Universidade de São Paulo
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
MARIA REGINA MARTINEZ
Reatividade vascular de aortas isoladas de ratas
ao término da gestação: participação de óxido
nítrico e prostanóides
Ribeirão Preto
2004
MARIA REGINA MARTINEZ
Reatividade vascular de aortas isoladas de ratas ao
término da gestação: participação de óxido nítrico e
prostanóides
Dissertação apresentada ao Departamento
de
Farmacologia
Medicina
de
da
Faculdade
Ribeirão
Preto
de
da
Universidade de São Paulo para obtenção
do título de Mestre em Ciências.
Área de Concentração: Farmacologia
Orientadora: Profa. Dra. Maria Cristina de
Oliveira Salgado
Ribeirão Preto
2004
AUTORIZO A REPRODUÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER
MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE
QUE CITADA A FONTE.
Martinez, Maria Regina
Reatividade vascular de aortas isoladas de ratas ao término da
gestação: participação de óxido nítrico e prostanóides./ Maria Regina Martinez;
orientadora Maria Cristina de Oliveira Salgado. – Ribeirão Preto, 2004.
83 f.
Dissertação (Mestrado – Programa de Pós-Graduação em
Ciências. Área de Concentração: Farmacologia) – Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo.
1. Reatividade vascular. 2. Gravidez. 3. Óxido Nítrico. 4.
Prostanóides.
Dedico este trabalho ao meu
companheiro e amigo Alexandre
e ao meu filho Gabriel, pessoas
que me inspiram e me amam
todos os dias.
Agradecimentos
Agradeço a todos que, durante esses anos, contribuíram de diferentes
formas para minha formação e para o desenvolvimento deste trabalho. Em especial
agradeço:
à Profa. Dra. Maria Cristina de Oliveira Salgado pela sua orientação, acolhimento e
incentivo no desenvolvimento desse trabalho. Agradeço também as oportunidades
que me deu para o meu desenvolvimento docente, o seu exemplo de dedicação à
docência e a sua amizade.
aos Professores Doutores Maria Cristina de Oliveira Salgado, Edson Antunes e
Rubens Fazan Júnior pela disponibilidade em fazer parte da comissão julgadora
dessa dissertação.
ao Prof. Dr. Gustavo Ballejo Olivera pela sua colaboração nesse trabalho e pelas
discussões desafiadoras que tanto me fizeram crescer cientificamente.
aos técnicos do laboratório, Osmar Vettore e Orlando Mesquita, que dividiram seu
conhecimento e me auxiliaram nos experimentos, colaborando para o meu
crescimento técnico. Agradeço, ainda, sua amizade e sabedoria de vida que
colaboraram para o meu desenvolvimento pessoal.
aos colegas Sérgio, Kênia, Cristina, Herbert, Carlos, Marcos Caprio, Marcos Miranda
e Murilo que já deixaram o laboratório, mas que me ensinaram muito sobre ciência e
amizade.
aos colegas de laboratório, Christiane, Disney, Luiz, Batata, Zé Vitor, Milene e Laura,
por tornarem o meu dia-a-dia um constante aprendizado e divertimento.
aos demais colegas da pós-graduação pela ajuda constante e alegre convivência.
aos docentes do Departamento de Farmacologia da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, pela transmissão de conhecimentos
durante o curso de pós-graduação.
aos docentes da Escola de Enfermagem de Ribeirão Preto da Universidade de São
Paulo, pelas várias oportunidades de ministrar aulas em seus cursos, contribuindo,
assim, para o meu desenvolvimento docente.
aos funcionários da secretaria, Ramon, Sônia e Fátima, e do biotério, Eliana e Inês,
pelo constante atenção e disponibilidade.
à minha família, em especial meu marido Alexandre e meu filho Gabriel, que
acompanharam meu trabalho desde os primeiros experimentos até a confecção da
dissertação com muito amor e carinho.
à Capes, pelo apoio financeiro concedido durante a realização desse trabalho.
SUMÁRIO
RESUMO......................................................................................................................8
ABSTRACT................................................................................................................10
1. INTRODUÇÃO........................................................................................................12
1.1. Adaptações hemodinâmicas durante a gestação...............................12
1.2.Controle do tônus vascular durante a gestação..................................13
1.2.1. Participação do óxido nítrico....................................................15
1.2.2. Participação de prostanóides...................................................19
2. OBJETIVOS...........................................................................................................23
3. METODOLOGIA....................................................................................................25
3.1. Animais...............................................................................................25
3.2. Reatividade Vascular..........................................................................25
3.3. Influência da tensão passiva na reatividade vascular de anéis de aorta
de ratas grávidas e não grávidas...............................................................26
3.4. Participação do NO e de prostanóides nas alterações de reatividade
associadas ao término da gestação: importância da condição
experimental...............................................................................................27
3.4.1. Experimentos utilizando 1 grama de tensão passiva
inicial..................................................................................................28
3.4.2. Experimentos utilizando 0,5 grama de tensão passiva
inicial..................................................................................................29
3.5. Drogas e substâncias utilizadas..........................................................29
4. ANÁLISE DOS DADOS.........................................................................................31
5. RESULTADOS.......................................................................................................33
6. DISCUSSÃO..........................................................................................................55
7. CONCLUSÕES......................................................................................................68
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..........................................................................70
Resumo
MARTINEZ, M. R. Reatividade vascular de aortas isoladas de ratas ao término
da gestação: participação de óxido nítrico e prostanóides. 2004. 83f.
Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de
São Paulo, Ribeirão Preto, 2004.
Ao final da gestação de ratas se observa hiporeatividade a agentes constritores que
tem sido atribuída à produção alterada de óxido nítrico (NO) e prostanóides. Nesse
estudo foi observada a participação dos derivados da sintase de NO (NOS) e
ciclooxigenase (COX) nas alterações de reatividade vascular à fenilefrina (FE)
durante a gestação, bem como a interferência da tensão passiva inicial na
importância relativa dessas enzimas. Foi avaliada a resposta vasoconstritora à
fenilefrina em anéis de aorta de ratas não grávidas (NG, fase estro do ciclo estral) e
grávidas (G, 19o e 20o dias de gestação) com o endotélio íntegro ou lesado, e após
-7
inibição da COX ou da NOS. Fixando a concentração de FE (10 M) e variando a
tensão passiva inicial (0,25, 0,50, 0,75, 1 ou 2g) a que o anel foi submetido, foi
observado aumento da magnitude da resposta vasoconstritora dependente do
aumento do estiramento do tecido em G e NG, sendo anéis de aorta de G menos
reativos à FE do que NG nas diferentes tensões. A retirada do endotélio, a inibição
da NOS por L-NNA ou da COX por diclofenaco de sódio (DF) reverteram
parcialmente essa hiporeatividade. A adição de concentrações cumulativas de FE
em anéis de aorta de G e NG submetidos às tensões passivas de 0,5 e 1 g
demonstrou, novamente, hiporeatividade associada à gestação. A retirada do
endotélio foi capaz de igualar a resposta constritora à FE de G e NG. A inibição da
via NOS/guanilato ciclase com L-NNA e ODQ aumentou a reatividade de G e NG
não alterando as diferenças de ambos; no entando, utilizando 0,5 g de tensão
passiva, a adição de L-NNA igualou a resposta constritora à FE de G e NG. A adição
de DF diminuiu a reatividade de NG igualando os grupos nas tensões de 0,5 e 1,0 g.
O relaxamento induzido por acetilcolina em vasos pré-contraídos com FE não foi
alterado pela gestação. Os resultados sugerem que a hiporeatividade à fenilefrina
em anéis de aorta de ratas ao término da gestação está relacionada a uma alteração
da ação de fatores derivados do endotélio, da NOS e da COX, sendo que as
condições iniciais determinam a importância relativa desses agentes.
Palavras-chave: Reatividade vascular. Gravidez. Óxido Nítrico. Prostanóides.
Abstract
MARTINEZ, M. R. Vascular reactivity of isolated aorta of late pregnant rats: role
of nitric oxide and prostaglandins. 2004. 83f. Disertation (Mestrado) - Faculdade
de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2004.
Late pregnancy is associated with diminished reactivity to vasoconstrictor agents that
may be mediated by altered production/release of nitric oxide (NO) and
prostaglandins. In the present study the role of NO synthase (NOS) and
cyclooxygenase (COX) derived products in the altered vascular reactivity to
phenylephrine (PE) was investigated in the isolated aorta of late-pregnant rats at
different basal conditions. The vasoconstrictor response to PE was recorded in aorta
rings of non-pergnant (NP, estrous) and late pregnant rats (P, 19- to 20 day) in the
presence and absence of the endothelium, and with COX or NOS inhibition. The
contractile response to PE (10-7 M) augmented with increasing resting tension from
0.25 to 2.0 g in both P and NP aorta; however, the responses in aortic rings from P
were smaller at all passive tension employed. Endothelium removal or NOS inhibition
with L-NNA or COX inhibition with sodium diclofenac (DF) attenuated but did not
abolished the hyporesponsivity of P aorta. Concentration-response curves induced
by PE were also attenuated in aortic rings of P compared with those of NP at both 0.5
and 1.0 g of resting tensions. Endothelium removal potentiated the constrictor
response induced by PE in both P and NP aortas and abolished the difference
between the groups. The NOS/guanilato cyclase pathway inhibition enhanced the
PE-induced responses in P and NP but aortas of P maintained at 1.0 g of passive
tension still respond less to PE; at 0.5 g of resting tension, however, L-NNA
abolished the differences between P and NP. DF blunted PE-induced contraction
only in NP aorta at both resting tensions and abolished the difference between P and
NP aorta responses to PE. The relaxant responses of aortic rings to acetylcholine
were not influenced by pregnancy. These results suggest that the refractoriness to
PE-induced contraction observed in aortic rings of late-pregnant rats is related to
altered production of NOS and COX endothelial factors. In addition, the basal
conditions determine the relative contribution of these factors to the observed
refractoriness to vasoconstrictor agent.
Keywords: Vascular reactivity. Pregnancy. Nitric oxide. Prostanoids.
1. Introdução
12
1. Introdução
1.1. Adaptações hemodinâmicas durante a gestação
A gestação de mulheres é caracterizada por diversas alterações
hemodinâmicas. O volume sangüíneo aumenta cerca de 30%, sendo uma
adaptação importante para a nutrição e oxigenação do feto e para a perda de cerca
de 500 a 1000 ml de sangue que ocorre durante o parto. Há um incremento de 50%
do débito cardíaco que está relacionado a um aumento do volume sistólico e da
freqüência cardíaca. O volume sistólico está aumentado por um aumento do volume
diastólico final acompanhado por uma manutenção da fração de ejeção e por um
aumento da força contrátil, mantidos pelo remodelamento do ventrículo esquerdo
(Hennessy e cols, 1996; Gilson e cols, 1997; Thornburg e cols, 2000).
