INFLUÊNCIA DA SUPLEMENTAÇÃO DE SELÊNIO ORGÂNICO SOBRE A
PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA DA MEMBRANA ESPERMÁTICA DE
CACHAÇOS
Simone Maria Massami Kitamura Martins1, André Furugen Cesar de Andrade2, Larissa
José Parazzi3, Fabiane Gilli Zaffalon4, Carolina Imamura Silva5, Esther Ramalho
Afonso5, Tacia Antunes Del Santos5, Andres Mejia-Gallego4, Aníbal Sant’Anna
Moretti6, Rubens Paes Arruda7
1
Doutoranda do Programa de Pós-Graduação em Reprodução Animal da FMVZ/USP.
[email protected]
2
Pós-Doutorando em Reprodução Animal da FMVZ/USP
3
Doutoranda do Programa de Pós-Graduação em Nutrição e Produção Animal da
FMVZ/USP.
4
Mestrandos do Programa de Pós-Graduação em Reprodução Animal da FMVZ/USP.
5
Mestrandas do Programa de Pós-Graduação em Nutrição e Produção Animal da
FMVZ/USP.
6
Professor do Departamento de Nutrição e Produção Animal da FMVZ/USP.
[email protected]
7
Professor do Departamento de Reprodução Animal da FMVZ/USP. [email protected]
INTRODUÇÃO
Os espermatozóides do cachaço são caracterizados por apresentar altos níveis de
ácidos graxos poliinsaturados. A peroxidação lipídica pode ser um dos mecanismos
responsáveis pelas mudanças fisiológicas e bioquímicas negativas durante a
refrigeração. Entretanto, dados sobre as mudanças na composição lipídica do
espermatozóide e sua susceptibilidade à peroxidação ainda são limitados (Cerolini et al.,
2000). Resultados têm demonstrado que o espermatozóide de cachaços contém
glutationa peroxidase e α-tocoferol, sugerindo que tanto o selênio como a vitamina E
exercem um papel na prevenção de danos peroxidativos (Marin-Guzman et al., 1997).
Deste modo, o objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos da suplementação de
selênio orgânico sobre a peroxidação lipídica da membrana do espermatozóide suíno
diluído em BTS e refrigerado por 3 dias.
MATERIAL E MÉTODOS
Os animais foram alojados em baias individuais no Laboratório de Pesquisa em
Suínos do Departamento de Nutrição e Produção Animal e as análises do sêmen foram
realizadas no Laboratório de Biotecnologia do Sêmen e Andrologia do Centro de
Biotecnologia em Reprodução Animal, pertencentes à Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo (FMVZ, USP), Campus
Pirassununga. Os 12 cachaços foram distribuídos nos três tratamentos experimentais:
CONTROLE – dieta formulada utilizando fonte inorgânica (0,30 ppm de selenito de
sódio), INORGÂNICO – dieta formulada utilizando fonte inorgânica (0,50 ppm de selenito
de sódio) (Marin-Guzman et al., 1997, 2000a, 200b) e ORGÂNICO - dieta formulada
utilizando fonte orgânica (0,50 ppm de selênio-levedura). A ração foi fornecida duas
vezes ao dia, na quantidade de 2,6 Kg/animal/dia. Anteriormente ao período
experimental todos os animais receberam uma dieta basal seguindo recomendações do
1
NRC (1998). As colheitas do sêmen empregaram o método da mão enluvada, com
prévia higienização do prepúcio (King & Macpheterson, 1973), sendo a fração
gelatinosa devidamente separada e descartada. Em seguida o sêmen foi diluído com um
diluidor padrão a concentração de 3 x 109espermatozóides/dose e refrigerado por 3 dias
a 18ºC.
Os espermatozóides foram corados com 1 µL/mL da sonda C11-BODIPY581/591
em dimetilsulfóxido (concentração final de 2 mM) por 30 minutos a 38ºC. Retirado o
sobrenadante a amostra foi suspendida em TALP na concentração de 25 x 10 6
espermatozóides. Então, adicionou-se a amostra 3 µL de Iodeto de Propídio (PI, L0770,
Sigma-Aldrich Co., Saint Louis, Missouri, EUA) para servir como um marcador das
células com membrana plasmática lesada. Após 10 minutos de incubação em
temperatura ambiente, os espermatozóides foram diluídos com a adição de 600 µL de
TALP (Raphael et al., 2008). Com isso, as amostras apresentaram uma concentração de
5 x 106 espermatozóides por mL no momento de serem analisadas por citometria de
fluxo.
O delineamento foi blocos com medidas repetidas no tempo, referentes aos 4
períodos em que o sêmen diluído e armazenado foi analisado. As probabilidades de
interações com o tempo foram determinadas pelo teste de Greenhouse-Geisse,
utilizando-se o comando REPEATED gerado pelo procedimento GLM (SAS, 2002). As
variáveis analisadas não apresentaram interação entre os tempos de amostragem e o
tratamento (P>0,05). Deste modo, realizou-se a análise dos efeitos principais. As
análises para efeito de tempo foram realizadas pelo teste de Fisher (LSD) e o efeito do
tratamento pela análise por contraste ortogonal, sendo o contraste 1 (C1) efeito da
suplementação (0,3 x 0,5 ppm de selênio) e contraste 2 (C2) efeito da fonte (orgânica x
inorgânica). As hipóteses testadas foram consideradas significativas quando P<0,05.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Não houve interação significativa entre os tratamentos e o períodos durante a
análise da intensidade de fluorescência emitida pela célula espermática com membrana
plasmática íntegra e corada com a sonda fluorescente C11-BODIPY581/591. Deste modo,
avaliaram-se em separado os efeitos principais. Não houve mudanças na intensidade de
fluorescência emitida pelas células independentemente do tratamento. Quando se
analisou o efeito de período, verificou-se que a fluorescência emitida aumentou até 24
horas e após este período diminuiu (Figura 1). A alta peroxidação lipídica encontrada
até 24 horas pode ser devido ao alto metabolismo celular no início do processo de
resfriamento (Raphael et al., 2008). O resfriamento levou a redução no metabolismo, o
qual gerou uma diminuição na peroxidação lipídica após 48 horas, provavelmente pela
ação do sistema antioxidante da própria célula espermática (Raphael et al., 2008).
2
Figura 1 - Médias ± erros padrão dos valores lineares médios da intensidade da
fluorescência da população espermática com membrana plasmática íntegra
e corada com a sonda fluorescente C11-BODIPY581/591 (IFPERMI) no
sêmen suíno, nos períodos. Os valores estão representados em unidades
arbitrárias (u.a.)
CONCLUSÃO
A suplementação de selênio orgânico não foi capaz reduzir a peroxidação
lipídica na célula espermática de suínos.
AGRADECIMENTOS
FAPESP Proc nº 07/55613-6, Alltech® Inc., Agroceres® Nutrição Animal, Vet life®
Produtos Veterinários.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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peroxidation and fatty acid composition of boar semen during liquid storage. Anim.
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MARIN-GUZMAN, J.; MAHAN, D.C.; CHUNG, Y.K.; PATE, J.L.; POPE, W.F.
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MARIN-GUZMAN, J.; MAHAN, D.C.; WHITMOYER, R. Effect of dietary selenium
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