XXV CONGRESSO BRASILEIRO DE ZOOTECNIA
ZOOTEC 2015
Dimensões Tecnológicas e Sociais da Zootecnia
Fortaleza – CE, 27 a 29 de maio de 2015
Efeito da adição de diferentes concentrações de melatonina sobre a integridade da membrana
plasmática de sêmen ovinos criopreservado1
Effect of addition of different melatonin concentrations in the ram semen on the plasma membrane
integrity after cryopreservation
Jonathan Maia da Silva Costa2*, Wildelfrancys Lima de Souza2, Elenice Andrade Moraes3, Laio Ramon
Cardoso Torres4, Vitória Gomes Coelho4, Dailli Ingrid de Brito Lima4, Pedro Humberto Félix de Sousa 5
1
Parte da dissertação de Mestrado do segundo autor
Mestrando do Curso de Pós-Graduação em Ciência Animal, (CPGCA), Universidade Federal do Vale do
São Francisco (UNIVASF), Petrolina-PE, *e-mail: [email protected]
3
Professora do Adjunto III do Colegiado de Zootecnia e do CPGCA, UNIVASF, Petrolina-PE
4
Graduando (a) do Curso de Medicina Veterinária, UNIVASF, Petrolina-PE
5
Professor do Setor de Ovinocultura do DTCS, UNEB, Juazeiro-BA
2
Resumo: Objetivou-se avaliar os efeitos da adição de diferentes concentrações de melatonina ao meio
diluente sobre a integridade da membrana plasmática de espermatozoides de carneiro após criopreservação.
Foram utilizados três carneiros. Ejaculados de três carneiros foram coletados e diluídos em Tris-gema de ovo
para concentração final de 200 x 106 espermatozoides/ml. O diluidor foi previamente preparado de acordo
com os tratamentos: Controle; 1 mM; 100 μM; 100 nM; e 100 pM de melatonina. Em seguida, as amostras
foram acondicionadas em câmara fria a 5°C por duas horas, para posteriormente serem envasadas em
palhetas de 0,5 mL, acondicionadas sob vapores de nitrogênio líquido, por 15 minutos, a 8 cm da lâmina
líquida. As palhetas foram imersas no nitrogênio líquido e descongeladas a 37°C durante 30s. Para a
avaliação da integridade da membrana plasmática utilizou-se a associação das sondas fluorescentes iodeto de
propídio (PI) e Hoechst 33342, onde as amostras de cada tratamento descongeladas foram incubadas por 8
minutos em banho-maria a 37ºC após adição de 2 μL PI e de Hoechst 33342. As células com membrana
plasmática lesada apresentaram o núcleo corado em rosa e as de membrana plasmática intacta apresentaram o
núcleo corado em azul. As variáveis foram submetidas à análise de variância e as médias foram comparadas
pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. A adição de 100 pM de melatonina aumentou a integridade da
membrana plasmática comparado aos demais tratamentos (P<0,05). Conclui-se que a adição de 100 pM de
melatonina ao meio diluente melhora a integridade da membrana plasmática de espermatozóides de ovinos
após descongelamento.
Abstract: The objective was to evaluate the effect of the addition of melatonin in diluent on the integrity of
the plasma membrane of ram semen after cryopreservation. Ejaculates of three ram were used and diluted in
Tris-egg yolk diluent to a final concentration of 200x10 6 sperm/ml. The diluent was previously prepared
according to the following treatments: Control; 1 mM; 100 µM; 100 nM and 100 pM melatonin. After
dilution, the samples were cooled at 5°C for two hours. After the samples were packaged into 0.5 ml straws,
sealed and frozen in static liquid nitrogen vapor (8.0 cm above the liquid nitrogen) for 15 minutes, before
being plunged into liquid nitrogen for storage. Straws were thawed at 37ºC in bath for 30 seconds. The total
sperm motility was determined using the CASA. To evaluate the plasma membrane integrity was used the
association of fluorescent probes propidium iodide (PI) and Hoechst 33342 (H342). The variables were
analyzed by ANOVA using a Tukey test. The samples were incubated with 2μl PI plus 2μl of Hoechst 33342
in a water bath at 37°C for 8 minutes and the numbered of 200 spermatozoa was counted using a
fluorescence microscope. Cells with damaged plasma membrane was stained with pink and with intact
plasma membrane stained with blue. The percentages of plasma membrane integrity was higher when was
added 100 pM compared others treatments (P<0.05). Addition of 100 pM of melatonin in the diluent
improve the plasma membrane integrity of ram sperm thawed.
