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IV Mostra de Pesquisa
da Pós-Graduação
PUCRS
Avaliação da Atividade Antimicrobiana por Bioautografia
Indireta dos Óleos Essenciais de Cymbopogum winterianus L.
e Rosmarinius officinalis L. Extraídos pelos Métodos de
Arraste à Vapor e Extração por CO2 Supercrítico.
Marcos Aurélio Almeida Pereira 1e2 ( [email protected]), Manuel Alves Falcão 1,
Prof.ª Denise Milão 1(coorientadora), Prof. Eduardo Cassel 2e3(orientador)
1
Faculdade de Farmácia, PUCRS; 2Programa de Pós Graduação em Engenharia e Tecnologia
de Materiais PGETEMA, PUCRS; 3Laboratório de Operações Unitárias, FENG, PUCRS.
Introdução
Existe uma crescente demanda, atualmente, por produtos com manejo cultural do tipo
“orgânico”, sem a utilização de agrotóxicos e adubos de origem industrial, para o uso na
saúde, na estética, na alimentação, entre outros. Na área da saúde estão sendo feitos
investimentos governamentais e privados no desenvolvimento da fitoterapia e medicina
complementar. O aumento da resistência bacteriana aos medicamentos disponíveis no
mercado é um indicador que novas alternativas terapêuticas aos antimicrobianos devem ser
estudadas e pesquisadas. O alecrim, Rosmarinus officinalis (Lamiaceae) e a citronela
Cymbopogum winterianus (Poaceae) possuem diversos usos citados na literatura, inclusive o
de antimicrobiano e antifúngico. Os óleos essenciais são uma mistura complexa de terpenos e
sesquiterpenos. São produtos do metabolismo secundário das plantas e estão sujeitos as
variações do clima, altitude, solo, luminosidade que influenciam na composição desses e na
relação percentual dos constituintes. Quando essas relações entre os diversos compostos
químicos que formam o óleo essencial se modificam por fatores abióticos, a sua atividade
antimicrobiana pode ser anulada, aumentada ou ainda modificada. Esses fatores abióticos,
edafoclimáticos, são mais estudados indiretamente quando se avalia o óleo essencial de uma
microregião específica. Já a influência da tecnologia de extração na composição final do óleo
apresenta um número bem menor de publicações.
O objetivo deste trabalho é avaliar a atividade antimicrobiana, pelo método de bioautografia
indireta dos óleos essenciais de alecrim e citronela, extraídos por arraste a vapor e extração por
CO2 supercrítico, frente à Escherichia coli, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus,
Salmonela typhymurium, Cândida albicans e Aspergillus niger wild.
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Metodologia
O processo de extração dos óleos essenciais por arraste à vapor consiste em passar vapor à
temperatura de aproximadamente 100°C por um leito fixo de massa verde de planta
aromática, interno a um vaso extrator. Pelo efeito da temperatura do vapor em fluxo
ascendente, ocorre o rompimento das células que contêm o óleo. Esse, em contato com o
vapor, é arrastado até o condensador. No bocal de saída do condensador, o condensado, água
e óleo essencial são separados. No processo de extração supercrítica, o CO2 é liquefeito
através de compressão e, em seguida, aquecido a uma temperatura superior ao seu ponto
crítico, 31 °C e pressurizado a uma pressão acima de 73 bar, pressão crítica. Nessa condição o
CO2 atinge o estado supercrítico no qual sua viscosidade é análoga à de um gás, mas sua
capacidade de dissolução é elevada como a de um líquido. Ao passar por um leito de massa de
planta ocorre a extração do óleo. Após, o CO2 retorna ao estado gasoso, e libera o óleo
essencial extraído em outro compartimento do equipamento onde a pressão a temperatura
estão nas condições ambientes.
