Saúde‟‟ (Harris et al.,1999). O
estadiamento clínico foi de acordo com Ann Arbor (Diebold 1988; Armitage 2005).
3. Os pacientes foram tratados com QT de 3ª geração: CHOP: ciclofosfamida,
doxorrubicina, vincristina e prednisolona; CHOEP: ciclofosfamida, doxorrubicina,
vincristina etoposídeo e prednisolona; R-ICE: rituximabe- ifosfamida, etoposida,
carboplatina; DHAP: dexametasona, cisplatina e citarabina (Miller et al.,1988;
Armitage et al.,1980; Jones et al.,1979).
Para os casos com doença “bulky” (grande massa com dimensão >10cm ou
superior a 1/3 do mediastino) ao diagnóstico, empregou-se a radioterapia regional
campo envolvido (Fisher et al.,1994; Shipp et al.,1999, Caballero et al.,1997).
4. Ao término da QT, os pacientes foram avaliados quanto à resposta clínica:
Remissão completa (RC): o total desaparecimento do tumor mantido por um
tempo mínimo de 4 meses.
Remissão parcial (RP): redução de pelo menos 50% da massa tumoral inicial.
Doença estável (DE): redução inferior a 25% da massa tumoral inicial, porém,
sem sinais de progressão.
Doença progressiva (DP): aumento de 25% ou mais da massa tumoral inicial,
durante a QT.
3.3.3 Linfoma de Hodgkin (LH)
1. Foram candidatos ao TMOA àqueles pacientes com LH em primeira recaída QT
sensível ou doença refratária.
2. Os pacientes tiveram o diagnóstico histológico e imunohistoquímico de acordo
com a classificação da “Organização Mundial de Saúde‟‟ (Harris et al.,1999). O
estadiamento clínico foi de acordo com Ann Arbor (Diebold 1988; Armitage 2005).
Materiais e Métodos
35
3. Os pacientes foram tratados com QT de 3ª geração: ABVD: doxorrubicina,
bleomicina, vinblastina e dacarbazina; ICE: ifosfamida, etoposida, carboplatina;
DHAP: dexametasona, cisplatina e citarabina (Miller et al.,1988; Armitage et
al.,1980; Jones et al.,1979).
Para os casos com doença “bulky” (grande massa com dimensão >10cm ou
superior a 1/3 do mediastino) ao diagnóstico, empregou-se a radioterapia regional
campo envolvido (Fisher et al.,1994; Shipp et al.,1999, Caballero et al.,1997).
4. Ao término da QT, os pacientes foram avaliados quanto à resposta clínica:
Remissão completa (RC): o total desaparecimento do tumor mantido por um
tempo mínimo de 4 meses.
Remissão parcial (RP): redução de pelo menos 50% da massa tumoral inicial.
Doença estável (DE): redução inferior a 25% da massa tumoral inicial, porém,
sem sinais de progressão.
Doença progressiva (DP): aumento de 25% ou mais da massa tumoral inicial,
durante a QT.
3.3.4 Leucemias
Os protocolos utilizados para tratamento de leucemias agudas basearamse em BFM: protocolo Berlim-Frankfurt-Munique: daunorrubicina, L-asparaginase,
metotrexate para leucemia linfóide aguda (LLA-L3) (Mayer et al.,1994; Steinbach
et
al.,2001);
R-CHOP
(ciclofosfamida,
adriamicina
(hidroxidaunorubicina),
vincristina, prednisolona e rituximab) (Ösby et al.,2003; Coiffier et al.,2002) para
leucemia linfóide crônica (LLC) e D3A7 (daunomicina e arabinosideo) + HD ARAC (alta dose de arabinosideo-C) (Velásquez et al.,1998) para as leucemias
mielóides agudas (LMA).
Ao término da QT, os pacientes foram avaliados quanto à resposta clínica:
Remissão completa (RC): contagem de células leucêmicas inferior a 5 % das
celularidade da MO, ausência de infiltração extra medular e desaparecimento
total das células leucêmicas no sangue periférico.
Falha de Remissão: contagem de células leucêmicas igual ou superior a 5 % das
celularidade da MO ou presença de infiltração extra medular ou presença de
células leucêmicas no sangue periférico.
Materiais e Métodos
36
3.4 Quimioterapia de mobilização de células-tronco hematopoéticas (CTHs)
Os pacientes elegíveis receberam QT de mobilização. No MM, a QT
consistiu
de
ciclofosfamida
5g/m2/EV
Preconizou-se
mesna,
em
doses
fracionadas como resgate, considerando-se 120% da dose total de ciclofosfamida.
Nos linfomas a mobilização se fez com DHAP ou ICE e G-CSF, na dose de 10
цg/Kg, administrado até o último dia da aférese. Nas leucemias, o esquema de
mobilização foi feito com ciclofosfamida na dose de 5g/m2, HD+ARA-C, ou
somente G-CSF (600ųg/dia). Em todos os pacientes, foi associado G-CSF na
dose 10 µg/Kg, iniciado no momento em que a contagem de leucócitos atingiu o
nadir de 1000/mm³ e mantido até o último dia da aférese.
Nos doadores, empregou-se G-CSF na mesma dose, por 5 dias, sendo as
aféreses realizadas no 4º e 5º dias após o início da administração do fator de
crescimento.
Em relação aos pacientes, quando houve recuperação hematológica após
nadir leucocitário, e quando o número de glóbulos brancos (GB) atingiu
2000/mm3, foi iniciada a quantificação seriada de células CD34+ no SP, através de
citometria de fluxo.
Quando o número absoluto de células CD34+ no SP foi superior a 15/mm3,
iniciou-se a primeira leucoaférese. Esses pacientes foram considerados bons
mobilizadores. Aqueles pacientes, que após quantificação seriada de células
CD34+ atingiram 10-15/mm3 e já contabilizaram um total de GB > 20.000/mm3,
foram considerados maus mobilizadores. Entretanto, foi realizada coleta por
aférese. Caso o rendimento de células CD34+, para esse último grupo, fosse
inferior a 2 x 106/Kg, foi coletado MO por aspiração em centro cirúrgico. Pacientes
que atingiram menos do que 10/mm3 células CD34+ em SP, com leucometria
superior a 20.000/mm3, foram considerados como falha de mobilização. Estes
realizaram coleta aspirativa de MO em centro cirúrgico.
3.5 leucoaférese de Grande Volume (LGV)
Imediatamente antes do procedimento de leucoaférese, os pacientes foram
avaliados quanto à necessidade de colocação de catéter central rígido de duplo
Materiais e Métodos
37
lúmen. As células foram coletadas, utilizando-se um processador automático de
sangue, modelo Spectra-Cobe (Cobe Lakewood, CO, USA).
Os pacientes foram submetidos a LGV, onde se processou 3 ou mais
volemias sanguíneas, calculadas a partir da fórmula de Nadler-Allen, inserida no
programa do equipamento. O anticoagulante utilizado é o ACD-A (ácido cítrico e
dextrose) na proporção de 15/1. Para prevenir hipocalcemia, utilizamos reposição
com gluconato de cálcio a 10%. Foram realizadas no máximo quatro sessões de
leucoaférese, com objetivo de se conseguir no mínimo, 3 x 10 6/Kg células CD34+.
Ao término da mobilização, foram caracterizados 3 grupos de pacientes,
de acordo com o número de células CD34+ no SP e o rendimento da LGV (Tabela
3).
Tabela 3. Classificação dos pacientes em relação à mobilização e rendimento de
células CD34+
CD34+/mm3 no sangue
CD34+ x 106/Kg no produto
periférico
de aférese
Bom mobilizador
> 15
Mau mobilizador
8-15
Falha de mobilização
<8
Bom rendedor
>2
Mau rendedor
<2
3.6 Criopreservação e armazenamento de CTH para TMOA
Alíquotas de 1 mL obtidas da bolsa que contém o produto final, foram
retiradas e distribuídas em tubos contendo EDTA. Uma amostra foi encaminhada
ao laboratório de citometria de fluxo para a contagem de células CD34+.
Realizamos esta contagem, através de terceirização de serviço, no Laboratório
Fleury nos casos do HSM. Os pacientes do HSP tiveram suas contagens de
células CD34+ realizadas no Laboratório de Citometria de Fluxo da Disciplina de
Hematologia da UNIFESP/EPM. Ambos os laboratórios já tiveram suas técnicas
padronizadas pelo método ISHAGE (Sutherland et al.,1996).
Materiais e Métodos
38
A bolsa que contém o produto de aférese foi centrifugada para obtenção do
concentrado celular. Este foi manipulado em fluxo laminar e dividido em alíquotas
de 15-40 mL, sendo transferido para bolsas próprias de congelamento (Cryosite
Freesing Bag- Baxter). A solução crioprotetora foi preparada em banho de gelo,
dentro do fluxo laminar e contem: 60% de meio de cultura TC 199 (Instituto Adolfo
Lutz), 20% de plasma autólogo e 20% de dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma) A
solução crioprotetora foi adicionada ao concentrado celular na proporção de 1:1.
