UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE AGRONOMIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DO SOLO
OCORRÊNCIA E DISTRIBUIÇÃO DE BACTÉRIAS DIAZOTRÓFICAS
ASSOCIADAS A CULTIVARES DE MILHO
LUIZ FERNANDO WURDIG ROESCH
Engenheiro-Agrônomo (UFRGS)
Dissertação apresentada como
um dos requisitos à obtenção do
Grau de Mestre em Ciência do Solo
Porto Alegre (RS) Brasil
Fevereiro de 2003
Dedico em memória de Arnoldo Würdig (meu avô)
AGRADECIMENTOS
Aos Professores Flávio Camargo e Pedro Selbach, pela amizade
confiança e orientação.
Ao Departamento de Solos, à Faculdade de Agronomia e à UFRGS,
pela formação proporcionada.
Aos colegas, amigos e professores do Departamento de Solos, pela
amizade e companheirismo.
A CAPES pelo apoio financeiro.
A minha família pelo afeto e carinho.
À Ana Claudia, pela paciência, amor e dedicação.
OCORRÊNCIA E DISTRIBUIÇÃO DE BACTÉRIAS DIAZOTRÓFICAS
ASSOCIADAS A CULTIVARES DE MILHO1/
Autor: Luiz Fernando Wurdig Roesch
Orientador: Prof. Flávio A. de Oliveira Camargo
Co-orientador: Prof. Pedro Alberto Selbach
RESUMO
A utilização adequada dos recursos biológicos do solo e do potencial
genético das plantas pode diminuir o consumo de fertilizantes nitrogenados na
cultura do milho. Deste modo, este trabalho teve por objetivo avaliar a
ocorrência e a distribuição de diazotróficos associados a cultivares de milho
atualmente cultivado no Estado do Rio Grande do Sul. A atividade experimental
foi realizada em três etapas, tendo a primeira etapa o objetivo de selecionar 32
cultivares de milho pela resposta à adubação nitrogenada. Este experimento foi
conduzido em vasos e resultou na seleção de duas cultivares cujo desempenho
foi avaliado em um experimento no campo (segunda etapa). A terceira etapa foi
realizada em laboratório e visou determinar a contribuição dos isolados obtidos
no experimento de campo quanto à fixação do nitrogênio e a produção de
promotores de crescimento de plantas. Todas as cultivares testadas foram
responsivas ao nitrogênio e estimularam a presença de diazotróficos no solo.
As cultivares Santa Helena 8447 e Santa Rosa 3063 foram selecionadas para o
experimento no campo pela menor e maior resposta a adubação nitrogenada,
respectivamente. O rendimento de matéria seca e o teor de N no tecido das
duas cultivares avaliadas foram afetados pela adubação nitrogenada porém a
população de diazotróficos só foi afetada pela adubação nitrogenada no início
do ciclo de desenvolvimento das plantas (r=0,76). Foi detectada a presença de
bactérias do gênero Azospirillum, Herbaspirillum e Burkholderia e de forma
geral, a distribuição destes microrganismos foi afetada pela adubação
nitrogenada, pelas cultivares e pelo período de avaliação sendo que as raízes
foram o sítio preferencial de colonização dos diazotróficos. A presença de
bactérias diazotróficas associadas as duas cultivares de milho foi confirmada
pelo isolamento de bactérias em meios específicos, pela quantificação do N2
fixado e pela produção de PCPs. Foram isolados duas espécies de
Azospirillum (A. lipoferum e A. brasiliense) e Herbaspirillum e todos isolados
fixaram nitrogênio e produziram PCPs "in vitro".
1/
Dissertação de Mestrado em Ciência do Solo. Faculdade de Agronomia, Universidade
Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre (78 p.) – Fevereiro, 2003.
OCCURRENCE AND DISTRIBUTION OF DIAZOTROPHIC BACTERIA
ASSOCIATED WITH MAIZE CULTIVARS1/
Author: Luiz Fernando Wurdig Roesch
Advisers: Flávio A. de Oliveira. Camargo
Pedro Alberto Selbach
ABSTRACT
The proper use of soil biologic resources and plant genetic potential
can decrease the consumption of nitrogen fertilizers in maize fields. The aim of
this work was to evaluate the occurrence and distribution of diazotrophs
associated to maize cultivars growing in the Rio Grande do Sul, State. The
study was carried out in three experiments. The first experiment had the
objective of selecting 32 maize cultivars through the effect of nitrogen fertilizers.
This experiment was conducted into flasks and was selected two cultivars,
whose performance was evaluated at field experiment. The third experiment
was carried at laboratory to determine the potential of field isolates for nitrogen
fixation and production of plant growth promoting substances. All tested
cultivars evaluated were affected by the nitrogen fertilizer and stimulated the
presence of diazotrophs in the soil. Cultivars Santa Helena 8447 and Santa
Rosa 3063 were selected for the field experiment by the smallest and highest
effect of nitrogen fertilization, respectively. The dry matter and the N content in
the plant tissue of the two cultivars were affected by the nitrogen fertilization.
However, the population of diazotrophs was affected only in the beginning of
the maize growth (r=0,76). The bacterial genuses of Azospirillum,
Herbaspirillum and Burkholderia were detected and its distribution was affected
by the addition of N, cultivars and period of evaluation. The plant roots were the
preferable site for the diazotrophs colonization. The presence of diazotrophs
associated to the maize cultivars was verified by the isolation of bacteria into
the selective media and by the production of plant growth promoting
substances. Two species of Azospirillum (A. lipoferum and A. brasiliense) and
Herbaspirillum spp. were isolated and all isolates showed the ability to fix
nitrogen and to produce plant growth promoting substances.
1/
M. Sc. Dissertation in Agriculture (Soils) - Faculdade de Agronomia, Universidade Federal
do Rio Grande do Sul, Porto Alegre (69 p.) – February, 2003.
SUMÁRIO
Página
1. INTRODUÇÃO ....................................................................................
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ..............................................................
2.1 A cultura do milho no Estado do Rio Grande do Sul .....................
2.2 Ocorrência de diazotróficos associados ao milho..........................
2.3 Contribuição dos diazotróficos para a cultura do milho ................
2.3.1 Fixação biológica de nitrogênio em plantas de milho...........
2.3.2 Produção de promotores de crescimento de plantas ...........
2.4 Especificidade hospedeira na associação diazotróficos gramíneas .....................................................................................
3. MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................
3.1 Seleção de cultivares de milho em vasos .....................................
3.2 Avaliação da ocorrência e distribuição de diazotróficos em
cultivares de milho no campo .......................................................
3.3 Análise de solo, planta e diazotróficos ..........................................
3.3.1 Análise do nitrogênio mineral do solo...................................
3.3.2 Análise da matéria seca e do nitrogênio total das plantas....
3.3.3 Análise do Número Mais Provável e isolamento das
diazotróficos .........................................................................
3.3.4 Análise dos isolados bacterianos..........................................
3.3.4.1 Quantificação do N2 fixado .......................................
3.3.4.2 Produção de substâncias promotoras de
crescimento de plantas............................................
3.4 Análise estatística..........................................................................
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ..........................................................
4.1 Seleção de cultivares de milho em vasos .....................................
4.1.1 Avaliação agronômica das cultivares ...................................
4.1.2 Avaliação da presença de diazotróficos ...............................
4.2 Avaliação das cultivares Santa Helena 8447 e Santa Rosa 3063
no campo ......................................................................................
4.2.1 Avaliação agronômica das cultivares ...................................
01
04
04
07
11
11
12
14
17
17
20
22
22
23
23
26
26
27
28
29
29
29
35
38
38
4.2.2 Ocorrência e distribuição dos diazotróficos nas cultivares
de milho.................................................................................
4.2.3 Relação entre a população de diazotróficos e N absorvido..
4.3 Análise dos isolados bacterianos...................................................
4.3.1 Quantificação do N2 fixado....................................................
4.3.2 Produção de substâncias promotoras de crescimento de
plantas...................................................................................
5. CONCLUSÕES ...................................................................................
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................
7. ANEXOS .............................................................................................
7.1 Anexo 1: Meios de cultura e soluções utilizadas..........................
7.2 Anexo 2: Tabela de McCrady para cálculo do Número mais
provável (NMP) diazotróficas em contagem om três
frascos por de bactérias diluição...................................
7.3 Anexo 3: Probabilidades calculadas para julgar a significância
das diferenças entre tratamentos..................................
7.4 Anexo 4: Nitrogênio mineral do solo aos 30, 55, 77 e 115 dias
após a emergência das plantas de milho nos
diferentes tratamentos...................................................
8. VITA ....................................................................................................
41
49
55
57
58
60
61
71
71
75
76
77
78
RELAÇÃO DE TABELAS
Página
Tabela 1.
Ocorrência de diazotróficos em plantas de milho ...................
09
Tabela 2.
Benefícios promovidos pela inoculação de diazotróficos em
sementes ou plantas de milho ...............................................
13
Cultivar, tipo de cultivar e ciclo de desenvolvimento das
plantas de milho avaliadas .....................................................
19
Rendimento de matéria seca da parte aérea das cultivares
de milho avaliadas aos 45 dias após a emergência ...............
30
Conteúdo de nitrogênio total no tecido da parte aérea das
cultivares de milho avaliadas aos 45 dias após a emergência
32
Razão entre as médias do rendimento de matéria seca e do
nitrogênio total dos tratamentos T1/T2 e T1/T3 das cultivares
de milho avaliadas....................................................................
34
Meios de cultura NFb e JNFb com formação de película (+)
ou sem formação de película (-) inoculados com suspensão
de solo coletado após o cultivo (45 dias após a emergência)
das cultivares de milho avaliadas ............................................
36
Rendimento de matéria seca e conteúdo de nitrogênio no
tecido da parte aérea, rendimento de grãos e teor de
nitrogênio nos grãos das cultivares de milho avaliadas com e
sem adubação nitrogenada (200 kg ha-1 de uréia) .................
39
Isolados das cultivares Santa Helena 8447 e Santa Rosa
3063 em diferentes locais, N total fixado, N excretado e
produção de auxinas................................................................
56
Tabela 3.
Tabela 4.
Tabela 5.
Tabela 6.
Tabela 7.
Tabela 8.
Tabela 9.
RELAÇÃO DE FIGURAS
Página
Figura 1.
Figura 2.
Figura 3.
Figura 4.
Figura 5.
Número mais provável (NMP) da população de diazotróficos
totais presentes no solo, raízes e colmo das cultivares Santa
Helena 8447 e Santa Rosa 3063 sem aplicação de
nitrogênio (A) e com aplicação de nitrogênio (B).....................
43
Distribuição da população de diazotróficos presentes no
solo, raízes e colmo das cultivares Santa Helena 8447 (A) e
Santa Rosa 3063 (B) aos 30, 55, 77 e 115 dias após a
emergência sem aplicação de nitrogênio ................................
45
Distribuição da população de diazotróficos presentes no
solo, raízes e colmo das cultivares Santa Helena 8447 (A) e
Santa Rosa 3063 (B) aos 30, 55, 77 e 115 dias após a
emergência com aplicação de nitrogênio ................................
47
Relação entre o NMP da população total de diazotróficos
presentes no solo, raízes e colmo e a absorção de nitrogênio
nas cultivares Santa Helena 8447 (A) e Santa Rosa 3063 (B)
sem aplicação de nitrogênio ....................................................
50
Relação entre o NMP da população total de diazotróficos
presentes no solo, raízes e colmo
e a absorção de
nitrogênio das cultivares Santa Helena 8447 (A) e Santa
Rosa 3063 (B) com aplicação de nitrogênio ...........................
52
RELAÇÃO DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
cm
cmol c L-1
g
ºC
h
kg
kg ha-1
L
m
m2
µg mL-1
µm
mL
mg L -1
mm
min.
mol L-1
nm
%
centímetros
centimol de carga por litro
grama
grau Celcius
hora
kilograma
kilogramas por hectare
litro
metro
metro quadrado
micrograma por mililitro
micrometro
miligrama
miligramas por litro
milímetro
minuto
mol por litro
nanometro
percentagem
1. INTRODUÇÃO
O milho é uma das principais culturas de importância econômica
para o Estado do Rio Grande do Sul. É cultivado em aproximadamente 1,5
milhões de hectares, ocupando quase todas as regiões e sub-regiões agroecológicas do Estado. Segundo estimativas do Levantamento Sistemático da
Produção Agrícola (LSPA), divulgada pelo IBGE (IBGE, 2002), o Estado foi o
segundo maior produtor de milho do Brasil (14,51 % da produção nacional). Os
custos médios totais de produção no ano de 2001, para uma produtividade de
4.500 kg ha-1, foram de US$ 355,27 por hectare e de US$ 4,74 por saca de 60
kg (Fecotrigo- FecoAgro, 2002), sendo que o custo da adubação nitrogenada
corresponde aproximadamente a US$ 149,21 por hectare e US$ 1,99 por saca
de 60 kg. Além do alto custo, a adubação nitrogenada repassa danos ao
ambiente com poluição de aqüíferos e uso de recursos energéticos não
renováveis, com sérias implicâncias à sustentabilidade do agro-ecossistema.
Uma das possibilidades para diminuir o consumo de fertilizantes
nitrogenados para a cultura do milho é a utilização dos recursos biológicos do
solo e do potencial genético das plantas. Destaca-se no solo a presença de
bactérias diazotróficas que podem associar-se à cultura do milho para fixar
nitrogênio (N2) e/ou produzir substâncias promotoras de crescimento de plantas
(PCPs).
Estes
microrganismos
podem
utilizar
energia
proveniente
de
carboidratos fornecidos pelas plantas para reduzir o nitrogênio atmosférico (N2)
a amônia (NH3). O nitrogênio fixado pode ser disponibilizado às plantas através
da
excreção
microrganismos.
de
A
NH3
ou
habilidade
pela
dos
mineralização
diazotróficos
após
em
a
morte
produzir
destes
PCPs
é
considerada como um dos fatores de maior importância para a fertilidade do
solo. A maioria dos diazotróficos associados a gramíneas pode sintetizar e
excretar PCPs, que são compostos orgânicos bioativos que influenciam os
processos
fisiológicos
das
plantas
em
baixas
concentrações.
Entre
os
principais PCPs sintetizados pelos diazotróficos, destacam -se as auxinas, que
são hormônios responsáveis pelo aumento da área de absorção radicular e
pelo desenvolvimento da planta pela alongação e proliferação das raízes
secundárias.
De modo geral, tem-se observado que os diazotróficos associados a
gramíneas
conseguem
se
ajustar
e
colonizar
um
ambiente
específico,
heterogêneo e variável, como a rizosfera. Este ajuste pode variar em função da
diversidade genética da população e das condições edafoclimáticas da região,
e quanto maior a variabilidade genética da população, maior o ajuste ao
ambiente. Os diazotróficos apresentam relações específicas na infecção de
raízes de gramíneas, sendo o grau de especificidade variável em função do
genótipo da planta, dos fatores abióticos do meio e da interação com a biota do
solo.
O
resultado
da
interação
diazotrófico-gramínea,
em
termos
de
potencialidade agronômica como fixadores de nitrogênio atmosférico ou como
promotores de crescimento, depende desse grau de especificidade. Para a
potencialização desta relação, devem ser considerados fatores bióticos, como
o genótipo da planta e a comunidade microbiana do solo. Deste modo, é
necessária a seleção adequada de plantas e de diazotróficos eficientes para
obter o máximo rendimento através da inoculação. Para tanto, é preciso avaliar
diferentes genótipos de milho, em relação à resposta à adubação nitrogenada e
à associação com diazotróficos específicos. Já que a menor resposta a
aplicação de nitrogênio pode estar relacionada ao suprimento deste nutriente à
planta
através
da fixação biológica, mediada por bactérias diazotróficas
associadas ao milho. Deste modo, o presente estudo objetivou avaliar a
ocorrência e a distribuição de bactérias diazotróficas associadas a cultivares de
milho atualmente cultivadas no Estado.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. A cultura do milho no Estado do Rio Grande do Sul
O milho destaca-se como uma das principais culturas de interesse
econômico para o Estado do Rio Grande do Sul. Desempenha função
importante
na alimentação humana e animal, principalmente na composição
de rações de suínos e aves. O milho pode ser cultivado sem restrições na
maioria das regiões e sub-regiões agroecológicas do Estado, variando apenas
a época de semeadura (RGS / SAA, 1994). Esta situação edafoclimática
favorável ao cultivo e a grande capacidade de adaptação da cultura, faz do RS
o segundo maior produtor nacional de milho, tanto em área, como em produção
de grãos (IBGE, 2002).
No ano agrícola 2001 / 2002 a área total cultivada na primeira safra
foi aproximadamente 1,40 milhões de hectares (15,11% da área nacional) e na
segunda safra (“safrinha”) a área cultivada foi de 1,38 milhões de hectares
(15,20% da área nacional) (IBGE, 2002). A produção total de grãos foi de 4,30
milhões de toneladas, com um rendimento médio por hectare de 3.106 kg. A
pesar do rendimento médio ter sido inferior em 5% ao da média nacional, o RS
contribuiu com 14,51% da produção nacional de grãos.
Atualmente, são utilizados no RS dois tipos de cultivares: as
variedades e os híbridos. Uma variedade de milho é um conjunto de plantas
com características comuns, sendo um material geneticamente estável e que,
por essa razão, com os devidos cuidados, a sua multiplicação pode ser
reutilizada sem perda de seu potencial produtivo. Os híbridos disponíveis no
mercado e recomendados pela pesquisa são de três tipos: híbrido simples (ou
modificado), híbrido duplo e híbrido triplo. O híbrido simples é obtido pelo
cruzamento de duas linhagens endogâmicas. Em geral, é mais produtivo que
os demais tipos de híbridos, apresentando grande uniformidade de plantas e
espigas. A semente tem maior custo de produção, porque é produzida a partir
de linhagens, que, por serem endógamas, apresentam menor produção. O
híbrido simples modificado é obtido utilizando-se como progenitor feminino um
híbrido entre duas progênies afins da mesma linhagem e, como progenitor
masculino, uma outra linhagem. O híbrido duplo é obtido pelo cruzamento de
dois híbridos simples, envolvendo, portanto, quatro linhagens endogâmicas e o
híbrido triplo é obtido do cruzamento de um híbrido simples com uma terceira
linhagem (Miranda & Viegas, 1987).
