CONVÊNIOS CNPq/UFU & FAPEMIG/UFU
Universidade Federal de Uberlândia
Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação
DIRETORIA DE PESQUISA
COMISSÃO INSTITUCIONAL DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA
2008 – UFU 30 anos
ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS E
DA RIZOSFERA EM RAÍZES DE ALGODOEIRO E TESTE DE INDUÇÃO
DE CRESCIMENTO IN VITRO
Juliana Rainho Teixeira1;
Universidade Federal de Uberlândia – Av. Amazonas, s/n, Umuarama, Uberlândia. CEP: 38400-902
[email protected]
Ana Paula de Oliveira Ribeiro2;
Rafael Rogerio Pereira da Silva3;
Maria Amelia dos Santos4;
Adão de Siqueira Ferreira5
Resumo: O presente trabalho teve como objetivo, fazer um isolamento de bactérias fixadoras de
nitrogênio presentes em raízes de algodoeiro cultivado em solos do Cerrado da região de
Uberlândia (MG) e testar a ação destas bactérias na mesma espécie vegetal cultivada in vitro para
verificar se são capazes de promover crescimento. As plantas coletadas foram lavadas em água
corrente e, em seguida, foram desinfetadas (endosfera) ou não (rizosfera) superficialmente. As
amostras foram trituradas em liquidificador e diluídas em série para obtenção de suspensões.
Alíquotas de 100 µL das suspensões do homogenato foram inoculadas em triplicata em tubos
Falcon contendo meios semi-sólidos seletivos: LGI, LGI NOVO e LGI-P. Os tubos foram incubados
a 30 °C por 7 dias. Utilizou-se a tabela de McCrady para o cálculo do número mais provável
(NMP) de bactérias para estimar a população. Foram obtidos 67 isolados que foram
caracterizados morfologicamente nos meios EMB, MacConkey, 523, LB e Batata-P e submetidos
aos testes bioquímicos Citrato-Simmons, SIM e fermentação da glicose. A maioria foi
caracterizada como bactérias Gram negativas e com forma bastante variada. Foram selecionados
oito isolados que foram testados para a capacidade de promover crescimento in vitro de plântulas
de algodão. Para tal, sementes foram desinfestadas e colocadas em meio LGI para germinação no
escuro durante uma semana, posteriormente, foram transferidas para ambiente iluminado por 12
horas diárias. Após duas semanas, as plântulas de algodão foram cortadas aproximadamente 2 cm
abaixo do hipocótilo e transferidas para frascos com meio MS, imersas em solução contendo
isolados a 400 Abs e mantidas por aproximadamente 20 dias. Observou-se que a contaminação foi
relativamente pequena e os melhores resultados foram obtidos nas plântulas acondicionadas em
meio MS com BAP, mas não podemos deixar de citar que alguns isolados estão apresentando
resultado comparável.
Palavras-chave: bactérias fixadoras de nitrogênio, Gossypium hirsutum, cultura de tecidos
vegetais e biotecnologia.
1. INTRODUÇÃO
O reconhecimento da importância da microbiologia do solo e a busca de alternativas para
diminuir o consumo de fertilizantes nitrogenados levaram à intensificação de pesquisas na área de
fixação biológica de nitrogênio. No Brasil, o fertilizante nitrogenado representa o maior custo entre
os fertilizantes, já que sua compra não é subsidiada e a quantidade requerida pela planta é uma das
maiores em relação aos outros macronutrientes, a exemplo do fósforo e potássio. Além disso, o uso
excessivo de fertilizantes nitrogenados representa risco de contaminação ambiental.
A fixação biológica do nitrogênio é, após a fotossíntese, o processo mais importante no
planeta. Na natureza, somente alguns microrganismos procariotos conhecidos como diazotróficos
(1) Acadêmica do curso de Ciências Biológicas; (2) Pós - Doutoranda em Agronomia UFU/FAPEMIG; (3) Acadêmico do curso
de Agronomia; (4) Docente do Instituto de Ciências Agrárias; (5) Orientador e docente do Instituto de Ciências Agrárias.
ou fixadores de nitrogênio, são capazes de reduzir nitrogênio atmosférico à amônia. Esse processo é
chamado de fixação biológica do nitrogênio (FBN), sendo a transformação de N2 a NH3 realizado
pela enzima nitrogenase (Eady e Postgate, 1974).