O material criopreservado foi submetido ao congelamento automatizado a
10C/minuto até -400C e, após isso, 10o/minuto até -900C (Controling Freesing
Rate- Forma Scientific). Ao término, foi transferido para um freezer mecânico a 800C (Harris, USA) ou tanque de nitrogênio líquido a -1900C. Cada Instituição tem
sua própria Unidade de Criobiologia, onde se realizaram as fases de
congelamento e armazenamento das bolsas em freezer a -80oC ou tanques de
nitrogênio líquido. No HSP, a unidade de criobiologia é comum para os serviços e
Hematologia e Oncopediatria.
A MO coletada em centro cirúrgico foi centrifugada da mesma forma
descrita para as células obtidas pela leucoaférese. Geralmente duas ou mais
centrifugações foram necessárias, para a completa remoção da camada
leucocitária. Todas as outras etapas da criopreservação foram idênticas ao que foi
descrito para o produto da leucoaférese, exceto a recuperação das células
mononucleares.
Os pacientes candidatos ao TMOA foram previamente analisados quanto
às características clínicas e laboratoriais da doença de base, tipo e intensidade
dos tratamentos anteriores, funções orgânicas diversas, situação clínica atual e
escolha dos regimes de condicionamentos. Os pacientes de cada instituição
realizaram os transplantes nas suas respectivas unidades, bem como o processo
de mobilização, coleta e criopreservação de células-tronco do sangue periférico
(CTSP) ou de células-tronco de medula óssea (CTMO).
Materiais e Métodos
39
3.7 Métodos
3.7.1 Coleta e processamento das amostras
Foram obtidos aproximadamente de 25 mL de MO em quatro ou mais
posicionamentos em crista ilíaca. O produto do aspirado foi empregado para
separação das células mononucleares (CMN) por Fycoll-Hypaque (Gibco, Grand
Island, NY, E.U.A; densidade de 1,077). A viabilidade celular das CMN foi
determinada utilizando azul de trypan (Sigma) e a contagem feita em câmara de
Neubauer e contador automatizado Cell-Dynn 3.500 (Abbott). O procedimento de
criopreservação utilizou uma solução com 10% de DMSO (Sigma), 50% de soro
fetal bovino (Cultilab) e 40% de meio RPMI (Sigma), em nitrogênio líquido (196ºC). O descongelamento foi realizado rapidamente (em até três minutos) em
banho-maria a 37ºC. Após, o degelo, as células foram lavadas 3 vezes em meio
de cultura e novamente tiveram sua viabilidade e contagem analisadas.
3.7.2 Separação de células CD34+
Uma alíquota de aproximadamente 1mL de CMN foram separadas por
seleção positiva através do método de coluna imunomagnética utilizando
anticorpo anti-CD34+ (MidiMACS -Miiltenyi Biotec).Em seguida as células foram
contadas em câmara de Neubauer e criopreservadas com uma solução
crioprotetora com DMSO 10% em nitrogênio líquido.
3.7.3 Culturas de estroma de MO de longa permanência
As CMN previamente congeladas ou obtidas a fresco foram utilizadas para
o estabelecimento da camada aderente (estroma), plaqueando-se as células em
uma concentração de 2x106/mL em placas de cultura (Chamber slides BD) em 2
mL de meio Iscove‟s (Sigma) com 10% de soro fetal bovino (Cultilab), 15% de
soro eqüino (Gibco, Grand Island, NY, E.U.A), 5x10-5 mmol de hidrocortisona
(Sigma),
em uma atmosfera de 5% de CO2, a 33ºC . O meio foi trocado
parcialmente (metade) uma vez por semana. O estabelecimento do estroma foi
acompanhado,
semanalmente
em
microscópio
invertido,
crescimento celular, modificação da estrutura e confluência
anotando-se
o
Materiais e Métodos
40
3.7.3.1 Análise da formação da camada estromal
A capacidade de formação da camada estromal foi avaliada através das
culturas de longa permanência. Realizou-se uma análise subjetiva da confluência
(crescimento celular organizado do estroma) visualizada semanalmente nas
placas de cultura. Estipulou-se um crescimento maior ou igual a setenta por cento
(≥ 70%) para culturas confluentes e menor que setenta por cento (< 70%) como
ausência de confluência (López-Holgado et al., 2005; Lanza et al., 2001; Dexter et
al.,1977).
Os padrões dos dois tipos de cultura estão representados na figura 5.
As culturas A e B demonstram celularidade baixa, sendo constituídas por
dois tipos celulares: o primeiro tipo apresentando aspecto fibroblastóide e o
segundo tipo apresentando células grandes com aspecto de macrófagos.
As culturas C e D demonstram uma formação da camada confluente do
estroma, apresentando grande quantidade de células com aspecto de
fibroblastos, adipócitos, macrófagos, algumas células hematopoéticas pequenas e
redondas e presença de áreas de “cobblestone” (área da placa recoberta por
células justapostas).
Todas as culturas que não atingiram a confluência foram mantidas até o
desaparecimento de todas as células (morte da cultura). Aquelas que não
morreram foram mantidas até a décima quarta semana para observação de
confluências tardias.
Em relação às culturas confluentes, estas foram observadas até o
momento em que a formação da camada de estroma demonstrou confluência
maior ou igual a 70% e utilizadas para outras análises.
Uma cultura de células de MO de doador normal foi mantida como controle
para meios de cultura e procedimentos. Esta cultura permaneceu com a
confluência máxima por nove meses.
Materiais e Métodos
A
B
C
D
Figura 5. Características morfológicas da confluência da camada do
estroma. A e B: Representação de culturas de longa permanência de
amostras de medula óssea de dois pacientes que não atingiram a
confluência mínima (< 70%); formação da camada estromal incompleta.
Análise realizada na quinta e quarta semanas pré-mobilização,
respectivamente. C e D: Representação de culturas de longa permanência
de amostras de medula óssea de dois pacientes que atingiram a confluência
mínima (≥ 70%); formação da camada estromal completa. Terceira e quarta
semanas pós-mobilização, respectivamente.
Fotomicrogafia de cultura de medula óssea de longa permanência.
Microscopia de contraste de fase de campo invertido (aumento 10X).
41
Materiais e Métodos
42
3.7.3.2 Análise da velocidade de formação da camada estromal
A velocidade de estabelecimento da camada estromal de amostras de
pacientes e controles, foi avaliada observando-se o crescimento e proliferação
dos fibroblastos, adipócitos e células hematopoéticas nas culturas de longa
permanência semanalmente, de forma subjetiva em microscópio invertido de
contraste de fase. Esta análise baseou-se em um sistema de escores seguindo
em parte o modelo de Domenech et al. (1994).
Sistema de escores da distribuição celular em cultura de estroma de longa
permanência.
Escore 0: nenhuma célula visualizada
Escore 1: raras células visualizadas
Escore 2: freqüentes células visualizadas
Escore 3: numerosas células visualizadas
Escore 4; abundantes células visualizadas
O sistema de escores exemplificando cada tipo celular adipócitos, fibroblastos,
células vivas e células mortas e seu respectivo escore está demonstrado na figura
6.
3.7.4 Co-cultura de Estroma de MO e Células CD34+
Após o estabelecimento do estroma, a camada de células foi irradiada com
15Gy (Irradiador: Gama Cell; Fonte:Césio137), na velocidade de aproximadamente
4Gy/minuto, com intuito de eliminar as células hematopoéticas. Metade do meio
das placas de cultura foi removido (1mL). As células CD34 + previamente
descongeladas e lavadas foram resuspendidas em 1mL de meio Iscove‟s e
inoculadas em uma concentração de 1 a 5x104/mL na camada de estroma
irradiada. (Castro-Malapsina et al.,1980; Coutinho et al.,1990;
al.,2000).
1993; Dürig et
Materiais e Métodos
A
B
C
D
E
F
G
H
Figura 6. Sistema de escore da distribuição celular em LTBMC.
(A) Escore 1: raros adipócitos; (B) Escore 2: frequentes adipócitos; (C) Escore
3 numerosos adipócitos; (D) Escore 4: abundantes adipócitos. (E) Escore 1:
raros fibroblastos; (F) Escore 2: frequentes fibroblastos; (G) Escore 3
numerosos fibroblastos; (H) Escore 4: abundantes fibroblastos.
Fotomicrogafia de cultura de medula óssea de longa permanência.
(Microscópio invertido de contraste de fase; Aumento 10x).