Com relação ao ciclo, as cultivares são classificadas em normais,
semiprecoces, precoces e superprecoces. As cultivares normais apresentam
exigências
térmicas
correspondentes
a
890-1200
graus-dia
(G.D.),
as
precoces, de 831 a 890, e as superprecoces, de 780 a 830 G.D. Essas
exigências calóricas se referem ao comprimento das fases fenológicas,
compreendidas entre a emergência e o início da polinização (Fancelli &
Dourado - Neto, 1997).
De acordo com os resultados obtidos em experimentos no campo,
coordenados pela FEPAGRO (Fundação Estadual de Pesquisa Agropecuária),
foram indicados pela pesquisa oficial safra 2002 / 2003, 104 cultivares de milho
híbrido, 14 variedades de polinização aberta e 6 milhos especiais (3 milho
pipoca e 3 milho doce), totalizando 124 híbridos e variedades recomendadas
(EMATER / RS, 2002). Entre os híbridos de ciclo precoce foram recomendadas
57 cultivares, sendo 19 híbridos simples e híbridos simples modificados, 19
híbridos duplos e 19 híbridos triplos. Foram recomendadas 36 cultivares de
ciclo superprecoce (14 híbridos simples e híbridos simples modificados, 7
híbridos duplos e 15 híbridos triplos) e 11 cultivares de ciclo normal (1 híbrido
simples, 4 híbridos duplos e 6 híbridos triplos).
A cultura do milho apresenta alta resposta à adubação nitrogenada
e, no atual sistema de cultivo, são utilizados até 160 kg ha-1 de N para um
rendimento igual ou superior a 6 toneladas por hectare (ROLAS, 1995). Os
programas de melhoramento de milho estão baseados na seleção de
germoplasma e métodos de melhoramento (seleção recorrente, hibridação,
retrocruzamento, mutação e outros). São poucos os programas de seleção que
visam eficiência no uso do N. A maioria dos programas tradicionais de
melhoramento genético efetua a seleção em condições ótimas, uma vez que a
variação ambiental reduz a herdabilidade do caráter produção. Geralmente, os
baixos níveis de N contribuem para seleção de genótipos eficientes na FBN
(Boddey et al., 1995).
O grande interesse pela fixação de nitrogênio em milho é justificado
pelo fato desta gramínea possuir um sistema fotossintético capaz de aproveitar
melhor a alta intensidade luminosa existente nos trópicos (plantas C4) e
apresentar um sistema radicular fasciculado, que, geometricamente, apresenta
vantagens sobre o sistema pivotante das leguminosas para extrair água e
nutrientes do solo. Deste modo, mesmo que apenas uma pequena parte do
nitrogênio pudesse ser fornecida pela associaç ão com bactérias fixadoras de
N2, a economia global em adubos nitrogenados seria significativa, igual ou
superior à obtida com as leguminosas, que podem ser auto-suficientes em N
(Paul & Clark, 1996).
2.2. Ocorrência de bactérias diazotróficas associadas ao milho
Bactérias diazotróficas são microrganismos capazes de realizar a
conversão enzimática do nitrogênio gasoso (N2) a formas acessíveis aos
demais eucariotos (NH3, etc.). Esses microrganismos podem associar-se a
rizosfera de gramíneas (associativos) ou até mesmo colonizar o interior dos
tecidos das mesmas (endofíticos) (Baldani et al., 1997). Além da FBN, alguns
desses microrganismos também possuem a capacidade de promover o
crescimento vegetal através da solubilização de fosfatos minerais ou outros
nutrientes do solo e produzem, ou alteram, a concentração de hormônios
vegetais, como o ácido indol acético, ácido giberélico, citocininas e etileno. Por
essas características, essas bactérias foram coletivamente chamadas de
rizobactérias promotoras de crescimento de plantas (Cattelan, 1999).
A associação de bactérias diazotróficas a gramíneas não exibe
modificação morfológica, conforme se observa na interação entre bactérias
diazotróficas do gênero Rizóbio e as raízes das plantas leguminosas. Os
diazotróficos que habitam a rizosfera e a superfície das raízes utilizam os
exudatos radiculares, secreções e lisados como fonte de carbono para fixação
de N2 e os números populacionais destes microrganismos podem variar de
acordo com as condições ambientais (Bakker et al., 1987; Chanway & Holl,
1994). A capacidade dos endofíticos de colonizar o interior do tecido das
plantas, representa uma vantagem em relação aos associativos na utilização
de substratos. Possivelmente, com fontes de carbono mais prontamente
disponíveis os problemas de competição com não diazotróficos podem ser
reduzidos (Olivares et al., 1997). Além disso, a colonização endofítica promove
proteção às variações ambientais e as elevadas concentrações de oxigênio
(O2), inibidoras da atividade da nitrogenase.
Os principais diazotróficos capazes de se associar com plantas de
milho são de ocorrência ampla e variada no ambiente e na planta (Tabela 1).
As espécies mais estudadas são Azospirillum lipoferum e A. brasiliense. Elas
ocorrem em grande abundância no solo, rizosfera e interior dos tecidos de
plantas de milho. Devido a sua ocorrência generalizada, tanto na superfície,
como no interior das plantas, são classificadas como bactérias endofíticas
facultativas ou rizosféricas. Algumas estirpes são capazes de colonizar apenas
a superfície das raízes, enquanto outras podem colonizar o interior das
mesmas (Baldani et al., 1987).
Azospirillum é uma bactéria aeróbia Gram -negativa, que possui
grande versatilidade na utilização de fontes de carbono e de nitrogênio, o que
permite sua adaptação ao ambiente competitivo da rizosfera. Em condições
adversas,
tais
como
dessecação
e
limitação
de
nutrientes,
esses
microrganismos podem formar cistos, facilitando a sobrevivência em condições
desfavoráveis (Lamm & Neyra, 1981; Sadasivan & Neira, 1987). Além de
mudanças morfológicas, sob condições de estresse, as bactérias desse gênero
podem aumentar a produção de polissacarídeos, que servem de fonte de
carbono e energia (Tal et al, 1985).
Estudos sobre a resposta de A. amazonense em ensaios de
inoculação são menos freqüentes. Esta espécie foi inicialmente isolada de
gramíneas forrageiras da região Amazônica (Magalhães, 1983), mas
detectada em alto número em solo, rizosfera e raízes de milho (Baldani, 1984).
já
foi
TABELA 1. Ocorrência de diazotróficos em plantas de milho.
Bactéria
Azospirillum
brasilense
Parte da planta
Referência:
Solo, Raízes
Baldani & Döbereiner,
Seiva
1980
Interior de Raízes
Marriel, 1996
Garcia de Salomone &
Döbereiner, 1996
Azospirillum lipoferum
Solo, Raízes
Baldani & Döbereiner,
Seiva
1980
Superfície e interior de
Marriel, 1997
raízes
Garcia de Salomone &
Döbereiner, 1996
Azospirillum
Solo, Rizosfera e
amazonense
Raízes
Solo, superfície e
Herbaspirillum
interior de raízes
seropedicae
Superfície e interior de
Baldani, 1984
Baldani et al., 1986
Olivares et al., 1996
raízes
Burkholderia spp.
Rizosfera e raízes
Bevivino et al., 1998
Solo
Pallud et al., 2001
A. amazonense pode ser isolado em meio de cultura semi-sólido contendo
sacarose como fonte de carbono, enquanto que A. lipoferum e A. brasiliense
são isolados em meio de cultura contendo malato como fonte de carbono. Com
relação à morfologia celular, A. brasiliense apresenta a forma de bastonetes
curvos e móveis, com 1 µm de espessura por 3 a 5 µm de comprimento em
meio de cultura semi-sólido A. lipoferum apresenta células semelhantes a A.
brasiliense, porém quando a colônia entra em faze de senescência, as células
tornam-se pleiomórficas e imóveis, podendo chegar a 10 µm de comprimento e
3 a 5 µm de espessura (Döbereiner et al., 1995). A espécie A. amazonense
apresenta a mesma morfologia celular de A. brasiliense, porém possui tamanho
de 0,9 µm de espessura por 3 a 4 µm de comprimento em meio de cultura
semi-sólido.
O gênero Herbaspirillum apresenta uma distribuição ecológica mais
restrita, a exceção de H. seropedicae, que tem sido isolada do solo, superfície
e interior de plantas de milho e outras gramíneas e cereais cultivados no Brasil
(Tabela 1). As bactérias deste gênero são classificadas como endofíticas
obrigatórias (James & Olivares, 1997), porém assim como ocorre com o gênero
Azospirillum, existem relatos da ocorrência de H. seropedicae no solo (Baldani
et al., 1986), o que sugere que este diazotrófico não coloniza obrigatoriamente
o interior dos tecidos das plantas. Por outro lado, James & Olivares (1997)
sugerem que o isolamento de Herbaspirillum em solo ocorreu devido à
contaminação por raízes ou pêlos radiculares no solo examinado. Essas
bactérias são Gram-negativas e, em meio de cultura semi-sólido, apresentam
células na forma de bastão com 0,6 a 0,7 µm de espessura por 3 a 5 µm de
comprimento. Em geral, são curvadas, mostrando movimento espiralóide
quando próximas a bolhas de ar (Döbereiner et al., 1995). Utilizam como fonte
de carbono ácido dicarboxílico, gluconato, glicose ou manitol e podem se
multiplicar em pH entre 5,3 a 8,0.
O gênero Burkholderia ocorre naturalmente na rizosfera de milho,
raízes, folhas e colmos de arroz (Baldani, 1996) ou saprofiticamente no solo
(Sonthayanon et al., 2002). Esta bactéria Gram-negativa tem como principal
fonte de carbono o manitol e apresenta multiplicação ótima em meio de cultura
semi-sólido, com pH entre 4,5 e 5,0. Além de relatos da FBN e produção de
promotores
de
crescimento
vegetal,
existem
relatos
de
antagonismo
a
Fusarium spp. em milho (Bevivino et al., 1998) que demonstram a possibilidade
da utilização de Burkholderia como agente no controle biológico dessa cultura.
Por outro lado, algumas espécies desse gênero podem ser patogênicas, como
B. pseudomallei, causadora de meloidose, doença endêmica do sul da Ásia e
norte da Austrália (Sonthayanon et al., 2002).
2.3 Contribuição dos diazotróficos para cultura do milho.
2.3.1 Fixação Biológica do Nitrogênio em plantas de milho
O aumento no rendimento de cereais devido à incorporação de
nitrogênio atmosférico via FBN já foi comprovado (Döbereiner et al., 1993).
Estudos recentes têm evidenciado a fixação biológica do nitrogênio em
algumas das principais culturas de interesse agronômico. Através de técnicas,
como a diluição do isótopo
15
N e abundância natural de
15
N, têm-se detectado
aumentos no conteúdo de N através da fixação do N2, demonstrada pela
presença do isótopo em baixas concentrações no interior do tecido das plantas
(James, 2000). Malik et al. (1993) utilizando
15
N constataram que cerca de 47%
do nitrogênio absorvido pelas plantas de trigo e arroz foi obtido através da FBN,
incrementada pela inoculação de um isolado de Azospirillum. Similarmente,
Ladha et al. (1998) relataram que a FBN em arroz pode ser um fator
significante no incremento de N para o crescimento das plantas. Em estudos
com 70 genótipos de arroz, Shrestha & Ladha (1996) obtiveram valores de 0 a
20,2% de N2 fixado biologicamente. A fixação biológica do nitrogênio também
foi detectada em plantas de trigo (Rennie et al., 1983) e gramíneas forrageiras
(De Polli et al., 1977), através de estudos do balanço de N. Através da técnica
da redução do acetileno, Kefalogianni et al. (1994) comprovaram a atividade da
enzima nitrogenase no interior e na superfície das raízes de trigo, cevada e
aveia. Esses autores atribuiram a atividade da enzima nitrogenase à presença
de bactérias diazotróficas do gênero Azospirillum que foram posteriormente
isoladas.
A maioria dos estudos com balanço de N realizados no Brasil
utilizaram variedades de cana-de-açúcar (Urquiaga et al., 1992; Boddey et al.,
1995, 1999; Yoneyama et al., 1997; Lima et al., 1987). Verificou-se que a
quantidade de N fixado era variável e dependente do genótipo das plantas e
das condições do ambiente. Todavia, algumas estimativas atribuíram cerca de
até 70% de absorção de N proveniente da FBN em algumas variedades de
cana-de-açúcar adaptadas e sugeriu-se que Gluconacetobacter diazotrophicus
era o principal microrganismo responsável pela FBN em cana-de-açúcar
(Boddey et al., 1995).
São poucos os estudos que evidenciem a FBN em milho. Porém, a
incorporação de nitrogênio atmosférico observada, através da abundância
natural de
15
N e da técnica da redução do acetileno, também tem sido
demonstrada em milho (Boddey, 1987; Alexander & Zuberer, 1989). Utilizando
N marcado, Garcia de Salomone et al. (1996) relataram que variedades de
milho cultivadas em vasos a céu aberto fixaram cerca de 58% do seu
requerimento de N quando inoculadas com Azospirillum spp. Os autores
demonstraram que bactérias do gênero Azospirillum isoladas das raízes do
milho podem ser os principais microrganismos envolvidos no processo da
fixação biológica do nitrogênio nessa gramínea.
2.3.2 Produção de promotores de crescimento de plantas
A maioria das bactérias diazotróficas associados a gramíneas pode
produzir hormônios, chamados comumente de promotores de crescimento de
plantas (PCPs). Estes compostos orgânicos são responsáveis pelo aumento da
área de absorção radicular, aumento do acúmulo de biomassa entre outros
efeitos que podem
aumentar o desenvolvimento da planta. Entre os
diazotróficos produtores de PCPs destacam-se Azospirillum lipoferum, A.
brasiliense e Azotobacter spp (Asghar, 2002b).
Os benefícios promovidos pela inoculação de sementes de milho “in
vitro” ou em vasos já foram demonstrados por diversos autores (Tabela 2).
A produção de PCPs pode estimular o aumento do peso da radícula
e da altura da plântula de sementes de milho germinadas em placa de Petri
(Javed et al., 1998), ou contribuir com incrementos de até 68% e 33% no
comprimento e no peso das raízes, respectivamente (Zahir et al., 2000).
Entretanto, experimentos conduzidos no campo nem sempre têm apresentado
resultados significativos. Chen et al. (1994) reportaram que a inoculação de
diazotróficos produtores de substâncias promotoras de crescimento de plantas
foi pouco eficaz quando os microrganismos foram inoculados em uma área
geograficamente distinta da área de origem do isolado. A variação na resposta
a inoculação de rizobactérias produtoras de substâncias promotoras de
crescimento de plantas em diferentes tipos de solo e cultivar, também foi
relatada por Chanway et al. (1988). Fallik & Okon (1988) relataram que a
inoculação de Azospirillum não causou efeito significativo no aumento do
comprimento das raízes quando inoculado em composto contendo argila e
mais que 1% de matéria orgânica. A especificidade hospedeira na associação
TABELA 2.
Benefícios
promovidos
pela
inoculação
de
diazotróficos
em
sementes ou plantas de milho.
Condição
Benefícios
Placas de Petri
Referência
Estímulo à germinação.
Hussain &
Vancura, 1970
Vasos em casa de
Aumento da superfície radicular, a partir da
Fallik et al., 1989
vegetação
segunda semana após a emergência.
“In vitro”
Produção de 10,5 a 39,0 µg mL-1 de AIA.
Mansour et al., 1994
Placas de Petri
Aumento no peso da radícula (68,4%) e altura
Javed et al., 1998
de plântula (42,2%).
Vasos em casa de
Aumento no comprimento (68,3%) e peso da
vegetação
radícula (33,8%).
Vasos em casa de
Aumento no comprimento (25%) e no peso
vegetação
das raízes (10,6%).
Vasos em casa de
Aumento no peso e comprimento de raízes
Zahir et al., 2000
Zahir et al., 2000
Thuar et al., 2000
vegetação
dos diazotróficos com o milho pode ser um dos principais fatores que
influenciam negativamente na inoculação.
2.4
Especificidade hospedeira na associação diazotróficos gramíneas
De modo geral, tem-se observado que os diazotróficos associados a
gramíneas conseguem se ajustar a um ambiente específico, heterogêneo e
variável, como a rizosfera. Este ajuste é dependente da diversidade genética
da população, pois quanto maior a variabilidade, maior o ajuste ao ambiente.
Através da quantificação da atividade da nitrogenase, Han & New (1998)
observaram que diferentes linhagens, isoladas de solos de sete regiões
geográficas da Austrália, apresentaram uma ampla variação na redução do
nitrogênio molecular à amônia. Essa grande diversidade é também estendida
para organismos do mesmo gênero e mesmo em linhagens de uma mesma
espécie,
cultivados
em
condições
ambientais
diferentes.
A
maioria
dos
diazotróficos listados na tabela 1 pode ocorrer associado a outras gramíneas e
cereais além do milho. No entanto, estudos de inoculação revelaram que existe
uma estreita afinidade entre estirpes e cultivares (Baldani & Döbereiner, 1980;
Penot et al., 1992).
Os efeitos da inoculação com Azospirillum em milho foram relatados
em vários trabalhos de pesquisa. Para Azospirillum brasiliense tem sido
verificado incrementos de 6 a 63% na produção de milho, ao passo que a
inoculação com A. lipoferum resultou em incrementos de até 100% (Baldani et
al., 1999). Grande parte desta variação se deve à inoculação de estirpes que
não são isoladas da mesma planta que está sendo inoculada (inoculação
heteróloga). Em sua maioria, a estirpe Cd, isolada de Cynodon dactilon, e Sp7,
isolada de Digitaria decumbens, foram as mais utilizadas. Fulchieri & Frioni
(1994), estudando o efeito da inoculação de Azospirillum lipoferum e A.
brasiliense (isolados de plantas de milho) em vasos (cultivar de milho híbrido
Cargil
155)
na
Argentina,
constataram
que
os
tratamentos
inoculados
obtiveram resposta similar ao tratamento com aplicação de 60 kg de uréia ha-1.
