Controle
Microbiológico nas
Usinas de açúcar e
álcool
Prof.ª Drª Dejanira de Franceschi de Angelis
1. OBJETIVO
O controle do crescimento da população
microbiana dentro de um complexo industrial de
açúcar e álcool objetiva essencialmente a
diminuição das perdas de matéria-prima e,
conseqüentemente,
alcançar
melhores
rendimentos econômicos.
2.
Pontos de
Amostragem
Água de lavagem da cana
Caldo primário
Caldo misto
Análises que podem ser
realizadas
• nºbactérias/mL
• Redução de resazurina
• Plaqueamento (contagem
geral)
• nºbactérias/mL
• Plaqueamento para
produtores de goma e ácido
• nºbactérias/mL
• Plaqueamento para
produtores de goma e ácido
Caldo antes da sulfitação • nºbactérias/mL
ou calagem
• Plaqueamento para produtores de
goma e ácido
Caldo decantado
• nºbactérias/mL
• Plaqueamento para produtores de
goma e ácido
• Redução de resazurina
• nºbactérias/mL
Mosto e Mel
• Redução de resazurina
Xarope, água de
diluição, caldo cru
• Plaqueamento para produtores de
goma e ácido
Mosto antes e após os
• Redução de resazurina
trocadores de calor
• Plaqueamento para produtores de
goma e ácido
Início de alimentação da
dorna
Final da alimentação
• nºbactérias/mL
• nº de células vivas/mL
• % de viabilidade
• % de brotamento
• % de brotos vivos
• Plaqueamento
Leite de leveduras ou cubas
• nºbactérias/mL
• % de células vivas
• % de brotamento
• % de brotos vivos
• plaqueamento
3. COLETA DE AMOSTRAS
As amostras devem ser coletadas com muito
cuidado, sempre da mesma forma e por pessoas
de alta responsabilidade.
Da coleta correta das amostras, acoplado com o
bom desenvolvimento laboratorial, depende o
resultado de uma empresa.
O ideal é que as coletas sejam feitas em frascos
inquebráveis, autoclaváveis e transparentes.
Existem frascos especiais de coleta, que podem
ser autoclavados.
Quando as análises são para microbiologia, os
frascos são de 200, 300 a 500 mL. As amostras
preferencialmente devem ser amostras mistas ou
compostas.
Uma vez coletadas as amostras, os frascos devem
ser fechados e guardados sob refrigeração de 5 ±
2ºC, pelo menor tempo possível. Dependendo da
amostra é conveniente anotar no momento da
coleta a temperatura e o pH.
4. AVALIAÇÃO DO NÚMERO DE BACTÉRIAS
A avaliação pode ser feita pelos seguintes
métodos principais:
™ MICROSCÓPICA
™ PLAQUEAMENTO
™ FISIOLÓGICA
MICROSCÓPICA
A análise por contagem microscópica é importante
pois permite relacionar possíveis aumentos das
bactérias no mosto proveniente das diferentes
etapas do processo.
Para contagem pode-se empregar várias técnicas,
entretanto a câmara de Neubauer é simples e
confiável.
PLAQUEAMENTO
O plaqueamento embora não forneça o resultado
imediato pode garantir a viabilidade dos
microrganismos presentes além de poder avaliar a
presença de microrganismos em volumes maiores.
FISIOLÓGICA
O método de resazurina permite avaliar de forma
relativa a presença de atividade microbiana em
função da mudança de cor no corante.
A produção de ácido pode ser avaliada e
comprovada mediante medida do pH, ou com
aplicação de corantes como indicadores.
Quanto à produção de goma, que é o resultado da
polimerização de açúcares simples glicose e
frutose que formam respectivamente dextrana e
levana.
5. MATERIAL E MÉTODOS
5.1. Teste da Resazurina
9 Preparar uma solução de NaCl 9 g/L, ajustar o
pH a 7,0 com solução de NaOH.
9 Solução de resazurina a 10 mg/L de solução de
NaCl 9 g/L. A solução não deve ser estocada por
muito tempo (10 dias), e deve ser protegida da luz
e de altas temperaturas.
9 Preparar tubos com 9 mL de solução de
resazurina, tampar com algodão, autoclavar 10
minutos a 121ºC.
9 Nos tubos com resazurina, adicionar 1 mL da
amostra. Incubar em estufa ou banho-maria a
37ºC.
9 Anotar as mudanças de cor a cada 30 minutos
(violeta-róseo-incolor), estão em relação direta
com a atividade microbiana.