Em alguns casos, a FBN pode suprir quase toda a demanda de nitrogênio ao
desenvolvimento da planta, para os padrões de produção da plantas cultivadas (Canuto et al., 2003).
Um exemplo do sucesso de FBN é o que ocorre em plantas de leguminosas em associação com com
bactérias diazotróficas. Os relatos de literatura também tem mostrado a fixação de nitrogênio em
plantas não-leguminosas (Raven et al., 2001; Moreira e Siqueira, 2002).
A população de bactérias diazotróficas é subdividida em vida livre e associativa. Esta última
subdivisão tem sido denominada endófita, pois as bactérias colonizam os tecidos de plantas,
ocupando os espaços intercelulares ou intracelular de certas plantas. A simbiose é estabelecida
quando planta e microrganismos estabelecem uma interação positiva, na qual a planta fornece
nutrientes para o crescimento das bactérias e estas por sua vez fornecem nitrogênio à planta. A
simbiose pode ser detectada pela colonização das bactérias, na epiderme e córtex da raiz, ou
sistêmica, pela colonização de toda planta (Moreira e Siqueira, 2002).
Bactérias não-simbióticas dos gêneros Azotobacter, Azotococcus, Beijerinckia e Clostridium
são capazes de fixar nitrogênio. Os três primeiros gêneros são formados por bactérias aeróbicas,
enquanto Clostridium é uma bactéria anaeróbica. Todos os quatro gêneros são de bactérias
saprófitas comumente encontradas no solo, onde realizam a oxidação da matéria orgânica para
obtenção de energia empregada no processo de fixação. Estima-se que elas provavelmente
adicionam cerca de 7 kg de N.ha-1 de solo a cada ano (Raven et al., 2001).
Esses microrganismos associados às leguminosas e gramíneas, e atualmente estudados em
novas famílias botânicas, contribuem para a produção de alimentos sem degradação do meio
ambiente, representando importante fonte genética a ser mantida para uso futuro. Na Coleção de
Culturas de microorganismos da EMBRAPA-Agrobiologia estão registradas bactérias diazotróficas
sendo que 71% são estirpes de Rhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Azorhizobium e
Sinorhizobium isoladas de diversas espécies de leguminosas de grãos, forrageiras e espécies
arbóreas, especialmente da Mata Atlântica e Amazônia; 25% são estirpes de Azospirillum,
Herbaspirillum e Burkholderia, isoladas de trigo, arroz, sorgo, dendê, abacaxizeiro e bananeira e de
Acetobacter, isoladas de cana-de-açúcar e batata-doce. Também, mantêm culturas de Azotobacter,
Azoarcus, Beijerinkia e outras obtidas por intercâmbio com coleções de diversos países; e 4% são
culturas modificadas geneticamente para estudos com diferentes finalidades (Pitard, 2002).
Microrganismos endofíticos têm apresentado a capacidade de estimular o crescimento das
plantas por mecanismos diretos (fixação de nitrogênio e/ou produção de fitohormônios) e por
mecanismos indiretos (antagonismo contra patógenos ou resistência a drogas). É possível que
bactérias epifíticas ou endofíticas possam promover o aumento de produtividade da planta por
sintetizar substâncias que atuam na regulação do crescimento e/ou por fixar nitrogênio atmosférico
(Neto et al., 2008).
No Brasil, estudos têm sido conduzidos com linhagens de Azospirillum lipoferum, A.
brasilense e Gluconoacetobacter diazotrophicus capazes de produzir ácido indol acético (AIA) e
compostos relacionados. Estas bactérias também são capazes de fixar N2, aumentado o seu
potencial para a promoção de crescimento. Outras bactérias como Burkholderia cepacia,
Methylobacterium spp. e Pantoea agglomerans têm sido avaliadas quanto à promoção de
crescimento de abacaxi, citros e eucaliptos, respectivamente (Neto et al., 2008).