43
Materiais e Métodos
44
O modelo seguido para análise de sustentação do estroma e capacidade
de proliferação das células CD34+ foi o descrito abaixo:
1. Estabelecimento de cultura de estroma de células dos pacientes em dois
estágios pré e pós-mobilização para TMOA
1.2. Co-cultura em estroma de pacientes pré-estabelecidos: inoculação de células
CD34+ de doadores saudáveis, seguido de análise de proliferação através de
contagem de clusters e colônias de células hematopoéticas.
2. Estabelecimento de culturas de células do estroma de células de doadores
normais, em dois estágios, pré e pós-mobilização para TMO alogênico.
2.2. Co-cultura em estroma de doadores normais: inoculação de células CD34 + de
pacientes, seguido de análise de proliferação através de contagem de “clusters” e
colônias de células hematopoéticas (Figura 7).
3.7.5 Ensaios clonogênicos
O ensaio clonogênico GEMM-CFC foi realizado a partir dos estromas
irradiados e co-cultivados com células CD34+.Os estromas co-cultivados foram
tripsinisados no 21º dia e plaqueados numa concentração de 1 a 5x105/mL em
placas de cultura de plástico de 35mm (Nunc, IL, E.U.A) contendo metilcelulose
(Fisher, 4000centipoises, N J, E.U.A), 30% de soro bovino fetal (Gibco, Grand
Island, NY, E.U.A), 1% de albumina bovina sérica (Boeringher-Manhein, IN,
E.U.A.), solução de 10-4M de metilprednisolona (Abbott, São Paulo),solução de
10-2 de 2-mercaptoetanol (Gibco, Grand Island, NY, E.U.A), sendo as células
estimuladas com os fatores de crescimento GM-CSF, G-CSF e IL-3
na
concentração de 10ng/mL, EPO 4UI previamente padronizadas. O controle
negativo era composto de todos os reagentes e células, exceto citocinas. Os
ensaios semi-sólidos foram analisados qualitativamente e quantitativamente de
acordo com o número de “clusters” e colônias em intervalos de 5, 10 e 15 dias. Os
“clusters” foram considerados como formações de duas a quarenta e nove células
unidas, e as colônias sendo as formações com mais de cinqüenta células. As
colônias foram definidas pelo seu aspecto morfológico de acordo com critérios
pré-estabelecidos, como sendo GM-CSF (granulócitos e/ou macrófagos), G-CFU
Materiais e Métodos
45
(granulócitos), CFU-E (células eritróides) e CFU-Mix aquelas com colônias mistas
(Scheinkönig et al., 2004; Metcalf et al, 1979).
CÉLULA CD34+ DOADOR PRÉ
CÉLULA CD34+ DOADOR PÓS
1
ESTROMA IRRADIADO PACIENTE PRÉ
ESTROMA IRRADIADO PACIENTE PÓS
CÉLULA CD34+ PACIENTE PRÉ
CÉLULA CD34+ PACIENTE PÓS
2
ESTROMA IRRADIADO DOADOR PRÉ
ESTROMA IRRADIADO DOADOR PÓS
Figura 7: Modelo de co-cultura de estroma de medula óssea e células CD34+.
Esquema 1: Estroma de paciente e células CD34+ de doadores nas fases pré e pósmobilização
Esquema 2: Estroma de doadores e células CD34+ de pacientes nas fases pré e
pós-mobilização.
Materiais e Métodos
46
3.7.6 Análise histopatológica das biópsias de medula óssea
Os fragmentos ósseos obtidos por biópsia de medula óssea (BMO) foram
fixados em formalina 10%, posteriormente emblocados em parafina. Foram feitos
cortes de 3 µm para análise estrutural através dos seguintes métodos:
Hematoxilina/Eosina (HE), Giemsa e impregnação pela prata (Reticulina). A
análise histopatológica da MO segue critérios pré-definidos e mundialmente
padronizados (Tuzuner & Bennett,1994). A fibrose foi caracterizada pela presença
da reticulina, agrupando-se os pacientes classificados como normais: normal e
grau I: até 5% da área da MO e entre 5-25% de fibras finas respectivamente; e
aumentada: graus II e III: 25-50% de fibras espessas com eventuais feixes e
>50% de fibras espessas com formação de feixes (Bauermeister 1971). A leitura
dos cortes foi interpretada por dois pesquisadores em momentos distintos,
obedecendo a uma sistemática de análise do laboratório de Histologia de Medula
Óssea do Laboratório de Patologia Investigativa do Departamento de Patologia da
UNIFESP/EPM.
3.8 Análise estatística
A análise estatística foi realizada através de modelos de regressão
logística,
análise
de
unidimensional
e
multidimensional
e
análises
de
sobrevivência. Os programas utilizados foram R 2.4.0 ,SPSS 11.5 for Windows,
SAS 9.1 for Windows e Minitab 14. Foram considerados significantes valores de
P<0,05. As análises foram realizadas pelo Instituto de Matemática e Estatística
(IME) da Universidade de São Paulo (USP).
Resultados 47
4. RESULTADOS
4.1 Tratamento quimioterápico prévio e mobilização
Os primeiros parâmetros analisados foram relativos aos tratamentos
quimioterápicos empregados nas diferentes doenças onco-hematológicas para
indução à remissão. A importância dessa análise refere-se aos possíveis danos
ao estroma causados pela quimioterapia, pois aqueles pacientes que recebessem
maior quantidade de ciclos durante um tempo mais longo estariam sujeitos a
maiores danos celulares. No grupo estudado não houve diferenças estatísticas
significativas entre as doenças (p>0,05) tanto em relação ao tempo decorrido
entre o diagnóstico e a mobilização, quanto à quantidade de ciclos de
quimioterapia empregados (Tabela 4).
Tabela 4. Pacientes relacionados com a mediana de idade, média de tempo entre
diagnóstico e mobilização e ciclos de quimioterapia (QT) prévia ao TMOA.
Nº
IDADE*
TEMPO DIAG E MOB**
CICLOS **
DOENÇA
PACIENTES
(anos)
(meses)
DE QT
LNH
5
42
16
10
LH
6
25
20
10,5
LEUCEMIAS
7
24
11
4,1
MIELOMAS
4
55
22
5,7
TOTAL
22
33
17
7,7
* Mediana; ** Média; Tempo entre diagnóstico e mobilização para TMOA; QT:
quimioterapia.
A quantidade de células CD34+ presente no sangue periférico dos
pacientes após a quimioterapia de mobilização acrescida do fator de crescimento
é o parâmetro utilizado para avaliação do status de mobilização. A mensuração
destas células no produto de aférese fornece dados relativos ao rendimento após
a coleta. A tabela 5 demonstra as contagens de células CD34 + no sangue
periférico e no produto de aférese, correlacionadas com o número de pacientes
Resultados 48
por grupo, classificados como falha de mobilização. Para fins estatísticos o
doador que apresentou mau rendimento foi classificado como falha de
mobilização.
De acordo com a classificação dos pacientes em relação ao status de
mobilização, foi observado que aproximadamente a metade dos pacientes
apresentou sucesso no procedimento (bons mobilizadores) e metade obteve um
pior desempenho (maus mobilizadores e falha de mobilização). Os controles
foram avaliados apenas em relação ao rendimento das células CD34 +,e dentre
estes apenas um não obteve um rendimento satisfatório, sendo classificado com
mau rendedor. A distribuição de acordo com o status de mobilização e rendimento
está demonstrada nos gráficos 1 e 2.
Tabela 5. Média de rendimento de células CD34
leucoaférese.
+
no sangue periférico e no produto da
+
Células CD34
Diagnóstico
Falha de
Mobilização e
Mau Mobilizador
n
Mobilização
Sangue Periférico
3
(células /mm )
Rendimento
Leucoaférese
3
(células/mm )
Doadores
10
-
13/12
1
Leucemias
6
21/9
5/5
3
Linfoma Não-Hodgkin
5
43/6
14/14
4
Linfoma de Hodgkin
6
18/19
4/4
2
48/23
8/4
1
Mieloma Múltiplo
4
SP: sangue periférico; *Média/Mediana.
Resultados 49
Porcentagem de pacientes em relação ao status de
mobilização. Dados relacionados com a contagem de células
CD34+ no sangue periférico.
Gráfico 1.
2. Porcentagem de doadores em relação ao
rendimento de células CD34+ no produto de leucoaférese.
Gráfico
Resultados 50
4.2. Análise da Hematopoese: Formação da camada estromal
Primeiramente foram empregados estudos funcionais de formação do
estroma, através de culturas de longa permanência, antes da mobilização. Este
procedimento teve o intuito de descartar danos prévios ao estroma causados pelo
tratamento quimioterápico de indução à remissão, correlacionando às alterações
encontradas apenas com o processo de mobilização.