Neste estudo, a utilização de uma estirpe isolada da mesma planta inoculada e
as condições ambientais controladas podem ter influenciado na resposta
positiva à inoculação. A maioria dos experimentos de inoculação em plantas de
milho
desenvolvidos
sob
condições
controladas
obteve
incrementos
significativos na produção. Em experimento em vasos, Tilak et al. (1982)
obtiveram incrementos significativos no peso da matéria seca da variedade de
milho “Ganga” inoculada com um inoculante misto de Azospirillum brasiliense e
Azotobacter chroococcum. Fallik & Okon (1996) relataram que houve aumento
significativo no peso de espigas e no peso dos grãos de milho da cultivar
“Hazera- 224” através da inoculação de A. brasiliense em vasos. Entretanto,
em experimentos de campo o incremento na produção de grãos, conteúdo de
N ou produção de matéria seca, nem sempre tem sido significativo. Em um
levantamento de experimentos de inoculação no campo em diversos países e
com culturas de importância agrícola, Okon & Labandera-Gonzalez (1994)
verificaram que somente 5 a 30% dos experimentos apresentaram respostas
positivas e estatisticamente significativas. A variabilidade na resposta da
inoculação em experimentos de campo pode ser atribuída a uma série de
fatores. Segundo Baldani et al. (1999), a estirpe utilizada, o estádio fisiológico
da bactéria, genótipo da planta, o veículo de inoculação e fatores abióticos
podem influenciar nos resultados.
Os resultados da pesquisa com inoculação a campo não tem sido
muito animadores, principalmente devido à falta de reprodutibilidade dos dados
obtidos e das diferenças de incremento na produção encontradas, que podem
variar em média de 20 a 30% (Baldani et al., 1999). Experimentos no campo,
que investigam o efeito da inoculação de diazotróficos em gramíneas têm
demonstrado dificuldade em predizer a resposta da planta à inoculação. Este
fato sugere que a interação diazotrófico - gramínea é complexa e instável,
podendo variar significativamente em função do genótipo da planta e da
bactéria (Belimov et al., 1995).
A falta de resposta à inoculação da maioria dos experimentos devese ao fato de que os múltiplos fatores do ambiente, tanto bióticos como
abióticos, que afetam a relação, não estão sendo considerados. Critérios de
seleção demonstrados na literatura deverão ser mais bem definidos. Com isso,
fatores abióticos, como as características de solo e clima, e fatores bióticos,
como o genótipo da planta e a comunidade microbiana do solo, deverão ser
considerados para especificidade hospedeira e a viabilização da interação.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Delineamento experimental e avaliações
A atividade experimental foi realizada em três etapas, tendo a
primeira etapa o objetivo de selecionar cultivares de milho, cultivadas no
Estado do Rio Grande do Sul, pela menor resposta a adubação nitrogenada.
Este experimento foi conduzido em vasos e resultou na seleção de duas
cultivares de milho cujo desempenho foi avaliado em um experimento de
campo (segunda etapa). A terceira etapa foi realizada em laboratório e visou
determinar a contribuição dos isolados obtidos no experimento de campo
quanto a fixação do nitrogênio e a produção de promotores de crescimento
vegetal.
3.1.1 Experimento em vasos
Foi instalado um experimento em vasos (2 L) onde foram avaliadas 32
cultivares de milho com diferentes tipos de cultivares e de ciclo (Tabela 1),
atualmente cultivadas no Estado do Rio Grande do Sul. O delineamento
experimental foi inteiramente casualizado, com três repetições e os tratamentos
foram os seguintes: T1- testemunha sem adubação nitrogenada; T2- 50% da
dose recomendada de nitrogênio (100 Kg de N ha-1) e T3- 100% da dose
recomendada de nitrogênio (200 Kg de N ha-1).
Foi utilizado no experimento, o horizonte superficial de um solo
peneirado (malha 100 mm) e seco ao ar. Este solo foi classificado como
Argissolo Vermelho-Amarelo distrófico arênico (Embrapa, 1999) com pH (H2O)
5,0 e continha: 13% de argila; 0,5% de matéria orgânica; 2,9 mg.L-1 de fósforo
trocável; 19 mg.L-1 de potássio trocável; 0,2 cmolc.L-1 de alumínio trocável; 0,5
cmol c.L-1 de cálcio trocável, 0,3 cmol c.L-1 de magnésio trocável, 1,6 cmolc.L-1 de
alumínio + hidrogênio, 2,4 cmolc.L-1 de capacidade de troca de cátions e 35%
de saturação de bases.
A adubação foi realizada através da adição de solução nutritiva, de
acordo com a análise do solo e a recomendação de Adubação e Calagem para
os Estados do Rio Grande do Sul e Santa Catarina (Comissão de Fertilidade do
Solo
–
RS/SC,
1995).
correspondentes a 48 kg ha
Foram
-1
aplicados
fertilizantes
-1
de P2O5, 108 kg ha
em
quantidades
de K2O e 200 kg ha-1 de
nitrogênio (para os tratamentos onde foi aplicado 100% da dose recomendada)
e 100 kg ha-1 de nitrogênio (para os tratamentos onde foi aplicado 50% da dose
recomendada).
Foram semeadas 10 sementes de cada cultivar por vaso e 5 dias
após a emergência foi feito o desbaste mantendo-se 2 plantas por vaso. As
plantas foram cultivadas ao ar livre e irrigadas diariamente, mantendo-se o solo
a 80% da capacidade de campo. Aos 45 dias após a emergência foi efetuada a
colheita da parte aérea das plantas de todos os tratamentos e o solo do
tratamento 1 foi amostrado para a detecção de diazotróficos no solo antes e
após o cultivo. A matéria vegetal seca foi pesada e analisada quanto ao
conteúdo de nitrogênio total.
A seleção das cultivares foi baseada no peso da matéria seca e no
nitrogênio total da parte aérea das plantas, utilizando-se como critério, a razão
entre a média das repetições do tratamento 1 e a média das repetições dos
tratamentos 2 e 3 (T1/T2 e T1/T3). Desta forma, razões com valor próximo a
zero indicaram dissimilaridade entre os tratamentos, demonstrando que a
cultivar não era apta para associar-se a microrganismos diazotróficos. Razões
com valor próximo a 1 indicaram similaridade entre os tratamentos e uma maior
aptidão da variedade para associar-se aos diazotróficos. Através deste critério
foram selecionadas para o experimento no campo, duas cultivares pela máxima
e mínima resposta a adubação nitrogenada.
TABELA 3. Cultivar, tipo de cultivar e ciclo de desenvolvimento das plantas de
milho avaliadas.
Cultivar
Tipo de Cultivar
Ciclo
Taquarão
Polinização aberta
Normal
Nitroflint
Polinização aberta
Precoce
Pop. LM 9275
Polinização aberta
Normal
Pop. Assis Brasil
Polinização aberta
Normal
RS 20
Polinização aberta
Normal
Pop. Charrua
Polinização aberta
Normal
Vencedor AL 25
Polinização aberta
Precoce
CEP 304 /Fundacep
Polinização aberta
Precoce
NB 3047
Híbrido simples
Precoce
Milho Doce / Agristar
Híbrido simples
Precoce
Agroceres 1225
Híbrido simples
Normal
Santa Rosa 3063
Híbrido simples
Precoce
Santa Rosa 3081
Híbrido simples
Precoce
Pioneer 3041
Híbrido simples
Precoce
Pioneer 3069
Híbrido simples
Superprecoce
Pioneer 30K75
Híbrido simples
Semiprecoce
Pioneer 30F88
Híbrido simples
Semiprecoce
Pioneer 30F80
Híbrido simples
Semiprecoce
Pioneer 30F33
Híbrido simples
Precoce
Pioneer 3072
Híbrido simples
Superprecoce
Pioneer 30R07
Híbrido simples
Precoce
Pioneer 32R21
Híbrido simples
Superprecoce
AS 523 / Agroeste
Híbrido Duplo
Precoce
Cargil 929
Híbrido Duplo
Superprecoce
SH 40-40 / Santa Helena
Híbrido Duplo
Precoce
Cargil 511 A
Híbrido Duplo
Superprecoce
SH 8447 / Santa Helena
Híbrido Duplo
Precoce
SH 50-50 / Santa Helena
Híbrido Triplo
Semiprecoce
Pioneer 3027
Híbrido Triplo
Precoce
Pioneer 3063
Híbrido Triplo
Precoce
Pioneer 3232
Híbrido Triplo
Semiprecoce
Pioneer 3071
Híbrido Triplo
Precoce
3.1.2 Experimento no campo
O experimento no campo visou avaliar a ocorrência e a distribuição
de diazotróficos associados as cultivares selecionadas, durante o ciclo de
desenvolvimento das plantas, com e sem adubação nitrogenada. As duas
cultivares selecionadas (Santa Helena 8447 e Santa Rosa 3063) foram
cultivadas no ano agrícola de 2001 / 2002, na Estação Experimental
Agronômica da UFRGS em Eldorado do Sul, RS.
O experimento foi delineado em um esquema do tipo fatorial 2 (cultivar)
x 2 (com e sem adubação nitrogenada), inteiramente casualizado, com 3
repetições. Os tratamentos utilizados foram os seguintes: T1 - cultivar Santa
Helena 8447 – sem adubação nitrogenada; T2 - cultivar Santa Rosa 3063 –
sem adubação nitrogenada; T3 - cultivar Santa Helena 8447 – com adubação
nitrogenada; T4 - cultivar Santa Rosa 3063 – com adubação nitrogenada.
O solo no local do experimento foi classificado como Argissolo Vermelho
distrófico típico (Embrapa, 1999) com pH (H2O) 5,2 e continha: 28% de argila,
2,3% de matéria orgânica, 3,8 mg.L-1 de fósforo trocável, 137 mg.L -1 de
potássio trocável, 0,1 cmolc.L-1 de alumínio trocável, 3,0 cmol c.L-1 de cálcio
trocável, 1,7 cmol c.L-1 de magnésio trocável, 3,6 cmol c.L-1 de alumínio +
hidrogênio, 8,6 cmolc.L-1 de capacidade de troca de cátions e 59% de
saturação de bases.
A adubação foi realizada de acordo com o resultado da análise do
solo e a recomendação de Adubação e Calagem para os Estados do Rio
Grande do Sul e Santa Catarina (Comissão de Fertilidade do Solo – RS/SC,
1995). Foram aplicados 160 kg ha-1 de superfosfato triplo (41% de P2O5 e 12 –
14% Ca) em toda a área e 200 kg ha-1 de uréia nas parcelas que receberam
adubação nitrogenada. A adubação nitrogenada foi aplicada em três doses de
30, 85 e 85 kg ha-1 após a semeadura e aos 50 e 70 dias após a emergência,
respectivamente.
A semeadura foi realizada manualmente em 6 linhas de uma parcela de
5 m x 7 m (35 m2 ) e 15 dias após a emergência foi feito o desbaste, mantendose uma densidade final de aproximadamente 60.000 plantas por hectare
(equivalente a 6 plantas por metro de linha).
Aos 30, 55, 77 e 115 dias após a emergência foram coletadas amostras
da parte aérea, das raízes e do solo rizosférico das plantas para a
quantificação dos diazotróficos presentes. As amostras foram compostas por
três plantas retiradas da segunda e terceira linhas de cultivo. Também foram
coletadas amostras da parte aérea das plantas (três amostras por parcela) para
a determinação do peso da matéria seca e quantificação dos teores de
nitrogênio no tecido. A quarta e quinta linhas de semeadura foram utilizadas
para a determinação da produção de grãos. Amostras de solo foram coletadas
para quantificação do nitrogênio mineral do solo na mesma época de coleta
das amostras das plantas. Utilizou-se um trado de rosca para retirar 30 subamostras por parcela, dentro das linhas de cultivo.
3.1.3 Experimento no laboratório
Os isolados bacterianos obtidos no experimento de campo foram
avaliados quanto a contribuição para as plantas quanto a fixação biológica do
nitrogênio e a produção de promotores de crescimento de plantas. A
quantificação da fixação biológica do nitrogênio foi obtida através da análise do
nitrogênio total presente no meio semi-sólido seletivo inoculado com 0,1mL de
meio de cultura líquido (108 - 109 células mL-1) contendo as bactérias
diazotróficas isoladas. O meio foi digerido com H2SO 4 concentrado e o
nitrogênio foi quantificado em micro Kjeldhal, de acordo com metodologia
descrita por Camargo et al.,1999. A produção de promotores de crescimento de
plantas foi quantificada através da produção de auxinas em meio de cultura
líquido e determinada por espectrofotometria a partir de uma curva padrão de
ácido indol acético.
3.2 Análise de solo, planta e de diazotróficos
3.2.1 Análise de solo
O nitrogênio mineral do solo foi determinado imediatamente após a
coleta. As amostras foram homogeneizadas, pesadas (50 g) e colocadas em
frasco de vidro contendo 200 mL de solução extratora de KCl 1 mol L-1. Outra
sub-amostra foi coletada para determinação da umidade do solo. Uma alíquota
de 20 mL do extrato foi destilada e foram quantificados os teores de NH4+ e
NO 3- + NO 2- de acordo com a metodologia descrita por Tedesco et al. (1995).
3.2.2 Análise da planta
O tecido das plantas foi seco em estufa com circulação forçada de ar
a 65-70°C, sem lavagem do material, até atingir peso constante. Para
determinação do peso da matéria seca utilizou-se balança com sensibilidade
de 0,001 g. O tecido seco foi moído em peneira de 0,5 mm de diâmetro e uma
amostra foi retirada para determinação do teor de nitrogênio a partir da
digestão sulfúrica, de acordo com a metodologia descrita por Tedesco et al.
(1995).
3.2.3 Análise dos diazotróficos
A contagem e o isolamento dos diazotróficos seguiu a metodologia
descrita por Dobereiner et al. (1995) e Baldani (1996). As amostras das raízes
e do colmo das plantas foram lavadas em água corrente e cortadas em frações
de aproximadamente 10 cm. As frações foram pesadas (10 g) e maceradas em
90 mL de solução salina e diluídas serialmente na mesma solução até 10 -5. As
amostras de solo rizosférico foram suspendidas em 90 mL de solução salina e
diluídas conforme descrito para as amostras de raízes e colmo.
Para a contagem dos diazotróficos, uma alíquota de 0,1 mL das
suspensões 10-2, 10-3, 10-4, e 10-5 foi inoculada em meios de cultura semisólidos, seletivos (3 frascos por diluição) para o isolamento de Burkholderia
spp. (meio JMV), Azospirillum spp. (meio NFb), Herbaspirillum spp. (meio
JNFb), A. amazonense (meio LGI) e Acetobacter diazotrophicus (meio LGI-P).
A composição dos meios utilizados encontra-se descrita no anexo 1.
Os meios de cultura foram incubados a 30ºC por 7 dias e após este
período, foi feita a contagem do número de bactérias presentes nas amostras
pelo método do Número Mais Provável (NMP), utilizando a tabela de McGrady.
O número de tubos positivos foi determinado pela presença de película
característica (em forma de véu) no meio semi-sólido.
O isolamento das bactérias diazotróficas foi feito através da
transferência de parte da película dos frascos de maior diluição com
crescimento positivo, para um novo meio semi-sólido (NFb, JNFb, LGI, LGI-P e
JMV) até que outra película fosse formada. Após esta etapa, as culturas foram
transferidas para placas de Petry, contendo meio de cultura sólido seletivo para
cada microrganismo a ser isolado, e incubadas a 30°C até a formação de
colônias características de cada espécie.
Para
a
purificação,
as
colônias
formadas
foram
novamente
transferidas para meios de cultura semi-sólidos, e após a formação de película,
transferidas para placas de Petry contendo o meio Batata (anexo 1). Após cada
etapa do isolamento foram feitas preparações para a observação dos isolados
em microscópio óptico, visando caracterizá-los quanto a forma, motilidade e
tamanho das células.
A verificação da presença de diazotróficos após o cultivo em vasos
seguiu o mesmo procedimento descrito anteriormente. Porém, utilizou-se
apenas a suspensão 10-3 para a inoculação, em triplicata, nos meios de cultura
NFb e JNFb (anexo 1) semi-sólidos seletivos para o isolamento de Azospirillum
spp. e Herbaspirillum spp., respectivamente.
3.2.3.1 Quantificação do N2 fixado
Para a quantificação do nitrogênio total fixado pelos diazotróficos,
uma colônia pura foi inoculada em meio de cultura líquido (Dygs modificado –
anexo 1) e incubada sob agitação por 24h. Após a incubação, uma alíquota de
0,1mL (contendo 108 - 109 células ml-1) foi transferida para um meio de cultura
semi-sólido (três repetições), ausente de nitrogênio, e incubado em estufa à
30°C por 72h. Como controle, utilizou-se uma prova branca, contendo apenas o
meio de cultura semi-sólido não inoculado, e uma prova positiva, contendo o
meio de cultura com uma quantidade conhecida de N (100 µg de NH4+). O
nitrogênio total foi quantificado após digestão sulfúrica e destilação com NaOH
conforme descrito por Camargo et al.,1999.
3.2.3.2 Produção de promotores de crescimento vegetal
A produção de promotores de crescimento vegetal foi analisada
conforme descrito por Asghar et al., 2001. Tubos de ensaio contendo 25 mL de
meio de cultura líquido esterilizado (Dygs modificado) foram inoculados com
0,1 mL das culturas puras dos diazotróficos isolados e incubados a 30ºC por
24h. Para a quantificação da produção de auxinas, o conteúdo dos tubos foi
filtrado em papel filtro Nº 2 e 3 mL do filtrado foram pipetados para um novo
tubo contendo 2 mL de uma solução contendo o reagente de Salkowski (2 mL
de FeCl3 0,5 mol L-1 + 98 mL de HClO4 35%). Após 30 min. a intensidade da
cor foi mensurada em espectrofotômetro a 535 nm. A curva padrão continha o
meio de cultura esterilizado e quantidades conhecidas de ácido indol acético
(AIA).
3.3 Análise estatística dos dados
Para a análise estatística das contagens dos diazotróficos, foi
utilizado o programa MULTIV versão 2.1.1 (Pillar, 2001) para a análise
multivariada dos dados. Como base para a análise, construiu-se uma matriz
para os dados de cada contagem dos diazotróficos presentes no solo, raízes e
colmo das amostras de milho e nas quatro épocas de coleta. Cada matriz foi
constituída por quatro colunas, representadas pelas variáveis (meio de cultura
onde se desenvolveram as bactérias) e 12 linhas, (unidades experimentais),
representadas pelas amostras coletadas de cada parcela. A variável LGI-P foi
ignorada, pois não se detectou a presença de microrganismos desenvolvidos
nesse meio de cultura.