O mecanismo de promoção de crescimento vegetal por microrganismos endofíticos ainda
necessita de mais estudos para um melhor entendimento dos fatores envolvidos. Além da interação
entre o genótipo da planta e a comunidade endofítica promotora de crescimento, outros fatores
interagem neste processo, como as comunidades microbianas epifíticas e da rizosfera (Neto et al.,
2008). Pode-se utilizar para testes de promoção de crescimento em plântulas, o cultivo in vitro.
A cultura de tecidos vegetais pode ser definida como um conjunto de métodos para o
crescimento de plântulas em um ambiente controlado e estéril. O grande impacto causado pela
cultura de tecidos, em 2001, foi a micropropagação ou propagação clonal, na qual produz
2
indivíduos idênticos (Raven et al., 2001). As técnicas a que a micropropagação recorre baseiam-se
em métodos modernos de cultura de tecidos vegetais in vitro. Deste modo, a micropropagação é
utilizada para multiplicar plantas jovens, produzidas pelos métodos convencionais de produção de
plantas, e mesmo plantas geneticamente modificadas (Micropropagação, 2007).
O presente trabalho tem como objetivos, fazer um isolamento e caracterização de bactérias
fixadoras de nitrgênio e testar as mesmas em plantas de algodoeiro cultivadas in vitro para verificar
se são capazer de promover crescimento vegetal.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
Plantas de algodoeiro novo, intermediário e velho, classificados aqui como estádio 1, 2 e 3,
respectivamente e com sistemas radiculares intactos foram coletados e levados ao laboratório para
posterior isolamento e quantificação de bactérias endofíticas.
2.1. Isolamento e Caracterização de Bactérias Endofíticas
Para o isolamento das bactérias, as raízes de algodoeiro foram lavadas em água corrente.
Após, este procedimento foram cortadas e desinfestadas superficialmente com etanol 70% por 1’,
seguida de exposição em solução de hipoclorito de sódio 2,5% durante 5’ e três lavagens com água
destilada estéril. Sob condições assépticas, fragmentos de cerca de 2 cm foram triturados em um
copo de liquidificador por 2’ na maior velocidade, juntamente com solução salina.
Da suspensão obtida, considerada como a diluição 10-1, foi realizada uma série de diluições
até 10-6 em solução salina contida em tubos de ensaio estéril, utilizando-se pipetador automático.
Posteriormente, iniciou-se a inoculação das bactérias da maior diluição seguindo para as menores,
para tal, retirou-se 0,1 mL e depositou no interior de cada um dos meios semi-sólidos LGI (5 g
sacarose, 0,6 g KH2PO4, 0,2 g K2HPO4, 0,2 g MgSO4.7H2O, 0,02 g CaCl2, 0,02 g Na2MoO4.2H2O,
0,5 % azul de Bromotimol, 1 mL vitaminas, 4 mL FeEDTA, 1000 mL de H2O, pH 6,0 - 6,2), LGI
NOVO (1 g ácido cítrico, 1 g ácido succínico, 1 g malato, 0,8 g KH2PO4, 0,3 g K2HPO4, 0,2 g
MGSO4.2H2O, 0,05 g CaCl2.2H2O, 0,02 g Na2MoO4.2H2O, 5 mL Bromotimol, 0,5 mL vitaminas,
4 mL FeEDTA, 1000 mL de H2O, pH 6,5) e LGI-P (100 g sacarose, 0,6 g KH2PO4, 0,2 g K2HPO4,
0,2 g MgSO4.2H2O, 0,02 g CaCl2, 0,002 g Na2MoO4.2H2O, 0,5 % azul de Bromocresol, 0,01 g
FeCl3.H2O, 1000 mL de H2O, pH 5,5) em tubos Falcon (15 mL) contendo 5 mL de meio.
O crescimento de bactérias foi observado pela mudança de cor dos meios de culturas e a
presença de uma película típica logo abaixo da superfície dos meios após o período de incubação de
7 dias à 30 oC. Pela indicação de crescimento nas diluições, quantificou-se a população de bactérias
por meio da técnica do número mais provável (MPN), usando a tabela de McCrady para três
repetições em diluição (Döbereiner et al., 1995). Os frascos que apresentaram crescimento foram
utilizados no isolamento de bactérias em meios sólidos dos respectivos meios de cultivo. As
colônias isoladas nestes meios foram transferidas para meios semi-sólidos adicionados de
100 mg.L-1 de extrato de levedura. Os isolados estão sendo mantidos em glicerol à -4 oC, no
Laboratório de Microbiologia Agrícola e Ambiental.