Palavras–chave: antioxidantes, carneiro, fluorescência
Keywords: antioxidants, ram, fluorescence
Introdução
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O custo acessível da inseminação artificial, torna está biotécnica a principal ferramenta para o
melhoramento genético do rebanhos de ovinos, todavia, para sua aplicação ampla é indispensável o uso do
sêmen criopreservado.
Entretanto, durante o processo de congelamento-descongelamento é estimada uma perda em torno de
50% de células espermáticas, ocasionada por danos ultra-estruturais, físicos, bioquímicos ou funcionais nos
diferentes componentes estruturais do espermatozoides, como a membrana plasmática, que devido as
crioinjúrias sofre modificações morfológicas na organização e composição dos lipídeos das membranas dos
espermatozoide, reduzindo sua capacidade de garantir a homeostase célula cuja é essencial para mantes a
viabilidade espermática ( SALAMON e MAXWELL, 1995).
Diante disso, a adição de antioxidantes ao meio diluidor tem sido estudada, visando fornecer maior
proteção a membrana plasmática, num ambiente que conserve a integridade e funções da membrana mesmo
durante mudanças de temperatura e osmolaridade, pelas quais os espermatozoides devem sofrer durante a
criopreservação (CELEGHINI, 2005).
Portanto, objetivou-se avaliar os efeitos de diferentes concentrações de melatonina sobre a membrana
plasmática de espermatozoides congelados de ovinos.
Material e Métodos
O experimento foi desenvolvido no Centro de Pesquisa em Suínos, Espécies Nativas e Silvestre
(CPSENS), localizado no Campus de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Vale do São Francisco
(UNIVASF), Petrolina, Pernambuco.
Foram utilizados três carneiros, com idade entre 2 a 4 anos. Os animais foram mantidos em baias
individuais, com dieta a base de volumoso e concentrado, com fornecimento de água ad libitum.
As colheitas foram realizadas duas a três vezes por semana para cada animal com intervalos de 48
horas. Foi utilizada nas colheitas vagina artificial para ovinos (Minitub®) com água a 50°C acoplada a tubos
de centrífuga de 50 ml, utilizando como manequim uma fêmea ovina. Após a coleta o sêmen foi transportado
imediatamente para o CPSENS e colocado em banho-maria a 32°C. Cada ejaculado foi avaliado quanto aos
parâmetros seminais (volume, aspecto, concentração e a motilidade espermática).
Os ejaculados foram distribuídos em cinco tubos de ensaio de 15 ml e diluídos em Tris-gema de ovo
para concentração final de 200x106 espermatozoides/ml, determinado através da análise no fotômetro SDM6
(Minitub®), e mantidos em banho maria a 32°C. O diluidor foi previamente preparado com as quatro
concentrações diferentes de melatonina, de acordo com os tratamentos: Controle; 1 mM; 100 μM; 100 nM;
100 pM de melatonina. Após a diluição as amostras nos tubos de ensaio foram colocadas em um becker com
água a 32°C e acondicionadas sobre rack em câmara fria a 5°C por duas horas. Após esse período, as
amostras de cada tratamento foram envasadas em palhetas de 0,5 ml e lacradas com seladora ultrasônica
(Minitub®) e acondicionadas sob vapores do nitrogênio líquido, por 15 minutos, a 8 cm da lâmina líquida.
Decorrido este tempo as palhetas foram imersas no nitrogênio líquido e descongeladas a 37°C durante 30
segundos.