Embora o aumento do débito cardíaco acompanhado por aumento da
freqüência cardíaca devesse levar a um aumento da pressão arterial, durante a
gravidez humana observa-se exatamente o inverso. Nos dois primeiros trimestres de
gestação há uma queda da pressão arterial média que se deve à diminuída
resistência periférica (Chapman e cols, 1998). Adicionalmente, a diminuição da
resistência periférica é acompanhada por uma diminuída resposta pressora a
constritores como a angiotensina II (Gant e cols, 1973).
Essas adaptações hemodinâmicas durante a gestação também são
observadas em outras espécies animais. Em ratas, a diminuição da pressão arterial
é progressiva, atingindo seu máximo ao término da gestação e retornando aos níveis
de não grávidas após o parto (Teew & De Jong, 1973). Observa-se, também,
durante a gestação desses animais, uma diminuída resposta pressora a
13
vasoconstritores como angiotensina II, vasopressina e noradrenalina (Teew & De
Jong, 1973; Paller, 1984; Pan e cols, 1990), assim como hiporeatividade vascular a
agentes constritores em vasos isolados (Aloamaka e cols, 1993; Cadorette e cols,
2000; Harrison & Moore, 1989; St-Louis & Sicotte, 1992; Ballejo e cols, 2002).
Essas adaptações hemodinâmicas que acompanham a gravidez permitem
que o feto se desenvolva adequadamente e que o sistema cardiovascular materno
não sofra sobrecarga pelo aumento do volume sangüíneo circulante. No entanto,
uma pequena parcela das mulheres grávidas desenvolve a pré-eclâmpsia, patologia
relacionada à alta morbidade e mortalidade da mãe e do feto, caracterizada por
aumento da pressão arterial e da resistência vascular periférica, proteinúria, redução
do volume plasmático e hiperreatividade a agentes constritores (Visser &
Wallenburg, 1991; VanWijk e cols, 2000). Não é completamente compreendida a
patofisiologia da pré-eclâmpsia e o seu tratamento consiste no alívio dos sintomas e
adiantamento do parto se necessário; portanto, um melhor entendimento do controle
do tônus vascular durante a gestação normal poderá auxiliar no desenvolvimento de
novas estratégias para prevenção e controle dessa doença.
1.2. Controle do tônus vascular durante a gestação
Na literatura encontramos diversos trabalhos investigando alterações de
reatividade vascular durante a gestação. Podemos observar, no entanto, que os
dados são inconclusivos, uma vez que variações na espécie animal, no leito vascular
e nas condições experimentais produzem resultados distintos.
A maioria dos trabalhos mostra uma hiporeatividade a constritores
associada ao término da gestação. Vasos de condutância isolados de cobaias e
14
ratas grávidas, como aorta, apresentam hiporeatividade à fenilefrina, sendo que
alguns trabalhos mostram diminuição da resposta máxima (Aloamaka e cols, 1993;
Cadorette e cols, 2000) e outros deslocamento da curva concentração-efeito para a
direita (Harrison & Moore, 1989; St-Louis & Sicotte, 1992; Ballejo e cols, 2002).
Esses tecidos também apresentam diminuição da reatividade a outros agentes
vasoconstritores como KCl e vasopressina (Aloamaka e cols, 1993; Cadorette e cols,
2000).
No
entanto,
dois
trabalhos
de
um
mesmo
laboratório
mostram
hiperreatividade de anéis de aorta a constritores associada ao término da gestação
de ratas (Jansakul e cols, 1989 e 1990).
A hiporeatividade durante a gestação também está presente em vasos de
pequeno calibre de diferentes espécies animais. Em anéis de artéria mesentérica
observa-se
diminuição
da
reatividade
a
vasoconstritores
como
fenilefrina,
noradrenalina e vasopressina, associada ao término da gestação em ratas e cobaias
(Parent e cols, 1990; St-Louis e cols, 1995; Davidge & McLaughlin, 1992). Em leito
arterial
mesentérico
isolado
e
perfundido,
em
ratas
grávidas
observa-se
hiporeatividade à fenilefrina, à noradrenalina, à angiotensina II, à vasopressina, à
endotelina e à estimulação elétrica perivascular em relação a preparações de ratas
não grávidas (Chu & Beilin, 1993; Ralevic & Burnstock, 1996; Coelho e cols, 1997).
Artérias uterinas de cobaias grávidas apresentam hiporeatividade à noradrenalina,
serotonina e U46619 (um análogo do tromboxano) quando comparadas com artérias
de não grávidas (Weiner e cols, 1991 e 1992). Em coelhas ao término da gestação
se observa aumento da condutância de artérias mesentérica e femoral e
hiporeatividade à noradrenalina e U46619 em arteríolas isoladas da musculatura
esquelética (Brooks e cols, 2001; Ungvari e cols, 2002).
15
Tem sido proposto que essa hiporeatividade arterial aos vasoconstritores
pode ser conseqüência de uma produção aumentada de autacóides vasodilatadores
de origem endotelial, desde que em vários modelos a retirada do endotélio aumenta
a reatividade e iguala as respostas à estimulação com vasoconstritores dos vasos
obtidos de grávidas e não-grávidas. Dentre os autacóides vasodilatadores derivados
do endotélio melhor caracterizados estão o óxido nítrico (NO) e a prostaciclina
(PGI2).
1.2.1. Participação do óxido nítrico
Em 1980, a partir do estudo de Furchgott e Zawadsky, ficou estabelecida
a importância do endotélio para o controle do tônus vascular. Neste estudo, os
pesquisadores demonstraram que o efeito vasodilatador da acetilcolina em vasos
isolados dependia da liberação de um fator relaxante derivado do endotélio, o EDRF.
Inicialmente, foi sugerido que o EDRF fosse um radical livre derivado do
metabolismo do ácido araquidônico (Furchgott, 1984). Mais tarde, em 1987, Palmer
e colaboradores demonstraram que cultura de células endoteliais de aorta liberava
NO, detectável por quimioluminescência, em concentrações suficientes para produzir
vasodilatação, mostrando que o EDRF era o NO.
O NO é um radical livre biatômico, instável, que contém um elétron não
pareado e que, portanto, pode reagir com qualquer composto oxidante fraco ou com
agentes redutores (Kanner e cols, 1991) e pode difundir-se livremente através de
membranas biológicas (Welch & Loscalzo, 1994).
O NO é sintetizado pela enzima sintase de NO (NOS) que utiliza o
aminoácido L-arginina como substrato (Palmer e cols, 1988). A síntese do NO pela
16
NOS implica inicialmente na formação do Nϖ-hidróxi-L-arginina (L-OHArg) pela
monooxigenação da L-arginina dependente de NADPH e tetrahidrobiopiterina (BH4).
Num segundo passo, a L-OHArg tem a ligação C=N clivada ocorrendo a formação
de citrulina e NO. Em ambos os passos ocorre o consumo de NADPH e O2 (Alderton
e cols, 2001).
A NOS é uma enzima presente em uma grande variedade de células e
que pode se apresentar sob as isoformas constitutivas (NOS neuronal ou endotelial)
ou induzível. No vaso podemos encontrar expressas a NOS endotelial (NOSe) na
camada endotelial (Knowles & Moncada, 1994) e a NOS neuronal (NOSn) na
camada muscular (Papadaki e cols, 1998; Cheah e cols, 2002), além de poder haver
expressão de NOS induzível após um estímulo apropriado tanto no endotélio como
no músculo (Knowles e cols, 1990; Rees e cols, 1990).
A NOSe é considerada uma enzima que depende da ligação do complexo
cálcio-calmodulina para ser ativada. A formação desse complexo ocorre com o
aumento da concentração de cálcio intracelular estimulado por agonistas
dependentes ou independentes de receptor, como a acetilcolina e o ionóforo de
cálcio A-23187 respectivamente. Uma forma de ativar a NOSe independentemente
do aumento intracelular de cálcio é a fosforilação dessa enzima, que ocorre durante
o estresse de cisalhamento (shear stress) induzido por fluxo por exemplo (Ayajiki e
cols, 1996; Fleming & Busse, 1999).
O NO gerado pela NOS se difunde pelas membranas e pode atingir a
guanilato ciclase (GC) solúvel presente nas células musculares lisas, estimulando
essa enzima a converter GMP em GMPc (Ignarro, 1992). A formação de GMPc
induz relaxamento da musculatura lisa vascular (Rapoport & Murad, 1983).
17
A produção de NO pode ser inibida por análogos da L-arginina como Nωnitro-L-arginina (L-NNA) e Nω-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME) (Moncada e cols,
1991; Chinellato e cols, 1998), que inibem de maneira competitiva a atividade da
NOS. Outra maneira de impedir a ação do NO é utilizar inibidores de GC, como o
1H-[1,2,4]oxadiazol[4,3-a]quinoxalim-1-ona (ODQ; Schrammel e cols, 1995), ou
seqüestradores de NO, como a hemoglobina (Gruetter e cols, 1981; Martin e cols,
1984).
A infusão de inibidores da NOS em ratas grávidas e não grávidas
aumenta e iguala a pressão arterial de ambas, além de restaurar a resposta
pressora à angiotensina II, vasopressina e noradrenalina nas primeiras (Molnár &
Hertelendy, 1992; Nathan e cols., 1995). Mas os mesmos inibidores em vasos
isolados respondem de maneira diversa dependendo das condições experimentais.
Chu e Beilin (1993), estudando reatividade vascular em leito arterial
mesentérico de ratas ao término da gestação, perfundido in situ, observaram
hiporeatividade vascular à noradrenalina, à estimulação elétrica perivascular e à
angiotensina II em relação a preparações de ratas não grávidas. Essa
hiporeatividade foi corrigida nos vasos estimulados com noradrenalina com uma
infusão de L-NNA 30 min antes da administração do vasoconstritor; porém, esse
tratamento, embora tenha aumentado a reatividade vascular de ratas grávidas e não
grávidas, não foi capaz de igualar os grupos que sofreram estimulação elétrica
perivascular ou administração de angiotensina II. No entanto, dados do nosso
laboratório demonstram que a presença de L-NNA na solução de perfusão de leito
arterial mesentérico isolado de ratas grávidas reverte a hiporeatividade à fenilefrina e
à estimulação elétrica perivascular observada em relação a de não grávidas (Coelho
e cols, 1997; Ballejo e cols, 2002).
18
A pré-incubação com L-NAME, outro inibidor da NOS, não reverte a
hiporeatividade à fenilefrina associada ao término da gestação em anéis de artéria
mesentérica isolada de ratas, apesar do aumento da reatividade a esse
vasoconstritor observado em grávidas e não grávidas (Davidge & McLaughlin, 1992).
No entanto, em nosso laboratório demonstramos que a presença de L-NNA em
anéis de aorta de ratas é capaz de, além de aumentar a resposta dos vasos de
grávidas e não grávidas, abolir as diferenças de reatividade à fenilefrina entre esses
grupos (Ballejo e cols, 2002).