Para comprovar a hipótese nula (Ho), de que não há diferença entre
os tratamentos utilizados, efetuou-se a análise de variância e o teste de
aleatorização, considerando-se como nível de significância ∝ = 0,05. Para
comparação entre as variáveis, utilizou-se a correlação que mede a relação
entre dois conjuntos de dados. Para a análise das médias dos demais dados foi
utilizado o teste de DMS a 5% de probabilidade.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Seleção de cultivares de milho em vasos
4.1.1 Avaliação agronômica das cultivares
A adubação nitrogenada afetou significativamente o peso da matéria
seca do milho (Tabela 4) e o conteúdo de nitrogênio total (Tabela 5) das
cultivares avaliadas. Em relação à produção de matéria seca pelas cultivares
de milho, o maior rendimento nas condições do experimento foi observado na
cultivar Pioneer 3069 (4,1 g planta-1), quando se adicionou 200 kg de N ha-1.
Este rendimento pode estar relacionado ao ciclo superprecoce deste híbrido
simples com a duração do cultivo (45 dias após a emergência). O menor
rendimento foi observado quando não se adicionou nitrogênio na cultivar
Nitroflint (0,50 g planta-1).
Em termos de resposta à adubação nitrogenada, a adição de 200 kg
-1
de N ha
aumentou 6,1 vezes o rendimento de matéria seca da cultivar
Nitroflint, comparado ao aumento de 4,6 vezes da cultivar Pioneer 3069. A
cultivar Nitroflint foi avaliada quanto ao efeito da adição de 10 e 100 kg ha-1 de
N por Machado et al. (1998). Estes autores observaram aumento significativo
do peso e do conteúdo de nitrogênio nos grãos e no tecido dessa cultivar com
o
aumento
da
adubação
nitrogenada,
demonstrando
que
esta
cultivar
apresenta alta resposta a adubação nitrogenada. Entretanto, a maior resposta
à adição de nitrogênio ocorreu na cultivar Santa Rosa 3063, com um
incremento de 6,5 vezes (0,55 g planta-1 sem adição de N e 3,62 g planta-1 com
adição de 200 kg de N ha-1). A menor resposta foi verificada na cultivar Santa
Helena 8447, com um incremento no rendimento da matéria seca de 2,7 vezes
TABELA 4. Rendimento de matéria seca da parte aérea das cultivares de
milho avaliadas aos 45 dias após a emergência.
Cultivar
0
Adubação Nitrogenada (kg ha-1 )
100
200
----------------------------------------- g planta-1 ----------------------------------------Polinização Aberta
Taquarão
Nitroflint
Pop. LM 9275
Pop. Assis Brasil
RS 20
Pop. Charrua
Vencedor AL 25
CEP 304 /Fundacep
0,93
0,50
0,62
0,52
0,59
0,67
0,64
0,80
BC c
Jc
GHIJ b
IJ b
GIHJ b
EFGHI c
FGHIJ b
BCDEF b
2,81
2,23
2,24
1,28
2,52
1,66
2,52
2,61
ABCDE b
FGH b
FGH a
HIJ a
ABCDEFG a
IJ b
ABCDEFG a
ABCDEFG a
3,67
3,07
2,52
2,29
2,48
2,12
2,90
2,96
ABCDE a
FGHIJKL a
LMNOP a
OP a
MNOP a
Pa
IJKLMN a
HIJKLM a
0,69
0,70
0,95
0,55
0,84
0,91
0,90
0,91
0,80
0,66
0,72
0,62
0,63
0,67
DEFGH c
DEFGH b
Bc
HIJ c
BCD c
BC b
BC c
BC c
BCDE b
EFGHI c
DEFG c
GHIJ c
GHIJ b
EFGHI b
2,59
1,45
2,80
2,53
2,90
3,04
2,85
2,82
3,00
2,85
2,40
2,45
2,40
2,22
ABCDEFG b
Jb
ABCDE b
ABCDEFG b
ABCD b
Aa
ABCDE b
ABCDE b
AB a
ABCDE b
DEFG b
CDEFG b
DEFG a
GH a
3,23
2,36
3,14
3,62
3,76
3,48
4,08
3,80
3,35
3,30
2,94
3,29
2,09
2,41
DEFGHIJK a
NOP a
EFGHIJK a
ABCDEF a
ABCD a
BCDEFGH a
Aa
ABC a
BCDEFGHIJ a
CDEFGHIJ a
HIJKLM a
CDEFGHIJ a
Pa
MNOP a
0,58
0,60
0,70
0,79
1,11
GHIJ b
GHIJ c
DEFGH c
CDEF c
Ab
2,72
2,35
2,78
2,48
2,95
ABCDEFG a
EFG b
ABCDE b
BCDEFG b
ABC a
3,20
3,33
3,53
2,80
3,04
DEFGHIJK a
CDEFGHIJ a
ABCDEFG a
JKLMNO a
GHIJKL a
EFGHI c
BC c
DEFG c
GHIJ b
BCDE c
2,75
2,69
2,79
2,50
2,71
ABCDEF b
GHI b
ABCDE b
BCDEFG a
ABCDEFG b
3,38
3,55
3,64
2,70
3,70
BCDEFGHI a
ABCDEFG a
AB a
KLMNO a
ABCD a
Hibrido Simples
NB 3047
Milho Doce / Agristar
Agroceres 1225
Santa Rosa 3063
Santa Rosa 3081
Pioneer 3041
Pioneer 3069
Pioneer 30K75
Pioneer 30F88
Pioneer 30F80
Pioneer 30F33
Pioneer 3072
Pioneer 30R07
Pioneer 32R21
Hibrido Duplo
AS 523 / Agroeste
Cargil 929
SH 40-40/Santa Helena
Cargil 511A
SH 8447/ Santa Helena
Hidrido Triplo
SH 50-50/Santa Helena 0,68
Pioneer 3027
0,88
Pioneer 3063
0,94
Pioneer 3232
0,57
Pioneer 3071
0,81
Médias seguidas da mesma letra maiúscula na coluna não diferem significativamente entre
cultivares e médias seguidas da mesma letra minúscula na linha não diferem
significativamente entre tratamentos pelo teste de DMS a 5%.
.
pela adição de 200 kg de N ha-1. Em relação aos tipos de cultivar, a análise
geral dos resultados indicou que não houve efeito significativo da adição de
nitrogênio sobre o rendimento da matéria seca entre híbridos e não híbridos,
que apresentaram incrementos médios de 4,3 a 4,5 vezes com a adição da
maior dose de nitrogênio.
O conteúdo de nitrogênio no tecido das cultivares de milho foi
afetado pela adição de nitrogênio
(Tabela 5). Os menores valores de N na
planta foram observados nas cultivares Santa Rosa 3063 e Nitroflint (ambas
4,29 mg planta-1) sem adição de nitrogênio. O maior acúmulo de nitrogênio no
tecido foi verificado no híbrido simples Santa Rosa 3063 (83,61 mg planta-1),
quando adicionou-se 200 kg de N ha-1.
A eficiência relativa de absorção de nitrogênio pelo milho variou
entre as cultivares testadas e as doses de N aplicadas. Em média, os híbridos
simples e triplo apresentaram a maior eficiência de absorção de N (32,9 e
31,6%, respectivamente), quando adicionou-se 100 kg de N ha-1. Entre as
doses de N aplicadas, a média geral das eficiências relativas indicou que não
houve diferenças entre a aplicação de 100 (31,2%) e 200 kg de N ha-1 (32,0%).
O híbrido simples Santa Rosa 3063 apresentou a maior eficiência de absorção
de N (68,0%) e a cultivar de polinização aberta LM 9275 a menor eficiência
(17,8%), quando adicionou-se 200 kg de N ha-1 (Tabela 5).
De modo geral, as cultivares de milho apresentaram diferentes
respostas quanto à produção de matéria seca e acúmulo de N em relação à
adição de nitrogênio e ao material genético testado. Entretanto, os resultados
obtidos podem não ser suficientes para a seleção direta das cultivares para o
experimento de campo, devido à amplitude de ciclos (normal, precoce,
semiprecoce e superprecoce) entre as cultivares e o curto período de cultivo
(45 dias após a emergência). Para compensar esta diferença, as cultivares
foram selecionadas através de um índice obtido pela razão entre os resultados
do rendimento de matéria seca e do conteúdo de N no milho observado no
tratamento sem nitrogênio e os tratamentos com adubação nitrogenada (100 e
200 kg N ha-1) (Tabela 6). As cultivares com índice calculado próximo a zero
apresentaram maior resposta à adubação nitrogenada, enquanto que as
cultivares com índices próximos a 1 apresentaram menor resposta ao N
adicionado.
TABELA 5. Conteúdo de nitrogênio total no tecido da parte aérea das
cultivares de milho avaliadas aos 45 dias após a emergência.
Adubação Nitrogenada (kg N ha -1)
Cultivar
0
100
200
-1
------------------------------------ mg planta ---------------------------------Polinização Aberta
Taquarão
Nitroflint
Pop. LM 9275
Pop. Assis Brasil
RS 20
Pop. Charrua
Vencedor AL 25
CEP 304 /Fundacep
6,57
4,29
4,66
4,41
4,46
6,08
5,06
6,45
CDEF c
Fc
EF c
Fc
Fc
CDEF c
CDEF c
CDEF c
25,91
24,61
20,27
16,68
24,61
22,85
22,29
24,53
EF b
GH b
Mb
Ob
GH b
JK b
Kb
GH b
43,80
38,61
25,49
35,99
38,59
51,39
38,84
47,28
FG a
JK a
Pa
Na
JK a
Ba
Ja
Da
5,34
7,28
7,01
4,29
5,46
7,35
7,27
7,42
5,92
4,89
5,61
5,23
4,64
6,49
CDEF c
BCD c
BCDE c
Fc
CDEF
BC c
BCD c
Bc
CDEF c
DEF c
CDEF c
CDEF c
EF c
CDEF c
29,20
29,88
25,28
29,68
20,99
25,24
27,81
20,90
28,23
25,24
23,88
20,39
20,81
26,48
Ab
Ab
FG b
Ab
LM b
FG b
BC b
LM b
Bb
FG b
HI b
Mb
LM b
DE b
39,17
34,13
45,95
83,61
44,13
36,52
44,28
48,08
44,10
39,91
37,31
36,26
34,36
39,27
IJ a
O
Ea
Aa
FG a
MN a
Fa
Da
FG a
Ia
LM a
Na
Oa
IJ a
4,35
5,44
5,28
7,25
9,26
Fc
CDEF c
CDEF c
BCD c
Ac
26,01
17,38
23,61
22,46
21,31
EF b
Ob
IJ b
Kb
Lb
42,21
36,72
42,09
33,95
33,57
Ha
MN a
Ha
Oa
Oa
5,14
6,55
5,18
4,61
6,45
CDEF c
CDEF c
CDEF c
EF c
CDEF c
23,89
25,31
27,03
18,97
25,50
HI b
FG b
CD b
Nb
Fb
42,19
37,84
48,99
43,40
45,48
Ha
KL a
Ca
Ga
Ea
Hibrido Simples
NB 3047
Milho Doce / Agristar
Agroceres 1225
Santa Rosa 3063
Santa Rosa 3081
Pioneer 3041
Pioneer 3069
Pioneer 30K75
Pioneer 30F88
Pioneer 30F80
Pioneer 30F33
Pioneer 3072
Pioneer 30R07
Pioneer 32R21
Hibrido Duplo
AS 523 / Agroeste
Cargil 929
SH 40-40/Santa Helena
Cargil 511A
SH 8447/ Santa Helena
Hidrido Triplo
SH 50-50 / Santa Helena
Pioneer 3027
Pioneer 3063
Pioneer 3232
Pioneer 3071
Médias seguidas da mesma letra maiúscula na coluna não diferem significativamente entre
cultivares e médias seguidas da mesma letra minúscula na linha não diferem significativamente
entre tratamentos pelo teste de DMS a 5%.
Entre as cultivares de milho avaliadas, o maior índice para o
rendimento de matéria seca foi obtido pela cultivar Santa Helena 8447, quando
adicionou-se 100 kg de N ha-1 (Tabela 6). Na dose máxima de nitrogênio
aplicada, esta cultivar obteve o segundo maior índice de rendimento. Já para o
conteúdo de nitrogênio no tecido, a cultivar Santa Helena 8447 apresentou os
maiores índices em ambas as doses de N aplicadas, sendo então selecionada
para o experimento de campo como a cultivar de menor resposta à adubação
nitrogenada. Os menores índices para o rendimento da matéria seca foram
observados entre as cultivares Nitroflint, AS 5223 Agroeste e Santa Rosa 3063.
Entre essas cultivares, o menor índice para acúmulo de N no tecido foi obtido
pela cultivar Santa Rosa 3063, sendo esta selecionada para o experimento de
campo como a cultivar de maior resposta à adubação nitrogenada.
4.1.2 Avaliação da presença de diazotróficos
A avaliação da formação de película em meio semi-sólido não
possibilitou a detecção de microrganismos diazotróficos no solo antes do
cultivo de milho. Geralmente, a sobrevivência de diazotróficos na ausência de
plantas é bastante baixa, principalmente para espécies como Azospirillum
brasilense (Bashan et al., 1994) e Herbaspirillum seropedicae (Olivares et al.,
1996). Para H. seropedicae, Olivares et al (1996) observaram que este
microrganismo apresentou uma baixa taxa de sobrevivência no solo rizosférico
sem planta. Entretanto, os mesmos autores reisolaram a bactéria do solo
quando
este
foi
cultivado
com
sementes
de
sorgo
desinfestadas
superficialmente. Este resultado indica que a população de diazotróficos pode
ter
sido
estimulada
pela
presença
das
plantas,
e
conseqüentemente,
aumentado seu número no solo para níveis detectáveis pela técnica utilizada
ou que a bactéria estava presente no interior da semente desinfestada de
sorgo.
Houve formação de película ao menos em um tubo contendo meio
de cultura semi-sólido sem adição de nitrogênio, seletivo para o crescimento de
diazotróficos, inoculado com amostras de solo coletado após o cultivo (45 dias
após a emergência) (Tabela 7). Os resultados deste experimento podem
indicar que as cultivares estimularam a presença de diazotróficos, suficiente
TABELA 6. Razão entre as médias do rendimento de matéria seca e do
conteúdo de nitrogênio total dos tratamentos T1/T2 e T1/T3 das
cultivares de milho avaliadas.
Cultivar
Polinização Aberta
Taquarão
Nitroflint
Pop. LM 9275
Pop. Assis Brasil
RS 20
Pop. Charrua
Vencedor AL 25
CEP 304 /Fundacep
Híbrido Simples
NB 3047
Milho Doce / Agristar
Agroceres 1225
Santa Rosa 3063
Santa Rosa 3081
Pioneer 3041
Pioneer 3069
Pioneer 30K75
Pioneer 30F88
Pioneer 30F80
Pioneer 30F33
Pioneer 3072
Pioneer 30R07
Pioneer 32R21
Híbrido Duplo
AS 523 / Agroeste
Cargil 929
SH 40-40/Santa Helena
Cargil 511A
SH 8447/ Santa Helena
Híbrido Triplo
SH 50-50/Santa Helena
Pioneer 3027
Pioneer 3063
Pioneer 3232
Pioneer 3071
Matéria Seca
T1 (1) /T2 (2)
T1/T3(3)
Nitrogênio Total
T1/T2
T1/T3
0,33
0,22
0,27
0,29
0,23
0,40
0,25
0,30
0,25
0,16
0,24
0,23
0,24
0,32
0,22
0,27
0,25
0,17
0,23
0,26
0,18
0,27
0,23
0,26
0,15
0,11
0,18
0,12
0,12
0,12
0,13
0,14
0,25
0,29
0,34
0,22
0,29
0,30
0,31
0,32
0,27
0,23
0,30
0,25
0,26
0,30
0,21
0,48
0,30
0,18
0,22
0,26
0,22
0,24
0,23
0,20
0,25
0,19
0,30
0,28
0,18
0,24
0,28
0,15
0,26
0,29
0,26
0,36
0,21
0,19
0,23
0,26
0,22
0,24
0,14
0,21
0,15
0,05
0,12
0,2
0,16
0,15
0,13
0,12
0,15
0,14
0,14
0,17
0,21
0,26
0,25
0,32
0,38
0,18
0,18
0,20
0,28
0,37
0,17
0,31
0,22
0,32
0,43
0,1
0,15
0,13
0,21
0,28
0,25
0,33
0,25
0,23
0,30
0,20
0,25
0,17
0,21
0,22
0,21
0,26
0,19
0,24
0,25
0,12
0,17
0,11
0,11
0,14
(1) Tratamento sem nitrogênio
(2) Tratamento com adição de 100 kg N ha-1
(3) Tratamento com adição de 200 kg N ha -1
para a detecção no meio de cultura semi-sólido. Para os híbridos duplos Santa
Helena 40-40 e Santa Helena 8447 houve formação de película em todos os
tubos, ao passo que em várias cultivares houve formação de película em
poucos tubos, incluindo algumas notadamente mais responsivas à adubação
nitrogenada, como o híbrido triplo Pioneer 3063.
De modo geral, observou-se uma relação direta entre as duas
cultivares selecionadas pela resposta à adubação nitrogenada (Santa Helena
8447e Santa Rosa 3063) e o número de tubos com formação de película, ou
seja, quanto menor a resposta à adubação nitrogenada, maior a população de
diazotróficos
presentes.
Entretanto,
não
foi
possível
detectar
diferenças
aparentes entre o número de tubos com formação de película contendo meio
NFb ou JNFb. Em média, ambos apresentaram 2,1 tubos com crescimento de
película. Os meios de enriquecimento NFb e JNFb, são utilizados para o
isolamento
de
Azospirillum
spp.
e
Herbaspirillum
spp.,
respectivamente
(Döbereiner et al. (1995). Azospirillum spp. ocorre naturalmente em solo
rizosférico de plantas, mas algumas espécies podem ser encontradas dentro
das raízes. Por outro lado, Herbaspirillum spp. ocorre endofiticamente, apesar
de ter sido isolado primeiramente de solo rizosférico de milho, sorgo e arroz
(Baldani et al., 1986). Mais recentemente, este microrganismo foi reclassificado
como endofítico obrigatório, apresentando uma baixa taxa de sobrevivência no
solo na ausência de um hospedeiro (James & Olivares, 1997).
