Estrutura dos Ácidos Nucléicos
DNA e RNA
Replicação – Transcrição – Tradução
Introdução à Biologia Molecular
Alexandre Havt
Moléculas com informações para a síntese
de proteínas
DNA – armazém ou biblioteca celular
Contém informações para a construção
das células e tecidos
Duplicação dos genes garante a
perpetuação das espécies
Transcrição – síntese de RNA
RNA mensageiro (mRNA)
RNA transportador (tRNA)
RNA ribossômico (rRNA)
Tradução – síntese de proteínas a partir das
informações dos RNAs
Descoberta da estrutura do DNA em 1953
Watson e Crick
Estrutura dos Ácidos Nucléicos – DNA e RNA
Estrutura dos Ácidos Nucléicos – DNA e RNA
Estrutura dos Ácidos Nucléicos – DNA e RNA
Estrutura dos Ácidos Nucléicos - DNA
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Estrutura dos Ácidos Nucléicos - RNA
RNA mensageiro - mRNA
RNA ribossômico - rRNA
RNA transportador - tRNA
Ribossomos
Procariotos
Citoplasma
Mitocôndrias Eucariotos
Procariotos
3 tipos de moléculas de rRNA
• 16S + 21 proteínas – 30S
• 23S
+34 proteínas – 50S
• 5S
Função
70S
Citoplasma de eucariotos
4 tipos de moléculas de rRNA
• 18S + 33 proteínas – 40S
• 5S
• 28S +50 proteínas – 60S
• 5,8S
Mitocondriais
80S
Transportar aminoácidos para
a síntese protéica
Assegurar a incorporação dos
mesmos na posição correta
• anticódon
Células com pelo menos 20 tRNA
Pequenas moléculas
80 nucleotídeos
4S
55S
• Propriedades similares ao das
bactérias
Regras da Síntese dos Ácidos Nucléicos e
Proteínas
Regras da Síntese dos Ácidos Nucléicos e
Proteínas
Formados por blocos monoméricos
RNA e DNA
• 5 Nucleotídeos
Proteínas
• 20 aminoácidos
Monômeros adicionados 1 por vez
Cadeia de formação tem ponto de partida específico com
crescimento unidirecional para um terminal fixo
Direção 5´ - 3´
Produto primário é frequentemente modificado
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Replicação do DNA
Duplicação do material genético para a divisão celular
Replicação é semiconservativa
• Uma fita parental e uma nova fita sintetizada
Replicação do DNA
Forquilha de replicação
Helicases - Separação das duplas fitas
Proteínas protegem DNA de fita simples e evitam reaproximação
Primase – síntese de iniciador
Topoisomerase
• Desenrolam supertorção
Ligases – união dos fragmentos de Okasaki
DNA polimerases
•
•
•
•
α - associação com primase para formação do iniciador
δ - polimerização das fitas líder e lenta
γ - polimerização DNA mitocondrial
β ε κ η ζ ι - polimerases de reparo
Replicação do DNA Eucariótico
Síntese de RNA
Transcrição
Síntese de RNA
Transcrição – Síntese de RNA
RNA polimerases devem reconhecer
O ponto de início da transcrição
Qual das fitas deve ser usada como molde – transcrita
Região promotora do DNA
Controla a ligação da RNA polimerase
Identifica o ponto de início da transcrição
Controla a frequência da transcrição
• Sequências regulatórias no promotor
• Sequências perto do promotor
• Reforçadores
Interagem com proteínas que estabilizam
a ligação RNA-polimerase ao promotor
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Transcrição
Processamento do mRNA Eucariótico
Síntese dos rRNAs Eucarióticos
Síntese dos tRNAs Eucarióticos
Síntese Protéica - Tradução
Ocorre nos ribossomos – rRNA
Síntese de proteínas
Tradução
Direcionado pela sequência dos códons
de mRNA
Cada tRNA traz um aminoácido
específico ao seu anticódon
Aminoacil-tRNA
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Código Genético
Primeira base
Segunda base
Terceira base
(5’)
U
C
A
G
(3’)
U
Phe
Ser
Tyr
Cys
U
Phe
Ser
Try
Cys
C
Leu
Ser
Parada
Parada
A
Leu
Ser
Parada
Trp
G
Leu
Pro
His
Arg
U
Leu
Pro
His
Arg
C
Leu
Pro
Gln
Arg
A
Leu
Pro
Gln
Arg
G
C
A
Ile
Thr
Asn
Ser
U
Ile
Thr
Asn
Ser
C
Formação do aminoacil-tRNA
Aminoacil-tRNA
tRNA ligado covalentemente a um
aminoácido na terminação 3’
Cada aminoácido com seu tRNA
• Alanil-tRNAala
• Metionil-tRNAi met
20 Aminoacil-tRNA-sintetases
Processo dependente de ATP
Ocorre em 2 passos
Ile
Thr
Lys
Arg
A
Met
Thr
Lys
Arg
G
Val
Ala
Asp
Gly
U
Val
Ala
Asp
Gly
C
Val
Ala
Glu
Gly
A
Hidroxila do carbono 2 ou 3 da ribose
Val
Ala
Glu
Gly
G
Nucleotídeo de adenina (CCA)
• Formação do complexo:
enzima/aminoacil-AMP e pirofosfato
G
• Transferência do aminoácido ativo
Iniciação
Processo da Tradução
Envolvimento de 3 passos
Iniciação
Alongamento
Terminação
Alongamento – Ligação Peptídica – Translocação
Terminação
Códons de parada
Inexistência de tRNA com anticódons que possam parear com
• UAA
• UGA
• UAG
Fatores de liberação unem-se ao ribossomo