Em outras espécies animais a importância do NO na hiporeatividade
associada à gestação também não está bem elucidada. Em coelhas ao término da
gestação, quando se observa a diminuição da pressão arterial e aumento da
condutância de artérias aorta, mesentérica e femoral, a infusão de L-NNA não é
capaz de igualar a pressão arterial e a condutância das artérias aorta e femoral de
grávidas e não grávidas, porém elimina as diferenças de condutância mesentérica
(Brooks e cols, 2001).
Pretendendo investigar se somado às alterações de resposta contrátil a
diferentes agentes constritores há alterações no relaxamento dependente do NO,
vários estudos têm investigado a vasodilatação induzida por nitroprussiato de sódio,
um doador de NO, e estimulada por substâncias que induzem a liberação de NO de
maneira dependente ou independente de receptor como acetilcolina e ionóforo de
cálcio A-23187, respectivamente. Em aorta de cobaias grávidas se observa um
aumento da sensibilidade ao efeito vasodilatador da acetilcolina que é revertido por
L-NNA (Gregg e cols, 1995). Em aorta de ratas grávidas, embora a maioria dos
trabalhos não relate diferenças no efeito vasodilatador do nitroprussiato de sódio e
de substâncias que induzem a liberação de NO (Honda e cols, 1998; Parent e cols,
19
1990; St-Louis & Sicotte, 1992; Whittemore e cols, 1994; Ballejo e cols, 2002),
alguns trabalhos demonstram aumento do relaxamento induzido por acetilcolina e
por A-23187 em relação a não grávidas (Goetz e cols, 1994; Dantas e cols, 1999).
Além dos estudos funcionais, estudos moleculares sugerem que durante a
gestação pode haver uma maior produção de NO. Goetz e cols (1994) encontraram
aumento da quantidade de RNA mensageiro da NOSe em aorta torácica de ratas
grávidas e Xu e cols (1996) encontraram aumento da expressão dessa enzima
nesses mesmos tecidos e também em artérias mesentéricas. Magness e cols (1997)
demonstraram aumento da expressão de NOSe na camada endotelial de artérias
uterinas de ovelhas grávidas. Nelson e cols (2000) encontraram aumento da
atividade e da expressão da NOSe em artérias uterinas de mulheres grávidas.
Porém, em nosso laboratório não encontramos aumento da atividade cálciodependente da NOSe em aorta ou artéria mesentérica de ratas ao término da
gestação (Ballejo e cols, 2002).
Portanto, dependendo do animal, do vaso estudado e das condições a
que ele é exposto podemos observar resultados diferentes, indicando que há a
participação do NO e também de outros agentes vasoativos nas alterações de
reatividade observadas.
1.2.2. Participação de prostanóides
Além do NO, outras substâncias vasoativas, como prostanóides, são
importantes moduladoras do tônus vascular, podendo participar da hiporeatividade
associada à gestação. A produção desses agentes é regulada pela disponibilidade
do ácido araquidônico e pela atividade da enzima ciclooxigenase (COX). Essa
20
enzima catalisa, a partir do ácido araquidônico, a formação de endoperóxido cíclico
(PGG2), que sofre redução formando um outro endoperóxido cíclico, PGH2. Uma vez
formado, PGH2 é convertido por diferentes enzimas a vários prostanóides, como
prostaciclina (PGI2) e tromboxano (TxA2) (Goodwin e cols, 1999).
Nos vasos, a PGI2 exerce importante função vasodilatadora que se
sobrepõe à ação vasoconstritora do TxA2 (Davidge, 2001). Durante a gravidez
humana há um aumento progressivo dos níveis plasmáticos de PGI2 e diminuição
progressiva dos níveis de TxA2 (Wang e cols, 1991). Em ratas, há aumento da
excreção de metabólitos urinários de prostanóides (Schafer e cols, 1993 e 1996) e
em artérias uterinas de ovelhas há aumento da produção de prostaciclina basal e
estimulada por angiotensina II (Magness & Rosenfeld, 1993). Adicionalmente, em
aortas de ratas e em células endoteliais de artérias uterinas de ovelhas grávidas foi
detectada maior expressão de COX (Davidge e cols, 1993; Habermehl e cols, 2000;
Janowiak e cols, 1998).
Em mulheres grávidas, Everett e cols (1978) observaram que o
tratamento com indometacina ou aspirina, inibidores da COX, é capaz de aumentar a
reatividade pressora à angiotensina II. De maneira semelhante em ratas, foi
demonstrado que o tratamento com outro inibidor da COX, o meclofenamato, foi
capaz de aumentar as respostas pressoras a angiotensina II, noradrenalina e
vasopressina de grávidas igualando-as a de não grávidas (Paller, 1984). No entanto,
em leito arterial mesentérico de rata perfundido in situ o pré-tratamento com
indometacina aumentou a reatividade à noradrenalina e à estimulação elétrica
perivascular mas não alterou as diferenças entre grávidas e não grávidas (Chu &
Beilin, 1993) e em artérias mesentéricas e aortas torácicas isoladas de ratas a
presença de meclofenamato não alterou a resposta contrátil à fenilefrina em grávidas
21
e não grávidas (Davidge & McLaughlin, 1992; Harrison & Moore, 1989). No entanto,
em artérias uterinas isoladas de cobaias e arteríolas da musculatura esquelética de
ratas grávidas há uma diminuição da sensibilidade ao tromboxano (verificada pelo
efeito contrátil de doses cumulativas do seu análogo U46619) (Weiner e cols, 1992;
Ungvari e cols, 2002).
Esses dados sugerem que derivados da COX podem determinar a
hiporeatividade a constritores associada à gestação, no entanto as condições
experimentais podem mascarar sua participação.
2. Objetivos
23
2. Objetivos
Gerais:
Considerando as divergências encontradas na literatura sobre a
importância da ação da NOS e da COX na determinação da hiporeatividade vascular
associada à gestação, nesse trabalho nos propomos investigar os efeitos da inibição
dessas enzimas na reatividade à fenilefrina em anéis de aorta de ratas grávidas e
não grávidas em diferentes situações experimentais.
Específicos:
1.
Identificar como as variações da tensão passiva inicial influenciam a
hiporeatividade a fenilefrina observada durante a gestação de ratas;
2.
Verificar se as alterações observadas com a variação da tensão
passiva inicial dependem da produção de derivados da NOS ou COX;
3.
Determinar se a inibição da produção de NO e/ou prostanóides altera
a reatividade de anéis de aorta de ratas grávidas e não grávidas a
concentrações
crescentes
experimentais diferentes.
de
fenilefrina
em
duas
condições
3. Metodologia
25
3. Metodologia
3.1. Animais:
Os experimentos foram realizados utilizando ratas Wistar (200g)
provenientes do biotério Central do Campus de Ribeirão Preto da Universidade de
São Paulo. Os animais foram mantidos no biotério do Departamento de
Farmacologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP, em sala com ciclos
luz/escuro de 12 horas a 25 ± 2 °C, e foram alimentados com ração padrão e água
ad libitum.
Os animais foram divididos de modo que parte deles foi destinada a
compor o grupo de ratas não grávidas e a outra parte foi submetida ao
acasalamento. As ratas foram utilizadas ou no período final da gestação (19-20°
dia), sendo que o dia "zero" de gestação foi determinado pela presença de
espermatozóides no esfregaço vaginal matinal, ou na fase estro do ciclo estral. As
fases do ciclo estral foram determinadas pela diferenciação celular observada no
esfregaço vaginal das ratas, conforme demonstrado anteriormente por Montes &
Luque (1988).
3.2. Reatividade Vascular:
As ratas foram anestesiadas com tribromoetanol 2,5% (1 mL/100g de
peso) e, em seguida, sacrificadas por decapitação. A seguir, a aorta torácica foi
isolada e dissecada de tecidos conectivos e, de sua parte proximal, foram cortados
anéis de aproximadamente 3 mm de largura. Dois ganchos de metal foram inseridos
26
no lúmen de cada anel. Um destes ganchos estava fixado à base da cuba e o outro
conectado a um transdutor de força isométrica (FT 03, Grass Instrument Division,
Astro-Med) acoplado a um amplificador (Gould Instrument Systems). Esse sistema
foi conectado a um computador para registro, em gramas, da tensão isométrica.
Para aquisição e análise dos dados foram utilizados, respectivamente, os softwares
Summit for ACQuire e Data Viewer (Gould Instrument Systems). O anel de aorta
permaneceu em cuba para órgão isolado contendo solução nutriente de Krebs (em
mM: NaCl: 118; KCl: 4,7; CaCl2+2H2O: 2,5; MgSO4+7H2O: 1,64; KH2PO4: 1,18;
NaHCO3: 24,9; Glicose: 11,1), com pH 7,4, mantida a 37°C e sob aeração constante
com mistura carbogênica (95% O2 e 5% CO2).
Antes do início de cada experimento, os anéis de aorta, após o equilíbrio
em uma determinada tensão passiva, foram desafiados com uma concentração fixa
de fenilefrina (10-7 M), um agonista α1-adrenérgico, até apresentarem respostas
vasoconstritoras semelhantes; a presença do endotélio vascular foi verificada pela
resposta vasodilatadora à acetilcolina (10-6 M) em preparações pré-contraídas com
fenilefrina.
Naqueles
protocolos
experimentais
que
pretendíamos
verificar
a
importância da camada endotelial na reatividade vascular, foi realizada a retirada do
endotélio, por meio de leve fricção do anel entre os dedos indicadores, antes do
início do experimento. O sucesso do procedimento foi verificado pela ausência de
resposta vasodilatadora à acetilcolina (10-6 M).
3.3. Influência da tensão passiva na reatividade vascular de anéis de
aorta de ratas grávidas e não grávidas:
27
Para determinar a influência da tensão passiva sobre a resposta à
fenilefrina em anéis de aorta de ratas virgens em estro e ao final da gestação foram
realizados experimentos onde se fixou a concentração do vasoconstritor (10-7 M) e
foi variada a tensão passiva a qual o anel estava submetido (0,25, 0,50, 0,75, 1,0 e
2,0 gramas). Após período de estabilização, a 0,25 g de tensão passiva, os anéis de
aorta de ratas grávidas e não grávidas, foram estimulados com uma única
concentração de fenilefrina e, após lavagem, a tensão passiva foi aumentada. Após
nova estabilização, os anéis foram novamente estimulados com a mesma
concentração de fenilefrina; este procedimento foi repetido a tensões crescentes. O
incremento de tensão provocado pela adição do vasoconstritor foi chamado de
tensão ativa.
Com a finalidade de identificar o papel do endotélio vascular nessas
preparações, foram utilizados anéis de aorta com ou sem a camada endotelial e,
com o objetivo de identificar quais as substâncias responsáveis pelas alterações
observadas durante a gestação nas diferentes tensões passivas, foram repetidos os
experimentos na presença de inibidor da NOS (Nω-nitro-L-arginina - L-NNA – 100
µM) e de inibidor da COX (diclofenaco de sódio, 10 µM disponibilizado na solução
nutriente de Krebs).