Os resultados deste experimento demonstraram que, independente
da cultivar, tanto Azospirillum spp. como Herbaspirilum spp. não estavam
detectáveis no solo rizosférico antes do cultivo e, após o cultivo, foi possível
detectá-los no solo rizosférico. De forma similar, Baldani et al. (1992)
observaram que Herbaspirillum seropedicae não pôde ser isolado de solos não
cultivados. A detecção de diazotróficos após o cultivo pode ter ocorrido devido
ao estímulo da planta ao aumento da população de bactérias para níveis
detectáveis, a presença na semente ou a presença de um pequeno número de
bactérias viáveis, mas não culturáveis por um longo período no solo nativo,
conforme observaram Olivares et al. (1996).
TABELA 7. Meios de cultura NFb e JNFb com formação de película (+) ou
sem formação de película (-) inoculados com suspensão de solo
rizosférico (10-3) coletado após o cultivo (45 dias após a
emergência) das cultivares de milho avaliadas.
Meios de Cultura
Cultivar
Polinização Aberta
Taquarão
Nitroflint
Pop. LM 9275
Pop. Assis Brasil
RS 20
Pop. Charrua
Vencedor AL 25
CEP 304 /Fundacep
Híbrido Simples
NB 3047
Milho Doce / Agristar
Agroceres 1225
Santa Rosa 3063
Santa Rosa 3081
Pioneer 3041
Pioneer 3069
Pioneer 30K75
Pioneer 30F88
Pioneer 30F80
Pioneer 30F33
Pioneer 3072
Pioneer 30R07
Pioneer 32R21
Híbrido Duplo
AS 523 / Agroeste
Cargil 929
SH 40-40/Santa Helena
Cargil 511A
SH 8447/ Santa Helena
Híbrido Triplo
SH 50-50/Santa Helena
Pioneer 3027
Pioneer 3063
Pioneer 3232
Pioneer 3071
NFb
JNFb
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
4.2
Avaliação das cultivares Santa Helena 8447 e
Santa Rosa 3063 no campo
As cultivares Santa Helena 8447 e Santa Rosa 3063 foram
selecionadas no experimento de vasos em função da menor e da maior
resposta à adubação nitrogenada, respectivamente. Este experimento teve por
objetivo avaliar no campo o rendimento de matéria seca e o acúmulo de
nitrogênio no tecido das duas cultivares de milho, na ausência e na presença
de 200 kg de uréia ha-1, e a distribuição e a ocorrência de diazotróficos
associados a elas.
4.2.1 Avaliação agronômica das cultivares
O rendimento de matéria seca das cultivares de milho foi afetado
pela adubação nitrogenada e pelos períodos de avaliação (Tabela 8). No
estádio vegetativo (30 DAE), a cultivar Santa Rosa 3063 apresentou o maior
rendimento
quando
recebeu
adubação
nitrogenada,
mas
não
significativamente da cultivar Santa Helena 8447 com ou sem
diferiu
adubação
nitrogenada (Tabela 8). No estádio de pendoamento (55 DAE), não houve
diferenças no rendimento de matéria seca entre as cultivares e entre os
tratamentos. Entretanto, a partir do espigamento (77 DAE), a cultivar Santa
Rosa 3063 adubada apresentou maior rendimento de matéria seca, quando
comparada à cultivar Santa Helena 8447.
Durante o ciclo reprodutivo (pendoamento + espigamento) não
houve diferença no rendimento de matéria seca entre cultivares e entre
tratamentos, à exceção da cultivar Santa Helena 8447 sem adubação no
estádio de pendoamento, que apresentou menor rendimento. No estádio de
enchimento de grãos (115 DAE) não houve diferenças entre adição ou não de
nitrogênio no rendimento de matéria seca da cultivar Santa Helena 8447, ao
passo que a adição de N aumentou 42% do rendimento da matéria seca da
cultivar Santa Rosa 3063 (Tabela 8).
A adubação nitrogenada afetou significativamente o rendimento de
grãos das cultivares de milho avaliadas (Tabela 8). A adição de N aumentou 14
e 26% o rendimento de grãos do híbrido duplo Santa Helena 8447 e do híbrido
simples Santa Rosa 3063, respectivamente. A cultivar Santa Rosa 3063
apresentou
os
maiores
rendimentos
de
grãos,
comparado
à
cultivar
TABELA 8. Rendimento de matéria seca e conteúdo de nitrogênio no tecido da
parte aérea, rendimento de grãos e teor de nitrogênio nos grãos
das cultivares de milho avaliadas com e sem adubação nitrogenada
(200 kg ha-1 de uréia).
Cultivar /
Dias após a emergência
Grãos
Tratamento
30
55
77
115
DMS (5%)
-1
--- kg ha-1---
---------------- Matéria seca (g planta ) ---------------Santa Helena sem N
11,42 A c
168 A b
186 B b
396 AB a
30,93
5341,55 C
Santa Rosa sem N
9,04 B d
183 A c
246 AB b
365B a
59,2
6949,03 B
Santa Helena com N
11,78 A c
221 A b
258 AB b
441 AB a
129,87
6076,00 BC
Santa Rosa com N
12,08 A c
181 A b
278 A b
520 AB a
98,46
8730,65 A
1,62
66,23
80,06
142,21
-
1406,28
DMS (5%)
----------------- Nitrogênio (mg planta -1) ---------------Santa Helena sem N 387,5 A b
2478,1 B a
---- N (%) ----
2757,9 A a 3349,9 A a
1313,5
1,60 B
Santa Rosa sem N
270,2 B b 3090,8 AB a
3574,3 A a 3857,5 A a
1558,7
1,59 B
Santa Helena com N
402,2 A b 4134,6 A a
4731,1 A a 6115,4 A a
2390,9
2,32 A
Santa Rosa com N
406,9 A b 3728,0 A a
3792,7 A a 5330,6 A a
2065,6
1,60 B
-
0,43
DMS (5%)
107,7
1219,7
2104,6
2865,2
Médias seguidas da mesma letra maiúscula na coluna não diferem significativamente entre
cultivares/tratamentos e médias seguidas da mesma letra minúscula na linha não diferem
significativamente entre dias após a emergência pelo teste de DMS a 5%.
Santa Helena 8447, independente da adição ou não de N.
O conteúdo de nitrogênio no tecido das cultivares de milho foi
afetado pela adubação nitrogenada e pelos períodos de avaliação, mas em
menor magnitude que o rendimento de matéria seca (Tabela 8). Apenas no
estádio de desenvolvimento vegetativo (30 DAE) as cultivares de milho
apresentaram conteúdos de N no tecido estatisticamente inferiores aos demais
estádios avaliados. A partir dos 77 dias após a emergência não ocorreram
diferenças significativas entre cultivares e adição ou não de N. A quantidade de
nitrogênio
absorvido
pelas
plantas
aumenta
progressivamente
durante
o
período de crescimento vegetativo, atinge o máximo durante os estádios
reprodutivos e decresce na fase de enchimento de grãos (Cregan & Berkum,
1984). A absorção deste nutriente é modulada pela disponibilidade energética
para os processos de transporte de íons pelas membranas, os quais são
dependentes de energia, gerada através do suprimento de carboidratos às
raízes (Bredemeir & Mundstock, 2000).
Ao final das avaliações (115 DAE) não houve diferenças (N total no
tecido) entre os tratamentos (Tabela 8). Entretanto, a cultivar Santa Helena
8447 acumulou 82% a mais de nitrogênio na matéria seca quando foi adubada,
ao passo que a Santa Rosa 3063 acumulou apenas 38%. No experimento em
vasos, este comportamento foi oposto, com a cultivar Santa Rosa 3063
acumulando mais nitrogênio do que a cultivar Santa Helena 8447.
A cultivar Santa Rosa 3063 havia sido selecionada como a mais
responsiva à adubação nitrogenada após 45 dias de avaliação no experimento
em vasos. Com a adição de N no solo do experimento no campo, a cultivar
Santa Rosa 3063 acumulou 50% de nitrogênio comparado ao acúmulo de
apenas 4% de N pela cultivar Santa Helena 8447 após 30 dias de cultivo.
Neste caso, a cultivar Santa Rosa 3063 respondeu melhor ao nitrogênio, mas
apenas no período inicial do cultivo. Estes resultados indicam que a avaliação
do desempenho das cultivares em vasos após 45 dias de cultivo não refletiu o
potencial
genético
das
cultivares
de
milho
em
responder
à
adubação
nitrogenada no campo, já que a maior absorção de nitrogênio ocorre no estádio
reprodutivo (Cregan & Berkum, 1984). O maior teor de nitrogênio no grão
confirma a capacidade da cultivar Santa Helena 8447 em utilizar mais
adequadamente o nitrogênio proveniente da adubação.
4.2.2 Ocorrência e distribuição das bactérias diazotróficas nas
cultivares de milho
Conforme observado no experimento em vasos, também não foi
detectada a presença de diazotróficos no solo antes do cultivo no campo, ao
passo que após a semeadura do milho foi possível detecta-los no solo e nas
diferentes partes das plantas avaliadas.
A avaliação do NMP da população total dos diazotróficos variou em
função das diferentes partes da planta (solo, raízes e colmo), dos diferentes
tratamentos e dos diferentes períodos de avaliação (Figura 1). Independente
dos tratamentos e dos estádios das cultivares, o NMP de diazotróficos foi, em
média, sempre superior nas raízes, seguido de valores menores detectados no
colmo e no solo. A presença de uma maior população de diazotróficos nas
raízes de milho tem sido relatada por outros autores (Döbereiner & Day, 1975;
Baldani & Döbereiner, 1980; Roesch et al., 2000). A maior incidência de
diazotróficos nas raízes das plantas também tem sido observada em outras
culturas, como cana-de-açúcar (Reis Junior et al., 2000), cevada (Didonet &
Didonet, 1998) e gramíneas forrageiras (Kirchhof et al., 1997). No estádio
vegetativo (30 DAE) observou-se uma maior população de diazotróficos nas
raízes quando não foi adicionado nitrogênio.
O nitrogênio diminuiu a população de diazotróficos em todas as
partes analisadas de ambas cultivares. Somente após o estádio reprodutivo,
verificou-se um acréscimo significativo na população de diazotróficos presentes
nas raízes, em relação ao estádio de desenvolvimento vegetativo (30 DAE).
Este aumento, depois dos 77 dias após a emergência, também foi observado
em
todos
os
tratamentos
avaliados.
A
população
de
diazotróficos
foi
influenciada negativamente pela adição de nitrogênio ao solo apenas
no
estádio inicial de desenvolvimento das plantas (30 DAE). Esta influência foi
observada através da análise de correlação entre o N mineral do solo e o NMP
da população de diazotróficos totais na planta em ambas cultivares (r = 0,76 p
≤ 0,07). Nos demais estádios de desenvolvimento das plantas não foram
observadas correlações, indicando que o N do solo teve influência negativa na
população de diazotróficos
população
de
provavelmente
apenas
diazotróficos
não
foi
no
detectada
influenciada
início do cultivo. A pequena
no
pela
período
reprodutivo,
adubação
nitrogenada.
Santa Helena 8447
NMP de diazotróficos x 104 g-1
250
(A)
250
200
200
150
150
100
100
50
50
(B)
0
0
30
55
77
30
115
55
77
115
Santa Rosa 3063
250
(A)
250
200
200
150
150
100
100
50
50
0
0
30
55
77
115
(B)
30
55
77
115
Dias após a emergência
Solo
Raiz
Colmo
FIGURA 1. Número mais provável (NMP) da população de diazotróficos totais
presentes no solo, raízes e colmo das cultivares Santa Helena
8447 e Santa Rosa 3063 sem aplicação de nitrogênio (A) e com
aplicação de nitrogênio (B).
Tem sido relatado que a adubação nitrogenada aumenta o número
de bactérias heterotróficas que colonizam a rizosfera de plantas de milho (Kolb
& Martin, 1988), o que sugere que o decréscimo no número de diazotróficos
pode
ter
sido
heterotróficas.
causado
Na
por
ausência
competição
de
entre
nitrogênio,
a
bactérias
diazotróficas
população
de
e
bactérias
diazotróficas é favorecida, já que os microrganismos heterotróficos necessitam
de uma fonte nitrogenada externa para o aumento da população. O oposto
ocorre quando existe uma fonte de nitrogênio disponível no solo. Entre
cultivares não se observaram diferenças significativas na população de
diazotróficos presentes no solo, raízes e colmo, independente da adição ou não
de nitrogênio ou dos estádios de desenvolvimento.
Os
meios
de
enriquecimento
utilizados
permitiram
detectar
a
presença de gêneros de diazotróficos como Azospirillum spp., Herbaspirillum
spp. e Burkholderia spp. e a espécie Azospirillum amazonense associados às
cultivares de milho Santa Rosa 3063 e Santa Helena 8447 em todas as partes
das plantas analisadas (Figuras 2 e 3). Estes microrganismos também foram
detectados nas raízes, colmos e solo rizosférico do milho, trigo, sorgo e arroz
(Baldani et al., 1997; James & Olivares, 1997). Não foi detectada a presença de
Gluconacetobacter diazotrophicus associado às cultivares nas diferentes partes
analisadas. Esta bactéria é endofítica e geralmente tem sido encontrada em
associação com plantas contendo maior quantidade de açúcar, como a canade-açúcar, batata-doce e Pennisetum purpureum (Steenhoudt & Vandrleyden,
2000).
De forma geral, a distribuição dos diazotróficos detectados nas
diferentes partes das plantas foi afetada pela adubação nitrogenada, pelas
cultivares e pelo período de avaliação (Figuras 2 e 3). Quando não foi aplicado
nitrogênio ao solo (Figura 2), verificou-se o predomínio na população de
Azospirillum spp. e Herbaspirillum spp., com o aumento da população de
Azospirillum amazonense na cultivar Santa Helena 8447, à medida que a
planta se desenvolvia.
A população de bactérias do gênero Burkholderia spp. foi menor
no solo e sua presença foi verificada somente nos estádios iniciais e finais
de desenvolvimento das plantas (Figuras 2 e 3). Nas demais partes da
planta,
este
gênero
somente
foi
detectado
na
cultivar
Solo
(A)
(B)
100
100
75
75
50
50
25
25
0
0
30
55
77
115
30
55
77
Raízes
(B)
Diazotróficos (%)
(A)
100
100
75
75
50
50
25
25
0
115
0
30
55
77
115
(A)
30
75
75
50
50
25
25
0
0
77
115
115
(B)
100
55
77
Colmo
100
30
55
30
55
77
115
Dias após a emergência
Azospirillum spp.
Azospirillum amazonense
Herbaspirillum spp.
Burkholderia spp.
Figura 2. Distribuição da população de diazotróficos presentes no solo, raízes
e colmo das cultivares Santa Helena 8447 (A) e Santa Rosa 3063
(B) aos 30, 55, 77 e 115 dias após a emergência sem aplicação de
nitrogênio.
Santa Helena 8447. De modo geral, para os tratamentos sem adubação
nitrogenada, a cultivar Santa Helena 8447 apresentou maior diversidade na
população de diazotróficos que a cultivar Santa Rosa 3063, principalmente
nas raízes e no colmo (Figura 2). Mota et al. (2002), estudando a
diversidade
de
Paenibacillus
polymyxa
em
quatro
cultivares
de
milho,
verificaram que a cultivar exerceu influência sobre a variabilidade genética
das
populações
presentes
na
rizosfera
do
milho.
A
diversidade
da
população de diazotróficos é afetada pela quantidade e composição dos
materiais orgânicos excretados pelas raízes das plantas, as quais variam
durante o ciclo de desenvolvimento de diferentes cultivares (Neal Junior et
al., 1970; Chanway et al., 1988).
A
distribuição
da
população
dos
diazotróficos
nas
raízes
foi
semelhante à distribuição da população de diazotróficos no solo, com uma
predominância da população de Azospirillum
spp. e Herbaspirillum spp.,
independente das raízes apresentarem a maior população observada no
experimento (Figura 1). Na cultivar Santa Rosa 3063 observou-se a presença
significativa da população de Azospirillum amazonense até os 77 dias após a
emergência. No colmo da cultivar Santa Helena 8447, a predominância foi da
população de Herbaspirillum spp. sobre os outros gêneros avaliados durante
quase todo os períodos de avaliação, ao passo que na cultivar Santa Rosa
3063 verificou-se a predominância de Azospirillum spp. Relatos sobre a
presença de Azospirillum spp. colonizando a parte aérea das plantas são
menos freqüentes No entanto, Pereira (1995) estudando a incidência de
bactérias do gênero Azospirillum em diferentes genótipos de milho, relatou a
presença no colmo em algumas amostras.
A adição de nitrogênio diminuiu a população de diazotróficos em
todas as partes avaliadas das cultivares no estádio inicial de desenvolvimento
das plantas (30 DAE) (Figura 1) mas, de modo geral, não afetou a diversidade
da população de diazotróficos, com pequenas alterações no padrão de
distribuição desses (Figura 3). Verificou-se o predomínio das populações dos
gêneros Azospirillum spp. e Herbaspirillum spp. sobre a população dos demais
gêneros avaliados. A população dos diazotróficos do gênero Burkholderia spp.
esteve presente em todos os tratamentos e partes da planta, e geralmente, nos
estádios iniciais até os 77 dias após a emergência. Resultados semelhantes
Solo
(A)
(B)
100
100
75
75
50
50
25
25
0
0
30
55
77
115
30
Diazotróficos (%)
(A)
55
77
115
(B)
Raízes
100
100
75
75
50
50
25
25
0
0
30
55
77
115
30
(A)
55
77
115
Colmo
100
(B)
100
75
75
50
50
25
25
0
0
30
55
77
115
30
55
77
115
Dias após a emergência
Azospirillum spp.
Azospirillum amazonense
Herbaspirillum spp.
Burkholderia spp.