A caracterização morfológica das colônias dos isolados foi realizada em meios de culturas
sólidos LGI-P, LGI, LGI NOVO, 523, EMB, MacConkey, Batata-P e LB incubado em BOD à
30 oC. Os isolados foram caracterizados quanto à forma, coloração, textura, tamanho das colônias,
arranjos das células (Coradas com Fucsina), reação à coloração de Gram e testes bioquímicos
(Citrato-Simmons – 1000 mL de água destilada; 2 g de citrato de sódio; 0,2 g de MgSO4.7H2O; 1 g
de NH4H2PO4; 1 g de K2HPO4; 5 g de NaCl, 20 g de ágar e 15 ml de azul de bromotimol; SIM –
1000 mL de água destilada; 30 g peptona; 3 g de extrato de carne; 0,10 g de FeSO4.7H2O e 3 g de
agar - presença de Indol, H2S e motilidade; e fermentação de glicose – 1000 mL de água destilada;
1 g de glicose; 2 g de peptona; 5 g de NaCl, 0,3 g de KH2PO4, 3 g de ágar e 3 mL de vermelho de
metila - produção de ácido e gás).
3
2.2. Cultivo in vitro de Plântulas de Algodão
Em paralelo, plântulas de algodoeiro estão sendo mantidas in vitro. Para tal, sementes de
algodão foram imersas overnigth em solução de Benomyl (1 mg mL-1) sob agitação constante.
Posteriormente, foram lavadas com água estéril e devidamente desinfetadas com etanol 70 %
durante 1’ e hipoclorito de sódio (2,5 %) por 10’. Cada semente foi estabelecida em um tubo Falcon
(50 mL) contendo meio LGI. Anterior à transferência das sementes para os tubos, foi realizado um
pequeno corte na extremidade próxima ao embrião, para facilitar a emergência da raiz. Os tubos
contendo as sementes foram mantidos em BOD à 25 ºC no escuro durante 1 semana, transferidas
para BOD com luz controlada (fotoperíodo de 12 h) à 25 ºC por mais uma semana.
Estas plântulas foram utilizadas para o teste de indução de crescimento com as bactérias
selecionadas. Desde modo, as plântulas de algodão foram cortadas aproximadamente 2 cm abaixo
do hipocótilo e transferidas para frascos com meio MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962). Foram
realizados dois experimentos utilizando isolados diferentes, cada um com 6 tratamentos, sendo dois
controles (negativo, sem BAP e isolados; e positivo apenas com BAP) e quatro tratamentos com
isolados diferentes, selecionados de acordo com suas características bioquímicas e morfológicas.
Para inoculação dos mesmos, foi feita medição em espectrofotômetro e padronização das
quantidades a serem inoculadas (400 Abs). As plântulas cortadas foram imersas nas soluções com
os isolados, e em seguida transferidas para meio MS. Os mesmos foram mantidos em BOD sob
fotoperíodo de 12horas, irradiância de 35 mmol m-2 s-1 por aproximadamente 20 dias, sendo que
foram avaliadas de 7 em 7 dias, características como: tamanho da plântula, tamanho das folhas
emergentes, presença de raiz e contaminação.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Isolamento e Caracterização de Bactérias Endofíticas
Foram observadas pelo método NMP (Número Mais Provável), nas populações obtidas da
endosfera das raízes, populações de 9,5x103, 4x103 e 2x102 para bactérias crescidas em meio LGI,
estádios 1, 2 e 3, respectivamente. Populações de 4,5x102, 3x104 e 14x102 para bactérias crescidas
em meio LGI-P, estádios 1, 2 e 3, respectivamente. Para rizosfera, observou-se populações de
9,5x104 e 1,1x102 para bactérias crescidas em meio LGI, estádios 2 e 3, respectivamente.