Modificação da cor
(horas)
violeta róseo
Avaliação
da infecção
Tratamento
incolor
-
0,5
3,0
alta
imediato
0,5
2,0
4,0
alta
imediato
1,0
4,0
6,0
média
imediato
3,0
5,0
7,0
fraca
normal
3,0
5,0
-
desprezível
preventivo
5.2. Plaqueamento
Para este teste deve-se dispor dos seguintes
materiais:
ƒ autoclave;
ƒ bico de bunsen;
ƒ estufa de incubação;
ƒ algodão
ƒ placas de petri;
ƒ reagentes: meios
cultura que podem
adquiridos prontos
preparados à partir
seus componentes
ƒ tubos para diluição;
ƒ pipetas;
de
ser
ou
de
Preparo do Material:
Placas de petri e pipetas devem ser esterilizadas
embrulhadas em papel ou em recipientes próprios.
A solução salina (NaCl a 0,85%) é colocada no
volume de 9 mL em tubos. A seguir tampa-se com
algodão e esteriliza-se em autoclave.
Os meios de cultura quando preparados devem
ser autoclavados para esterilização durante 15
minutos a 121ºC.
A amostra a ser analisada deve ser representativa
do ponto selecionado.
Das amostras são feitas diluições decimais
utilizando-se soluções contidas nos tubos. Deve-se
diluir a amostra para se atingir entre 30 e 300
UFC (Unidades Formadoras de Colônias) por placa.
Feitas as diluições, seleciona-se as que serão
processadas. A seguir, retira-se 0,1 mL do tubo da
diluição selecionada e transfere-se para a placa
que conterá ou não o meio de cultura, depende da
técnica a ser aplicada.
Caso a placa não contenha o meio, este deverá ser
colocado posteriormente, já liquefeito e a uma
temperatura (± 50ºC), vertendo-o sobre a
amostra, fazendo-se movimentos em forma de
oito para homogeneizá-la no meio antes da
solidificação.
Caso o meio já tenha sido colocado na placa, este
deve estar frio e solidificado ao se colocar a
amostra na superfície. Neste caso a amostra é
espalhada com auxílio de uma espátula de
Drigalsky.
Marcar na placa a amostra, a diluição, o volume de
amostra e a data do experimento.
Após estarem solidificadas, as placas são
incubadas a 36ºC (bactérias) ou 28ºC (leveduras).
Pode-se aplicar também uma temperatura de
30ºC para bactérias e leveduras.
A incubação deve ser de 24 a 48 horas e a seguir
as colônias são contadas. O experimento deve
sempre ser feito em placas com duplicatas.
Ex. de contagem na diluição a 10-3, plaqueando-se
0,1 mL
Placa 1: 110 colônias
Placa 2: 130 colônias
Média: 120 colônias
120 x 103 x 0,1 = 1,2 x 104/0,1 mL
120 x 103 x (0,1 x 10) = 1,2 x 105 UFC/mL
5.3. Produção de ácido
Amostras de caldo são coletadas nos diferentes
pontos do processo em frascos, tubos ou
recipientes esterilizados. A seguir são colocadas
em uma solução contendo indicador com faixa de
variação curta (ex. púrpura de bromocresol ou
verde de bromocresol).
Ajustar o pH das amostras a pH 6,8 para púrpura
de bromocresol e pH 5,0 para verde de
bromocresol.
Os tubos são incubados a 30ºC e observados de
hora em hora. Descartar após 12 ou 24 horas.
Quando ocorrer predominância de bactérias
ácidas as alterações ocorrem aproximadamente
após 3 horas.
5.4. Produção de goma
Amostras devem ser coletadas como no caso
anterior e colocadas diretamente na estufa, caso
a presença de goma seja numerosa o meio mostrase em 12 horas turvo e viscoso. Para acelerar a
reação é conveniente acrescentar para cada 10
mL de amostra 2 mL de solução esterilizada de
extrato de levedura a 20%.
O número das bactérias formadoras de goma
pode ser determinado pelo meio de Mayeux &
Colmer ou ainda pelo meio CSN. As UFC aparecem
convexas ou espalhadas, podem ser leitosas ou
límpidas.
5.5. Técnica de contagem de células ou partículas
Rotineiramente emprega-se em Microbiologia a
Câmara de Neubauer, considerada como precisa e
de leitura rápida para quantificar células de
leveduras, esporos, bactérias e outras partículas.
A câmara de Neubauer é conhecida por “lâmina
hematimétrica”. Presta-se à contagem de células
ou partículas visíveis ao microscópio ótico.