Figura 3. Distribuição da população de diazotróficos presentes no solo, raízes e
colmo das cultivares Santa Helena 8447 (A) e Santa Rosa 3063 (B)
aos 30, 55, 77 e 115 dias após a emergência com aplicação de
nitrogênio.
foram observados por Bevivino et al. (1998), onde a população rizosférica de
Burkholderia cepacia foi elevada no início do ciclo das plantas de milho,
decresceu após o estádio vegetativo e tornou a aumentar quando a maturação
da planta estava completa. Esses autores sugerem que seria mais vantajoso
isolar bactérias para a utilização como inoculantes em milho nos estádios finais
de desenvolvimento das plantas, pois os genótipos bacterianos seriam mais
bem adaptados já que estes foram capazes de colonizar e sobreviver até o final
do ciclo de desenvolvimento das plantas.
Entre cultivares não foi possível detectar diferenças aparentes na
diversidade da população de diazotróficos nas partes das plantas avaliadas.
Entretanto,
a
análise
estatística
multivariada
dos
resultados
(Anexo
3)
possibilitou verificar que a cultivar influenciou a população de bactérias
presentes
no
solo
nos
períodos
de
desenvolvimento
vegetativo
e
de
florescimento (30 e 77 dias após a emergência, respectivamente) (p<0,05) No
período de pendoamento, (55 dias após a emergência) a cultivar também
influenciou a população de bactérias no colmo (p< 0,05) e nas raízes (p< 0,01).
Esta análise também indicou que o nitrogênio diminuiu significativamente a
população de diazotróficos no solo (p < 0,05) e nas raízes (p < 0,01) somente
no estádio de desenvolvimento vegetativo (30 dias após a emergência) apesar
da população de diazotróficos estar exposta a teores elevados de N (nos
tratamentos que receberam adubação nitrogenada) durante todos os períodos
avaliados (Anexo 4). Quando as diferenças entre grupos de unidades amostrais
são descritas por mais de uma variável, a análise de variância multivariada
pode ser uma alternativa para evitar as restrições da análise univariada
(Podani, 1994). Desta forma, foi possível verificar diferenças na diversidade da
população de diazotróficos entre as cultivares avaliadas, indicando que a
cultivar pode ter influenciado na diversidade da população de diazotróficos
associados ao milho.
4.2.3 Relação entre a população de diazotróficos e N absorvido
Foi
observado
no
experimento
no
campo
que
a
adubação
nitrogenada afetou a produção e o acúmulo de N nas cultivares de milho e a
distribuição e ocorrência de diazotróficos nos sítios avaliados das plantas. Para
compreender a dinâmica da relação entre diazotróficos e N absorvido pelas
plantas
nos
diferentes
estádios
de
desenvolvimento
das
cultivares,
os
resultados foram sistematizados em função dos sítios na planta, da ausência
(Figura 4) ou da presença de nitrogênio no solo (Figura 5).
Sem a adição de nitrogênio, a população de diazotróficos presentes
no solo variou em função dos estádios de desenvolvimento da planta e das
cultivares (Figura 4). Observou-se que no estádio inicial de desenvolvimento de
ambas cultivares, a população de diazotróficos foi maior, decrescendo à
medida que o milho absorveu mais nitrogênio e aumentando no final do ciclo,
quando a demanda de N pela planta era menor. No entanto, a população de
diazotróficos presentes no colmo aumentou ou diminuiu com o aumento ou
decréscimo na absorção de N pelas plantas, respectivamente (Figura 4).
Pode-se
sugerir
que
a
variação
no
número
de
diazotróficos
presentes nas raízes e no solo, durante o ciclo de desenvolvimento das
plantas, seja governada pela disponibilidade de fontes de carbono fornecida
através da exsudação radicular. Na medida em que a taxa de absorção de
nitrogênio aumenta, o suprimento de carboidratos às raízes também aumenta e
esse processo gera uma perda irreversível de fotoassimilados transferidos até
a rizosfera. Por outro lado, quando a taxa de absorção de nitrogênio é baixa
(início e final do ciclo de desenvolvimento do milho), há uma diminuição na taxa
de translocação de compostos de carbono para o sistema radicular, o que
diminui a liberação de exsudatos para a rizosfera (Bredemier & Mundstock,
2000). O aumento da exsudação de compostos de carbono pode favorecer o
desenvolvimento de microrganismos heterotróficos, os quais podem competir
com os diazotróficos, diminuindo a população dos mesmos. As variações na
população de diazotróficos e na população de bactérias heterotróficas totais
nas raízes e na rizosfera podem estar diretamente ligadas à disponibilidade de
fontes de carbono e ao efeito competitivo entre esses microrganismos.
A população dos microrganismos diazotróficos endofíticos presentes
no colmo das plantas de milho analisadas não sofre efeito competitivo com
Solo
(A)
10
(B)
10
80
70
60
50
40
30
20
10
0
8
6
4
2
0
30
55
77
80
70
60
50
40
30
20
10
0
8
6
4
2
0
115
30
55
77
115
Raízes
NMP diazotróficos x 104 g-1
250
250
80
70
60
50
40
30
20
10
0
200
150
100
50
0
30
55
77
80
70
60
50
40
30
20
10
0
200
150
100
50
0
115
30
55
77
Absorção de N (%)
(B)
(A)
115
Colmo
(A)
20
(B)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
15
10
5
0
30
55
77
115
20
80
70
60
50
40
30
20
10
0
15
10
5
0
30
55
77
115
Dias após a emergência
Diazotróficos
N
FIGURA 4. Relação entre o NMP da população total de diazotróficos
presentes no solo, raízes e colmo e a absorção de nitrogênio nas
cultivares Santa Helena 8447 (A) e Santa Rosa 3063 (B) sem
aplicação de nitrogênio.
outros microrganismos não diazotróficos e no interior do tecido das plantas.
Provavelmente, as fontes de carbono estão prontamente disponíveis (Olivares
et al., 1997). Sendo assim, a população dos diazotróficos que colonizam o
colmo das plantas de milho pode variar de acordo com a maior ou menor taxa
de absorção de nutrientes.
Com a adição de nitrogênio, a população de diazotróficos no solo foi
afetado apenas no início do cultivo (Figura 5). A partir do estádio vegetativo (30
DAE), observou-se que o aumento na absorção de N pelas plantas foi seguido
do decréscimo da população de diazotróficos. Aos 55 e 77 dias após a
emergência das plantas, os diazotróficos presentes no solo não foram afetados
pelo nitrogênio, mesmo quando este atingiu valores de 17,30 e 151,47 mg N
kg-1 de solo aos 55 dias nas cultivares Santa Helena 8447 e Santa Rosa 3063,
respectivamente (Anexo 4). Ao final do ciclo de desenvolvimento das plantas, a
população de diazotróficos tendeu a aumentar em ambas cultivares. Este
comportamento é melhor observado para os diazotróficos presentes nas raízes
das cultivares. Kolb & Martin (1988), estudando a influência do nitrogênio sobre
a população de bactérias diazotróficas e bactérias totais na rizosfera,
verificaram um comportamento semelhante ao observado neste estudo. Após a
aplicação de nitrogênio, os autores verificaram que houve um decréscimo no
número mais provável (NMP) de diazotróficos e um aumento no NMP de
heterotróficos. Os autores atribuem este fato à supressão competitiva, como o
principal fator determinante da diminuição da população de diazotróficos.
A relação entre a população de diazotróficos presentes no colmo e a
absorção de N pela cultivar Santa Helena 8447 foi a mesma observada quando
não se adicionou N, ou seja, à medida que ocorreram aumentos ou
decréscimos na absorção de N, também se verificou o mesmo com a
população de diazotróficos. Para a cultivar Santa Rosa 3063, observou-se o
mesmo comportamento dos diazotróficos presentes no colmo porém, a
amplitude dos valores foi inferior.
Os resultados obtidos neste levantamento permitem fazer algumas
inferências a respeito de técnicas de manejo do solo em nível experimental, a
fim de otimizar o processo da fixação biológica do nitrogênio e da produção de
substâncias
promotoras
de
crescimento
de
plantas.
Pode-se
sugerir
a
avaliação do impacto na produção através supressão da adubação nitrogenada
Solo
(A)
(B)
8
80
8
80
70
6
60
70
6
60
50
50
4
40
4
40
30
30
2
20
2
20
10
10
0
0
0
30
55
77
0
30
115
55
77
115
(A)
150
(B)
80
150
80
70
120
90
70
60
120
50
90
60
50
40
60
40
60
30
20
30
10
0
30
55
77
20
30
10
0
30
0
115
0
30
55
77
Absorção de N (%)
NMP diazotróficos x 104 g-1
Raízes
115
Colmo
(A)
6
(B)
80
6
80
70
70
60
60
4
50
40
30
2
4
50
40
30
2
20
20
10
0
0
30
55
77
115
10
0
0
30
55
77
115
Dias após a emergência
Diazotróficos
N
FIGURA 5. Relação entre o NMP da população total de diazotróficos
presentes no solo, raízes e colmo e a absorção de nitrogênio das
cultivares Santa Helena 8447 (A) e Santa Rosa 3063 (B) com
aplicação de nitrogênio.
inicial aplicada no momento da semeadura. A supressão da adubação inicial
pode favorecer o desenvolvimento da população inoculada, já que o nitrogênio
exerce seu maior efeito no estádio de desenvolvimento vegetativo das plantas
de milho. A supressão da adubação de base favorece o aumento da população
bacteriana, que pode penetrar no tecido das plantas. No interior das mesmas a
absorção de N pela planta favorece a população de diazotróficos.
Os
diazotróficos
associativos
podem
aumentar
o
comprimento
radicular do milho até o final do período vegetativo pela produção de
substâncias promotoras de crescimento de plantas e, após a aplicação de
nitrogênio em cobertura, o sistema radicular mais desenvolvido terá capacidade
de absorver com mais eficiência a água e o nitrogênio adicionado, diminuindo
as perdas por lixiviação. A aplicação do nitrogênio apenas em cobertura pode
diminuir em cerca de 30% a utilização de adubos nitrogenados, o que
representa uma grande economia em termos globais.
4.3 Análise dos isolados bacterianos
O isolamento de bactérias da maior diluição com crescimento de
película em meio de cultura semi-sólido e a caracterização da morfologia das
colônias em meio seletivo e meio enriquecido, bem como a quantificação do N2
fixado confirmou a presença de bactérias diazotróficas associadas às duas
cultivares de milho. Isolados do gênero Azospirillum spp. foram obtidos em
todas as partes amostradas (solo, raízes e colmo) (Tabela 9), ao passo que
bactérias do gênero Herbaspirillum sp. foram isoladas apenas de raízes e
colmo. O isolamento de Herbaspirillum spp. em raízes e colmo pode ter
ocorrido devido ao caráter endofítico do gênero. O isolamento de Azospirillum
spp. em todas as partes amostradas pode ter ocorrido devido ao caráter
endofítico facultativo destas bactérias. Não foram isoladas bactérias do gênero
Burkholderia spp. e da espécie A. amazonense, mesmo tendo ocorrido
formação de película em meio de cultura seletivo para ambos microrganismos.
Embora Burkholderia spp. não tenha sido isolada no presente estudo, este
gênero já foi encontrado colonizando raízes de milho (Hernandez et al., 1995).
A maior freqüência de isolamento foi obtida para bactérias do gênero
Azospirillum spp. (85%), enquanto que apenas 15% dos isolados obtidos foram
do gênero Herbaspirillum sp. Todos os isolados do gênero Herbaspirillum
TABELA 9. Isolados das cultivares Santa Helena 8447 e Santa Rosa 3063 em
diferentes locais, N total fixado, N excretado e produção de
auxinas.
Isolados
Gênero
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Azospirillum brasiliense
Azospirillum lipoferum
Azospirillum lipoferum
Azospirillum brasiliense
Azospirillum lipoferum
Azospirillum lipoferum
Herbaspirillum sp.
Herbaspirillum sp .
Azospirillum brasiliense
Herbaspirillum sp.
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
Sp 7
DMS (5%)
Azospirillum lipoferum
Azospirillum brasiliense
Azospirillum brasiliense
Azospirillum lipoferum
Azospirillum brasiliense
Azospirillum lipoferum
Azospirillum brasiliense
Azospirillum brasiliense
Azospirillum brasiliense
Azospirillum lipoferum
Azospirillum brasiliense
N Total
N Excretado Auxinas
Local
Santa Helena 8447
------------------ µg mL-1 dia-1 -----------------Solo
4,04 hi
0,46 cdef
18,42 gh
Solo
6,40 b
0,56 abcd
19,68 gh
Solo
2,90 jk
0,21 ghi
17,04 hi
Raiz
3,77 hi
0,22 ghi
20,43 fg
Raiz
2,79 k
0,29 fghi
23,13 ef
Raiz
4,67 fg
0,17 hi
36,06 a
Raiz
5,89 bc
0,53 bcd
19,86 gh
Raiz
5,54 cde
0,58 abcd
17,61 ghi
Colmo
3,51 ij
0,22 ghi
17,16 hi
Colmo
4,98 ef
0,65 ab
19,91 gh
Santa Rosa 3063
Solo
4,98 ef
0,31 efghi
18,30 gh
Solo
2,58 kl
0,53 bcd
32,50 b
Solo
4,11 ghi
0,14 i
27,10 cd
Solo
5,26 def
0,35 efg
25,55 de
Solo
4,67 fg
0,20 ghi
15,09 ij
Solo
5,63 cd
0,73 a
17,33 hi
Solo
6,27 b
0,48 bcde
13,19 j
Raiz
2,12 l
0,34 efgh
27,56 cd
Raiz
5,86 bcd
0,59 abcd
29,11 c
Colmo
4,22 gh
0,42 def
29,86 bc
7,62 a
0,60 abc
6,18 k
4,85
1,41
2,99
Números seguidos da mesma letra minúscula na coluna não diferem significativamente entre
isolados pelo teste de DMS a 5%.
............
foram obtidos da cultivar Santa Helena 8447 (Tabela 9), sendo que 2 foram
isolados das raízes e 1 do colmo desta cultivar, o que comprova a maior
diversidade observada na avaliação do NMP dos diazotróficos no campo. Na
cultivar Santa Helena 8447 predominaram isolados do gênero A. lipoferum
(75%), ao passo que na cultivar Santa Rosa 3063 a distribuição das duas
espécies de Azospirillum foi mais homogênea (57% de A. brasiliense e 43% de
A. lipoferum ). A identificação destas duas espécies pode ser realizada pela
multiplicação em meio contendo glicose, onde somente a espécie A. lipoferum
é capaz de utilizar glicose como única fonte de carbono (Döbereiner et al.,
1995). Cerca de 50% dos isolados da cultivar Santa Helena 8447 foram obtidos
das raízes das plantas. Os resultados obtidos neste experimento estão de
acordo a maioria dos resultados da avaliação do NMP de diazotróficos em
gramíneas (Baldani & Döbereiner, 1981; Baldani, 1984; Reis Jr., 2000), onde
verifica-se que a maioria das bactérias diazotróficas são isoladas das raízes.
Foram obtidos 30% dos isolados do solo e 20% do colmo. Já na cultivar Santa
Rosa 3063, 70% dos isolados foram obtidos do solo, 20% das raízes e 10% do
colmo.
4.3.1 Quantificação do N2 fixado
Os resultados da quantificação do N2 fixado pelos isolados (Tabela
9) variaram de 6,27 µg de N mL-1 dia-1 (isolado nº 17) a 2,12 µg.de N mL-1 dia-1
(isolado nº 18), ambos da espécie A. brasiliense,. isolados da cultivar Santa
Rosa 3063. A média geral de N fixado foi de 4,5 µg de N mL-1 dia-1, ao passo
que a estirpe padrão A. brasiliense Sp7 fixou 7,62 µg de N mL-1 dia-1, 69% a
mais que a média geral. A estirpe Sp7 foi originalmente isolada de Digitaria
decumbens e é mais utilizada em estudos de inoculação (Baldani et al., 1999),
provavelmente, devido ao seu alto potencial de fixação biológica. Destacaramse também, quanto a maior fixação de N2, os isolados do gênero Herbaspirillum
(Tabela 9), que fixaram em média 5,47 µg de N mL-1dia-1, 21,5% a mais que a
média geral. Os isolados de A. brasiliense fixaram em média 4,1 µg de N mL-1
dia-1, ao passo que os isolados de A. lipoferum fixaram 4,25 µg de N mL-1 dia-1.
Porém, os isolados de A. brasiliense apresentaram maior amplitude nos
resultados (2,12 a 6,27 µg de N mL-1 dia-1).
A destilação do meio de cultura sem prévia digestão sulfúrica
permitiu quantificar o nitrogênio que foi excretado pelos microrganismos
(Tabela 9). A capacidade dos diazotróficos em excretar parte do N fixado já
havia sido comprovada por Cojho et al. (1993), através da interação de
Gluconacetobacter diazotrophicus com uma levedura em meio de cultura sem
nitrogênio. Neste estudo, os autores verificaram que os microrganismos deste
gênero excretaram até 48% do N fixado. Os isolados obtidos das duas
cultivares excretaram em média 9,2% do N fixado, sendo que a variação foi de
3 a 21%. A média de N excretado foi de 0,43 µg de N mL-1 dia-1 e a maior
excreção foi verificada no isolado de A. lipoferum nº 16 (0,73 µg de N mL-1 dia1
) ao passo que a menor excreção foi verificada no isolado de A. brasiliense nº
13(0,14 µg de N mL-1 dia-1). Novamente, destacaram-se os isolados endofíticos
do gênero Herbaspirillum, que excretaram em média 0,58 µg de N mL-1 dia-1,
45% a mais que a média.
4.3.2 Produção de substâncias promotoras de crescimento de
plantas
Com relação à produção de PCPs, verificou-se que todos os
isolados apresentaram habilidade de produzir AIA em meio de cultura (Tabela
9). Em média, os isolados produziram 22,24 µg de AIA mL-1 dia-1. Asghar
(2002b) trabalhando com PCPs em Brassica sp, verificou produção de até 24,6
µg de AIA mL-1. A estirpe padrão Sp7 produziu 6,18 µg de AIA mL-1 dia-1, 3,6
vezes menos do que a média. De forma geral, verificou-se uma correlação
negativa entre fixação de nitrogênio e produção de AIA (r = 0,53, p ≤ 0,20).