Populações de 2,5x103 e 3x104 para bactérias crescidas em meio LGI-P, estádios 2 e 3,
respectivamente. E para o meio LGI NOVO houve crescimento bacteriano, mas o mesmo não foi
significativo em nenhum dos estádios (Tabela 1). Foram obtidos 67 isolados que se encontram
estocados em glicerol 10% em eppendorfs e mantidos à 4ºC. enquanto que, Barretti et al. (2008)
obtiveram 150 isolados de bactérias endofíticas sendo os mesmos de folhas, caules e raízes de
tomateiros e destes, 53 destacam-se quanto à habilidade em promover crescimento de plantas. Já
Stroschein (2007), trabalhando com três espécies de tremoço, isolou 204 indivíduos e selecionou 38
após a purificação.
Foi realizada caracterização morfológica nos meios LB, 523, Batata-P, EMB e MacConkey
(Figura 1 e Tabela 2). Durante a caracterização em meio LB e 523 foi observada colônias com
coloração: branca e amarela; textura: lisa e rugosa; formato: redonda, arredondada e disforme; e
tamanho: pequena, média e grande (Figura 1A e 1B). Enquanto que no meio Batata-P, foi
observado todas as colônias brancas, com texturas variando entre lisa, rugosa e gosmenta. Algumas
colônias crescidas em meio Batata-P apresentaram característica muito peculiar, que foi a formação
de uma película cobrindo-as (Figura 1C). Nos meios EMB (Figura 1D) e MacConkey (Figura 1E)
foi encontrado colorações: rosa, marrom e preta. A maioria dos isolados apresentaram coloração
GRAM negativa e foram observadas as seguintes formas: cocos, bacilos, cocobacilos, diplococos,
bastonete e diplobacilo. Enquanto que, Sakiyama (2001) encontrou em cafeeiro uma maior
predominância destas bactérias na forma de bastonetes e GRAM negativas, o que diverge em parte
com os nossos resultados. Já isolados de tremoço do trabalho de Stroschein (2007) foram
caracterizados também como GRAM negativos.
4
Tabela 1: Valores do número mais provável (NMP) das bactérias endofíticas diazotróficas isoladas.
Meio
NMP*
LGI
0,95
Estádio 1
Endosfera
LGI-P
4,5
Novo
0,0
LGI
0,095
Estádio 2
Rizosfera
LGI-P
0,25
Novo
0,0
LGI
0,4
Endosfera
LGI-P
0,03
Novo
0,0
LGI
1,1
Estádio 3
Rizosfera
LGI-P
1,4
Novo
0,0
LGI
2,0
Endosfera
LGI-P
14
Novo
0,0
* NMP (bactérias g-1) = (ND x FD x 10)/(AL x MFA), sendo que: NMP – número mais provável; ND – número de
diazotróficas de acordo com a Tabela de McCrady; FD – fator de diluição (intermediário); Al - alíquota; MFA – peso
de massa da amostras.
A
C
B
E
D
Figura 1: Isolados 9, 10, 11 e 12 do meio LGI submetidos à caracterização da colônia em meio:
A - LB; B - 523; C - Batata-P; D - EMB; e E - Isolados 1, 2, 4 e 5 em meio MacConkey.
O meio Batata-P, em particular, é capaz de purificar Acetobacter diazotrophicus e apresenta
colônias inicialmente claras e úmidas, tornando-se de coloração chocolate após sete a dez dias de
incubação à 30ºC (Döbereiner, Baldani, Baldani, 1995). Porém a coloração descrita encontrada não
foi observada, indicando que as bactérias isoladas não são da espécie citada.
Tabela 2: Caracterização dos isolados selecionados de algodão nos meios LB, 523, Batata-P,
MacConkey e BEM e coloração de GRAM.
LGI-P
meio
tamanho
coloração
textura
forma
GRAM
9
LB
média
branca
lisa
redonda
-
3R 10-2
523
média
branca
lisa
redonda
Diplococos
Batata-P
média
branca
lisa
redonda
MacC.
média
rosa
lisa
redonda
EMB
média
preta
rugosa
redonda
5
continuação Tabela 2
13
LB
média
amarela
lisa
arredondada
-
3R 10-2
523
grande
amarela
lisa
arredondada
Diplococos
Batata-P
grande
branca
gosmenta
arredondada
MacC.