A metodologia da bioautografia indireta implica em fazer uma cromatografia em camada
delgada (CCD). Os óleos essenciais foram aplicados em placas de sílica gel (ALUGRAM®
SIL G/UV₂₅₄), e para a fase móvel foram utilizados tolueno (Synth) e acetato de etila
(Nuclear) na proporção 93:7. Após a migração, ocorre a separação de alguns dos compostos
do óleo essencial e a placa de sílica é aerada para eliminar a possível interferência dos
solventes no teste antimicrobiano. Os inóculos dos microorganismos, Escherichia coli ATCC
25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Micrococcus luteus ATCC 9341 e Salmonela
typhymurium ATCC 14028 foram preparados a 1,5x10⁸ UFC/mL, conforme tubo 0,5 da
escala de Mac Farland, Cândida albicans ATCC 28367 a 9,0X10⁸ UFC/mL (tubo 3) e o
Aspergillus niger wild a 1,0x10⁷ esporas por mL, contados em câmara de Neubauer. O
inóculo é preparado e diluído em ágar Müller-Hinton (Merck) até se obter a concentração de
trabalho de 1,5x106 UFC/mL para Escherichia coli, Micrococcus luteus, Staphylococcus
aureus, Salmonela. Para Candida e Aspergilus a concentração final de trabalho em ágar
Sabourad (Merck) é 9,0X106 e 1,0X105 respectivamente. As placas cromatográficas são então
colocadas em uma placa de Petry e o meio de cultura inoculado é vertido sobre esta a fim de
formar uma fina camada. Também são testados os óleos puros e como controle positivo de
inibição são usados o antibiótico Amoxicilina para bactérias e Cetoconazol para fungos. A
inibição do crescimento é facilmente identificada pela adição de um revelador à base de sal de
tetrazólio, INT “p-iodonitrotetrazolium violet” (Sigma).
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Resultados e Discussão
Os resultados obtidos e expressos na tabela 1 são fruto de um trabalho de ajustes e
padronização das condições do ensaio, conciliando o fenômeno físico de difusão e os
fenômenos biológicos relacionados ao microorganismo, espessura e uniformidade da camada
do meio de cultura e as condições de incubação. Neste estudo foi possível avaliar e comparar
a ação antimicrobiana dos óleos essenciais de alecrim e citronela, tanto puros, com todos os
seus constituintes, quanto fracionados por cromatografia em camada delgada, ao serem
extraídos por arraste à vapor e por CO2 supercrítico. As quatro combinações, para cada óleo,
possibilitaram comprovar a existência de sinergismo entre os seus componentes, quando o
óleo puro inibiu o crescimento e a fração não e a maior atividade de alguns componentes da
fração do óleo, quando o óleo puro e a fração inibiram o crescimento. A importância do
processo extrativo na atividade do óleo quando houve inibição apenas por um processo.
Tabela 1: Óleo Supercrítico (SC) e Arraste à vapor (AV) frente aos Microrganismos (MO)
Óleo Essencial
M. lúteos
E. coli
+(F; O)
+
-
+ (F)
+ (O)
-
C. albicans
A. Niger
S. Aureus
Salmonela
Citronela (AV)
+ (F; O)
+ (F; O)
+
Alecrim (SC)
+ (F;O)
Alecrim (AV)
+ (O)
+ (O)
Legenda: (+) inibição de crescimento do MO; ( - ) não houve inibição do MO; ( F ) inibição na fração um dos
Citronela (SC)
constituintes do óleo; ( O ) inibição do óleo puro com todos os constituintes.
Para dar continuidade aos estudos é necessário identificar quimicamente os componentes, as
frações e a diferença da composição entre os óleos gerada pela forma de extração, utilizando–
se para isso de métodos analíticos quantitativos e qualitativos, como cromatografia gasosa,
cromatografia gasosa acoplada à massa e cromatografia líquida de alta eficiência. Assim,
poderemos apontar qual ou quais componentes presentes nas plantas são potenciais agentes
antimicrobianos.
Referências
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