Hidrólise da ligação peptidiltransferase
• Cadeia peptídica
• tRNA
Peptídeo sintetizado é liberado
Dissociação das subunidades do ribossomo
• Liberação do mRNA
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Polissomos
Ligação de vários ribossomos ao mRNA
Cada ribossomo cobre 80 nucleotídeos de mRNA
Aproximadamente um ribossomo a cada 100 nucleotídeos
Técnicas de Biologia Molecular
Reação de Polimerase em Cadeia – PCR
Função - Multiplicação de trecho específico de DNA
• Problema – análise de ácidos nucleicos
Karis Mulis
Baixa quantidade de ácidos nucléicos nos tecidos
Primers
Taq – DNA polimerase (Thermus aquaticus)
• Enzima termoestável em temperatura até 117 °C
• Temperatura ótima 72 °C
Início – vários banhos maria com diferentes temperaturas
1987 – publicação do artigo de Mulis na Methods in
Enzymology
1989 – primeiro termociclador
1994 – Nobel em química para Karis Mulis
Técnicas de Biologia Molecular
Técnicas de Biologia Molecular
Fundamentos do PCR
Desnaturação das cadeias de DNA à 94 °C
Anelamento dos primers (de acordo com a TM de cada primer)
Extensão – incorporação dos nucleotídeos pela enzima Taq á 72 °C
Vídeo da reação de PCR
Reagentes essenciais
Taq – em solução de Tris-HCL (pH 8,0), 0,1 mM EDTA, 1mM
DTT, 50% glicerol
Tampão – 200 mM Tris-HCL (pH 8,4), 500 mM KCl
Cloreto de magnésio – cofator para ação da enzima
Desoxinucleotídios (ATP, TTP, CTP, GTP) – mistura de [ ]’s
iguais
Primers específicos à sequência que se deseja amplificar
Técnicas de Biologia Molecular
Fundamentos da Transcriptase Reversa
Vírus de RNA tipo VI
• Enzima transcriptase reversa
CGTCATGCTTAGCCGTTCCGGCTGCAGCTTAAAAAAAAAAAAA
mRNA
ACGTCGAATTTTTTTTTTTTT
cDNA
CGTCATGCTTAGCCGTTCCGGCTGCAGCTTAAAAAAAAAAAAA
mRNA
GCAAGGCCGACGTCGAATTTTTTTTTTTTT
cDNA
CGTCATGCTTAGCCGTTCCGGCTGCAGCTTAAAAAAAAAAAAA
mRNA
GCAGTACGAATCGGCAAGGCCGACGTCGAATTTTTTTTTTTTT
cDNA
• Genoma de RNA orienta a formação de uma molécula de DNA
AMV - Vírus da Mieloblastose aviária
RNAse I
M-MuL-V (Moloney Murine Leukemia Virus)
Importante ferramenta para o estudo da expressão gênica a partir do
mRNA
CGTCATGCTTAGCCGTTCCGGCTGCAGCTTAAAAAAAAAAAAA
mRNA
GCAGTACGAATCGGCAAGGCCGACGTCGAATTTTTTTTTTTTT
cDNA
Síntese de uma fita de DNA complementar de fita simples (cDNA)
Sequências de cDNA específico podem ser amplificados por PCR
PCR
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Isolamento de RNA por TRIZOL
Técnicas de Biologia Molecular
Fenol + Isotiocianato de guanidine
Isolamento de RNA
Imprescindível uso de luvas e amostras no gelo quando possível –
evitar RNAse
Membranas celulares e nucleares destruídas
Manutenção da integridade do RNA
Maceração da amostra com TRIZOL
Clorofórmio – separação em 3 fases
Qualquer amostra tecidual, cultura de células - (100mg)
RNA – sobrenadante
DNA – camada intermediária
Protéinas – camada inferior
Método muito utilizado Reagente TRIZOL
Precipitação com Isopropanol
Lavagem com Etanol 75%
Leitura em espectrofotômetro
260nm – quantidade ( A260 x fator de diluição x 0,04 = [ ug/uL])
Razão 260nm/280nm – qualidade do RNA ( ≅ 2,00)
Análise por Eletroforese
Amostra 100 mg
+
1 mL de TRIZOL
Homogeneizar
• Centrifugar 12.000 g
10 min. 2- 8 °C
Principio básico
O DNA tem carga negativa
Aplicando uma voltagem as moléculas de DNA migrariam para o
Vórtex por 15 sec.
• Remover sobrenadante
transparente para novo
tubo
• Acrescentar 500 uL de
isopropanol
Incubar RT °C p/ 2-3
min
Centrifugar 12.000 g p/
15 min
catodo
• Remover
sobrenadante p/ novo
tubo
Malha de gel de agarose permite o deslocamento do DNA separando-
• Acrescentar 200 uL
de clorofórmio
o por tamanho
• Moléculas menores migram mais rápido
• Incubar RT °C 10 min
• Moléculas maiores migram mais lento
• Descartar 3° sobrenadante
• Centrifugar 12.000 g p/
15 min à 2 – 8 °C
• Acrescentar 3x 1mL de
etanol 75%
• Descartar sobrenadante
• Centrifugar 3x a 7.500 g
por 5 minutos à 2 – 8 °C
• Evaporar etanol
•Solubilizar
pellet
ddH2O autoclavada
com
A distância percorrida é comparada à distância de uma molécula de
tamanho conhecido
•Leitura espectrofotômetro
Análise por Eletroforese
Principio básico
Agarose – polissacarídeo é aquecido para dissolver em tampão
eletrolítico
• Tris-Acetato-EDTA – TAE
• Tris- Borato-EDTA
• Solubilização do gel por esfriamento
Aumento da viscosidade da amostra com glicerol
Visualizaçãoda corrida da amostra com corante – bromofenol blue
Visualização do DNA no gel por brometo de etídeo
Cuba de Eletroforese Horizontal
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