Analisando de forma geral as duas fases não houve diferença significativa.
Dos 32 indivíduos estudados (22 pacientes e 10 controles), 21 amostras (66%)
atingiram confluência ≥ 70% na fase pré-mobilização; e 11 de 27 (34%) na fase
pós-mobilização (p=0,14).
Estratificando os grupos como “controles” e “pacientes”, os resultados
encontrados foram distintos. Os controles apresentaram a formação da camada
estromal em quase todas as amostras no período pré-mobilização, e uma
diminuição importante na fase pós-mobilização (p=0,03). Analisando os pacientes,
o comportamento do crescimento celular foi semelhante para as duas fases
(Gráfico 3)
Os resultados encontrados na análise geral do grupo de pacientes
demonstrados no gráfico acima revelam que não houve alteração funcional
aparente causada pelo processo de mobilização. Entretanto, quando foram
analisadas separadamente as amostras do grupo dos “pacientes” por doenças
(LNH, DH, MM e leucemias), foi observada uma tendência das amostras dos
pacientes de LNH, a terem pior desempenho na fase pós-mobilização, porém sem
diferenças estatísticas significativas. (Gráfico 4).
Resultados 51
Formação do estroma: Amostras de controles e
pacientes que atingiram a confluência mínima nas fases pré e pósmobilização.
Gráfico 3.
Formação da camada estromal: Amostras de pacientes
separadas por doenças que atingiram a confluência mínima nas
fases pré e pós-mobilização.
Gráfico 4.
Resultados 52
4.2.1. Formação da camada estromal e análise histopatológica da MO
A análise histopatológica da medula óssea segue critérios pré-definidos e
mundialmente padronizados. Levando-se em conta que danos à medula óssea
causados pelo tratamento quimioterápico prévio podem ser detectados através da
avaliação de parâmetros como celularidade global, celularidade da série branca,
fibrose e infiltração neoplásica, correlacionaram-se estes dados com a
capacidade de formação da camada estromal. Exemplos das análises estruturais
das biópsias de medula óssea de pacientes e doadores estão representadas nas
figuras 8 e 9.
De forma geral os pacientes estudados apresentaram diminuição da
celularidade da medula óssea, ou seja, a avaliação subjetiva a celularidade global
foi menor que 30%; tanto na fase pré (71% das amostras de pacientes) como na
fase pós-mobilização (52% das amostras de pacientes). A presença de fibrose
medular, caracterizada pela presença de reticulina esteve aumentada em quase
todas as amostras de pacientes nas duas fases da mobilização (76% e 71% das
amostras de pacientes, respectivamente). A celularidade da série branca
apresentou-se diminuída em 43% das amostras dos pacientes na fase prémobilização, e na fase pós-mobilização apesar do estímulo com fator de
crescimento, 14% das amostras de pacientes apresentaram diminuição da série
branca. A infiltração neoplásica foi detectada em 43% das amostras dos
pacientes, sendo que um dos pacientes apresentou doença progressiva no
momento da análise e foi excluído do estudo (Tabela 6). Não houve alterações
significativas nestes parâmetros avaliados entre a fase pré e pós-mobilização, o
que sugere que, estruturalmente a quimioterapia de mobilização mais o uso do
fator de crescimento não causaram danos além daqueles já existentes na MO.
Avaliando os grupos de doenças, observa-se que as amostras dos
pacientes com LNH e MM apresentaram celularidade mais baixa, fibrose
aumentada e infiltração neoplásica mais frequente nas biópsias de MO, tanto na
fase pré como na fase pós-mobilização (Tabela 7).
Resultados 53
I. MO Hipocelular LNH Pré (HE/10X)
II. MO Hipocelular LNH Pré (HE/10X)
III. MO Hipocelular LNH Pós (HE/40X)
IV. MO Hipercelular LMA Pré (HE/40X)
V. MO Hipercelular Doador Pós (HE/10X)
VI. MO Hipercelular Doador Pré (HE/40X)
Figura 8. Celularidade Global da Medula Óssea: I-III: medula óssea hipocelular
representada por escasso tecido hematopoético, substituído pro tecido adiposo (setas
pretas).
IV-VI: medula óssea hipercelular representada por abundante tecido hematopoético
(setas vermelhas) e menor quantidade de tecido adiposo.
Fotomicrografia de cortes histológicos de biópsias de medula óssea corados com H/E
(hematoxilina/eosina). Microscópio óptico comum. (Aumentos 10X e 40X)
Resultados 54
VII. MO Infiltrada MM Pré (HE/10X)
VIII. MO Infiltrada MM Pré (HE/40X)
IX. MO Infiltrada MM Pré (HE/100X)
X. Reticulina Normal LMA Pré (10X)
XI. Reticulina Grau I MM Pré (10X)
XII. Reticulina Grau II. LNH Pós (10X)
Figura 9. Infiltração e Fibrose:
VII-IX: medula óssea infiltrada por células neoplásicas (plasmócitos/setas).
X-XI: coloração da reticulina para detecção de fibrose normal, graus I e II.
Fotomicrografia de cortes histológicos de biópsias de medula óssea corados
com H/E (hematoxilina/eosina); Impregnação pela prata (reticulina).
Microscópio óptico comum. Aumentos: 10X, 40X e 100X.
Resultados 55
Tabela 6. Parâmetros estruturais analisados das biópsias de MO de pacientes nas fases pré e
pós-mobilização.
Doença
ID
Celularidade (%)
Biópsias de Medula Óssea (BMO)
Fibrose
Celularidade Série Branca (Reticulina)
Pré
Pós
Pré
Pós
Pré
Pós
Pré
Pós
Infiltração
Pré
Pós
LNH
P1
20
30
D
NA
D
A
A
N
Negativa Negativa
LNH
P2
20
NA
D
NA
D
D
A
A
Positiva
Positiva
LNH
P3
15
5
D
D
N
D
A
N
Positiva
Positiva
LNH
P4
15
70
D
A
N
A
A
A
Negativa Negativa
LNH
P5
15
40
D
N
N
N
A
A
Positiva
Positiva
LH
P6
5
10
D
D
D
A
NA
A
Positiva
Positiva
LH
P7
NA
20
NA
D
NA
N
A
A
Positiva
Positiva
LH
P8
10
10
D
D
N
A
A
A
Positiva
Positiva
LH
P9
20
50
D
A
N
A
A
A
Negativa Negativa
LH
P10
NA
20
NA
D
NA
A
NA
A
Negativa Negativa
LH
P11
20
70
D
A
D
N
NA
N
Negativa Negativa
LLA-L3
P12
30
30
D
D
N
A
A
N
Negativa Negativa
LMA-M2
P13
50
70
N
A
N
A
A
A
Negativa Negativa
LMA-M2
P14
15
15
D
D
N
A
A
A
Negativa Negativa
LMA -M0
P15
40
40
N
N
D
A
N
A
Negativa Negativa
LLC atípica
P16
20
15
N
D
N
A
A
A
Negativa Negativa
LMA após
SMD
P17
70
NA
A
NA
A
NA
A
NA
Negativa Negativa
LMA-M1
P18
NR
NA
NA
NA
NR
NA
NR
NA
Positiva
MM
P19
NA
30
NA
N
D
A
A
A
Negativa Negativa
MM
P20
15
20
D
N
D
D
A
N
Positiva
Positiva
MM
P21
20
10
N
D
D
A
A
A
Positiva
Positiva
MM
P22
5
5
D
D
D
D
N
N
Negativa Negativa
NA: não analisado; D: diminuída; A: aumentada; N: normal
*Paciente apresentando doença progressiva que não realizou coleta de biópsia de MO.
Positiva
Resultados 56
Tabela 7. Parâmetros analisados das biópsias de MO por grupo de pacientes nas fases
pré e pós-mobilização.
Biópsias de Medula Óssea
Celularidade
Média (%)
Doença
Linfoma Não-Hodgkin
Fibrose Aumentada*
(Reticulina – Graus II e III)
Presença de
Infiltração**
Pré
Pós
Pré
Pós
Pré
Pós
17
36,2
5 (5)
3(5)
3(5)
3(5)
Doença de Hodgkin
13,7
30
3(3)
5(6)
3(6)
3(6)
Leucemias
37,5
34
5(6)
4(5)
1(7)
1(7)
Mieloma Múltiplo
13,3
16,2
3(4)
2(4)
2(4)
2(4)
* Total de amostras de BMO por grupo, apresentando fibrose aumentada em relação ao
total de pacientes (entre parênteses); ** Infiltração neoplásica positiva em BMO, em
relação ao total de pacientes (entre parênteses).