-
-
-
-
EMB
-
-
-
-
NOVO
tamanho
coloração
textura
forma
GRAM
2
LB
média
branca
lisa
arredondada
-
3R 10-4
523
grande
branca
lisa
disforme
Diplococos
Batata-P
grande
branca
lisa
disforme
MacC.
grande
rosa
lisa
redonda
EMB
Placa com bactérias móveis
5
LB
média
branca
lisa
arredondada
-
3R 10-4
523
grande
branca
lisa
disforme
Cocobacilos
Batata-P
grande
branca
lisa
disforme
MacC.
grande
rosa
lisa
redonda
EMB
média
rosa
lisa
redonda
24
LB
média
amarela
rugosa
arredondada
-
3E 10-5
523
média
amarela
rugosa
arredondada
Cocobacilos
Batata-P
grande
branca
rugosa
disforme
MacC.
média
rosa
rugosa
arredondada
EMB
média
rosa
rugosa
arredondada
LGI
tamanho
coloração
textura
forma
GRAM
1
LB
média
amarela
rugosa
arredondada
-
3E 10-3
523
média
branca
rugosa
arredondada
Bastonete
Batata-P
grande
branca
rugosa
redonda
MacC.
média
marron
rugosa
arredondada
EMB
média
preta
rugosa
arredondada
10
LB
média
branca
lisa
arredondada
-
2R 10-2
523
grande
branca
lisa
redonda
Cocos
Batata-P
grande
branca
lisa
redonda
MacC.
-
-
-
-
EMB
média
preta
lisa
redonda
20
LB
média
branca
lisa
arredondada
-
3E 10-1
523
média
branca
lisa
redonda
Cocobacilos
Batata-P
média
amarela
lisa
redonda
MacC.
média
rosa
lisa
redonda
EMB
média
preta
rugosa
redonda
6
Quanto aos testes bioquímicos (Tabela 3), a maioria são Citrato positivas (Figura 2), não
produzem indol e produzem H2S. A partir destes testes, conseguimos selecionar os isolados que
apresentaram características conjuntas divergentes, para posteriores etapas.
Figura 2: Isolados do meio LGI submetidos a teste bioquímico Citrato-Simmons.
Tabela 3: Resultados dos testes bioquímicos SIM, Citrato/Simmons e Fermentação nos isolados de
bactérias endofíticas diazotróficas selecionados.
Meio de cultura
Isolado
LGI
1
10
20
2
5
24
9
13
MEIO NOVO
LGI-P
(*) + - positivo e;
Utilização
de citrate
+
+
+
+
+
+
+
Produção de
H 2S
+
+
+
+
+
+
–
+
–
Produção de
Indol
Mobilidade
–
–
–
–
–
–
–
–
–
+
+
+
+
–
–
+
– - negativo.
3.2. Cultivo in vitro de Plântulas de Algodão
As sementes de algodão germinadas em condições de escuro em BOD e posteriormente
transferidas para câmara de crescimento (Figura 3) estão apresentando bons resultados. Os tubos
são verificados diariamente e os que apresentarem contaminação são descartados.
A
B
Figura 3: Sementes de algodão submetidas ao cultivo in vitro, no meio LGI em sala de
crescimento. A – Detalhe do Tubo Falcon contendo uma plântula; B – Visão do material nas
prateleiras na sala de crescimento.
Os isolados já testados apresentaram resultados divergentes. Alguns conseguiram resultados
superiores aos do controle e outros não (Tabela 4 e 5). Sakiyama (2001) testou isolados de bactérias
endofíticas em cafeeiro e comprovou a promoção de crescimento da planta por alguns.
Diferentemente do nosso experimento, utilizou-se do reisolamento de isolados para a verificação de
que os mesmos haviam promovido o crescimento.
7
Tabela 4: Resultado referente à avaliação das plântulas de algodão germinadas in vitro após uma
semana da montagem do experimento 1 .