Porém, o número de amostras não foi suficiente para que a correlação fosse
significativa a 5%. Resultados positivos da utilização com inoculantes mistos
tem sido relatados. Em trabalho com inoculantes contendo uma mistura de
bactérias
do
gênero
Azospirillum,
Brasil
(2001)
verificou
aumentos
no
nitrogênio total e no peso da matéria seca de gramíneas forrageiras comparado
com a inoculação com apenas uma espécie de Azospirillum. Han & New (1998)
observaram resultados semelhantes em plantas de trigo inoculadas com
inoculante misto, em comparação com a inoculação simples. As diferenças na
FBN e na produção de PCPs dos isolados pode ser um dos motivos da
obtenção de incrementos na produção através da utilização de inoculantes
mistos.
A maior produção de AIA foi obtida pelo isolado nº 6 de A. lipoferum
(36,06 µg de AIA mL-1 dia-1), 62% acima da média, seguido do isolado nº 12 de
A. brasiliense (32,5 µg de AIA mL-1 dia-1), 46% acima da média. A menor
produção de AIA foi observada no isolado nº 17 de A. brasiliense (1,6 vezes
menor que a média).
5. CONCLUSÕES
Os resultados obtidos no presente estudo permitiram as seguintes
conclusões:
a) Bactérias do gênero Azospirillum spp., Herbaspirillum spp., e
Burkholderia spp. Foram detectadas em cultivares de milho colonizando o solo
da rizosfera, as raízes e colmo das plantas;
b) as raízes foram oo sítio preferencial de colonização dos
diazotróficos avaliados;
c) a distribuição de diazotróficos foi influenciada por cultivares de
milho contrastantes quanto à resposta ao N. no entanto, a população de
diazotróficos totais não foi afetada pelas diferentes cultivares;
d) a adição de nitrogênio ao solo influenciou negativamente a
população de diazotróficos na fase inicial de desenvolvimento do milho;
e) o ciclo de desenvolvimento das plantas de milho influenciou a
distribuição e o número de diazotróficos totais;
f) os diazotróficos isolados das plantas e do solo rizosférico de
milho
foram
capazes
de
fixar
N2
e
produzir
PCPs.
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALEXANDER, D. B.; ZUBERER, D. A. 15N2 fixation by bactéria associated with
maize roots at a low partial O 2 pressure. Appl. Environ. Microbiol.,
Washington, v.55, p.1748-1753, 1989.
ASGHAR, H. N.; ZAHIR, Z. A.; ARSHAD, M KHALIQ, A. Relationship between
in vitro production of auxins by rhizobacteria and their growth-promoting
activities in Brassica juncea L. Biol Fertil. Soils, Berlin, v.35, p.231-237,
2002a.
ASGHAR, H. N. Isolation and screening of plant growth promoting
rhizobacteria for increasing tield and oil contents of Brassica sp.
Faisalabad: University of Agriculture, 2002. 210f. Tese (Doutorado - Soil
Science), University of Agriculture, Faisalabad, 2002b.
BAKKER, P. A.; BAKKER, H. M.; MARUGG, A. W.; WEISBECK, J. D.;
SCHIPPERS, P. J. Bioassay for studying the role of siderophores in potato
stimulation by Pseudomonas spp. in short potato rotations. Soil Biol.
Biochem., Oxford, v.19, p.443-449, 1987.
BALDANI, J. I. Ocorrência e caracterização de Azospirillum amazonense
em comparação com as outras espécies deste gênero, em milho,
sorgo e arroz. Itaguaí: UFRRJ, 1984. 110f. Dissertação (Mestrado Ciência do Solo) - Programa de Pós-Graduação em Agronomia,
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Itaguaí, 1984.
BALDANI, J. I.; BALDANI, V. L.; SELDIN, L.; DOBEREINER, J.
Characterization of Herbaspirillum seropedicae gen. nov., sp. Nov., a root
associated nitrogen fixing bacterium. Intern. J. Syst. Bacteriol.,
Washington, v.36, p.86-93, 1986.
BALDANI, J. I.; CARUSO, L.; BALDANI, V. L. D.; GOI, S.; DÖBEREINER, J.
Recent advances in BNF with non-legume plants. Soil Biol. Biochem.,
Oxford, v.29, p.911-922, 1997.
BALDANI, J. I.; AZEVEDO, M. S.; REIS, V. M.; TEIXEIRA K. R.; OLIVARES, F.
L.; GOI, S. R.; BALDANI, V. L. D.; DÖBEREINER J. Fixação biológica do
nitrogênio em gramíneas: Avanços e aplicações. In. SIQUERA, J. O.;
MOREIRA, F. M. S.; LOPES, A. S.; GUILHERME, L. R. G.; FAQUIN, V.;
FURTINI NETO, A. E.; CARVALHO, J. G. (Eds.). Inter-relação fertilidade,
biologia do solo e nutrição de plantas. Lavras: UFLA:SBCS, 1999. p.
621-667.
BALDANI, J.I.; POT, B.; KIRCHHOF, G.; FALSEN, E.; BALDANI, V.L.D.;
OLIVARES, F.L.; HOSTE, B.; KERSTERS, K.; HARTMANN, A.; GILLIS, M.;
DÖBEREINER, J. Emended description of Herbaspirillum; inclusion of
Pseudomonas rubrisubalbicans, a mild plant pathogen, as Herbaspirillum
rubrisubalbicans comb. nov.; and classification of a group of clinical isolates
(EF group 1) as Herbaspirillum species 3. Intern. J. Syst. Bacteriol.
Washington, v.46, p.802-810, 1996.
BALDANI, J.L.; BALDANI, V.L.; SELDIN, L.; DÖBEREINER, J. Characterization
of Herbaspirillum seropedicae. nov., sp. nov., a root associated nitrogen
fixing bacterium. Intern. J. Syst. Bacteriol, Washington, v.36, p.86-93,
1986.
BALDANI, V. L. D. Efeito da inoculação de Herbaspirillum spp. no
processo de colonização e infecção de plantas de arroz e, ocorrência
e caracterização parcial de uma nova bactéria diazotrófica. Seropédica:
UFRRJ, 1996. 234f. Tese (Doutorado - Ciência do Solo) - Programa de
Pós-Graduação em Agronomia, Universidade Federal Rural do Rio de
Janeiro, Seropédica, 1996.
BALDANI, V. L. D.; BALDANI, J. I.; DÖBEREINER, J. Inoculation of field-grown
wheat (Triticum aestivum) with Azospirillum spp. In Brazil. Biol. Fertil.
Soils, Berlin, v.4, p.37-40, 1987.
BALDANI, V. L. D.; BALDANI, J. I.; OLIVARES. F. L.; DÖBEREINER, J.
Identificatin and ecology of Herbaspirillum seropedicae and the closely
related Pseudomonas rubrisubalbicans. Symb., Rehovot, v.13, p.65-73,
1992.
BALDANI, V. L. D.; DOBERINER, J. Host-plant specificity in the infection of
cereals with Azospirillum spp. Soil Biol. Biochem., Oxford, v. 12: p. 433439, 1980.
BALDANI, V. L. D., DÖBEREINER,J. Host – plant specificity in infection of
maize, wheat and rice with Azospirillum spp. In VSE, P. B.; RUSCHEL, A.
P., (Ed.) Associative N2 fixation. CRC Press, Boca Ration, v.1, p.131 – 136,
1981.
BASHAN, Y.; PUENTE, E. M.; RODRIGUEZ-MENDOZA, M.; HOLGUIN, G.;
FERRERA-CERRATO, R.; TOLEDO, G.; PEDRIN, S. Soil parameters which
affect the survival of Azospirillum brasiliense. In: WORKSHOP ON
AZOSPIRILLUM
AND RELATED MICRORGANISMS, 1994, Sárvár.
Abstracts. Egypt: NATO Advanced Reserch, 1994. 1p.
BELIMOV, A. A.; KUNAKOVA, A. M.; VASILYEVA, N. D. Relationship between
survival rates of associative nitrogen-fixers on roots and yield response of
plants to inoculation. FEMS Microbial. Ecol., Amsterdam, v.17, p.187-196,
1995.
BEVIVINO, A.; SARROCCO, S.; DALMASTRI, C.; TABACCHIONI, S.;
CANTEALE, C.; CHIARINI, L. Characterization of a free-living Maizerhizosfere population of Burkholderia cepacia: effect of seed treatment on
disease suppression and growth promotion of maize. FEMS Microbiol.
Ecol., Amsterdam, v.27, p.225-237, 1998.
BODDEY, R. M., Methods for quantification of nitrogen fixation associated with
Gramineae. CRC Crit. Rev. Plant Sci., Amsterdam, v.6, p.209-266, 1987.
BODDEY, R. M.; OLIVEIRA, O. C.; URQUIAGA, S.; REIS, V. M.; OLIVARES, F.
L.; BALDANI, V. L.; DÖBEREINER, J. Biological nitrogen fixation
associated with sugarcane and rice: contributions and prospects for
improvement. Pl. Soil, The Hague, v.174, p.195-209, 1995.
BODDEY, R. M.; SILVA, L. G.; REIS, V. M.; ALVES, B. J. R.; URQUIAGA, S.
Assessment of bacterial nitrogen fixation in grass species. In: TRIPLETT, E.
W. (Ed.). Nitrogen Fixation in Bacteria: Molecular and Celular Biology.:
New York: Horizon Scientific Press, 1999, In press.
BRASIL, M., S. Ocorrência de bactérias diazotróficas associadas a
gramíneas forrageiras do Pantanal da Nhecolândia – MS. Seropédica:
UFRRJ, 2001. 105f. Dissertação (Mestrado - Ciência do Solo) Programa de
Pós-graduação em Agronomia, Universidade Federal Rural do Rio de
Janeiro, Seropédica, 2001.
BREDEMEIR, C.; MUNDSTOCK, C., M., Regulação da absorção e assimilação
do nitrogênio nas plantas. Ciênc. Rur., Santa Maria, v.30, p.365-372, 2000.
CAMARGO, F. A. O.; GIANELLO, C.; RHEINHEIMER, D. S.; KAMINSKI, J.;
BISSANI, C. Fracionamento do N, P e S orgânicos. In: CAMARGO, F. A. O.;
SANTOS G. A. (Eds.). Fundamentos da Matéria Orgânica do Solo:
Ecossistemas Tropicais e Subtropicais. Gênesis: Porto Alegre: 1999. p.297289.
CATTELAN, A. J. Métodos quantitativos para determinação de
características bioquímicas e fisiológicas associadas com bactérias
promotoras do crescimento vegetal. Londrina: EMBRAPA/Soja, 1999.
36p.
CHANWAY, C. P.; HOLL, F. B. Growth of outplanted lodgepole pine seedlings
one year after inoculation with growth promoting rhizobacteria. For. Sci.,
Amsterdam, v.40, p. 238-246, 1994.
CHANWAY, C. P.; NELSONA, L. M.; HOLL F. B. Cultivar specific growth
promotion of spring wheat by co-existent Bacillus species. Can. J.
Microbiol., Ottawa, v.34, p.925-929, 1988.
CHEN, Y.; MEI, R.; LU, S.; LIU, L.; KLOEPPER, W. The use of yield increasing
bacteria as PGPR in Chinese agriculture. In. GUPTA, U.K; UTKHEDE R.
(Eds.) Manejament of Soil borne diseases. New Delhi: M/S Narosa
Publishing House,1994.
COJHO, E. H.; REIS, V. M.; SCHENBERG, A. C. G.; DÖBEREINER, J.
Interactions of Acetobacter diazotrophicus with an amylolytic yeast in
nitrogen-free batch culture. FEMS Microbiol. Letters, Amsterdam, v.106,
p.341-346, 1993
COMISSÃO DE FERTILIDADE DO SOLO – RS/SC, Recomendações de
Adubação e Calagem para os Estados do Rio Grande do Sul e de
Santa Catarina. 3.ed. Passo Fundo: SBCS – Núcleo Regional Sul, 1995.
CREGAN, P. B.; BERKUM, P. Genetics of nitrogen metabolism and
physiological/biochemical selection for increased grain crop productivity.
Theor. Appl. Gen., Heidelberg, v.67, p.97-111, 1984.
DIDONET, A. D.; DIDONET, C. C. G. M. Caracterização fisiológica, bioquímica
e molecular de isolados de Azospirillum spp. obtidos de raízes de cevada.
In: REUNIÃO BRASILEIRA DE FERTILIDADE DO SOLO E NUTRIÇÃO DE
PLANTAS, 23.; REUNIÃO BRASILEIRA SOBRE MICORRIZAS, 7.;
SIMPÓSIO BRASILEIRO DE MICROBIOLOGIA DO SOLO, 5.; REUNIÃO
BRASILEIRA DE MICROBIOLOGIA DO SOLO, 2., 1998, Caxambu.
Resumos. Lavras: UFLA:SBCS:SBM, 1998. p.187.
DÖBEREINER, J.; BALDANI, V. L. D.; OLIVARES, F.L.; REIS, V. M.
Endophytic diazotrophs: the key to BNF in non-leguminous plants. In:
INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON NITROGEM FIXATION WITH NONLEGUMES 6.; 1993, Ismailia. Abstracts. Egypt: NATO advanced Reserch,
1993. p.52.
DÖBEREINER, J.; BALDANI, V.L.D.; BALDANI, J.I. Como isolar e identificar
bactérias diazotróficas de plantas não leguminosas. Brasília: EmbrapaSPI, 1995. 60p.
DÖBEREINER, J.; DAY, J.M. Associative symbioses in tropical grasses:
characterization
of
microorganisms
and
nitrogen-fixing
sites.
In:
INTERNATIONAL
SYMPOSIUM
ON
NITROGEN
FIXATION,1975,
Washington. Abastracts. Washington: NATO advanced Reserch, 1975.
p.518-538.
EMATER/RS. Recomendação de cultivares de milho para o Estado do Rio
Grande do Sul. Rio Grande do Sul: EMATER/RS. 2002.
EMBRAPA. Centro Nacional de Pesquisa de Solos. Sistema Brasileiro de
classificação de solos. Brasilia: SPI, 1999.
FALLIK, E.; OKON, Y. Growth response of maize roots to Azospirillum
inoculation: effect of soil organic matter content, number of rhizosphere
bacteria and timing of inoculation Soil Biol. Biochen., Oxford, v.20, p.4549, 1988.
FALLIK, E.; OKON, Y.; GOLDMAN, A.; FISCHER, M. Identification and
quantification of IAA and IBA in Azospirillum brasiliense-inoculated maize
roots. Soil Biol. Biochen., Oxford, v.21, p.147-153, 1989.
FALLIK, E.; OKON, Y., Inoculants of Azospirillum brasiliense: biomass
production, survival and growth promotion of Setaria italica and Zea mays.
Soil Biol. Biochem., Oxford, v.1, p.123-126, 1996.
FANCELLI, A. L.; DOURADO - NETO, D. Milho: ecofisiologia e rendimento. In:
FANCELLI, A. L.; DOURADO - NETO, D. (Eds.). Tecnologia da produção
de milho. USP-ESALQ: Piracicaba, 1997. p. 157-170.
FECOTRIGO-FECOAGRO/RS Custo de produção de milho. Disponível em:
http://www.redeagro.com.br/indica/custos.htm, Acesso em 03 jan. 2003.
FERNANDES, M. F.; FERNANDES, R. P. M.; RODRIGUES, L. S. Bactérias
diazotróficas associadas a coqueiros na região de baixada litorânea em
Sergipe. Pesq. Agropec. Bras., Brasília, v.12, p.1509-1517, 2001.
FULCHIERI, M.; FRIONI, L. Azospirillum inoculation on maize (Zea mays):
effect on yield in a field experiment in Central Argentina. Soil Biol.
Bichem., Oxford, v.26, p.921-923, 1994.
GARCIA de SALOMONE, I. E.; DÖBEREINER, J. Maize genotype effects on
the response to Azospirillum inoculation. Biol. Fertil. Soils, Berlin, v.21,
p.193-196, 1996.
GARCIA de SALOMONE, I. E.; DÖBEREINER, J.; URQUIAGA, S.; BODDEY,
R. M. Biological nitrogen fixation in Azospirillum strain-maize genotype
associations as evaluated by the 15N isotope diluition technique. Biol.
Fertil. Soils, Berlin, v.23, p.249-256, 1996.
HAN, S. O.; NEW, P. B. Variation in nitrogen fixing ability among natural
isolates of Azospirillum. Microb. Ecol., Amsterdam, v.36, p.193-201, 1998.
HERNANDEZ, A. N.; HERNANDEZ, A.; HEVDRICH, M. Selección de
rizobactérias asociadas al cultivo del maíz. Cultivos tropicales, Havana,
v.16, p.5-8, 1995.
HUSSAIN, A.; VANCURA, V. Formation of biologically active substances by
rhizosphere bacteria and their effect on plant growth. Folia Microbiol.,
Phara v.15, p.468-478, 1970.
IBGE/CEPAGRO, Levant. Sistem. Prod. Agríc.,
p.1-76, Jan.2002.
Rio de Janeiro, v.14, n.01,
JAMES, E. K. Nitrogen fixation in endophytic associative symbiosis. Field
Crops Res., North Carolina, v.65, p.197-209, 2000.
JAMES, E. K.; OLIVARES, F. L.; BALDANI, J. I.; DÖBEREINER, J.
Herbaspirillum, in endophytic diazotrph colonizing vascular tissue in leaves
of Sorghum bicolor L. Moench. J. Exp. Bot., Oxford, v.48, p.785-797, 1997.
JAMES, E.K.; OLIVARES, F.L. Infection and colonization of sugar cane and
other gramineous plants by endophytic diazotrophs. Crit. Rev.Pl. Sci..
Amsterdam, v.17, n.1, p.77-119, 1997.
JAVED, M.; ARSHAD, M.; ALI, K. Evaluation of rhizobacteria for their growth
promoting activity in maize. Pak. J. Soil Sci., Faisalabad, v.14. p.36-42,
1998.
KEFALOGIANNY, Y.; FLOURI, F.; BALIS, C. Occurrence, isolation and
identification of Azospirillum strains in Greece. In: WORKSHOP ON
AZOSPIRILLUM
AND
RELATED
MICROORGANISMS.1994,
Sávár.
Abstracts. Hungary: NATO Advanced Researsh, 1994. 1p.
KIRCHHOF, G.; SCHLOTER, M.; ABMUS, B.; HARTMANN, A. Molecular
microbial ecology approaches applied to diazotrphs associated with nonlegumes. Soil Biol. Biochem., Oxford, v.29, p.853-862, 1997.