As câmaras podem ser simples ou duplas,
atualmente apresentam-se espelhadas para
realçar a matéria a ser contada.
De uma maneira geral tem:
1mm x 1mm x 0,1mm
E esta área está dividida em 16 ou 25 quadrados.
¾ Quando estiver dividido em 25, cada quadrado
terá 0,2mm.
¾ Quando estiver dividido em 16, cada quadrado
terá 0,25mm.
Assim o volume útil de cada quadrado médio é:
0,2mm x 0,2mm x 0,1mm = 0,004mm3
25 quadrados: 25 x 0,004 = 0,1 mm3
0,25mm x 0,25mm x 0,1mm = 0,00625mm3
16 quadrados: 16 x 0,00625 = 0,1mm3
RECORDANDO
Considerando a profundidade da Câmara (1/10mm)
e que as contagens são anotadas em cm3 (1 cm3 =
1 mL) o volume de um quadrado grande é:
1mm x 1mm x 0,1mm = 1/10 cm x 1/10 cm x 1/100 cm =
= 1/10 000 cm3
ou 0,0001 cm3
REGRAS DE CONTAGEM
1) Conte as células usando o quadrado grande do
centro.
2) Conte as células dos quadrados médios e as
células que estiverem tocando as linhas superior
e as linhas à direita.
3) Conte cerca de 200 a 250 células antes de
determinar o número por cm3.
Nos 25 ou 16 quadrados podem surgir 4 situações:
A. Coincidir de haver 200 a 250 células, neste
caso conte as mesmas e multiplique por 104
para obter o nº de células por cm3
Ex: 200 células
2 x 102 x 104 = 2 x 106
B. Pode haver menos de 200 células por quadrado
grande, neste caso será necessário a contagem
de células de alguns quadrados grandes
laterais para atingir cerca de 200.
Divida o nº de células pelo nº de quadrados
grandes e multiplique por 104 para achar o nº
de células por mL ou cm3.
C. Pode haver mais de 200 células por quadrado
grande, neste caso conte as células dos
quadrados médios até haver contado cerca de
200. Determine o nº de células de um dos
quadrados médios. Multiplique a média por 25
para obter as células por quadrado grande.
Este nº x 104 fornece o número de células por
cm3.
Ex: 210 células em 3 quadrados médios (cada um
medindo 0,2 x 0,2mm). Quantas células há por
cm3 ?
210/3 = 70 células por quadrado médio
70 x 25 = 1750 em 0,1mm3 (1750 células
por quadrado grande)
1750 x 104 = 17.500.000 ou 1,75 x 107
cels/cm3
D. O número de células é muito grande para ser
contado. Neste caso a suspensão precisa ser
diluída.
1 mL diluído em 9 mL de água ou solução salina é
uma diluição de 1:10 ou 1/10, neste caso o nº de
células contadas deve ser multiplicado por 10.
Cálculos de Porcentagem de células de Leveduras
% Viabilidade =
vivas x 100
vivas + mortas
% Brotamento = brotos x 100
vivas + mortas
% Viabilidade dos Brotos = brotos x 100
Br. Vivos + Br. Mortos
Flocos por campo (mL) =
Flocos
nº de quadrados
Soluções usadas na Contagem de Leveduras
‰ Sol. A – Solução de Sulfato Azul de Nilo
20 g de sulfato azul de Nilo em 100 mL de água
destilada.
‰ Sol. B – Solução de Azul de Metileno
0,2 g de azul de metileno em 100 mL de água
destilada.
USO: solução A + solução B em partes iguais
Eritrosina
1 g de eritrosina em 100 mL de água destilada.
Diluir 1 mL desta solução em 50 mL de solução
tampão (partes iguais de 0,2 M de Na2HPO4 e
0,2 M de NH2PO4); ficando solução de corante
1:5000.
Guardar em refrigerador.
1 mL (suspensão de células) + 1 mL solução corante
BIBLIOGRAFIA
ƒ LIMA, A. O.; SOARES, J.B.; GRECO, J.B.;
GRAUZZI, J.E.; CANÇADO,J.R. – Métodos de
laboratório aplicados a Clínica – 5ª edição – pg
403 – 411
ƒ SHARF, J.M. – Métodos recomendados para o
exame microbiológico de alimentos – Ed. Polígono –
1972 – pg 239
ƒ SUSSMAN, A.S. – Microrganismos, Crescimento;
Nutrição e Interação – Edart – SP, 1975 – pg 56 –
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