Isolado
Caracterização da 1ª folha emitida
nº1
nº2
nº3
nº4
nº5
Controle NCF*
Pequena*
Média
NCF*
Pequena*
Controle +
Pequena
Grande
NCF
Pequena
Média
NOVO 05
Média
NCF
NCF
Grande
Pequena
LGI 10
Grande
Pequena
NCF
Média
NCF
LGI 20
Pequena
NCF
NCF
Pequena
Pequena
LGI-P 09
NCF
NCF
NCF
NCF
NCF
Tamanhos: pequena (até 1cm), média (de 1 a 1,5 cm), grande (de 1,5 a 2 cm) e enorme (de 2 a 3 cm); NCF = não houve
crescimento foliar; *presença de contaminação.
Tabela 5: Resultado referente à avaliação das plântulas de algodão germinadas in vitro após uma
semana da montagem do experimento 2.
Isolado
Caracterização da 1ª folha emitida
nº1
nº2
nº3
nº4
nº5
Controle Média*
Pequena*
NCF*
Pequena*
Pequena*
Controle +
Pequena*
NCF*
Média*
NCF*
Pequena*
NOVO 02
Pequena
NCF
Pequena
NCF
Pequena*
NOVO 24
Pequena
Pequena
NCF
Pequena
Pequena
LGI 01
Pequena
Pequena
NCF
Pequena
Pequena
LGI-P 13
Pequena
NCF
Pequena
Pequena
Pequena*
Tamanhos: pequena (até 1cm), média (de 1 a 1,5 cm), grande (de 1,5 a 2 cm) e enorme (de 2 a 3 cm); NCF = não houve
crescimento foliar; *presença de contaminação.
Podemos perceber que, comparando um experimento com outro, o Experimento 2
apresentou maior grau de contaminação, sendo que a mesma inclui-se de fungos e bactérias, ao
contrário do Experimento 1, onde foram detectadas apenas bactérias. Quanto às bactérias,
acreditamos que as mesmas sejam endógenas, porém são necessários outros testes para a posterior
comprovação.
No experimento 1, os melhores resultados foram observados no Controle Positivo, pois as
primeiras folhas cresceram mais e não houve contaminação. Observou-se que, o tratamento com
isolado LGI-P 09 não apresentou crescimento foliar.
No Experimento 2, os melhores resultados foram obtidos com o Controle Negativo. Porém,
como citado anteriormente, muitos foram contaminados por fungos. Contudo, os tratamentos com
os diferentes isolados não apresentaram contaminação neste experimento.
Demais bactérias irão ser testadas, visto que possuímos um grande número de isolados em
nosso banco de germoplasma bacteriano.
4. AGRADECIMENTOS
Agradeçemos à FAPEMIG pelo apoio financeiro à pesquisa. À AgroTeste, que nos
forneceram as sementes e raízes de algodoeiro utilizados no trabalho. À Professora Maria Rita da
Universidade Federal de Goiás (UFG) pela ajuda na padronização do cultivo in vitro de plântulas de
algodão. Aos professores Jonas Jäger Fernandes, José Magno Q. Luz e Marcus Vinícius Sampaio e
membros dos Laboratórios de Biotecnologia Vegetal, Nematologia, Entomologia-Controle
Biológico e Fitopatologia e Virologia Vegetal da UFU, que gentilmente cederam instalações e
equipamentos para realização de parte do experimento. A todos aqueles que diretamente ou
indiretamente ajudaram na realização deste trabalho.
5. REFERÊNCIAS
8
Barretti, P. B.; Souza, R. M.; Pozza, E. A., 2008, “Bactérias endofíticas como agentes promotores
do crescimento de plantas de tomateiro e de inibição in vitro de Ralstonia solanacearum”, Ciênc.
Agrotec., Lavras, Vol. 32, n.3, pp 731-739.
Canuto, E.L.; Salles, J.F.; Oliveira, A.L.M.; Perin, L.; Reis, V.M. and Baldani, J.I., 2003,
“Respostas de plantas micropropagadas de cana-de-açúcar à inoculação de bactérias diazotróficas
endofíticas”, Agronomia, Vol. 37, n.2, pp 67-72.
Döbereiner, J.; Baldani, V. L. and Baldani, J. I., 1995, “Como isolar e identificar bactérias
diazotróficas de plantas não-leguminosas”. Brasília: EMBRAPA-SPI: Itaguaí, RJ: EMBRAPACNPAB, 60p.