3.4. Participação do NO e de prostanóides nas alterações de reatividade
associadas ao término da gestação: importância da condição experimental
Para avaliar quanto a alteração da tensão passiva influenciava a
participação de NO e prostanóides nas alterações de reatividade associadas à
28
gestação, foram construídas curvas concentração-efeito para fenilefrina (10-9 a 3x106
M) em duas tensões passivas iniciais diferentes (0,5 e 1 gramas).
3.4.1. Experimentos utilizando 1 grama de tensão passiva inicial:
A tensão passiva inicial de 1 grama foi escolhida por ser a menor tensão
que permitia a maior visualização do efeito de 10-7 M de fenilefrina.
A princípio foi verificado se as alterações de reatividade associadas à
gestação dependiam da integridade do endotélio vascular, para tanto os
experimentos foram realizados na presença e ausência da camada endotelial.
Para avaliar a participação de alguns dos fatores vasoativos derivados do
endotélio, como NO e derivados da COX, foram construídas curvas concentraçãoefeito para fenilefrina nos anéis de aorta de ratas grávidas e não grávidas. Os
experimentos foram realizados na presença de L-NNA (100 µM) ou veículo (10 µl/ml
de HCl 0,05 N), de diclofenaco de sódio (10 µM, disponibilizado na solução nutriente
de Krebs) e de diclofenaco sódio e L-NNA simultaneamente. Para uma abordagem
complementar da via NOS/NO/GMPc, também foram realizados experimentos na
presença de 1H-(1,2,4)Oxadiazolo[4,3-a]quinoxaline-1-ona (ODQ, 25 µM), inibidor
da guanilato ciclase, ou veículo (1 µl/ml de DMSO).
Adicionalmente, com a intenção de verificar se nessas condições
experimentais havia alteração na vasodilatação mediada por liberação de óxido
nítrico, foram feitas curvas concentração-efeito para acetilcolina (ACh 10-8-10-5 M)
em anéis de aortas de ratas grávidas e não grávidas pré-contraídos com 60 a 80%
do efeito máximo da fenilefrina.
29
3.4.2. Experimentos utilizando 0,5 grama de tensão passiva inicial:
Escolhemos 0,5 grama por ser uma tensão passiva que rotineiramente
era utilizada no nosso laboratório e que permitiu a observação da participação da via
NOS/NO durante a gestação em experimentos prévios utilizando anéis isolados de
aorta de ratas (Ballejo e cols, 2002).
Repetimos os experimentos com os inibidores de NOS e COX, realizando
curvas concentração-efeito para fenilefrina nos anéis de aorta de ratas grávidas e
não grávidas na presença de L-NNA (100 µM) ou veículo (10 µl/ml de HCl 0,05 N),
de diclofenaco de sódio (10 µM, disponibilizado na solução nutriente de Krebs) e de
diclofenaco sódio e L-NNA simultaneamente.
3.5. Drogas e substâncias utilizadas:
Dentre as drogas: fenilefrina e L-NNA foram obtidos da Sigma; acetilcolina
da Merck; diclofenaco de sódio e ODQ da Research Biochemicals International; e
tribromoetanol 2,5% da Aldrich Chemical Company.
Dentre os sais que compuseram a solução de Krebs: clroreto de sódio foi
obtido de J.T. Baker; cloreto de potássio, cloreto de cálcio, bicarbonato de sódio e
glicose da Merck; sulfato de magnésio da Vetec; fosfato de potássio da Mundial
Química.
4. Análise dos dados
31
4. Análise dos dados
As respostas vasoconstritoras são apresentadas como o aumento de
tensão em gramas nos anéis de aorta a partir da tensão passiva inicial imposta e as
respostas vasodilatadoras são expressas como porcentagem de relaxamento em
relação à pré-contração com fenilefrina.
Nos experimentos onde se variou a tensão passiva foi utilizado análise de
variância (ANOVA) de duas vias e, quando diferenças significativas foram
encontradas, foi aplicado o pós-teste de Bonferroni.
Nos experimentos onde se realizaram curvas concentração-efeito os
resultados são apresentados como média±erro padrão da média (EPM) dos valores
de pD2 (-log EC50) e de efeito máximo (Emax). Os valores de pD2 para fenilefrina
foram calculados por equação de regressão não-linear. Foram comparados os
valores de Emax e pD2 das curvas concentração-efeito obtidas de anéis de aorta de
ratas grávidas e não grávidas. Para a análise estatística foram utilizados teste t de
Student e um valor de P<0,05 foi considerado estatisticamente diferente. Todos os
testes estatísticos foram realizados utilizando o programa Graph Pad Prism versão
3.0, 1999.
5. Resultados
33
5. Resultados
Inicialmente foram realizados experimentos que visavam verificar como as
alterações na tensão passiva inicial modificavam a resposta vasoconstritora à
fenilefrina em ratas não grávidas e grávidas.
Em anéis de aorta de ratas não grávidas o aumento da tensão passiva
inicial induziu aumento da reatividade à fenilefrina (P<0,001, ANOVA). A remoção
mecânica do endotélio vascular aumentou a reatividade à fenilefrina demonstrando
que fatores relaxantes endoteliais são responsáveis pela modulação do efeito
vasoconstritor deste agonista α1-adrenérgico. A inibição da NOS com L-NNA
aumentou a reatividade à fenilefrina de forma semelhante à retirada do endotélio
sugerindo que o NO é o principal agente relaxante liberado pelo endotélio vascular
que é capaz de modular a resposta vasoconstritora a esse agonista. A inibição da
COX com diclofenaco promoveu diminuição da resposta vasoconstritora à fenilefrina
em relação ao grupo controle (E+), indicando que parte do efeito constritor induzido
pela estimulação de receptores α1-adrenérgicos em anéis de aorta de ratas não
grávidas se deve a liberação de prostanóides constritores (FIG. 1).
Embora a magnitude da resposta à fenilefrina possa ser modulada pelo
endotélio, por NO e por derivados da COX, esses fatores não evitaram que essa
resposta vasoconstritora fosse aumentada pelo estiramento do tecido, isto é, pelo
aumento da tensão passiva, em anéis de aorta de ratas não grávidas. Ou seja,
aumentos da tensão passiva promovem aumentos da tensão ativa induzida por
fenilefrina, sendo que esses aumentos são amplificados pela retirada do endotélio e
pela adição de L-NNA e deprimidos pela adição de diclofenaco.
34
Tensão Ativa (g)
2
E+ (n=10)
E- (n=10)
E+/ L-NNA (n=7)
#
E+/ DF (n=10)
*
1
*
*
*
*
#
#
#
0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Tensão Passiva (g)
FIGURA 1. Resposta vasoconstritora à fenilefrina (10-7 M) nas diferentes tensões passivas em
anéis de aorta de ratas não grávidas com ou sem endotélio (E+ ou E-,respectivamente), na
presença de L-NNA ou diclofenaco (DF). Os pontos representam a média±EPM dos
experimentos realizados (n=7-10, *P<0,05, # P<0,01 ANOVA, em relação ao grupo E+).
35
Em anéis de aorta de ratas grávidas o aumento da tensão passiva inicial
também induziu aumento reatividade à fenilefrina (P<0,05, ANOVA). A remoção
mecânica do endotélio vascular, como nos anéis de aorta de ratas não grávidas, foi
capaz de aumentar a reatividade à fenilefrina, demonstrando que, também durante a
gestação, os fatores relaxantes endoteliais são responsáveis pela modulação do
efeito vasoconstritor de agonistas α1-adrenérgicos. A inibição da NOS com L-NNA
aumentou a reatividade à fenilefrina de forma semelhante à retirada do endotélio,
como em não grávidas, sugerindo que o NO nesses vasos também é o principal
agente relaxante liberado pelo endotélio vascular capaz de modular a resposta
vasoconstritora a agonista α1-adrenérgico. A adição de diclofenaco não promoveu
alterações na resposta vasoconstritora à fenilefrina sugerindo que, diferentemente
de não grávidas, não há participação dos derivados da COX na vasoconstrição
dependente da estimulação α1-adrenérgica em aortas de ratas grávidas (FIG. 2).
Em anéis de aorta de ratas grávidas também se observou que o aumento
da tensão ativa induzida por fenilefrina dependente do estiramento do tecido
continua existindo apesar da retirada do endotélio e da pré-incubação com L-NNA
ou diclofenaco. No entanto, o diclofenaco adicionado aos anéis de aorta de ratas
grávidas não promoveu alterações em relação ao controle e, reproduzindo os dados
observados nos vasos de não grávidas, a retirada do endotélio e a adição de L-NNA
amplificaram o aumento da tensão ativa induzida por fenilefrina que se observava
com o aumento do estiramento do tecido.
36
Tensão Ativa (g)
2
E+ (n=12)
E- (n=11)
E+/ L-NNA (n=7)
E+/ DF (n=8)
1
*
*
*
*
*
*
*
*
#
#
0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Tensão Passiva (g)
FIGURA 2. Resposta vasoconstritora à fenilefrina (10-7 M) nas diferentes tensões passivas em
anéis de aorta de ratas grávidas com ou sem endotélio (E+ ou E-, respectivamente), na
presença de L-NNA ou diclofenaco (DF). Os pontos representam a média±EPM dos
experimentos realizados (n=7-12, *P<0,01, #P<0,001 ANOVA, em relação ao grupo E+).
37
Nossos resultados demonstram que o aumento da tensão passiva inicial
aumentou a reatividade à fenilefrina em anéis de aorta tanto de ratas grávidas como
de não grávidas. Podemos observar, ainda, que há uma hiporreatividade a
constritores associada à gestação que não é corrigida pelo estiramento do tecido,
pelo contrário, as diferenças de reatividade, que se apresentam mais discretas nas
menores tensões, são amplificadas nas maiores tensões. Adicionalmente, não houve
interação da tensão com a gestação (FIG. 3 e 4).
FIGURA 3. Registro representativo da contração induzida por fenilefrina (10-7 M) em anéis de
aorta com o endotélio preservado de ratas grávidas e não grávidas nas tensões passivas de
0,25, 0,50, 0,75, 1 e 2 gramas.
38
Tensão Ativa (g)
1.5
NG
G
1.0
*
*
*
0.50
0.75
1.00
0.5
**
0.0
0.25
2.00
Tensão Passiva (g)
FIGURA 4. Resposta vasoconstritora à fenilefrina (10-7 M) nas diferentes tensões passivas em
anéis de aorta de ratas grávidas (G) e não grávidas (NG) na presença do endotélio vascular
(n=10-12, *P<0,01; ** P<0,001 ANOVA, G vs. NG).