KOLB, M.; MARTIN, P. Influence of nitrogen on the number of N2-fixing and
total bacteria in the rhizosphere. Soil Biol. Biochem., Oxford v.20, n.2,
221-225, 1988.
LADHA, J. K.; KIRK, G. J. D.; BENNETT, J.; REDDY, C.K.; SINGH, U.
Opportunities for increased nitrogen use efficiency from improved lowland
rice germoplasm. Field Crops Res., North Carolina, v.56, p.36-69, 1998.
LAMM , R. B.; NEYRA, C. A. Characterizatoin and cyst production of Azospirilla
isolated from selected grasses growing in New Jersey and New York. Can.
J. Microbiol., Ottawa, v.27, p.1320-1325, 1981.
LIMA, E.; BODDEY, R. M.; DÖBEREINER, J. Quantification of biological
nitrogen fixation associated with sugarcane using a 15N aided nitrogen
balance. Soil Biol. Biochem., Oxford, v.19, p.165-170, 1987.
MACHADO, A.T.; SODEK, L.; DÖBEREINER, J.; REIS, V.M. Efeito da
adubação nitrogenada e da inoculação com bactérias diazotróficas no
comportamento bioquímico da cultivar de milho Nitroflint. Pesq. Agropec.
Bras., Brasília, v.33, n.6, p.961-970, 1998.
MAGALHÃES, F. M. M. Caracterização e distribuição de uma nova espécie
de bactéria fixadora de nitrogênio. Amazonas: INPA, 1983. 98f,
Dissertação (Mestrado - Ciência do Solo) - Programa de Pós-graduação
em Ciência do Solo, Instituto Nacional de Pesquisas Amazônicas,
Amazonas, 1983.
MALLIK, K. A.; RASUL, G.; HASSAN, U.; MEHNAZ, S.; ASHARF, M. Role of
N2-fixing and growth hormone producing bacteria in improving growth of
wheat and rice. In: INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON NITROGEM
FIXATION WITH NON-LEGUMES 6., 1993, Ismailia. Abstracts. Egypt:
NATO advanced Reserch, 1993. p.52.
MANSOUR, F. A.; ILDESUGUY, H. S.; HAMEDO, H. A. Studies on plant growth
regulators and enzyme production by some bacteria. Univ. Sci. J., Qatar,
v.14, p.281-288, 1994.
MARRIEL, I. E. Diversidade morfológica bioquímica e serológica de
diazotróficos associados a gramíneas. Piracicaba: ESALQ, 1996. 103f.
Tese (Doutorado - Solos e Nutrição de Plantas) - Programa de PósGraduação em Ciência do Solo , Escola Superior de Agricultura Luiz de
Queiroz, Piracicaba, 1996.
MIRANDA, J. B.; VIEGAS, G. P. Milho híbrido. In: PATERNIANI, E.; VIEGAS,
G. P.(Eds.). Melhoramento e produção do milho. Fundação Cargil:
Campinas, 1987. p. 277-326.
MOTA, F. F.; NÓBREGA, A.; MARRIEL, I. E.; PAIVA, E.; SELDIN, L. Genetic
diversity of Paenibacillus polymyxa populations isolated from the
rhizosphere of four cultivars of maize (Zea mays) planted in Cerrado soil.
App. Soil Ecol., Washington, v.20. p.119–132, 2002.
NEAL JUNIOR, J. L.; ATKINSON, T. G.; LARSON, R. I. Changes in the
rhizosphere microflora of spring wheat induced by disomic substitution of a
chromosome. Can. J. Microbiol., Ottawa, v.16, p.153-158, 1970.
OKON, Y.; LABANDERA-GONZALEZ, C. A. Agronomic applications of
Azospirillum: an evalution of 20 years worldwide field inoculation. Soil Biol.
Biochem., Oxford, v.26, p.1591-1601, 1994.
OLIVARES, F. L.; BALDANI, V. L. D.; REIS, V. M.; BALDANI, J. I.;
DOBEREINER, J. Occurrence of the endophytic diazotrophs Herbaspirillum
spp. in roots, stems and leaves predominantly of Gramineae. Biol. Fertil.
Soils, Berlin, v.21, p.197-200, 1996.
OLIVARES, F. L.; JAMES, E. K.; BALDANI. J. I.; DÖBEREINER, J. Infection of
mottled stripe disease susceptible and resistant varieties of sugar cane by
endophytic diazotroph Herbaspirillum. New Phytol., Oxford, v.135, p.723737, 1997.
OLIVARES, F.L.; BALDANI, V.L.D.; REIS, V.M.; BALDANI, J.I.; DÖBEREINER,
J. Occurence of the endophytic diazotrophs Herbaspirillum spp. in roots,
stems and leaves predominantly of Gramineae. Biol. Fert. Soils, Berlin,
v.21, p.197-200, 1996.
PALLUD,
C.;
VIALLARD,
V.;
BALANDREAU,
J.;
NORMAND,
P.;
GRUNDMANN, G. Combined use of a specific probe and PCAT medium to
study Burkholderia in soil. J. Microbiol. Meth.,Washington, v.47, p.25-34,
2001.
PAUL, E.; CLARK, W.E. Soil Microbiology and. Biochemistry.. New York:
Academic. Press, 1996. 224p.
PENOT, I.; BERGES, N.; GUIGUENÉ, C.; FAGES, J. Characterization of
Azospirillum associated with maize (Zea mays L.) in France using
biochemical test and plasmid profiles. Can. J. Microbiol., Ottawa. v.38,
p.798-803, 1992.
PEREIRA, J. A. R. Bactérias diazotróficas e fungos micorrízicos
arbusculares em diferentes genótipos de milho (Zea mays L.).
Lavras:UFLA, 1995. 112f. Dissertação (Mestrado - Solos e Nutrição de
Plantas) - Programa de Pós-Graduação em Agronomia, Universidade
Federal de Lavras, Lavras, 1995.
PILLAR, V. D. P. Multiv Multivariate Exploratory Analysis, Randomization
Testing and Bootstrap Resampling. Porto Alegre: Universidade Federal
do Rio Grande do Sul, 2001.
PODANI, J. Multivariate Data Analysis in Ecology and Systematics. SPB
The Hague: Academic Publishing, 1994. p.77-106.
POLLI, H.; MATSUI, E.; DÖBEREINER, J.; SALATI, E. Confirmation of nitrogen
fixation in two tropical grasses by 15N2 incorporation. Soil Biol. Biochem.,
Oxford, v.9, p.119-123, 1977.
RECOMENDAÇÕES técnicas para a cultura do milho no Estado do Rio Grande
do Sul - Porto Alegre: FEPAGRO; EMATER/RS; FECOAGRO/RS, 1998
(Boletim Técnico, n. 5).
REIS JR. F. B.; SILVA, L. G.; REIS, V. M.; DÖBEREINER, J. Ocorrência de
bactérias diazotróficas em diferentes genótipos de cana-de-açúcar. Pesq.
Agropec. Bras, Brasília, v.35, p.985-994, 2000.
RENNIE, R. J.; FREITAS, J. R.; RUSCHEL, A. P.; VOSE, P. B. 15N isotope
diluition to quantify dinitrogen (N2) fixation associated with Canadian and
Brazilian wheat. Can. J. Bot., Ottawa, v.61, p.1667-1671, 1983.
RIO GRANDE DO SUL/SAA. Macrozonemento agroecológico e econômico
do Rio Grande do Sul. Porto Alegre: SAA, 1994. 544p.
ROESCH, L. F. W.; CAMARGO, F. A.O.; SELBACH, P. A.; BIZARRO, M. J.
Ocorrência de bactérias diazotróficas associadas à plantas de milho
cultivadas em sistema de semeadura direta. In: REUNIÃO BRASILEIRA DE
FERTILIDADE DO SOLO E NUTRIÇÃO DE PLANTAS, 25.; REUNIÃO
BRASILEIRA SOBRE MICORRIZAS, 8.; SIMPÓSIO BRASILEIRO DE
MICROBIOLOGIA
DO
SOLO,
6.;
REUNIÃO
BRASILEIRA
DE
MICROBIOLOGIA DO SOLO, 3., 2000 Santa Maria. Resumos
Expandidos, Santa Maria: UFSM:SBCS:SBM, 2000. CD-ROM.
SADASIVAN, L.; NEYRA, C. A. Cyst production and brown pigment formation in
aging cultures of Azospirillum brasiliense ATCC 29145. J. Bacteriol.,
Washington, v.169, p.1670-1677, 1987.
SHERSTHA, R. K.; LADHA, J. K.; Genotypic variation in promotion of rice
nitrogen fixation as determined by nitrogen 15N diluition. Soil Sci. Am. J.,
Madison, v.60, p.1815-1821, 1996.
SONTHAYANON, P.; KRASAO, P.; WUTHIEKANUN, V.; PANYIM, S.;
TUNGPRADABKUL, S.
A simple method to detect and differentiate
Burkholderia thailandensis using specific flagellin gene primers. Molec. Cel.
Prob., Amsterdam, v.16, p.217-222, 2002.
STEENHOUDT, O.; VANDRLEYDEN, J. Azospirillum, a free-living nitrogenfixing bacterium closely associated with grasses: genetic, biochemical and
ecological aspects. FEMS Microbiol. Rev., Amsterdam, v.24, p.487-506,
2000.
TAL, S.; OKON, Y. production of the reserve material poly-b-hydroxybutyrate
and its function in Azospirillum brasiliense Cd. Can. J. Microbiol., Ottawa,
v.31, p.608-613, 1985.
TEDESCO, M. J.; GIANELLO, C.; BISSANI, C. A.; BOHNEN, H.; VOLKWEISS,
S. J. Análise de solo plantas e outros materiais. 2ed. Porto Alegre:
Depto. de Solos da UFRGS, 1995. 174p.
THUAR, A. M.; OLMEDO C. A.; BELLONE, C. Greenhouse studies on growth
promotion of maize inoculated with plant growth-promoting rhizobacteria
(PGPR). Auburn University Disponível em:
http://www.ag.auburn.edu/argentina/pdfmanuscripts/thuar.pdf. Acesso em
01 fev.2000.
TILAK, K. V. B. R.; SINGH, C. S.; ROY, N. K.; SUBA RAO, N. S., Azospirillum
brasiliense and Azotobacter chrococcum inoculum: effect on yield of maize
(Zea mays) and sorghum (Sorghum bicolor). Soil Biol. Biochem., Oxford,
v.14, p.417-418, 1982.
URQUIAGA, S.; CRUZ, K. H.; BODDEY, R. M. Contribution of nitrogen fixation
to sugarcane: nitrogen 15 and nitrogen balance estimates. Soil Sci. Soc.
Am. J., Madison, v.56, p.105-114, 1992.
YONEYAMA, T.; MURAOKA, T.; KIM, T. H.; DACANEY, E.V.; NAKANISHI, Y.
The natural 15N abundance of sugarcane and neighbouring plants in Brazil
the Philippines and Miyako (Japan). Pl. Soil, The Hague, v.189, p.239-244,
1997.
ZAHIR, Z. A.; ABBAS, S. A.; KHALID, M.; ARSHAD, M. Substrate dependent
microbiallly derived plant hormones for improving growth of maize
seedlings. Pak. J. Biol. Sci., Faisalabad, v.3, p.289-291, 2000.
7. ANEXOS
7.1 Anexo 1: Meios de cultura e soluções utilizadas
Meio de cultura NFb (Döbereiner et al., 1995)
5,0 g L-1
Ácido málico
-1
K2HPO4
-1
MgSO4.7H2O
0,5 g L
0,2g L
-1
0,1 g L
0,02 g L
-1
NaCl
CaCl2.2H2O
2 mL
Solução de micronutrientes
2 mL
azul de bromotimol (solução 0,5% em 0,2N KOH)
4 mL
FeEDTA (solução 1,64%)
1 mL
Solução de vitaminas
-1
4,5g L
KOH
pH
6,5 - 6,8
Meio de cultura JNFb (Döbereiner et al., 1995)
5,0 g L-1
Ácido málico
0,6 g L-1
K2HPO4
-1
KH2PO4
-1
0,2g L
MgSO4.7H2O
0,1 g L-1
NaCl
0,02 g L-1
CaCl2.2H2O
1,8 g L
2 mL
Solução de micronutrientes
2 mL
azul de bromotimol (solução 0,5% em 0,2N KOH)
4 mL
FeEDTA (solução 1,64%)
1 mL
Solução de vitaminas
4,5g L-1
KOH
pH
5,8
Meio de cultura LGI (Döbereiner et al., 1995)
5,0 g L-1
Sacarose
-1
K2HPO4
-1
0,6 g L
KH2PO4
0,2 g L-1
MgSO4.7H2O
0,002
Na2Mo4.2H2O
0,002
CaCl2.2H2O
5 mL
azul de bromotimol (solução 0,5% em 0,2N KOH)
4 mL
FeEDTA (solução 1,64%)
1 mL
Solução de vitaminas
pH
6,0 - 6,2
0,2 g L
Meio de cultura LGI-P (Döbereiner et al., 1995)
100 g L-1
Sacarose
-1
K2HPO4
-1
0,6 g L
KH2PO 4
0,2 g L-1
MgSO4.7H2O
0,002 g L-1
Na2Mo4.2H2O
0,02 g L-1
CaCl2.2H2O
5 mL
azul de bromotimol (solução 0,5% em 0,2N KOH)
0,01 g L-1
FeCl3.6H2O
pH
5,5
0,2 g L
Meio de cultura JMV (Baldani, 1996)
5,0 g L-1
Manitol
-1
0,6 g L
K2HPO4
1,8 g L-1
KH2PO 4
-1
0,2g L
MgSO4.7H2O
0,1 g L-1
NaCl
0,02 g L-1
CaCl2.2H2O
2 mL
Solução de micronutrientes
2 mL
azul de bromotimol (solução 0,5% em 0,2N KOH)
4 mL
FeEDTA (solução 1,64%)
1 mL
Solução de vitaminas
pH
4,2 - 4,5
Meio de cultura Batata (Baldani & Döbereiner, 1980)
200 g L-1
Batata
-1
Ácido málico
-1
2,5 g L
Sacarose
2 mL
Solução de micronutrientes
1 mL
Solução de vitaminas
pH
6,5 - 7,0
2,5 g L
Solução de micronutrientes (Döbereiner, 1995)
0,04 g L-1
CuSO2.5H2O
1,20 g L-1
ZnSO 4.7H2O
1,40 g L-1
H3Bo3
1,00 g L-1
Na2Mo4.2H2O
1,175 g L-1
MnSO4.2H2O
Solução de vitaminas (Döbereiner et al., 1995)
10 mg 100 mL-1
Biotina
20 mg
Pirridoxol - HCl
Solução salina para diluição (Döbereiner et al., 1995)
3,4 g L-1
KH2PO 4
0,2 g L-1
MgSO4.7H2O
0,1 g L-1
NaCl
0,02 g L-1
CaCl2.2H2O
2 mL
Solução de micronutrientes
4 mL
FeEDTA (solução 1,64%)
-1
4,5 g L
KOH
pH
7,0
7.2 Anexo 2:
Tabela de McCrady para cálculo do Número mais provável
(NMP) de bactérias diazotróficas em contagem com três frascos
por diluição
Diluição
com cresc.
000
Nº de
diazotróficos
0,0
Diluição
com cresc.
201
Nº de
diazotróficos
1,4
Diluição
com cresc.
302
Nº de
diazotróficos
6,5
001
0,3
202
2,0
310
4,5
010
0,3
210
1,5
311
7,5
011
0,6
211
2,0
312
11,5
020
0,6
212
3,0
313
16,0
100
0,4
220
2,0
320
9,5
101
0,7
221
3,0
321
15,0
102
1,1
222
3,5
322
20,0
110
0,7
223
4,0
323
30,0
111
1,1
230
3,0
330
25,0
120
1,1
231
3,5
331
45,0
121
1,4
232
4,0
332
110,0
130
1,6
300
2,5
333
140,0
200
0,9
301
4,0
-
-
7.3 Anexo 3:
DAE
Probabilidades calculadas para
diferenças entre tratamentos.
30
55
77
115
Solo
0,041
0,456
0,302
0,545
30
55
77
115
0,027
0,581
0,044
0,560
julgar
Nitrogênio
Raiz
0,004
0,888
0,875
0,782
Variedade
0,598
0,051
0,881
0,723
a
significância
Colmo
0,696
0,432
0,368
0,630
0,120
0,005
0,130
0,402
das
7.4 Anexo 4:
Nitrogênio mineral do solo aos 30, 55, 77 e 115 dias após a
emergência das plantas de milho nos diferentes tratamentos.
Cultivar / Tratamentos
NH4
NO3 + NO2
N total
-1
--------------------------- mg kg -------------------------30 DAE
Santa Helena sem N
Santa Rosa sem N
Santa Helena com N
Santa Rosa com N
5,73
4,96
14,41
8,00
1,34
0,80
4,11
2,39
7,06
5,76
18,52
10,39
6,95
8,23
16,37
145,61
0,00
0,00
0,92
5,86
6,95
8,23
17,30
151,47
77 DAE
6,78
8,22
10,96
0,52
0,26
2,22
7,31
8,48
13,18
13,05
4,31
17,35
0,51
0,00
0,77
4,62
5,39
4,10
3,98
7,70
55 DAE
Santa Helena sem N
Santa Rosa sem N
Santa Helena com N
Santa Rosa com N
Santa Helena sem N
Santa Rosa sem N
Santa Helena com N
Santa Rosa com N
115 DAE
Santa Helena sem N
Santa Rosa sem N
Santa Helena com N
Santa Rosa com N
4,87
4,10
3,21
3,08
8. VITA
Luiz Fernando Wurdig Roesch, filho de Fernando José Germany
Roesch e Erica Würdig Roesch, nascido em 25 de maio de 1976 em Porto
Alegre -RS.
Estudou no Colégio Nossa Senhora da Glória, onde completou o
primeiro e segundo graus. Em 1995 ingressou na Universidade Federal do Rio
Grande do Sul, onde foi graduado Engenheiro Agrônomo em fevereiro de 2001.
Neste mesmo ano iniciou o curso de Mestrado em Ciência do Solo no Curso de
Pós-Graduação
em
Ciência
do
Solo
Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
da
Faculdade
de
Agronomia
da