Correlacionando os dados das biópsias de medula óssea com o
estabelecimento da camada estromal nas culturas de estroma de longa
permanência, observamos que os parâmetros celularidade da série branca e
infiltração não influenciaram significativamente no crescimento celular (p>0,05). A
celularidade global diminuída, entretanto, demonstrou uma tendência de menor
capacidade de formação da camada estromal, principalmente na fase prémobilização (Gráficos 5 e 6).
A fibrose mostrou maior influência na formação da camada estromal
(p=0,11), pois 73% (8/11) e 62,5% (10/16) das amostras que não atingiram a
confluência mínima nas culturas de longa permanência nas fases pré e pósmobilização, respectivamente, apresentaram fibrose aumentada (graus II e III);
(Gráfico 7). Pacientes que apresentaram medula óssea com fibrose aumentada
ou
celularidade
global
diminuída
demonstraram
menor
capacidade
de
estabelecimento do estroma, sugerindo que o dano quimioterápico prévio possa
afetar estruturalmente e funcionalmente o microambiente medular. Entretanto,
entre os períodos de mobilização não foram observadas diferenças estatísticas
significativas entre os parâmetros histopatológicos (BMO) e o estudo funcional
realizado através das culturas de longa permanência.
Resultados 57
Gráfico 5. Deficiência de formação da camada estromal: amostras de controles e
pacientes relacionada com a infiltração de doença na MO nas fases pré e pósmobilização.
Gráfico 6. Deficiência de formação da camada estromal: amostras de
controles e pacientes relacionada com a celularidade global da MO nas fases
pré e pós-mobilização.
Resultados 58
Gráfico 7. Deficiência de formação da camada estromal: em relação à fibrose
da MO nas fases pré e pós-mobilização.
4.2.2. Formação da camada estromal e mobilização de células CD34+
A mobilização de células CD34+ foi correlacionada com a capacidade de
formação da camada estromal nas culturas de estroma de longa permanência. Os
pacientes classificados como falha de mobilização e maus mobilizadores foram
reunidos no grupo de “maus mobilizadores” (< de 15 células CD34+/mm3 no
sangue periférico) e o grupo daqueles que obtiveram mais de 15 células
CD34+/mm3 no sangue periférico, como “bons mobilizadores”. Estratificamos por
grupos de doenças e observamos que não houve diferença significativa na
formação da camada estromal entre bons e maus mobilizadores, tanto na fase pré
como na fase pós-mobilização.
Resultados 59
4.2.3.Velocidade de formação da camada estromal
A velocidade de formação da camada estromal foi analisada semanalmente
de acordo com o surgimento das células estromais e o respectivo escore. De
forma geral, o velocidade de formação da camada estromal foi maior na fase prémobilização, tanto para controles, quanto para as doenças. Observa-se
claramente que o grupo controle teve o crescimento mais rápido na fase pré- e
mais lento na fase pós-mobilização. Na figura 10 (A e B) estão apresentadas as
estimativas de Kaplan-Meier (Moeschberger & Klein,1997) para as curvas de
recuperação medular (estabelecimento do estroma) dos pacientes e doadores
acompanhados.
Analisando os tipos de doenças nota-se uma tendência das leucemias a
um crescimento mais rápido na fase pós-mobilização, porém devido à quantidade
das amostras analisadas não foram possíveis análises conclusivas das demais
doenças.
Os fatores que influenciaram na velocidade do estabelecimento da camada
estromal, ou seja, os tipos celulares e a influência destes na formação do estroma
foram examinados através de análise multivariada. Observou-se que apenas a
quantidade de fibroblastos e adipócitos (p=0,01) interferem no aumento da
velocidade na fase pré-mobilização. Na fase pós-mobilização a única variável com
influência positiva significativa foi os fibroblastos (p<0,001). Avaliando o grupo dos
doentes separadamente observamos também a quantidade de fibroblastos
(p=0,002) e a infiltração de células neoplásicas na medula óssea (p=0,12)
interferindo de forma positiva e negativa respectivamente na velocidade de
estabelecimento do estroma na fase pré-mobilização. Na fase pós-mobilização
das amostras de doentes analisados apenas os fibroblastos (p=0,002) mostraram
influência positiva na velocidade de estabelecimento do estroma
Resultados 60
PRÉ-MOBILIZAÇÃO
1.0
DOENÇA
A
PACIENTES
.8
CONTROLES
.6
0.4
MIELOMAS
.2
LEUCEMIAS
LINFOMAS
0.0
-.2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
TEMPO (SEMANAS)
PÓS-MOBILIZAÇÃO
DOENÇA
1.0
CONTROLES
B
PACIENTES
.8
.6
MIELOMAS
.4
LEUCEMIAS
.2
LINFOMAS
0.0
-.2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
TEMPO (SEMANAS)
Figura 10: Velocidade do estabelecimento da camada estromal.
Estimativas de Kaplan-Meyer para recuperação medular (estabelecimento
do estroma) nas fases Pré-Mobilização (A) e Pós-mobilização (B).
Resultados 61
4.3. Co-cultura e ensaios clonogênicos
As culturas de longa permanência que atingiram a confluência mínima de
70% (formação completa da camada estromal) foram irradiadas e co-cultivadas
com células CD34+. No entanto, uma parte significativa quantidade das culturas
iniciadas, principalmente amostras de doentes, não formaram uma camada
estromal completa. Dessa forma o esquema inicialmente proposto de análise
comparativa
entre
estroma
e
células
CD34+
não
pode
ser
aplicado
completamente.
O tempo decorrido entre o estabelecimento da camada estromal, a cocultura e o ensaio clonogênico teve duração de aproximadamente sete meses.
Infortunadamente parte das culturas que tiveram seguimento até a última etapa,
que eram manipuladas em estufa multiusuário, foram contaminadas por fungos na
fase final da análise. Devido ao número reduzido de amostras analisadas,
nenhum modelo estatístico pôde ser empregado para demonstrar as tendências
de crescimento observadas.
As células progenitoras hematopoéticas formadas por colônias de
macrófagos, granulócitos eritrócitos e mistas foram analisadas qualitativamente e
quantitativamente no 7º, 14º e 21º dias de cultura (Figura 11). Um ensaio
utilizando estroma e células CD34+ provenientes de controle normal prémobilização, apresentou formação de todos os tipos de colônias. Este ensaio foi
empregado como controle do experimento para descartar possíveis erros de
execução técnica.
No segmento da análise, três ensaios não apresentaram crescimento de
nenhum tipo de colônia. Um estroma de amostra de paciente de MM com célula
CD34+ autóloga e dois estromas de amostras de controles normais com células
CD34+ de paciente LLA e LH.
Os estromas formados por amostras de dois pacientes com MM e LH cocultivado com células CD34+ autólogas na fase pós-mobilização, apresentaram
crescimento de todas as colônias, obtendo resultados inferiores somente ao
controle normal. O mesmo comportamento foi observado no estroma de um
paciente com MM co-cultivado com células CD34+ de controle pós-mobilização.
Resultados 62
A
B
C
D
E
F
G
I
Figura 11. Ensaios clonogênicos após co-cultura de estroma de medula óssea
com células CD34+.
(A) e (B): Colônias de CFU-E; (C) e (D): Colônias de CFU-G; (E) e (F): Colônias de
CFU-GM; Colônias de CFU-Mix.
Fotomicrogafia de cultura semi-sólida em metilcelulose. Microscópio invertido
de contraste de fase. A-F: Aumento 20X; G e H: Aumento 40X
Resultados 63
O maior crescimento de todos os tipos de colônia foi observado no estroma
de amostra de controle normal com célula CD34 + de LLC em remissão molecular
na fase pós-mobilização (Tabela 8).
Tabela 8. Ensaio clonogênico de co-cultura de estroma e células CD34+. Análise
qualitativa e quantitativa das colônias de células hematopoéticas progenitoras.
ESTROMA
CÉLULAS
CD34+
DOENÇA/FASE
DOENÇA/FASE
CFU-G
CFU-GM
CFU-M
CFU-MIX
CFU/
BFU-E
LNH-P2/PRÉ
LNH/P2PRÉ
1
0
0
0
0
LH-P10/PÓS
LH-P10/PÓS
350
40
50
30
70
MM-P5/PÓS
MM-P5/PÓS
410
20
20
90
680
LMA-P13/PÓS
DN-D6/PÓS
595
0
0
106
0
MM-P19/PRÉ
MM-P19/PÓS
0
0
0
0
0
MM-P19/PRÉ
DN-D6/PÓS
290
30
30
10
620
DN-D9/PÓS
LLC-P16/PÓS
1780
110
100
100
970
DN-D10/PRÉ
LLA-P12/PRÉ
0
0
0
0
0
DN-D10/PRÉ
LH-P6/PRÉ
0
0
0
0
0
DN-D10/PRÉ
DN-D10/PRÉ
680
70
120
110
840
COLÔNIAS
*CFU-G: Unidade formadora de colônia de granulócitos; CFU-GM: Unidade
formadora de colônia de granulócitos e monócitos; CFU-M: Unidade formadora de
colônia de macrófagos; CFU-E: Unidade formadora de colônia de eritrócitos; CFUMix: Unidade formadora de colônia de granulócitos, monócitos, macrófagos e
eritrócitos.