Assim, de acordo com nossos resultados, dependendo das condições
experimentais impostas, a hiporeatividade durante a gestação pode ser mais ou
menos claramente visualizada.
A lesão do endotélio diminuiu a hiporeatividade vascular à fenilefrina de
grávidas em relação a não grávidas, fazendo desaparecer as diferenças estatísticas
observadas antes da retirada do endotélio nas tensões passivas de 0,5, 0,75 e 1
grama.
No
entanto,
como
o
estiramento
aumenta
consideravelmente
a
vasoconstrição induzida por fenilefrina de não grávidas e altera pouco a de grávidas,
39
na tensão passiva de 2,0 gramas as diferenças de reatividade entre os grupos foram
mantidas (FIG. 5).
Tensão Ativa (g)
1.5
NG
G
*
1.0
0.5
0.0
0.25
0.50
0.75
1.00
2.00
Tensão Passiva (g)
FIGURA 5. Resposta vasoconstritora à fenilefrina (10-7 M) nas diferentes tensões passivas em
anéis de aorta de ratas grávidas (G) e não grávidas (NG) na ausência do endotélio vascular
(n=10-11, *P<0,05; ANOVA, G vs. NG).
Esse resultado demonstra a importância da presença da camada
endotelial para o controle do tônus vascular e para determinar parte das alterações
vasculares observadas durante a gestação. Demonstra, ainda, a diminuída
capacidade contrátil da musculatura lisa vascular durante a gestação evidenciada,
principalmente, nas maiores tensões passivas.
40
A adição de diclofenaco de sódio, por reduzir o efeito contrátil da
fenilefrina em não grávidas, diminuiu as diferenças de reatividade entre os grupos,
fazendo desaparecer as diferenças observadas na ausência dessa droga nas
tensões passivas de 0,5, 0,75 e 1 grama. Como o efeito vasoconstritor da fenilefrina
nos anéis de aorta de ratas grávidas é pouco modificado pelo aumento da tensão
passiva e nos anéis de aorta de não grávidas é aumentado, as diferenças de
reatividade entre os grupos reaparecem na tensão de 2,0 gramas, maior tensão que
utilizamos (FIG. 6). Esse dado sugere que parte da hiporeatividade à fenilefrina
associada ao término da gestação está relacionada a alterações na produção de
derivados da COX.
Tensão Ativa (g)
1.5
NG
G
1.0
*
0.5
0.0
0.25
0.50
0.75
1.00
2.00
Tensão Passiva (g)
FIGURA 6. Resposta vasoconstritora à fenilefrina (10-7 M) nas diferentes tensões passivas em
anéis de aorta de ratas grávidas (G) e não grávidas (NG) na presença de 10 µM de diclofenaco
(n=8-10, *P<0,001 ANOVA, G vs. NG).
41
A adição de L-NNA não modificou a diminuída reatividade à fenilefrina
observada em ratas grávidas quando comparadas com não grávidas, embora tenha
atenuado as diferenças observadas na ausência dessa droga nas tensões passivas
de 0,5 e 0,75 gramas (FIG. 7A). Esse resultado mostra a pouca participação do NO
na hiporeatividade da aorta a agonistas α1-adrenérgicos associada à gestação. A
concentração utilizada de L-NNA foi eficaz em abolir a resposta vasodilatadora à
acetilcolina (10-6 M) em ambos os grupos (FIG. 7B).
% Relaxamento ACh
1.5
Tensão Ativa (g)
B
125
A
NG
G
NG
G
100
75
50
25
0
Controle
1.0
*
*
1.00
2.00
L-NNA
0.5
0.0
0.25
0.50
0.75
Tensão Passiva (g)
FIGURA 7. A, Resposta vasoconstritora à fenilefrina (10-7 M) nas diferentes tensões passivas
em anéis de aorta de ratas grávidas (G) e não grávidas (NG) na presença de 100 µM de LNNA. B, Relaxamento à acetilcolina (ACh, 10-6M) antes e após a adição de L-NNA (n=7,
*P<0,05 ANOVA, G vs. NG).
42
Com a finalidade de verificar como a hiporeatividade à fenilefrina
associada à gestação se manifestava com adições crescentes dessa droga,
realizamos curvas com concentrações cumulativas desse vasoconstritor (10-9 –
3x10-6 M) em anéis de aorta de ratas grávidas e não grávidas utilizando 1 grama
como tensão passiva inicial.
A
fenilefrina
foi
capaz
de
induzir
contrações
dependentes
da
concentração nos anéis de aorta de ratas não grávidas e grávidas. Anéis de aorta
com o endotélio preservado obtidos de ratas grávidas apresentaram diminuição da
reatividade à fenilefrina quando comparados com os obtidos de ratas não grávidas,
manifestada por diminuição de efeito máximo (FIG. 8). Esses resultados
demonstram claramente a hiporeatividade associada ao término da gestação e
confirmam os achados descritos na literatura.
Tensão Ativa (g)
1.5
NG
G
1.0
0.5
0.0
-9
-8
-7
-6
-5
Fenilefrina (log M)
NG
G
pD2
7,43±0,08
7,14±0,13
Emáx
1,04±0,09
0,61±0,05*
* P<0,01 em relação à NG
FIGURA 8. Curvas concentração-efeito para fenilefrina (10-9 a 3x10-6 M) e valores de pD2 e
efeito máximo (Emáx) obtidos em anéis de aorta com o endotélio preservado isolados de ratas
grávidas (G) e não grávidas (NG) utilizando 1 grama de tensão passiva inicial. Os pontos
representam a média±EPM dos experimentos realizados (n=8).
43
A fim de identificar se a camada endotelial participa da hiporeatividade
associada à gestação nesta condição experimental provocamos a lesão mecânica
do endotélio. A remoção do endotélio vascular aumentou a eficácia em anéis de
aorta de ratas grávidas (P<0,05) e a sensibilidade à fenilefrina em grávidas e não
grávidas (P<0,001) quando comparado com os grupos com o endotélio preservado.
Quando comparamos grávidas e não grávidas, a retirada do endotélio foi capaz de
abolir as diferenças entre os grupos, evidenciando, portanto, a importância dos
fatores endoteliais na determinação da hiporeatividade associada à gestação (FIG.
9).
Tensão Ativa (g)
1.5
NG
G
1.0
0.5
0.0
-9
-8
-7
-6
-5
Fenilefrina (log M)
NG
G
pD2
8,16±0,13
8,13±0,15
Emáx
1,10±0,09
1,02±0,14
FIGURA 9. Curvas concentração-efeito para fenilefrina (10-9 a 3x10-6 M) e valores de pD2 e
efeito máximo (Emáx) obtidos em anéis de aorta com o endotélio retirado isolados de ratas
grávidas (G) e não grávidas (NG) utilizando 1 grama de tensão passiva inicial. Os pontos
representam a média±EPM dos experimentos realizados (n=8-11).
44
A adição de L-NNA aumentou a potência e a eficácia da fenilefrina em
anéis de aorta de ratas grávidas e não grávidas, e não foi capaz de alterar as
diferenças de reatividade entre esses grupos (FIG. 10A). O relaxamento induzido por
acetilcolina (10-6 M) foi completamente abolido com a concentração utilizada de LNNA, mostrando a eficácia da inibição da NOS (FIG. 10B).
% Relaxamento ACh
125
A
Tensão Ativa (g)
2
G
NG
G (L-NNA)
NG (L-NNA)
NG
G
100
B
75
50
25
0
Controle
L-NNA
1
0
-9
-8
-7
-6
-5
Fenilefrina (log M)
Controle
L-NNA
NG
G
NG
G
pD2
7,23±0,05
7,12±0,09
7,95±0,07#
7,73±0,09#
Emáx
0.96±0,04
0,73±0,04**
1,61±0,06#
1,31±0,09*#
*P<0,05 e **P<0,01 em relação à NG; #P<0,001 em relação ao controle.
FIGURA 10. A, Curvas concentração-efeito para fenilefrina (10-9 a 3x10-6) e valores de pD2 e
efeito máximo (Emáx) obtidos em anéis de aorta de ratas grávidas (G) e não grávidas (NG)
com o endotélio preservado na tensão passiva inicial de 1 grama na presença ou ausência de
L-NNA. B, Porcentagem de relaxamento induzido por acetilcolina (ACh, 10-6 M) antes e após a
adição de L-NNA em G e NG. Os pontos representam a média±EPM dos experimentos
realizados (n=8).
45
Com o intuito de confirmar a pouca participação do NO na hiporeatividade
associada ao término da gestação na aorta na tensão passiva de 1 grama,
utilizamos como segunda abordagem experimental a pré-incubação com ODQ, um
inibidor de guanilato ciclase. A enzima guanilato ciclase é ativada pelo NO produzido
nas células endoteliais e transforma GTP em GMP cíclico que, por sua vez, promove
relaxamento da musculatura lisa vascular. A adição de ODQ em uma concentração
capaz de abolir o relaxamento por acetilcolina (FIG. 11B), apesar de ter aumentado
a potência e a eficácia da fenilefrina em ambos os grupos, como observado com a
pré-incubação de L-NNA, não reverteu a hiporeatividade dos anéis de aorta de ratas
no final da gestação em relação a ratas não grávidas (FIG. 11A). Esses dados
reforçam a hipótese de que outros fatores vasoativos além da via NOS/NO/GMPc
podem colaborar para as diferenças nas respostas vasculares entre grávidas e não
grávidas.
46
3
G
NG
G (ODQ)
NG (ODQ)
2
B
125
% Relaxamento ACh
Tensão Ativa (g)
A
1
NG
G
100
75
50
25
0
Controle
ODQ
0
-9
-8
-7
-6
-5
Fenilefrina (log M)
Controle
ODQ
NG
G
NG
G
pD2
7,17±0,06
7,00±0,11
8,10±0,10*
7,86±0,11*
Emáx
1,12±0,08
0,69±0,08*
2,47±0,28*
1,44±0,17*#
* P<0,001 em relação ao controle; # P<0,001 em relação à NG
FIGURA 11. A, Curvas concentração-efeito para fenilefrina (10-9 a 3x10-6 M) e valores de pD2 e
efeito máximo (Emáx) obtidos em anéis de aorta de ratas grávidas (G) e não grávidas (NG)
com o endotélio preservado na tensão passiva inicial de 1 grama na presença ou ausência de
ODQ. B, Porcentagem de relaxamento induzido por acetilcolina (ACh, 10-6 M) antes e após a
adição de ODQ em G e NG. Os pontos representam a média±EPM dos experimentos
realizados (n=5-7).
47
A inibição da COX com diclofenaco de sódio não promoveu nenhuma
alteração da reatividade à fenilefrina nos anéis de aorta de ratas grávidas. Em não
grávidas houve uma aparente redução de reatividade, no entanto quando
comparamos o efeito máximo e o deslocamento na concentração que promove 50%
do efeito máximo (pD2) não encontramos diferença significativa (P=0,054 e P=0,87,
respectivamente, FIG. 12). Porém, esta pequena redução da reatividade à fenilefrina
promovida pelo diclofenaco em não grávidas abole as diferenças associadas à
Tensão Ativa (g)
gestação.