Após o descongelamento, a integridade da membrana plasmática foi determinada utilizando a
associação das sondas fluorescentes iodeto de propídio (IP) e Hoechst 33342 (H342), onde amostras de cada
grupo foram incubadas em banho-maria a 37ºC, adicionadas de 2 μL PI e 2 μL H342, por 8 minutos. As
células com membrana plasmática lesada apresentaram o núcleo corado em rosa, aquelas com a membrana
plasmática intacta, núcleo corado em azul (Figura1).
As variáveis foram submetidas à análise de variância e as médias foram comparadas pelo teste de
Tukey, a 5% de probabilidade, utilizando-se o programa estatístico SAEG.
Resultados e Discussão
A percentagem de espermatozoides com membrana plasmática intacta detectada pela associação
das sondas fluorescentes iodeto de propídio (PI) e Hoechst 33342 são apresentados na Tabela 1.
Houve aumento da porcentagem de espermatozoides com membrana plasmática intacta (iMP) após a adição
de 100 pM de melatonina (37%) no sêmen de carneiros comparado aos demais tratamentos (Tabela 1;
P<0,05).
Tabela 1. Integridade da membrana plasmática (%) de espermatozoides de carneiros criopreservados após
adição de diferentes concentrações de melatonina no sêmen fresco
Concentrações de melatonina
iMP %
Controle
22,04±13,84BC
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1 mM
18,80±11,45C
100 µM
23,68±10,60BC
100 nM
27,18±12,33B
100 pM
37,0±10,66A
A,B
Médias com letras maiúsculas diferentes sobrescritas na mesma coluna diferem entre si pelo teste de
Tukey (P<0,05).
iMP= integridade da membrana plasmática;
Os resultados observados corroboram com os reportados por Salamon e Maxwell (1995), que
relataram percentagem de membrana intacta de 20 a 30% dos espermatozoides de carneiros.
Nossos resultados são superiores aos encontrados por Válcárcel et al. (2004) e Maia (2009) que
reportaram 17% e 32,4, respectivamente, de membrana plasmática intacta. Isso, demonstrando que a adição
de 100 pM de melatonina aumentou a integridade da membrana plasmática.
A adição, portanto, de melatonina ao meio diluente de sêmen de carneiros que serão criopreservados
contribui para a melhoria da qualidade espermática durante protocolo de congelamento. Sendo assim, isso
pode ter reduzido o efeito deletério do estresse osmótico, responsável pela crioinjúria, durante o
congelamento e descongelamento.
Conclusões
A adição de 100 pM de melatonina ao meio diluente melhora a integridade da membrana plasmática
de espermatozóides de ovinos após descongelamento.
Agradecimentos
Universidade Estadual da Bahia-UNEB pela concessão dos animais experimentais. A Univasf pela
estrutura e apoio financeiro a pesquisa (Edital 17/2013-Universal Pós-Univasf), e a Fundação de Amparo à
Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco (FACEPE) pela bolsa de mestrado.
Literatura citada
CELEGHINI, E. C. C. Efeitos da criopreservação de sêmen bovino sobre as membranas plasmática,
acrossomal e mitocondrial e estrutura da cromatina dos espermatozoides utilizando sondas
fluorescentes. São Paulo, 2005. 186 p. Tese (Doutorado) Departamento de reprodução animal. Universidade
de São Paulo.
MAIA, M. S.; BICUDO, S. D.; AZEVEDO, H. C.; SICHERLE, C. C.; SOUSA, D. B.; RODELLO, L.
Motility and viability of ram sperm cryopreserved in a Tris-egg yolk extender supplemented with antioxidants. Small Ruminant Research. v. 85, p. 85–90, 2009
SALAMON, S.; MAXWELL, W.M.C. Frozen storage of ram semen I. processing, freezing, thawing and
fertility after cervical insemination. Animal Reproduction Science, v. 37, p.185-249, 1995.
VALCÁREL, A.; DE LAS HERAS, M. A.; PÉREZ, L.; MOSES, D. F.; BALDASSARRE, H. Fluorescent
staining as a method of assessing membrane damage and pos-thaw survival of ram spermatozoa.
Theriogenology, v. 41, p 483-489, 1994.
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