Resultados 64
4.4. Criopreservação
Em
outro
braço
deste
trabalho
analisou-se
comparativamente
o
comportamento celular do material em duas coortes, a primeira procedente de
material ensaiado a fresco (no momento da coleta) e a segunda coorte consistiu
de material submetido a criopreservação e posterior descongelamento.
Analisando de forma geral pacientes e controles na fase pré-mobilização,
observa-se que não existe diferença significativa (p>0,05) entre os grupos de
amostras criopreservadas e a fresco em relação à formação da camada estromal.
Na fase pós-mobilização verifica-se uma tendência das amostras criopreservadas
atingirem menos a confluência (Figura 12).
Formação da Camada Estromal
Pós-Mobilização
Pré-Mobilização

Amostras de MO a fresco

Amostras de MO criopreservadas
Figura 12. Porcentagem de amostras criopreservadas e a fresco que obtiveram
formação completa da camada estromal nas fases pré e pós-mobilização.
Estratificando em grupos de “doentes” e “controles” nas fases pré e pósmobilização, observa-se que não houve diferença significativa no crescimento da
cultura entre os dois grupos. Analisando os resultados dos dois grupos de
indivíduos em relação às fases de mobilização, também não foi constatada
diferença significativa entre o desempenho das amostras criopreservadas e a
fresco.
Resultados 65
Em relação aos grupos de indivíduos, o grupo controle apresenta uma
modificação do seu desempenho quando se compara as duas fases de
mobilização.
Na
fase
pós-mobilização,
os
controles
apresentam
menor
capacidade de formação da camada estromal tanto nas amostras criopreservadas
quanto nas amostras a fresco (Gráfico 8). Estes dados sugerem que possa existir
alguma interferência da utilização do fator de crescimento G-CSF na
funcionalidade das células estromais.
Gráfico 8. Análise comparativa da capacidade de formação da camada estromal:
por tipo de amostras (a fresco e criopreservadas) em relação aos grupos dos pacientes
e controles, nas fases pré e pós-mobilização.
Resultados 66
4.4.1. Análise comparativa entre amostras criopreservadas e a fresco e o
status de mobilização
Analisando o status de mobilização, observa-se que não existe diferença
significativa entre os doentes e controles classificados como “bons” e “maus”
mobilizadores em relação à formação da camada estromal de acordo com o tipo
de amostra estudada, a fresco ou criopreservada, tanto na fase pré como na fase
pós-mobilização. No entanto, parece haver uma tendência das amostras dos
maus mobilizadores de não formarem a camada estromal. Dos 21 indivíduos que
atingiram a confluência mínima na fase pré-mobilização, 14 eram bons
mobilizadores e 7 eram maus mobilizadores. Na fase pós-mobilização o
comportamento foi semelhante, do total de 11 indivíduos que atingiram a
confluência, 7 eram bons mobilizadores e 4 foram classificados como maus
mobilizadores (Figura 13).
Formação da Camada Estromal de Amostras Criopreservadas e A
Fresco
Pré-Mobilização
Pós-Mobilização
Figura 13. Correlação entre as amostras que obtiveram formação de camada
estromal completa em relação ao total de indivíduos estudados, analisadas por
tipo de amostra e status de mobilização nas fases pré e pós-mobilização.
Resultados 67
4.5. Situação atual dos pacientes estudados
Os pacientes que fizeram parte deste estudo foram acompanhados no
seguimento após o procedimento de mobilização. Do total de vinte e dois
pacientes estudados, 13 foram submetidos a TMOA. Destes, 7 encontram-se
vivos e sem doença detectável, e um recidivou. Cinco pacientes foram a óbito
após o transplante por recaída da doença e sepse. Os demais pacientes não
transplantaram e suas células CD34+ encontram-se criopreservadas, e poderão
ser utilizadas caso haja possibilidade futura de realização do TMOA. Os dados
relativos à situação atual dos pacientes estão descritos na tabela 9.
Tabela 9. Situação atual dos pacientes após a mobilização de células CD34 +.
DOENÇA
ID
DATA TMO
PEGA
SITUAÇÃO
ATUAL
LNH
P2
07/12/2005
D+6
VIVO
LNH
P5
15/03/2006
D+12
VIVO
LH
P8
29/06/2006
D+15
VIVO
LLA-L3
P12
27/12/2005
D+19
VIVO
LMA -M0
P15
12/06/2006
D+9
VIVO
LMA pós MDS
P17
07/03/2006
D+16
VIVO
MM
P19
07/04/2006
D+11
VIVO
MM
P20
02/06/2006
D+12
VIVO
LNH
P1
***
***
ÓBITO
ÓBITO NA MOBILIZAÇÃO
LH
P11
***
***
ÓBITO
NÃO TRANSPLANTOU
LH
P7
03/02/2006
D+12
ÓBITO
RECAÍDA
LH
P6
21/12/2006
D+11
ÓBITO
RECAÍDA
LMA-M1
P18
***
***
ÓBITO
NÃO TRANSPLANTOU
LH
P10
11/05/2006
D+10
ÓBITO
RECAÍDA
MM
P21
21/04/2006
D+16
ÓBITO
MM
P22
05/06/2006
D+12
ÓBITO
LNH
P4
***
***
***
NÃO TRANSPLANTOU
LNH
P3
***
***
***
NÃO TRANSPLANTOU
LH
P9
***
***
***
NÃO TRANSPLANTOU
LMA-M2
P14
***
***
***
NÃO TRANSPLANTOU
LLC atípica
P16
***
***
***
NÃO TRANSPLANTOU
LMA-M2
P13
***
***
***
NÃO TRANSPLANTOU
OBSERVAÇÃO
RECAÍDA 28/06/2009
ID: número de identificação do paciente;PEGA: data da pega medular;
Discussão
68
5. DISCUSSÃO
5.1 Capacidade e velocidade de formação da camada estromal
A qualidade e o número das CTHs podem ser avaliados in vitro por meio de
ensaios de progenitores hematopoéticos como as culturas em meio semi-sólido
com estímulo de citocinas e fatores de crescimento, ou culturas de medula óssea
de longa permanência. Além disso, estes ensaios fornecem uma avaliação
funcional do estroma medular, sua capacidade proliferativa e de manutenção da
hematopoese (López-Holgado et al.,2005; Lanza et al., 2001; Selleri et al., 1999).
A extensão dos danos causados à medula óssea pela quimioterapia e
radioterapia está relacionada à diminuição da quantidade de progenitores
hematopoéticos comprometidos. Consequências desta redução podem ser
observadas em análises histopatológicas de medula óssea através da presença
de diferentes graus de hipocelularidade global e da série branca. As células
estromais, no entanto, são menos sensíveis à ação da terapia citotóxica e da
radiação. Esta aparente resistência deve estar associada à baixa taxa de
renovação da medula óssea intacta, porém, após altas doses de quimio ou
radioterapia os componentes estromais podem apresentar sérios danos
funcionais e estruturais (van Hennik et al., 2000; Selleri et al., 1999; Del Cañizo et
al 1999; Galotto et al 1999; Domenech et al.,1994).
Diversos estudos funcionais realizados com portadores de doenças oncohematológicas
submetidos
a
transplante
de
medula
óssea
autólogo,
demonstraram que altas doses de quimioterapia causam danos não só nas CTHs,
mas também no microambiente medular. Entretanto, não se pode excluir que
estes danos funcionais possam ter sido causados pelo regime quimioterápico de
indução/consolidação ou pela agressividade hematológica da doença de base.
Estudos empregando culturas de longa permanência evidenciaram este ensaio
como fator prognóstico de recuperação hematológica de curto e longo prazo,
correlacionando a formação deficiente da camada estromal com uma pobre
reconstituição hematológica após transplante de medula óssea autólogo (Cashen
et al. 2007; van Hennik et al., 2000; Domenech et al., 1994; Gilabert & Ayats,
1994).