1.5
NG
G
NG (DF)
1.0
G (DF)
0.5
0.0
-9
-8
-7
-6
-5
Fenilefrina (log M)
Controle
DF
NG
G
NG
G
pD2
7,34±0,09
7,22±0,06
7,36±0,09
7,18±0,08
Emáx
1,09±0,07
0,81±0,09*
0,88±0,07
0,82±0,07
*P<0,05 comparado com NG
FIGURA 12. Efeito da adição de diclofenaco (DF) na resposta vasoconstritora induzida por
fenilefrina (10-9 a 3x10-6 M) e valores de pD2 e efeito máximo (Emáx) obtidos em anéis de aorta
de ratas grávidas (G) e não grávidas (NG) com o endotélio preservado utilizando 1,0 grama de
tensão passiva. Os pontos representam a média±EPM dos experimentos realizados (n=7-9).
48
A inibição da NOS somada à inibição da COX aumentou a potência e a
eficácia da fenilefrina em anéis de aorta de ratas grávidas e não grávidas, como
havíamos observado com a pré-incubação isolada de L-NNA, e manteve abolidas as
diferenças entre os grupos, de forma semelhante à incubação de diclofenaco (FIG.
13A). A concentração de L-NNA utilizada foi capaz de abolir o efeito vasodilatador
da acetilcolina em grávidas e não grávidas (FIG. 13B)
A
NG
G
125
% Relaxamento ACh
Tensão Ativa (g)
2
NG (DF+L-NNA)
G (DF+L-NNA)
1
NG
G
B
100
75
50
25
0
Controle
DF + L-NNA
0
-9
-8
-7
-6
-5
Fenilefrina (log M)
Controle
DF+L-NNA
NG
G
NG
G
pD2
7,34±0,09
7,22±0,06
7,88±0,09**
7,66±0,04***
Emáx
1,09±0,07
0,81±0,09#
1,52±0,15*
1,42±0,11**
*P<0,05, **P<0,01 ***P<0,001, comparado ao controle; #P<0,05 comparado com NG
FIGURA 13. A, Efeito do L-NNA somado ao diclofenaco na resposta vasoconstritora induzida
por fenilefrina (10-9 a 3x10-6 M) e valores de pD2 e efeito máximo (Emáx) obtidos em anéis de
aorta de ratas grávidas (G) e não grávidas (NG) utilizando 1 grama de tensão passiva. B,
Porcentagem de relaxamento induzido por acetilcolina (ACh, 10-6 M) antes e após a adição de
L-NNA em G e NG. Os pontos representam a média±EPM dos experimentos realizados (n=78).
49
Concentrações cumulativas de acetilcolina promoveram relaxamento
concentração-dependente em anéis de aorta de ratas grávidas e não grávidas précontraídos com 50 a 80% do efeito máximo da fenilefrina. Embora no grupo
composto por ratas grávidas houve um aumento aparente da sensibilidade à
acetilcolina, não foram encontradas diferenças significativas (P=0,064, FIG. 14).
% Relaxamento
0
NG
G
50
100
-8
-7
-6
-5
Acetilcolina (log M)
NG
G
pD2
7,7±0,07
8,17±0,21
Emáx
97,3±4,2
107,7±5,3
FIGURA 14. Curvas concentração-efeito para acetilcolina (10-8 – 3x10-6 M) em anéis de aorta
de ratas grávidas (G) e não-grávidas (NG) utilizando 1 grama de tensão passiva. Os pontos
representam a média±EPM dos experimentos realizados (n=6-7).
50
Com o objetivo de verificar como pequenas variações experimentais
podem modificar a reatividade à fenilefrina em ratas grávidas, foram repetidas
algumas abordagens utilizando 0,5 grama como tensão passiva inicial.
A
fenilefrina
foi
capaz
de
induzir
contrações
dependentes
da
concentração nos anéis de aorta de ratas grávidas e não grávidas. Anéis de aorta
com o endotélio preservado obtidos de ratas grávidas apresentaram diminuição da
reatividade à fenilefrina quando comparados com os obtidos de ratas não grávidas,
manifestada por diminuição de efeito máximo e deslocamento da curva para a direita
(FIG. 15). Esses resultados demonstram claramente a hiporeatividade associada ao
término da gestação também nesta tensão passiva, confirmando os achados
descritos na literatura.
Tensão Ativa (g)
1.5
NG
G
1.0
0.5
0.0
-9
-8
-7
-6
-5
Fenilefrina (log M)
NG
G
pD2
7,50±0,14
6,97±0,10*
Emáx
0,92±0,04
0,65±0,04**
* P<0,05, ** P<0,01 em relação a NG
FIGURA 15. Curvas concentração-efeito para fenilefrina (10-9 a 3x10-6 M) e valores de pD2 e
efeito máximo (Emáx) obtidos em anéis de aorta com o endotélio preservado isolados de ratas
grávidas (G) e não grávidas (NG) utilizando 0,5 grama de tensão passiva inicial. Os pontos
representam a média±EPM dos experimentos realizados (n=6-7).
51
A pré-incubação dos anéis de aorta de ratas grávidas e não grávidas com
L-NNA utilizando 0,5 grama de tensão passiva inicial aumentou a potência e a
eficácia da fenilefrina em ambos os grupos. Foi capaz, ainda, de igualar a
reatividade à fenilefrina entre grávidas e não grávidas (FIG. 16A), confirmando dados
obtidos previamente em nosso laboratório e demonstrando a importância de
pequenas alterações nas condições experimentais para a visualização dos fatores
que determinam a hiporeatividade associada à gestação. A concentração utilizada
de L-NNA mostrou-se eficaz em abolir o efeito vasodilatador da acetilcolina (FIG.
16B).
A
NG
125
G
NG (L-NNA)
% Relaxamento ACh
Tensão Ativa (g)
2
G (L-NNA)
1
NG
G
100
75
50
25
0
Controle
L-NNA
0
-9
-8
-7
-6
-5
Fenilefrina (log M)
Controle
L-NNA
NG
G
NG
G
pD2
7,50±0,14
6,97±0,10#
7,89±0,08*
7,77±0,08**
Emáx
0,92±0,04
0,65±0,04##
1,61±0,19**
1,50±0,08**
* P<0,05, ** P<0,01 em relação ao controle; # P<0,05, ## P<0,01 em relação a NG
FIGURA 16. A, Curvas concentração-efeito para fenilefrina (10-9 a 3x10-6 M) e valores de pD2 e
efeito máximo (Emáx) obtidos em anéis de aorta isolados de ratas grávidas (G) e não grávidas
(NG) na tensão passiva inicial de 0,5 grama na ausência e presença de L-NNA. B,
Porcentagem de relaxamento induzido por acetilcolina (ACh, 10-6 M) antes e após a adição de
L-NNA em G e NG. Os pontos representam a média±EPM dos experimentos realizados (n=57).
B
52
A inibição da COX com diclofenaco de sódio em 0,5 grama de tensão
passiva, como nos experimentos realizados com 1 grama, não promoveu nenhuma
alteração da reatividade à fenilefrina nos anéis de aorta de ratas grávidas. Em não
grávidas, novamente houve uma aparente redução de reatividade, no entanto,
quando comparamos o efeito máximo e o deslocamento na concentração que
promove 50% do efeito máximo (pD2) não encontramos diferença significativa
(P=0,36 e P=0,08, respectivamente, FIG. 17). Porém, esta pequena redução da
reatividade à fenilefrina promovida pelo diclofenaco em não grávidas, novamente em
0,5 grama de tensão passiva, aboliu as diferenças associadas à gestação.
1.5
NG
Tensão Ativa (g)
G
NG (DF)
1.0
G (DF)
0.5
0.0
-9
-8
-7
-6
-5
Fenilefrina (log M)
Controle
DF
NG
G
NG
G
pD2
7,50±0,14
6,97±0,10*
7,10±0,15
7,10±0,15
Emáx
0,92±0,04
0,65±0,04**
0,84±0,08
0,73±0,09
* P<0,05, ** P<0,01 em relação a NG
FIGURA 17. Efeito da adição de diclofenaco na resposta vasoconstritora induzida por
fenilefrina (10-9 a 3x10-6) e valores de pD2 e efeito máximo (Emáx) obtidos em anéis de aorta de
ratas grávidas (G) e não-grávidas (NG) utilizando 0,5 grama de tensão passiva. Os pontos
representam a média±EPM dos experimentos realizados (n=5-7).
53
A adição de L-NNA ao diclofenaco aumentou a potência e a eficácia da
fenilefrina em anéis de aorta de ratas grávidas e não grávidas, como havíamos
observado somente com a inibição da NOS, e aboliu as diferenças entre os grupos
de forma semelhante à incubação de diclofenaco (FIG. 18A). A concentração
utilizada de L-NNA mostrou-se eficaz em abolir o efeito vasodilatador da acetilcolina
(FIG. 18B).
A
NG
G
125
% Relaxamento ACh
Tensão Ativa (g)
2
NG (DF+L-NNA)
G (DF+L-NNA)
1
NG
G
B
100
75
50
25
0
Controle
DF + L-NNA
0
-9
-8
-7
-6
-5
Fenilefrina (log M)
Controle
DF + L-NNA
NG
G
NG
G
pD2
7,50±0,14
6,97±0,10
7,91±0,08*
7,81±0,07**
Emáx
0,92±0,04
0,65±0,04
1,51±0,13**
1,62±0,12**
*P<0,05, **P<0,01, comparado ao controle
FIGURA 18. A, Efeito da somatória de diclofenaco e L-NNA na resposta vasoconstritora
induzida por fenilefrina (10-9 a 3x10-6) e valores de pD2 e efeito máximo (Emáx) obtidos em
anéis de aorta de ratas grávidas (G) e não-grávidas (NG) utilizando 0,5 grama de tensão
passiva. B, Porcentagem de relaxamento induzido por acetilcolina (ACh, 10-6 M) antes e após a
adição de L-NNA em G e NG. Os pontos representam a média±EPM dos experimentos
realizados (n=5-7).
6. Discussão
55
6. Discussão
Inicialmente neste estudo determinamos a influência da tensão passiva
sobre a resposta à fenilefrina em anéis de aorta de ratas virgens na fase estro do
ciclo estral e de ratas grávidas ao final da gestação. Nosso objetivo era verificar se
diferentes condições iniciais poderiam alterar a reatividade vascular durante a
gestação, explicando, assim, parte das divergências sobre a participação do NO
e/ou prostanóides encontradas na literatura (Davidge & McLaughlin, 1992; Ballejo e
cols, 2002; Brooks e cols, 2001; Paller, 1984; Harrison & Moore, 1989)
Observamos que existe uma relação entre o estiramento do tecido,
imprimido pela tensão passiva inicial, e a reatividade a um agonista α1-adrenérgico,
como a fenilefrina, em anéis de aorta de ratas grávidas e não grávidas. Em nossos
experimentos, quanto maior foi a tensão passiva inicial a que o tecido foi exposto,
maior foi a tensão ativa desenvolvida em resposta ao estímulo contrátil.