Eady, R.R. and Postgate, J.R., 1974, “Nitrogenase”, Nature”, Vol. 249, pp 805-810.
Micropropagação, 2007. Disponível em:. Acesso em: 4 ago 2007.
Moreira, F.M.S. and Siqueira, J.O., 2002, “Fixação biológica de nitrogênio atmosférico”. In:
Microbiologia e bioquímica do solo, Lavras: UFLA, pp 399-471.
Murashige, T. and Skoog, F., 1962, “A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue cultures”, Physiologia Plantarum, Vol. 15, pp 473-497.
Neto, P.C.S.P.; Azevedo, J.L. and Araújo, W.L., 2008, “Microrganismos endofíticos: interações
com plantas e potencial biotecnológico”, Biotecnologia, Ciência e Desenvolvimento, n. 29, pp 6276. Disponível em: www.biotecnologia.com.br. Acesso em: 01 ago. 2008.
Pitard, R.M., 2002, “Banco de germoplasma de bactérias diazotróficas e actinomicetos”,
EMBRAPA Agrobiologia. Disponível em: http://www.cnpab.embrapa.br/pesquisas/
projetos/022000446.html. Acesso em: 29 set. 2005.
Raven, P.H.; Evert, R.F. and Eichhorn, S.E., 2001, “Biologia Vegetal”, 6. ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 906p.
Sakiyama, C. C. H., 2001, “Colonização de Coffea arábica L. por bactérias endofíticas promotoras
de crescimento”, Tese de doutorado, Viçosa, UFV, 80p.
Stroscheim, M. R. D., 2007, “Caracterização de bactérias fixadoras de nitrogênio em Lupinus
albescens”, Tese de mestrado, Santa Maria, 83p.
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ISOLATION AND CARACTERIZATION OF BACTERIA ENDOPHYTIC
AND RIZOSPHYTIC PRESENT IN ROOTS OF COTTON AND TEST TO
PROMOTE GROWTH IN VITRO
Juliana Rainho Teixeira1;
Federal University of Uberlândia – Av. Amazonas, s/n, Umuarama, Uberlândia. CEP: 38400-902
[email protected]
Ana Paula de Oliveira Ribeiro2;
Rafael Rogerio Pereira da Silva3;
Maria Amelia dos Santos4;
Adão de Siqueira Ferreira5
Abstract: This study aimed to make an isolation of bacteria present in roots of cotton plant
cultivated in soils of the Cerrado of the region of Uberlândia (MG) and to test the same ones in
plants of cotton plant cultivated in vitro to verify if they are to able to promote growth of the
vegetable. The collected plants had been washed in current water and after that they had been
disinfected (endosphera) or not (rizosphera) superficially. The samples had been triturated in
liquidizer and diluted in series for obtain of the suspensions. Aliquot of 100µL of the suspensions
they had been inoculated in third copy in tube falcon contend selective semisolids medium: LGI,
LGI NOVO and LGI-P. The tube were incubated at 30°C for 7 days. It was used McCrady table for
the calculation of the most likely number (NMP) of bacteria estimate the population. Had been
gotten 67 isolated ones that they had been characterized morphologically in medium EMB,
MacConkey, 523, LB and Batata-P and submitted to the biochemists tests Citrate-Simmons, SIM
and fermentation of the glucose. The majority was characterized as negative Gram bacteria and
with form sufficiently varied. Isolated ones had been selected eight had been tested for the capacity
to promote growth in vitro of buds of cotton. For such, seeds had been disinfested and placed in
half LGI for germination in the dark one during one week, after that they had been transferred to
environment illuminated for 12 daily hours. After two weeks, buds of cotton had been cut
approximately 2 cm below of hypocotyl and transferred to bottles with MS medium, being immersed
in solution contend isolated 400Abs approximately and kept for 20 days. It was observed that the
contamination was relatively small e the best ones resulted had been gotten in buds conditioned in
medium MS with BAP, but we cannot leave to cite that some isolated ones are presenting resulted
comparable.
Key words: fixing nitrogen bacteria, Gossypium hirsutum, plant tissue culture,
biotechnology.
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