Discussão
69
Em nossa análise foi observada uma diminuição da capacidade de
formação do estroma após a mobilização nas amostras dos controles. Este
resultado pode estar associado ao fato que após a mobilização a quantidade de
células progenitoras imaturas está diminuída na medula óssea, sugerindo que
quanto maior a migração destas células para o sangue periférico, menor será a
quantidade de células progenitoras na medula óssea e como consequência
ocorrerá formação de um estroma mais deficiente. Uma vez que é sabido que a
recuperação hematológica é mais rápida quando se utiliza células progenitoras
mobilizadas quando comparada com células obtidas diretamente da MO,
pressupõe-se que seja porque o produto da leucoaférese deva conter uma
quantidade maior de progenitores que a MO após a mobilização (Cashen et
al.,2007; Theilgaard-Mönch et al., 1999). Esta hipótese pode ser corroborada pelo
estudo de López-Holgado et al. (2005) realizado com 72 doadores de MO para
transplante alogênico utilizando culturas de longa permanência e ensaios
clonogênicos. Eles observaram que as células do produto da leucoaférese
apresentaram uma recuperação hematológica mais rápida quando comparadas
com as culturas com células obtidas diretamente da medula óssea. Nesse mesmo
estudo, as características individuais foram correlacionadas com rendimento da
mobilização e capacidade proliferativa das células CD34 +. A variação mais
importante foi relacionada ao sexo dos pacientes e doadores: indivíduos do sexo
masculino apresentaram produção maior de todos os tipos de progenitores
hematopoéticos e melhor confluência na cultura de longa permanência. Todavia,
a variação da idade não apresentou diferença estatística significativa naqueles
doadores analisados. Em nossa análise, as características individuais dos
pacientes e doadores como idade e sexo não apresentaram diferenças
significativas na capacidade de estabelecimento do estroma, o que também foi
observado por Domenech et al.(1994) em seu estudo com pacientes portadores
de doenças hematológicas e tumores sólidos submetidos a TMOA.
Em nosso estudo as amostras de pacientes apresentaram aparente
diminuição da capacidade de formação da camada estromal quando comparados
com os controles na fase pré-mobilização. Estes resultados são confirmados em
parte pelo estudo de Lanza et al. (2001) que analisaram por meio de culturas de
longa permanência, ensaios de CFU-F (unidades formadoras de colônia de
Discussão
70
fibroblastos) e ensaios clonogênicos, amostras de MO de 34 pacientes portadores
de doenças hematológicas submetidos à TMOA. Eles demonstraram que houve
uma redução na quantidade de CFU-F e também na capacidade de formação da
camada estromal em relação aos controles normais. Neste estudo o tempo
decorrido entre mobilização e coleta de MO foi de quatro semanas, com intuito de
minimizar o efeito imediato citotóxico no microambiente medular causado pela
quimioterapia de mobilização. No entanto, em nosso estudo este efeito citotóxico
imediato não foi observado, pois as coletas de MO para análise da fase pósmobilização foram realizadas no dia da leucoaférese (após a quimioterapia de
mobilização e administração do fator de crescimento) e o comportamento das
culturas de longa permanência indicou formação da camada estromal semelhante
à fase pré-mobilização para o grupo dos pacientes, porém reduzida para o grupo
dos controles.
Dessa forma, como os controles foram submetidos somente à ação do GCSF, sugerimos outra hipótese relacionando o efeito negativo imediato do fator de
crescimento ao microambiente medular normal. A medula óssea intacta seria
mais suscetível à ação do G-CSF? Este possível dano funcional permaneceria no
microambiente medular de doadores normais, ou a medula óssea seria
completamente recuperada? Para elucidar estas questões seriam necessários
outros ensaios funcionais utilizando amostras de MO de doadores submetidos à
terapêutica de mobilização, após um período mais longo para recuperação
hematológica completa da medula óssea.
Estudos relacionados com o efeito do G-CSF pouco discorrem a respeito
da questão funcional relacionada ao microambiente hematopoético. Cashen et al.
(2007) em uma revisão sobre os efeitos fisiológicos e tóxicos do G-CSF e outros
fatores de crescimento empregados na mobilização das CTHs, descrevem como
toxicidade comum: febre, cefaléia, reação local e dor óssea; e como efeitos
tóxicos incomuns ruptura esplênica, trombose, surgimento de doenças autoimunes e precipitação de crises de falcização. Eles também sugerem a
necessidade de outros estudos que elucidem as interações entre as CTHs, o
microambiente medular e os efeitos dos fatores de crescimento empregados na
terapêutica de mobilização.
Discussão
71
Em relação às doenças analisadas separadamente observou-se em nosso
estudo um comportamento semelhante de formação da camada estromal nas
fases pré e pós-mobilização diferindo apenas nas amostras de MO de pacientes
portadores
de
LNH.
Recentes estudos empregando
culturas
de
longa
permanência e ensaios clonogênicos demonstraram que as CTHs de pacientes
com LNH difuso de grandes células B (LNH-DGCB) pós-quimioterapia,
apresentam uma proliferação deficiente quando comparadas à medula normal e
que a capacidade de formação do estroma está reduzida nas amostras de
pacientes em relação aos controles (Martínez-Jaramillo et al.,2004; HuertaZepeda et al.,2000). No nosso estudo este fato foi observado através do
insucesso na LTBMC, as amostras analisadas formaram uma camada estromal
deficiente na fase pré e nenhuma das amostras dos pacientes com LNH obteve
sucesso na formação do estroma na fase pós-mobilização, possivelmente devido
ao caráter agressivo das doenças analisadas.
As nossas amostras de controles apresentaram a maior velocidade de
formação do estroma antes da mobilização, ou seja, amostras de MO sem
nenhum tipo de doença hematológica e que não tiveram nenhum tipo de
manipulação. As leucemias apresentaram nas LTBMC características de
crescimento semelhantes aos controles. As pesquisas anteriores utilizando cultura
tipo Dexter com LMA são discrepantes. Ailles et al. (1997) estudaram o
comportamento de culturas de pacientes com LMA, demonstrando a manutenção
de células blásticas em longos períodos de cultura. Entretanto, Sparrow et al.
(1997), não obtiveram o mesmo desempenho na sustentação de culturas,
demonstrando uma aderência deficiente das células à placa de cultura,
desprendendo-se da camada aderente após alguns dias de cultivo em 50% dos
pacientes analisados. Interações anormais entre células hematopoéticas em
desenvolvimento e seu microambiente podem, ao menos em parte, causar a
saída prematura de blastos nas leucemias, mas ainda não está claro se um
microambiente medular “leucêmico” existe (Greenberger,1992; Liesveld et
al.,1993; Liesveld et al.,1994; Reuss-Borst et al.,1995; Reuss-Borst et al.,1992;
Teixidó et al.,1992; Diamond & Springer,1994).
As amostras de pacientes portadores de mieloma múltiplo apresentaram
um início de confluência mais rápido (segunda semana), porém esta era discreta
Discussão
72
e não foi superior a 30%. Visani et al.(1989) demonstraram que as LTBMC de
pacientes com mieloma múltiplo, eram capazes de sustentar a hematopoese por
quatro semanas sem a proliferação de células neoplásicas. Tal achado sugere
que este tipo de cultura fornece condições para crescimento seletivo de células
hematopoéticas normais, suprimindo o desenvolvimento de células plasmáticas
(Bloem et al., 1998). A quantidade de células mononucleares plaqueadas em
cultura foi de 2x106/mL. Devido ao fato das MO de dois pacientes estarem
infiltradas por plasmócitos, a quantidade real de células hematopoéticas normais
com capacidade de proliferação e sustentação do estroma podem ter sido
reduzidas, não sendo capazes desta forma de formarem uma confluência
adequada. Outra questão que pode ter contribuído para o insucesso da cultura, é
o tratamento prévio com radioterapia, uma vez que já é sabido que este
procedimento causa danos no microambiente medular (Galotto et al., 1999).
Observou-se ainda um aumento na quantidade de macrófagos nas culturas de
MM (dados não mostrados) em relação aos controles normais, fato este que
confirma estudos anteriores realizados por Faid et al. (1996), que observaram
48% de macrófagos presentes nas culturas de longa permanência de amostras de
pacientes com MM contra 30% dos controles, podendo este fato estar relacionado
com as interações das células neoplásicas do mieloma com o microambiente
medular.
Apesar de não terem sido encontradas diferenças significativas nos
parâmetros como fibrose, infiltração e celularidade da MO, pode-se supor que
essas características possam interferir na velocidade de estabelecimento do
estroma. As amostras de pacientes que apresentaram crescimento mais lento
possuíam fibrose e/ou hipoplasia de MO. A fibrose poderia causar uma dificuldade
na aspiração da MO, associada com a diminuição da celularidade que resultariam
em material com menor quantidade de células progenitoras mais imaturas, e uma
consequente dificuldade de estabelecimento do estroma na LTBMC. Outros
parâmetros analisados como tempo entre diagnóstico e mobilização, status da
doença, grupos de doenças, tipos de amostra, dados das biópsias de MO e de
mobilização também não apresentaram influência significativa na formação da
camada estromal. Este fato pode ser devido ao número de pacientes estudados,
pois os fatores como um tempo prolongado entre o diagnóstico e a mobilização e
Discussão
73
a presença de doença na MO apresentam uma tendência a um crescimento mais
lento do estroma.