Esse resultado já era esperado, visto que na literatura há diversos relatos
do efeito do estiramento na contratilidade de vasos isolados. Sparks e Bohr (1962)
demonstraram que o aumento do estiramento de tiras helicoidais de ramificações da
artéria mesentérica superior de cão aumenta o efeito vasoconstritor induzido por
estímulo elétrico ou por agonista como epinefrina. Esse achado foi reproduzido mais
tarde por Peipre e cols (1973), em tiras helicoidais de artéria coronária suína, e por
Dobrin (1973), em artéria carótida de cão. Toda e cols (1978), além de confirmarem
o aumento da tensão ativa desenvolvida a diferentes agentes vasoconstritores em
diferentes vasos de cão relacionado ao aumento da tensão passiva, estudaram o
relaxamento induzido por adenosina em tiras de artéria cerebral, encontrando um
aumento do efeito vasodilatador correspondente ao aumento da tensão passiva.
56
Nosso trabalho acrescenta aos dados já conhecidos que o efeito do
estiramento sobre a contratilidade induzida por fenilefrina em anéis de aorta está
alterado ao fim da gestação de ratas. Embora o estiramento do vaso tenha
determinado um aumento da resposta vasoconstritora à fenilefrina tanto no grupo de
não grávidas como de grávidas, observamos que estas últimas são muito menos
reativas ao estímulo vasoconstritor. Esse dado nos permite concluir que os vasos de
ratas grávidas são mais resistentes ao estímulo contrátil mesmo quando expostos a
aumentos crescentes do estiramento.
Um dos mecanismos que poderia explicar essa refratariedade a
vasoconstritores associada à gestação que não responde ao estiramento vascular é
uma redução na mobilização de cálcio extracelular. Investigando a contração
induzida por vasopressina em artéria mesentérica de rata, St-Louis e cols (1995)
encontraram diminuição da sensibilidade a esse vasoconstritor durante a gravidez e
a incubação de nifedipina, um bloqueador de canal de cálcio operado por voltagem,
produziu deslocamento da curva concentração-efeito para a direita de grávidas e
não grávidas de modo a sobrepor as curvas. Esse dado sugere que parte da
hiporeatividade a constritores se deve a uma menor capacidade de mobilização de
cálcio extracelular durante a gestação. Ademais o NO, que aparentemente está
aumentado durante a gestação, pode modular parte da mobilização do cálcio
extracelular
visto
que
experimentos,
utilizando
aorta
de
ratas
grávidas,
demonstraram que o tratamento prévio com L-NAME aumenta o influxo de cálcio
após estímulo com fenilefrina ou KCl (Crews e cols, 1999).
A retirada do endotélio, bem como a inibição da NOS com L-NNA,
demonstrou que fatores relaxantes endoteliais, dentre eles principalmente o NO,
57
modulam o efeito constritor da fenilefrina em anéis de aorta de ratas grávidas e não
grávidas nas diferentes tensões passivas.
Essa liberação de NO capaz de modular o efeito constritor da fenilefrina
pode se dar de maneira espontânea ou estimulada pelo próprio agonista ou pela
contração per se. Como nosso modelo experimental não permite a visualização de
qualquer efeito relaxante sem a prévia pré-contração do vaso, não conseguimos
afirmar a existência de uma produção espontânea de NO, embora seja uma hipótese
pertinente. Quanto à estimulação por fenilefrina os são dados controversos. Há
evidências que a ativação de receptores α1-adrenérgicos estimulam o influxo de
cálcio na célula endotelial, podendo, portanto, ativar a NOSe (Tuttle & Falcone,
2001); por outro lado, outros experimentos demonstram que a fenilefrina não é
capaz de alterar a formação de GMPc quando adicionada em anéis de aorta de
ratos (Martin e cols, 1986). Finalmente, alguns achados sugerem que a contração
per se seria capaz de aumentar a liberação de NO (Fleming e cols, 1999).
Nossos resultados demonstram que a retirada do endotélio ou a adição
de L-NNA não foram capazes de abolir a diminuída reatividade observada durante a
gestação nos anéis de aorta submetidos a maiores tensões passivas, sugerindo que
o aumento da produção de NO não é o bastante para explicar as alterações de
reatividade vascular observadas nessa condição.
Em anéis de aorta de ratas não grávidas observamos que parte do efeito
constritor da fenilefrina se deve à produção de prostanóides constritores, desde que
a adição de diclofenaco diminuiu a responsividade vascular a esse agonista.
Fatores constritores derivados da COX participam do efeito vasoconstritor
induzido por fenilefrina em anéis de aorta de ratas não grávidas, mas parecem
ausentes em anéis de aorta de ratas grávidas. Esse desaparecimento dos fatores
58
constritores derivados da COX ou a ineficácia do efeito dos mesmos em induzir
contração vascular parece determinar parte da hiporesponsividade vascular a
constritores observada nesses animais durante a gestação.
Verificamos, ainda, em nossos experimentos que, embora tenha havido
um aumento da magnitude da resposta à fenilefrina após a retirada do endotélio ou
inibição da NOS em anéis de aorta de grávidas e não grávidas e diminuição dessa
resposta após a inibição da COX em preparações obtidas de ratas não grávidas,
esses tratamentos não evitaram que a resposta vasoconstritora α1-adrenérgica fosse
aumentada pelo estiramento do tecido. Esses dados estão de acordo com os
achados de Dainty e cols (1990) que demonstraram que a retirada do endotélio em
anéis de aorta de rato não altera o aumento da resposta à fenilefrina induzido pelo
aumento da tensão passiva.
Comparando a resposta a concentrações cumulativas de fenilefrina em
anéis de aorta de ratas grávidas em relação a não grávidas nas tensões passivas de
0,5 e 1 gramas pudemos observar uma diminuição da reatividade associada à
gestação, confirmando os resultados encontrados nos experimentos anteriores onde
fixamos a concentração de fenilefrina e variamos a tensão passiva inicial. Esses
achados confirmam, ainda, a maioria dos dados da literatura, embora nem todos os
trabalhos tenham observado a diminuição de efeito máximo que nós observamos em
ambas as tensões (Aloamaka e cols, 1993; Cadorette e cols, 2000; St-Louis &
Sicotte, 1992; Ballejo e cols, 2002).
Após a retirada do endotélio observamos aumento da resposta contrátil à
fenilefrina em anéis de aorta de grávidas e não grávidas submetidos à 1 grama de
tensão passiva, confirmando os dados obtidos anteriormente nas diferentes tensões.
Esse aumento da resposta contrátil sugere que o endotélio é capaz de liberar
59
substâncias vasodilatadoras que modulam o tônus vascular. No mínimo três
substâncias
diferentes
já
foram
identificadas:
prostaciclina,
NO
e
fator
hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF). A prostaciclina é o principal
metabólito da COX nas células endoteliais e induz relaxamento, embora alguns
trabalhos demonstrem que o aumento da concentração dessa substância é capaz de
contrair aorta isolada de rato (Vam Dam e cols, 1986; Williams e cols, 1994). No
entanto, a prostaciclina não parece ter importância no controle do tônus vascular no
nosso modelo experimental, visto que a inibição da COX com diclofenaco não
aumentou a reatividade à fenilefrina. O NO é reconhecidamente o principal
modulador do tônus vascular, sendo que o tratamento de animais com inibidores da
NOS é capaz de induzir aumento mantido da pressão arterial (Resende e cols,
1998). Finalmente, o EDHF é capaz de, a partir da ativação de canais de potássio,
induzir hiperpolarização da membrana da célula muscular lisa e conseqüente
relaxamento vascular. No entanto, este fator não parece importante em vasos de
condutância como a aorta e, sim, em vasos de pequeno calibre, como a artéria
mesentérica e suas ramificações (Brandes e cols, 2000). Podemos concluir, então,
que o aumento da resposta contrátil após a retirada do endotélio está relacionado
principalmente à retirada do componente vasodilatador NO.
A retirada do endotélio dos anéis de aorta que foram estimulados com
concentrações cumulativas de fenilefrina sob 1,0 grama de tensão passiva foi capaz
de abolir completamente a hiporeatividade associada à gestação observada nos
experimentos realizados com o endotélio íntegro, corroborando os dados da
literatura (Aloamaka e cols, 1993; Ballejo e cols, 2002). Esses resultados também
confirmam nossos dados obtidos anteriormente nas diferentes tensões passivas e
60
demonstram a participação dos fatores endoteliais na hiporeatividade associada à
gestação.
Em
trabalho
recente,
Dièye
e
Gairard
(2003)
demonstraram
hiporeatividade à noradrenalina associada ao término da gestação de ratas em anéis
de aorta sem o endotélio. Estes vasos estavam submetidos a 2,0 gramas de tensão
passiva inicial e apresentaram hiporeatividade somente após o aumento da
concentração de cálcio disponibilizada na solução nutriente de Krebs de 1,25 M para
2,5 M. Esse resultado mostra que o aumento da concentração de cálcio extracelular
é suficiente para aumentar a contração de não grávidas, no entanto fracassa em
aumentar a reatividade de grávidas. Esse dado não confronta nossos resultados,
pois quando estimulamos com fenilefrina os anéis de aorta de ratas grávidas e não
grávidas após a retirada do endotélio na tensão passiva de 2,0 gramas também
observamos hiporeatividade associada à gestação. Esses resultados, em conjunto,
indicam que, além de alterações endoteliais, os vasos de ratas grávidas apresentam
alterações musculares, provavelmente relacionadas com a mobilização do cálcio
extracelular, que colaboram com a refratariedade ao efeito contrátil de agonistas α1adrenérgicos.
Considerando que o NO é o principal fator relaxante modulador do tônus
vascular, é razoável pensar que, além de uma capacidade contrátil diminuída, esse
vasodilatador possa estar sendo produzido em maior quantidade nas células
endoteliais dos anéis de aorta de ratas grávidas, colaborando com a hiporeatividade
observada nesses vasos antes da retirada do endotélio. Para testar esta hipótese
realizamos experimentos na presença de inibidor da NOS. A pré-incubação com LNNA de anéis de aorta de ratas grávidas e não grávidas promoveu aumento da
reatividade vascular a concentrações fixas e cumulativas de fenilefrina nas várias
61
tensões passivas, confirmando novamente que o NO é um importante modulador da
contração estimulada por agonistas nesses tecidos. Esse dado corresponde aos
achados da literatura que demonstram que a inibição da NOS por diferentes
inibidores aumenta a reatividade vascular a diferentes agonistas (Joly e cols, 1994;
Srivastava e cols, 2002). Quando comparamos grávidas e não grávidas observamos
que, embora a inibição da NOS reverta parte da hiporeatividade associada à
gestação, o estiramento do segmento vascular permite identificar outros fatores que
participam das alterações de reatividade. Sob a tensão inicial de 0,5 grama a adição
de L-NNA foi capaz de sobrepor as curvas de concentração-efeito para fenilefrina de
grávidas e não grávidas e com 1 grama de tensão as diferenças de reatividade
associadas à gestação foram mantidas.
Com a finalidade de fortalecer a hipótese de que o NO tem pouca
participação na hiporeatividade associada à gestação quando o segmento vascular
está submetido a maiores tensões passivas, utilizamos uma segunda abordagem
experimental: realizamos curvas com concentrações cumulativas de fenilefrina na
presença de ODQ, um inibidor de guanilato ciclase. Como já dissemos
anteriormente, a ativação da guanilato ciclase solúvel por NO estimula essa enzima
a converter GMP em GMPc que induz relaxamento da musculatura lisa vascular. A
pré-incubação com ODQ de anéis de aorta submetidos a 1 grama de tensão inicial
aumentou a reatividade à fenilefrina de grávidas e não grávidas, efeito já observado
por outros pesquisadores (Payne e cols, 2003; Giardina e cols, 2002), no entanto
não foi capaz de modificar as diferenças entre os grupos, confirmando que, embora
o NO exerça importante modulação do efeito contrátil da fenilefrina, seu efeito
vasodilatador não é determinante da hiporeatividade associada à gestação nesta
condição experimental.
62
A adição de concentrações cumulativas de acetilcolina em anéis de aorta
de ratas grávidas e não grávidas pré-contraídos com fenilefrina induziu relaxamento
dependente da concentração que não foi alterado pela gestação. Ainda que se saiba
que a acetilcolina pode estimular a liberação de EDHFs, há indicação que na aorta
essa droga somente é capaz de aumentar a produção de NO (Brandes e cols,
2000); e seu efeito relaxante está relacionado à estimulação da NOS, visto que é
abolido após a adição de L-NNA. Como não há diferença no efeito vasodilatador da
acetilcolina entre grávidas e não grávidas, podemos sugerir que a produção
estimulada por agonistas de NO não está alterada na condição experimental que
utilizamos.
Utilizando 0,5 grama de tensão passiva, também foi demonstrado que a
inibição da NOS é capaz de reverter a hiporeatividade de anéis de aorta de ratas
grávidas à fenilefrina, embora a reatividade à acetilcolina não estivesse alterada
(Ballejo e cols, 2002), como se uma produção de NO espontânea ou estimulada pela
contração vascular estivesse aumentada e a produção estimulada pela ativação da
NOS por agonista muscarínico não estivesse alterada.
Vários trabalhos mostram que a aplicação de inibidores da NOS ou
inibidores da guanilato ciclase em vasos pré-contraídos com o endotélio íntegro é
capaz de aumentar o tônus vascular, indicando que pode haver uma liberação
espontânea de NO ou até mesmo estimulada pela contração vascular (Martin e cols,
1986; Frew e cols, 1993; Bang e cols, 1999). Essa produção espontânea ou
estimulada pela contração pode ser por uma via de ativação da NOSe diferente
daquela usada pela acetilcolina, isto é, independente da formação do complexo
cálcio-calmodulina. Tem sido demonstrado que a NOSe pode ser ativada por
fosforilação
em
resposta
ao
estresse
de
cisalhamento
(shear
stress)
63
independentemente do aumento da concentração de cálcio intracelular (Fleming e
cols, 1997; Fleming e cols, 1998). Reforçando essa hipótese, a inibição da
fosforilação da NOSe reverte o aumento do tônus vascular induzido por L-NNA em
vasos pré-contraídos (Fleming e cols, 1999).
Se a hiporeatividade associada à gestação ainda é presente nas maiores
tensões apesar da inibição da NOS, é possível que o estiramento do tecido tenha
tornado aparente outros produtos vasculares determinantes desse fenômeno. A fim
de
identificar
quais
seriam
esses
outros
produtos
vasculares
realizamos
experimentos na presença de um inibidor da COX, o diclofenaco de sódio.
Anéis de aorta de ratas não grávidas apresentaram diminuição da
reatividade à fenilefrina após a inibição da COX com diclofenaco nas tensões de 0,5
e 1 grama, de modo a abolir as diferenças de reatividade associadas à gravidez
nessas tensões passivas, confirmando os resultados obtidos anteriormente com
concentração única de fenilefrina e variações da tensão passiva. A adição de L-NNA
à pré-incubação com diclofenaco nesses experimentos apenas aumentou a
reatividade à fenilefrina em ambos os grupos sem alterar o efeito inicial de abolir a
hiporeatividade associada à gestação do inibidor da COX.
A diminuição da reatividade à fenilefrina nos anéis de aorta de não
grávidas após a adição de diclofenaco pode estar relacionada à inibição da
produção de prostanóides constritores. Em perfusão de trem posterior de ratas
grávidas e não grávidas Ahokas e cols (1997) observaram diminuição da reatividade
à noradrenalina após a pré-incubação com indometacina, um outro inibidor da COX,
apenas nos leitos vasculares obtidos de não grávidas. Fulton & Stallone (2002)
encontraram diminuição de reatividade a fenilefrina e vasopressina em anéis de
aorta de fêmeas na presença de indometacina. Nestes experimentos a pré-
64
incubação com SQ-29548, antagonista do receptor de endoperóxido e tromboxano
(prostanóides constritores), diminuiu a reatividade à vasopressina e fenilefrina de
maneira semelhante à adição de indometacina.
Como a inibição da COX igualou a reatividade à fenilefrina de grávidas e
não grávidas à medida que diminuiu a responsividade das últimas, podemos inferir
que durante a gestação a aorta não produz prostanóides vasoconstritores ou a
produção é normal mas a célula muscular lisa é insensível ao seu efeito constritor.
Como já dissemos em outro momento, em artérias uterinas de cobaias e arteríolas
da musculatura esquelética de coelhas há uma diminuída reatividade ao U46619,
análogo do tromboxano, e em aortas há uma diminuição na concentração de
receptores para tromboxano ao término da gestação (Weiner e cols, 1992; Ungvari e
cols 2002).
Alterações da COX ou a diminuída sensibilidade dos receptores de
prostanóides podem estar relacionadas às alterações hormonais que acompanham
a gravidez. Durante a gestação de ratas há um aumento significativo dos níveis
séricos de estrogênio (Honda e cols, 1998) e este hormônio parece interagir com a
COX e com os receptores dos seus derivados. A produção de tromboxano e
prostaciclina é diminuída em células endoteliais bovinas em cultura após a adição de
estradiol e em artérias mesentéricas de ratas ovarectomizadas há diminuição da
reatividade ao análogo do tromboxano, U46619, e ao endoperóxido (PGH2) após
tratamento crônico com estrogênio (Stewart e cols, 1999; Davidge & Zang, 1998).
Adicionalmente, concentrações crescentes de ácido araquidônico induz contração
em artérias cerebrais de ratas ovarectomizadas e relaxamento em animais tratados
cronicamente com estrogênio, mostrando que o estrógeno diminui a produção de
prostanóides constritores e aumenta a de dilatadores (Ospina e cols, 2003). Em
65
trabalho recente foi observado, ainda, que o tratamento crônico de ratas grávidas
com um modulador seletivo de receptores de estrogênio, o tamoxifeno, diminuiu os
níveis séricos de estradiol e reverteu a hiporeatividade à fenilefrina de anéis de
artéria mesentérica (Zhang e cols, 2001).
O estrogênio também pode aumentar a produção de NO pela estimulação
da NOSe. O estradiol induz relaxamento vascular concentração-dependente sensível
à inibição da NOS (Smolders e cols, 2002). O tratamento crônico com estradiol
aumenta o relaxamento induzido por acetilcolina em leito coronariano de cobaias e
em anéis de aorta de ratas ovarectomizadas, além de aumentar a expressão de
NOSe (Thompson e cols, 2000; Gonzales e cols, 2001). Células endoteliais de aorta
e células endoteliais de veia umbilical humana em cultura apresentam,
respectivamente, aumento da expressão de NOSe acompanhado por liberação
aumentada de NO (Hishikawa e cols, 1995) e aumento da atividade dessa enzima
após exposição ao estradiol (Hisamoto e cols, 2001). Essa ativação da NOSe por
estrogênio pode ser independente da formação do complexo cálcio-calmodulina,
desde que a adição de estradiol em cultura de células endoteliais promove o
aumento da expressão da NOSe na sua forma fosforilada (Haynes e cols, 2000).
O estrogênio ainda pode alterar a contribuição relativa de NO e de
prostanóides. Em leito mesentérico de rata pré-contraído com fenilefrina, por
exemplo, o relaxamento induzido por agonista de receptor H1 de histamina, 2-TEA,
depende de NO e prostanóides. Após a ovarectomia desses animais há a redução
dos níveis de estradiol e os componentes derivados da COX ganham mais
importância para determinar o relaxamento ao 2-TEA e o tratamento crônico com
estradiol faz com que o NO seja o responsável por esse relaxamento. Portanto, na
falta do estrogênio os derivados vasodilatadores da COX são mais importantes e na
66
sua presença o NO é o componente relaxante mais importante no relaxamento
induzido por 2-TEA nesses vasos (Case & Davison, 1999).
Finalmente, diante dos nossos resultados, podemos sugerir que as
adaptações vasculares durante a gravidez modulam o aumento do efeito constritor
da fenilefrina estimulado pelo aumento da tensão passiva, não aumentando o tônus
apesar do aumento do estiramento vascular. Concluímos, ainda, que uma maior
produção de fatores relaxantes, como NO, e menor produção ou reatividade vascular
a fatores contráteis, como prostanóides constritores, determinam a hiporeatividade
de aortas de ratas ao término da gestação, sendo que as condições experimentais
impostas podem alterar a participação relativa desses fatores.
7. Conclusões
68
7. Conclusões
Os dados apresentados nessa dissertação permitem concluir:
•
O aumento da tensão passiva determina aumento da reatividade à fenilefrina em
anéis de aorta de ratas grávidas e não grávidas;
•
Anéis de aorta de ratas grávidas apresentam hiporeatividade à fenilefrina quando
comparados com anéis de não grávidas, sendo que o estiramento do tecido não
é capaz de corrigir essa diferença de reatividade;
•
A maior produção de fatores relaxantes, como NO, e menor produção ou
reatividade vascular a prostanóides constritores, determinam a hiporeatividade de
aortas de ratas ao término da gestação;
•
O estiramento do tecido vascular altera a contribuição relativa de NO e de
prostanóides na alteração de reatividade a constritores em aortas de ratas
grávidas.
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