Nos ensaios clonogênicos, a adição de fatores de crescimento à cultura
promove a resposta celular imediata ou, ausência dela no caso de hematopoese
deficiente. Corazza et al. (2004) demonstraram que pacientes com LLA
apresentam uma diminuição de progenitores BFU-E e CFU-GM, quando
comparados com controles normais. Estes pesquisadores também demonstraram
que os níveis de TGFβ estão maiores em pacientes que em controles, isto está
correlacionado inversamente com o número de BFU-E presentes nas culturas, o
que sugere a capacidade inibitória do TGFβ secretado em grande quantidade
pelas células estromais. A anemia associada às leucemias foi correlacionada com
a diminuição no pool eritropoético (CFU-E), indicado por um baixo nível do
receptor solúvel da transferrina, em contraste a um aumento da produção de EPO
em resposta à anemia. Apesar de nossa pequena amostragem, nossos resultados
confirmam esses achados, pois um paciente com LMA na cultura do estroma e
co-cultura com células CD34+ de doador, não apresentou nenhuma colônia
eritróide, mas apresentou colônias granulocíticas em quantidade relativamente
semelhante ao controle.
Outro achado em nossos dados é que apenas os estromas obtidos de
amostras de pacientes pós-mobilização e co-cultivados com células CD34+
apresentaram atividade proliferativa nos ensaios clonogênicos, com exceção do
controle normal co-cultivado com célula CD34+ autóloga. É sabido que células
mais maduras já comprometidas também expressam este marcador. Pode-se
dessa forma supor que após a mobilização, seja encontrada quantidade maior de
células mais imaturas gerando mais colônias após o estímulo com fatores de
crescimento na cultura semi-sólida.
Em virtude da diversidade de doenças analisadas e do número de
pacientes com características heterogêneas no momento do TMOA, do
tratamento quimioterápico prévio, grau de comprometimento medular e status da
doença, não foi possível traçar um parâmetro linear entre todos os pacientes
estudados. Porém, foi observado que a celularidade e a fibrose medular,
associadas à doença não-controlada, estão diretamente relacionados ao
insucesso na capacidade de formação do estroma sugerindo fortemente que os
Discussão
74
danos maiores estão relacionados ao estroma medular possivelmente causados
pelo tratamento quimioterápico prévio. A correlação entre a formação da camada
estromal e o status de mobilização não foi estabelecida nesta análise, pois não foi
notada diferença significativa entre os maus e bons mobilizadores, apenas uma
tendência dos bons mobilizadores de formarem menos a camada estromal na
LTBMC.
5.2. Análise comparativa entre culturas criopreservadas e a fresco
As condições de criopreservação e armazenamento capazes de prevenir
ou limitar os danos celulares funcionais das células-tronco de sangue periférico
(Aird et al.,1992), são pré-requisitos cruciais para garantir a capacidade de
reconstituição da hematopoese após altas doses de quimio/radioterapia dos
protocolos de condicionamento para o TMOA. Estudos sobre as melhores
condições de criopreservação e armazenamento de células hematopoéticas
utilizam dois agentes crioprotetores: o dimetilsulfóxido (DMSO) e/ou HES
(hidroxietil starch), porém existem controvérsias em relação à concentração final
do DMSO (2-10%). Balint et al. (1999), demonstraram as diferentes propriedades
biológicas das células mais primitivas em comparação com as células
comprometidas em relação ao DMSO.
Almici et al.(2003), utilizando células criopreservadas por 24-48h a -80ºC e
posteriormente armazenadas em nitrogênio líquido avaliaram a funcionalidade
celular através do sistema de LTBMC e ensaios clonogênicos em metilcelulose.
Eles obtiveram uma boa recuperação das células hematopoéticas com a
preservação de células progenitoras primitivas e comprometidas.
Na
análise
geral
de
todas
as
amostras
coletadas
a
fresco
e
criopreservadas, os nossos resultados indicam que não há diferença entre o
desempenho dos dois tipos de amostras nas LTBMC, o que confirma um estudo
prévio realizado com pacientes submetidos a TMOA e controles normais
(Mellado-Damas et al., 1997). Todavia, as células hematopoéticas provenientes
dos doentes são sabidamente mais vulneráveis aos danos da criobiologia do que
as normais. Coulombel et al. (1983) e Frassoni et al.(1986) observaram que nas
LMC Ph1-negativas eram mantidas por várias semanas em cultura, e que nos
Discussão
75
clones Ph1-positivos as culturas declinaram não sustentando a hematopoese por
serem mais sensíveis aos danos do cultivo. No que tange ao mieloma múltiplo,
inúmeras alterações de estroma e MEC já foram documentadas. Faid et al.(1996)
demonstraram algumas alterações do estroma como a confluência menor que os
controles normais com aumento da proporção de macrófagos e presença de
osteoclastos. Este e outros estudos também confirmaram a expressão aumentada
de moléculas de adesão como ICAM-1, H-CAM e VLA-4 sugerem o envolvimento
do estroma no “homing” das células tumorais do mieloma (Damiano et al.,1999,
Uchiyama et al.,1993).
Na análise dos períodos de pré e pós-mobilização, observamos diminuição
da formação da camada estromal tanto das amostras de doentes quanto de
controles, sendo que estes últimos apresentaram a maior perda da capacidade no
período pós-mobilização com amostras criopreservadas. Esta capacidade
reduzida mostra uma maior vulnerabilidade das células normais tanto ao processo
de mobilização como também ao processo de criopreservação. A literatura
apresenta poucos relatos sobre os efeitos do G-CSF na biologia das células
normais. Cashen et al. (2007) apontam em sua revisão que variações
interpessoais como idade e sexo, interferem no rendimento das células CD34 +,
contudo os mecanismos da mobilização e ação do G-CSF ainda não são
totalmente conhecidos.
Inicialmente esperávamos melhor evolução dos controles, ou seja, por
serem células normais, acreditávamos que o estabelecimento do estroma seria
maior na fase pós-mobilização, naqueles classificados como “bons” mobilizadores
e que o processo de criopreservação afetaria menos estas células. No entanto,
observamos aqui um paradoxo e sugerimos algumas hipóteses para explicá-lo. A
menor capacidade de estabelecer o estroma em amostras normais após a
criopreservação e uso de G-CSF mostra uma maior vulnerabilidade destes em
virtude de maior mobilização de células precursoras para o SP do que os
pacientes. Talvez a possível explicação seja o fato de as células mononucleares
normais não apresentarem mecanismos de resistência que os preserve da
agressividade do processamento criobiológico.
Estes achados sugerem que a existência de um estroma doente torna-o
menos suscetível ao processo de mobilização e criopreservação.
Conclusões
76
6. CONCLUSÕES
Em relação à influência da mobilização na funcionalidade hematológica podemos
concluir:

Houve diminuição na capacidade de formação da camada estromal das
amostras de controles na fase pós-mobilização, sugerindo que a medula
óssea normal seja mais afetada pelo efeito imediato do G-CSF, ou pela
migração mais expressiva das células progenitoras imaturas da MO para o
sangue periférico.

As amostras de pacientes apresentaram menor capacidade de formação da
camada
estromal
em
relação
aos
controles,
indicando
danos
ao
microambiente medular causados pelo tratamento quimioterápico prévio.

As amostras de pacientes não apresentaram diferenças funcionais entre as
fases de mobilização, não se relacionando a capacidade de formação do
estroma com a terapêutica empregada na mobilização.

Características individuais dos pacientes e doadores como idade e sexo não
apresentaram diferenças significativas na capacidade de formação e
manutenção do estroma.

As amostras de portadores de LNH apresentaram o pior desempenho nas
LTBMC, possivelmente devido ao caráter agressivo das doenças analisadas e
à intensidade do tratamento quimioterápico prévio.

A presença de fibrose, infiltração e celularidade diminuída na MO contribuíram
em parte para a diminuição da capacidade de formação da camada estromal.
Em relação ao processo de criopreservação na funcionalidade do estroma:

Não houve diferença na formação da camada estromal entre as amostras de
controles e pacientes criopreservadas e a fresco.

O período de mobilização não afetou o desempenho das LTBMC em relação
aos tipos distintos de amostras (criopreservadas e a fresco).

As amostras de controles apresentaram diminuição significativa na formação
da camada estromal na fase pós-mobilização em relação às amostras de
pacientes principalmente nas amostras a fresco, podendo-se sugerir que a
situação do estroma medular de pacientes com doenças onco-hematológicas
anteriores à mobilização possa apresentar um efeito protetor aos agentes
criopreservadores.
Referências Bibliográficas
77
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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